專利名稱：：通過(guò)核酸擴(kuò)增檢測(cè)1型和2型單純皰疹病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)核酸擴(kuò)增法鑒定單純皰疹病毒(HSV)的診斷方法和核酸序列。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)渭儼捳钍怯邪さ碾p鏈DNA病毒，它導(dǎo)致人原發(fā)性和復(fù)發(fā)性感染且與導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多(EB病毒)、水痘和帶狀皰疹(水痘_帶狀皰疹病毒)的病毒有關(guān)。單純皰疹病毒(HSV)感染的癥狀包括皮膚或粘膜上長(zhǎng)出小水皰。在長(zhǎng)出的水皰消退后，病毒在對(duì)感染區(qū)提供神經(jīng)纖維的神經(jīng)細(xì)胞群(神經(jīng)節(jié))內(nèi)保持靜止(潛伏)狀態(tài)。病毒定期再活化，開始再生長(zhǎng)并通過(guò)神經(jīng)纖維傳遞回皮膚，由此使與早期感染相同的皮膚區(qū)上長(zhǎng)出水皰。有時(shí)病毒甚至可以在沒有明顯水皰出現(xiàn)時(shí)存在于皮膚或粘膜上。將單純皰疹病毒(HSV)分類成兩種類型=HSV-I和HSV-2。已經(jīng)對(duì)人HSV-I和HSV-2的完整基因組進(jìn)行了測(cè)序(例如，分別參見NCBI登記號(hào)X14112和Z86099)。已經(jīng)證實(shí)HSV造成或?qū)е赂鞣N疾病，包括失明和腦炎。除導(dǎo)致局部發(fā)作外，HSV-I和HSV-2還與腦炎相關(guān)。這種腦炎的病理生理學(xué)在人中難以理解。動(dòng)物模型提示該病毒通過(guò)外周神經(jīng)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并使大腦產(chǎn)生炎癥。HSV-I是成年人腦炎的更為常見的原因。HSV-2是新生兒腦炎的更為常見的原因，它與母體生殖器感染有關(guān)。HSV-2是社會(huì)中最常見的性傳播疾病之一。與HSV相關(guān)的腦炎在所有類型的腦炎中具有最高致死率，為100萬(wàn)分之1-4的年發(fā)病率。HSV腦炎影響所有年齡的人且可以在全年的任意時(shí)間出現(xiàn)。在成年人中，認(rèn)為與HSV相關(guān)的腦炎因潛伏病毒再活化所致。癥狀可以包括發(fā)熱、頭痛、癲癇發(fā)作、意識(shí)水平改變和人格改變。這些癥狀與其它疾病的相似性使得臨床診斷變得困難。如果不進(jìn)行治療，那么單純性皰疹腦炎(HSE)的死亡率可以高達(dá)70%，與之相比，接受治療的人中的死亡率低至19%。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在接受治療的患者中，約38%最終可以恢復(fù)正常功能。因此，能夠在早期診斷HSV感染是極為重要的。通常對(duì)合適的臨床樣本使用細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行HSV感染的診斷。然而，在有宿主免疫反應(yīng)和再活化發(fā)作存在下，分離細(xì)胞培養(yǎng)物中的HSV的能力在舊損害中降低。血清學(xué)診斷，特別是在腦脊髓液(CSP)中HSV的診斷不夠靈敏或具有特異性且需要花費(fèi)很多時(shí)間做出決定，包括選擇早期的腦炎治療干預(yù)手段。難以使用細(xì)胞培養(yǎng)物在腦脊髓液中檢測(cè)到HSV，其中僅4%的病例培養(yǎng)物呈陽(yáng)性。血清學(xué)方法也因在開始感染后出現(xiàn)2-3周抗體反應(yīng)延遲而不足以診斷HSE。包括腦活檢在內(nèi)的診斷的"金標(biāo)準(zhǔn)"法是侵害性的且因具有長(zhǎng)期發(fā)病的顯著風(fēng)險(xiǎn)而存在爭(zhēng)議。可選技術(shù)，諸如計(jì)算機(jī)輔助斷層攝影術(shù)和磁共振影像學(xué)不具有特異性且缺乏作為診斷工具的靈敏性。目前，用于檢測(cè)HSV的免疫學(xué)方法并不可靠且難以進(jìn)行。分子檢測(cè)方法比可能使用常規(guī)方式提供了增強(qiáng)的靈敏性和快速產(chǎn)生結(jié)果的可能性。存在必須快速、靈敏和特異性診斷HSV疾病的情況。因此，存在研發(fā)有助于診斷HSV的快速和靈敏工具的臨床需求。還存在對(duì)對(duì)HSV感染分型的工具的需求?？焖勹b定病毒感染中所涉及的特異性病原體提供了可以用于在短期內(nèi)確定合適療法的信息。