專利名稱：一種禽流感H₉N₂亞型病毒毒株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物病毒領域，涉及病毒新毒種，具體涉及一種禽流感亞型病 毒毒株及其應用。
背景技術：
2006年1月河南某大型養(yǎng)雞場的180日齡發(fā)病蛋雞群發(fā)病，雞臥地不起，精神沉 郁，爪子干癟。剖檢發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)和消化道呈現(xiàn)明顯的病理變化，氣管環(huán)有出血，肺臟嚴重 出血、淤血，呈現(xiàn)病理性實變；小腸各段均有不同程度的出血，肌胃、腺胃交界處有出血、潰 瘍灶，幾天后出現(xiàn)產蛋下降接著出現(xiàn)死亡，部分雞只發(fā)生急性死亡，日死淘率達2%以上，雖 使用各種抗生素，發(fā)病無明顯好轉，總死淘率在20%左右，產蛋下降至15%。持續(xù)近4周才 逐步回升。上述臨診表現(xiàn)與近年來國內報道的其他地區(qū)發(fā)病后的壓隊亞型禽流感大致相 似。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種禽流感H9N2亞型病毒毒株，分類命名禽流感H9N2亞型 病毒，拉丁文學名=Orthomyx0Viridae,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏單位簡稱CGMCC，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，保藏日期 2009年12月17日，保藏編號3526。本發(fā)明的技術方案是一種禽流感H9N2亞型病毒毒株，禽流感HJ2亞型病毒毒株 (Orthomyxoviridae)，CGMCC NO :3526。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株具有下述特點(1)所述毒株為低致病力禽流感病毒株；(2)所述毒株具有特異性；(3)所述毒株具有免疫原性。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備疫苗的生產毒種中的應用。本發(fā)明的禽流感亞型病毒毒株在制備禽流感病毒診斷用抗原試劑中的應用。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒診斷用陽性血清試劑中的 應用。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒治療用抗血清中試劑的應 用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的禽流感H9N2亞型病毒毒株具有良好的特異性和免 疫原性，雞胚尿囊液凝集紅細胞的作用不能被抗NDV陽性血清、抗EDS76陽性血清、抗M41陽 性血清、抗H5亞型禽流感病毒單因子陽性血清以及抗H7亞型禽流感病毒單因子陽性血清所 抑制，而能被H9亞型禽流感病毒單因子陽性血清抑制。免疫雛雞能產生對H9特異的HI抗 體。用H9亞型特異抗血清中和后接種雞胚，雞胚均不死亡，而未中和的對照接種胚都死亡， 這進一步說明了本發(fā)明毒株的特異性。本發(fā)明作為制造效果良好的疫苗毒株，預防禽類的H9亞型禽流感，用于病毒的鑒定和流行病學的調查。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株，保藏日期2009年12月17日，保藏單位中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱CGMCC，保藏編號3526。
具體實施例方式實施例2006年1月，河南某雞場從發(fā)病蛋雞群分離到一株A型禽流感病毒毒株。雞群180 日齡開始發(fā)病，雞臥地不起，精神沉郁，爪子干癟。剖檢發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)和消化道呈現(xiàn)明顯的 病理變化，氣管環(huán)有出血，肺臟嚴重出血、淤血，呈現(xiàn)病理性實變；小腸各段均有不同程度的 出血，肌胃、腺胃交界處有出血、潰瘍灶，以嚴重呼吸道癥狀為主，幾天后出現(xiàn)產蛋下降接著 出現(xiàn)死亡，部分雞只發(fā)生急性死亡，日死淘率達2%以上，雖使用各種抗生素，發(fā)病無明顯好 轉，總死淘率在20%左右，產蛋下降至15%。持續(xù)近4周才逐步回升。上述臨診表現(xiàn)與近 年來國內報道的其他地區(qū)發(fā)病后的亞型禽流感大致相似。從雞群病例的氣管、輸尿管和泄殖腔拭子中分離到一株病毒，通過SPF雞胚傳代 后，將分離的毒株和其他毒株的雞胚尿囊液用0. 05%甲醛溶液滅活后，送國家流感中心， 做HI和OT試驗，確定病毒的亞型。結果表明分離到的毒株為H9亞型禽流感，定名為A/ Chicken/Henan/01/2006 (H9N2 亞型)株(簡稱 HNlO6 株)。在初次分離時，尿囊液血凝滴度為1 256，凝集不被ND和EDS76抗血清抑制，出 現(xiàn)全身出血、明顯水腫和肝臟壞死的病變；死亡時間多集中在72 之間。盡管從致雞胚癥狀看，該毒株對禽類有一定的致病力。但根據分離病毒對雞胚的 致死時間、對雛雞的致病力和雞腦內致病指數(ICPI)的測定結果，依據國際通用標準和國 際獸醫(yī)局(OIE)推薦的鑒定標準，判定分離的病毒株為低致病力禽流感病毒株。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備疫苗的生產毒種中的應用。