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于測(cè)定哺乳動(dòng)物中存在單純皰疹病毒(HSV)，特別是1型(HSV-I)或2型(HSV-2)單純皰疹病毒的方法和組合。該方法包括使用擴(kuò)增和檢測(cè)單純皰疹病毒靶序列的引物。一個(gè)實(shí)施方案使用鏈置換擴(kuò)增(SDA)的擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明的核酸引物可以獨(dú)特地?cái)U(kuò)增HSV-I或HSV-2中的靶序列，由此能夠?qū)SV進(jìn)行靈敏性檢測(cè)和類型鑒定。本發(fā)明還涉及基于鏈置換擴(kuò)增(SDA)的用于檢測(cè)HSV的方法，該方法包括使用通用熒光能量傳遞探針進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明的探針和引物提供了對(duì)HSV核酸的直接、快速和靈敏性檢測(cè)且由此為免疫學(xué)測(cè)定提供了有吸引力的選擇。本發(fā)明的探針和引物可以在樣品培養(yǎng)后用作證實(shí)培養(yǎng)的生物體的特性的工具。另一方面，可以在培養(yǎng)前使用它們或?qū)⑺鼈冇糜诖媾囵B(yǎng)物使用公知的擴(kuò)增方法檢測(cè)和鑒定HSV核酸。本發(fā)明的探針、引物和組合物以及使用所述探針、引物和組合物的測(cè)定方法為在HSV-I和HSV-2的核酸靶序列之間快速識(shí)別提供了工具，從而使專業(yè)人員能夠鑒定、診斷和治療HSV類型，而不需要借助于一般所依賴的耗時(shí)的免疫學(xué)和生物化學(xué)方法。本發(fā)明的各種目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征易于在結(jié)合附圖閱讀時(shí)從下列詳細(xì)描述中得到理解，其中；圖1表示1型單純皰疹病毒(HSV-I)的糖蛋白G(US4)基因的共有序列(SEQIDNO:1)。圖2是表示HSV-I靶區(qū)(SEQIDNO2)基因組序列的一部分和用于對(duì)HSV-1DNA的特異性檢測(cè)的引物、緩沖物和連接物的位置的圖。圖3是表示結(jié)果的〃MOTA〃表達(dá)的示意圖。圖4是表示用于BDProbeTeCTMET系統(tǒng)的〃PAT"算法的示意圖。圖5描繪了SDA法對(duì)各種HSV-I株稀釋液的分析靈敏度。圖6是2型單純皰疹病毒(HSV-2)的糖蛋白G(US4)基因片段的共有序列(SEQIDNO3)。圖7是表示HSV-2靶區(qū)(SEQIDNO4)的基因組序列和用于對(duì)HSV-2DNA的特異性檢測(cè)的引物、緩沖物和連接物的位置的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了分離和純化的核酸、多核苷酸、擴(kuò)增引物和在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中表現(xiàn)出單純皰疹病毒(HSV)類型特異性的測(cè)定探針。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的探針和引物檢測(cè)和鑒定HSV核酸的方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及檢測(cè)靶核酸序列存在的擴(kuò)增方法，其中使用含有靶結(jié)合序列的一種或多種擴(kuò)增引物、產(chǎn)生擴(kuò)增的靶序列和檢測(cè)該靶序列。擴(kuò)增方法的非限制性實(shí)例包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；參見Saiki等1985《科學(xué)》(Science)230=1350-1354,引入本文作為參考)；連接酶鏈反應(yīng)(LCR；參見Wu等1989《基因組》(Genomics)4560-569；Barringer等1990《基因》(Gene)89117~122；Barany，1991《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88189-193，將所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考)；原位雜交；轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA；參見Kwoh等1989《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