本發(fā)明的禽流感亞型病毒毒株在制備禽流感病毒診斷用抗原試劑中的應用。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒診斷用陽性血清試劑中的 應用。本發(fā)明的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒治療用抗血清中試劑的應 用本發(fā)明中，毒株定名為A/Chicken/Henan/01/2006株，簡稱HN106株。(1)流行病學調查調查雞群的發(fā)病年齡，臨床表現(xiàn)、剖檢病變及死亡率等情況。2006年1月河南某大 型養(yǎng)雞場的180日齡發(fā)病蛋雞群發(fā)病，雞臥地不起，精神沉郁，爪子干癟。剖檢發(fā)現(xiàn)，呼吸系 統(tǒng)和消化道呈現(xiàn)明顯的病理變化，氣管環(huán)有出血，肺臟嚴重出血、淤血，呈現(xiàn)病理性實變；小 腸各段均有不同程度的出血，肌胃、腺胃交界處有出血、潰瘍灶。(2)病毒分離選擇臨床癥狀典型的瀕死雞和死亡后池以內的病死雞，無菌采集氣管、輸卵管或 喉頭、泄殖腔分泌物棉拭子。用勻漿器研磨，按體積1 5的比例加入含青霉素l，000U/mL、 鏈霉素1，000U/mL滅菌的生理鹽水，制成組織懸液，置2 8°C冰箱，抑菌濁，4000rpm離心 20min，取上清液，無菌濾器過濾，然后經尿囊腔接種10 11日齡SPF雞胚，每胚0. 2mL，37°C孵化，每日照蛋2次，將48h以前死亡的雞胚棄去。4 后，每4 Mi照蛋1次，死亡的 雞胚隨時取出，直至120h，不論死亡或存活，取出所有雞胚，氣室向上直立，置2 8°C冰箱 冷卻8 16h，收獲雞胚液。按照上述方法，從病雞的病料中分離到有血凝性的病毒，HI試驗證明HN106株的 血凝性不能被ND抗血清抑制，能被AIH9亞型陽性血清抑制。結果見表1。表1現(xiàn)場病料初次分離結果
病料來源(代號)雞胚死亡時間HA滴度(Log2) ND抗血清HI AIV H9抗血清HI
HN106_75h_8_-_+(3) HA 和 HI 試驗按微量法在V型血凝試驗微量板上進行，雞紅細胞濃度為1 % (V/V)，反應總量均 為 0. 075mL。(4)病毒繼代病毒在10 11日齡SPF雞胚中繼代，收獲尿囊液。(5)亞型的鑒定將分離的HN106株和其他毒株的雞胚尿囊液用0. 05%甲醛溶液滅活后，送國家流 感中心，做HI和NI試驗，確定病毒的亞型。經國家流感中心鑒定，HN106株分離物為HJ2 亞型,命名為 A/Chicken/Henan/01/2006(H9N2 亞型)株，簡稱 HN106 株。(6) 1日齡雞腦內致病指數(ICPI)測定將第2代SPF雞胚尿囊液用滅菌生理鹽水10倍稀釋，滅菌濾器過濾后，對10只1 日齡雛雞腦內注射，0. 05mL/只，另取2只以同樣的方法注射稀釋病毒用的滅菌生理鹽水各 0. 05mL。隔離飼養(yǎng)，觀察8d，記錄試驗結果。按照打分系數標準(正常雞，0分；發(fā)病雞，1分；病死雞，2分)給正常、發(fā)病和死 亡雞打分，試驗結果如表2。按照計算ICPI的公式ICPI =(發(fā)病數+死亡數)/總觀察數，計算得ICPI = 11/80 = 0. 14。根據國際通用的標準，ICPI在1. 6 5范圍內，可判定病毒為強致病力株。本試 驗ICPI的結果為1. 3，故判定分離的病毒株為低致病力禽流感病毒株。表2腦內致病指數測定結果
權利要求
1.一種禽流感HJ2亞型病毒毒株，其特征在于禽流感H9N2亞型病毒 (Orthomyxoviridae)，CGMCC NO :3526。
2.根據權利要求1所述的禽流感H9N2亞型病毒毒株，其特征在于所述毒株具有下述 特點(1)所述毒株為低致病力禽流感病毒株；(2)所述毒株具有特異性；(3)所述毒株具有免疫原性。
3.如權利要求1所述的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備疫苗的生產毒種中的應用。
4.如權利要求1所述的禽流感H9N2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒診斷用抗原試劑 中的應用。
5.如權利要求1所述的禽流感H9N2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒診斷用陽性血清 試劑中的應用。
6.如權利要求1所述的禽流感HJ2亞型病毒毒株在制備禽流感病毒治療用抗血清中 試劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽流感H9N2亞型病毒毒株，禽流感H9N2亞型病毒毒株(Orthomyxoviridae)，CGMCC NO3526。本發(fā)明的禽流感H9N2亞型病毒毒株具有良好的特異性和免疫原性，雞胚尿囊液凝集紅細胞的作用不能被抗NDV陽性血清、抗EDS76陽性血清、抗M41陽性血清、抗H5亞型禽流感病毒單因子陽性血清以及抗H7亞型禽流感病毒單因子陽性血清所抑制，而能被H9亞型禽流感病毒單因子陽性血清抑制。免疫雛雞能產生對H9特異的HI抗體。本發(fā)明作為制造效果良好的疫苗毒株，預防禽類的H9亞型禽流感，用于病毒的鑒定和流行病學的調查。
文檔編號C12N7/00GK102093982SQ20101012368
公開日2011年6月15日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權日2010年2月10日
發(fā)明者崔保安, 崔沛, 李雙亮, 李新生, 陳紅英, 高文明, 黃宗梅 申請人:河南農業(yè)大學