)861173-1177，引入本文作為參考)；自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR;參見Guatelli等1990《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:1874_1878，引入本文作為參考)；滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)；Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)(Lizardi等1988《生物技術(shù)》(BioTechnology)6:1197_1202，引入本文作為參考)和鏈置換擴(kuò)增(SDA；參見Walker等1992《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:392_396；Walker等1992《核酸研究》(Nuc.Acids.Res.)201691-1696；和EPO497272，將所有這些文獻(xiàn)引入本文作為參考))，包括耐熱SDA(tSDA)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)使HSV靶序列以指數(shù)式擴(kuò)增檢測(cè)樣品中存在的HSV核酸序列的等溫鏈置換擴(kuò)增(SDA)法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如美國(guó)專利US5,648，211中所述在約52"C下，使用如US5,919，630、US5,928，869、US5,958，700和US6,261，785所述為在擴(kuò)增過(guò)程中檢測(cè)靶物而選擇的檢測(cè)引物進(jìn)行SDA，將所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考。作為用于SDA的典型，將試劑、引物、諸如限制酶和聚合酶這類酶和其它成分加入到反應(yīng)微孔、容器或貯器中。SDA擴(kuò)增來(lái)自樣品的特異性DNA序列，其中一旦所有成分彼此混合，則反應(yīng)持續(xù)至關(guān)鍵成分耗盡。與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相反，SDA是一種等溫反應(yīng)過(guò)程，使得一旦反應(yīng)開始，則在反應(yīng)進(jìn)程中沒有外部控制。本發(fā)明的SDA法需要至少兩種HSV擴(kuò)增引物和兩種緩沖引物以啟動(dòng)擴(kuò)增法。將所述的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)成對(duì)HSV-I或HSV-2具有高度特異性。SDA法包括在混合物中同時(shí)進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)且不需要用于循環(huán)變溫的作為PCR擴(kuò)增法中必不可少的單獨(dú)的期或循環(huán)。本發(fā)明SDA的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于指數(shù)式擴(kuò)增。DNA聚合酶延伸、產(chǎn)生切口、置換和切口位點(diǎn)再生的步驟產(chǎn)生了取代的單鏈分子，這些分子在末端上帶有循環(huán)且被擴(kuò)增引物俘獲的部分限制酶位點(diǎn)(例如BsoBI位點(diǎn))，由此使HSV靶序列以指數(shù)方式擴(kuò)增。SDA法還提供了改善的工作流程，尤其用于高流通量法。可以將SDA引入基于微陣列的應(yīng)用，其中可以將小量體積(納升)的樣品和試劑用于擴(kuò)增HSV靶DNA并通過(guò)在單一平臺(tái)上進(jìn)行多次SDA測(cè)定檢測(cè)微嵌片陣列上的擴(kuò)增產(chǎn)物。用于檢測(cè)樣品中的HSV的SDA法的主要優(yōu)點(diǎn)在于最低的勞動(dòng)需求量和高流通量的可能性，因?yàn)榈葴財(cái)U(kuò)增法在所述平臺(tái)設(shè)計(jì)和維護(hù)方面提供了顯著少的技術(shù)挑戰(zhàn)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶物”或“靶序列”指的是有待擴(kuò)增和檢測(cè)的HSV核酸序列、HSV-I或HSV-2。它們包括有待擴(kuò)增的原始HSV核酸序列、有待擴(kuò)增的原始HSV核酸序列的互補(bǔ)第二條鏈和通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的原始HSV序列的拷貝鏈。這些拷貝用作可擴(kuò)增靶物，因?yàn)樗鼈兒袛U(kuò)增引物退火至的序列拷貝。擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的靶序列拷貝被稱作擴(kuò)增產(chǎn)物、擴(kuò)增引物或擴(kuò)增子。HSV-I和HSV-2靶序列位于HSV-I和HSV-2基因組序列的糖蛋白G(US4)基因內(nèi)。HSV-I靶序列位于附圖1的共有序列的555位-680位堿基之間。HSV-2靶序列位于附圖6的共有序列的867位-990位堿基之間。糖蛋白G(US4)基因分別位于附圖2和7的HSV-I基因組序列的136744-137460位之間和HSV-2基因組序列的137878-139977位之間。本文所用的“擴(kuò)增引物”是退火至靶序列且可以通過(guò)擴(kuò)增延伸的引物。結(jié)合靶序列的擴(kuò)增引物區(qū)為靶結(jié)合序列。擴(kuò)增技術(shù)包括，但不限于鏈置換擴(kuò)增(SDA)，包括耐熱SDA(tSDA)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；連接酶鏈反應(yīng)(LCR)；原位雜交；自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)；滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)；和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增引物可以用于鏈置換擴(kuò)增(SDA)法。擴(kuò)增引物包括3'末端上結(jié)合HSV靶序列的靶結(jié)合序列部分和5'末端上不結(jié)合或退火至靶序列的部分。不結(jié)合靶序列的SDA擴(kuò)增引物的部分還如美國(guó)專利US5，455，166和US5，270，184中所述包括尾和靶結(jié)合序列上游的限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，將所述文獻(xiàn)引入本文作為參考。當(dāng)該識(shí)別位點(diǎn)如Walker等(1992《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:392_396和1992《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)201691-1696)中所述被半修飾時(shí)，這一識(shí)別位點(diǎn)對(duì)使DNA雙鏈體的一條鏈產(chǎn)生切口的限制酶具有特異性。所述的尾是限制酶識(shí)別位點(diǎn)序列的上游且在擴(kuò)增引物剩余部分在SDA過(guò)程中產(chǎn)生切口并被取代時(shí)起聚合酶再引發(fā)位點(diǎn)的作用。尾的再引發(fā)功能維持SDA反應(yīng)并從單一靶分子合成多擴(kuò)增子。尾的長(zhǎng)度和序列一般并不關(guān)鍵且可以常規(guī)地選擇和修飾。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案基于給擴(kuò)增引物賦予靶特異性的靶結(jié)合序列，其中應(yīng)理解本發(fā)明中舉例說(shuō)明的靶結(jié)合序列還可以在各種其它方式中用于檢測(cè)HSV。例如，本文公開的靶結(jié)合序列可選地在不進(jìn)行預(yù)先擴(kuò)增或在擴(kuò)增后測(cè)定中用作直接檢測(cè)HSV的雜交探針。這類雜交方法是本領(lǐng)域中眾所周知的且一般使用與靶結(jié)合序列結(jié)合或連接的可檢測(cè)標(biāo)記以便有利于檢測(cè)雜交。此外，表1和2中列出了含有通過(guò)大寫和加下劃線表示的靶結(jié)合序列的引物序列(分別為SEQIDNOs:5-25和36-47)。這些靶結(jié)合序列可以用作不需要其它特異性序列的擴(kuò)增反應(yīng)(諸如PCR)中的引物或附加到用于NASBA、原位雜交、TMA、3SR、需要與引物的靶結(jié)合序列連接的RNA聚合酶啟動(dòng)子的其它基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增引物合適的特異性序列上；或這些靶結(jié)合序列可以用作任意其它引物延伸擴(kuò)增反應(yīng)中的引物。這些在引物中需要特異性非靶結(jié)合序列的擴(kuò)增方法對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)而言是必不可少的且一般用于給靶物附加特異性序列。例如，限制酶識(shí)別位點(diǎn)對(duì)SDA中發(fā)生指數(shù)式擴(kuò)增而言是必不可少的(參見美國(guó)專利US5,455，166和US5,270，184)。相反，用于自主序列復(fù)制(3SR)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)的擴(kuò)增引物包括接近5'末端的RNA聚合酶啟動(dòng)子(如Guatelli等，1990，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)871874-1878中所述的3SR測(cè)定)。該啟動(dòng)子附加在靶結(jié)合序列上且通過(guò)指導(dǎo)模板的多RNA拷貝的轉(zhuǎn)錄用于驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。用于選擇的擴(kuò)增反應(yīng)的這類特異性序列與靶結(jié)合序列的連接是常規(guī)的且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知。相反，諸如PCR這類在靶物末端上不需要特異性序列的擴(kuò)增法一般使用僅由靶結(jié)合序列組成的擴(kuò)增引物。為了在這些其它擴(kuò)增方法中的檢測(cè)目的，可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的以檢測(cè)方式標(biāo)記引物。因?yàn)楹怂岵恍枰耆幕パa(bǔ)性以便退火，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以在某種程度上修飾本文公開的探針和引物序列，而不會(huì)喪失作為HSV-I-和HSV-2-特異性引物和探針的用途。術(shù)語(yǔ)“同源性”指的是互補(bǔ)性程度。可以存在部分同源性或完全同源性，其中完全同源性等同于同一性。至少部分抑制相同序列與靶核酸雜交的部分互補(bǔ)序列被稱作“基本上同源的”?？梢允褂秒s交試驗(yàn)(例如DNA印跡或RNA印跡、溶液雜交等)在低嚴(yán)格條件下檢驗(yàn)對(duì)完全互補(bǔ)序列與靶序列雜交的抑制?；旧贤吹男蛄谢蛱结樃?jìng)爭(zhēng)和抑制完全同源序列或探針在低嚴(yán)格條件下與靶序列結(jié)合(即，雜交)。盡管如此，低嚴(yán)格條件還是不允許非特異性結(jié)合；低嚴(yán)格條件要求兩種序列彼此的結(jié)合為特異性(即，選擇性)相互作用。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，可以改變退火的嚴(yán)格性以便鑒定或檢測(cè)相同或相關(guān)的多核苷酸序列。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步意識(shí)到的，可以根據(jù)本領(lǐng)域中公知的公式估計(jì)解鏈溫度Tm，這取決于許多參數(shù)，諸如核苷酸編號(hào)中的引物或探針長(zhǎng)度或退火緩沖液組分和條件(例如，參見τ.Maniatis等《分子克降實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloningALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,1982和J.Sambrook等《分子克降實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY,1989《最新分子牛物學(xué)方案》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),Eds.F.M.Ausubel等第1HA的制備與分析”(〃PreparationandAnalysisofDNA"),JohnWiley和Sons，Inc.，1994-1995，增刊26，29，35和42；2.10.7-2.10.16頁(yè)；G.M.Wahl和S.L.Berger(1987《酶學(xué)方法》(MethodsEnzymo1.)152:399_407)；和A.R.Kimmel,1987《酶學(xué)方法》(MethodsofEnzymo1.)152:507_511)。作為一般性指導(dǎo)，序列同源性每減少1%，則Tm降低大約I0C-1.5°C。溫度范圍可以在約50°C-62°C之間改變，但可以將擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)為在52°C下最佳。然而，低于50°C的溫度可以導(dǎo)致引物缺乏特異性，而溫度高于62°C則可能無(wú)法產(chǎn)生雜交。在設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物時(shí)，進(jìn)一步考慮的是鳥嘌呤和胞嘧啶含量。一般來(lái)說(shuō)，引物的GC含量可以約為60-70%，還可以低于該范圍且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)調(diào)整。靶結(jié)合序列的雜交區(qū)可以具有約42°C-48°C的Tm。可以通過(guò)改變退火條件以提高或降低嚴(yán)格性(即，調(diào)整退火溫度或緩沖液的鹽含量)獲得退火互補(bǔ)和部分互補(bǔ)的核酸序列。對(duì)公開序列的這類次要的修飾和維持HSV-I和HSV-2特異性的退火條件的任何必要調(diào)整僅需要進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)且屬于本領(lǐng)域普通技能的范圍。表1和2中分別將設(shè)計(jì)用于檢測(cè)HSV-I和HSV-2靶序列的擴(kuò)增引物標(biāo)示為SEQIDN0s:7-18和38-43。設(shè)計(jì)這些擴(kuò)增引物，使得靶結(jié)合序列退火至高度同源共有糖蛋白G(US4)基因區(qū)的片段(參見圖1-2和6-7)。給退火至HSV靶DNA序列或與之互補(bǔ)的擴(kuò)增引物內(nèi)的HSV靶結(jié)合序列區(qū)加下劃線并以大寫字母表示(參見表1和2)。SDA檢測(cè)引物序列的剩余5'部分包括進(jìn)行SDA反應(yīng)所需的BsoBI限制酶識(shí)別位點(diǎn)(RERS)(如以小寫字母斜體字表示)以及一般非靶特異性5'尾端序列。SEQIDNOs:7_8和38的HSV-1和HSV-2擴(kuò)增引物分別為左手(“第一種”)Sl擴(kuò)增引物且SEQIDNOs:9-18和39-43分別為右手(“第二種”)S2擴(kuò)增引物。為了擴(kuò)增目的，可以單獨(dú)(即，一個(gè)HSV-I左擴(kuò)增引物和一個(gè)HSV-I右擴(kuò)增引物)或以組合方式(即，一個(gè)HSV-ISDA左引物和兩個(gè)HSV-ISDA右引物)使用HSV特異性類型的擴(kuò)增引物對(duì)，使得在反應(yīng)中至少存在一個(gè)左手與右手引物對(duì)?？梢詫⒍鄠€(gè)擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增靶序列的幾個(gè)區(qū)?？梢赃m當(dāng)調(diào)整引物的濃度，使得當(dāng)將HSV-I第一種擴(kuò)增引物以500nM的濃度用作唯一的第一種擴(kuò)增引物時(shí)，可以以結(jié)合方式使用兩個(gè)HSV-I右擴(kuò)增引物，它們各自具有的濃度為250nM。術(shù)語(yǔ)“延伸產(chǎn)物”一般指的是通過(guò)使用酶，諸如聚合酶使引物或靶序列延伸產(chǎn)生的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)聚合酶，使用HSV靶序列作為模板使擴(kuò)增引物雜交并使擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)生擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物?！熬彌_引物”或“外部引物”是退火至擴(kuò)增引物上游的靶序列的引物，使得緩沖引物的延伸取代了下游擴(kuò)增引物及其延伸產(chǎn)物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“緩沖引物”指的是包括HSV靶結(jié)合序列的多核苷酸。表1和2中分別將有用的緩沖引物標(biāo)示為SEQIDN0s:23-25和46-47。左或第一種HSV-I和HSV-2緩沖引物分別為SEQIDNOs:23和46，而右或第二種HSV-I和HSV-2緩沖引物分別為SEQIDNOs:24_25和47。緩沖引物來(lái)源于位于擴(kuò)增引物側(cè)翼的序列的保守區(qū)，所述的擴(kuò)增引物位于充分接近該擴(kuò)增引物靶結(jié)合位點(diǎn)的擴(kuò)增引物上游位置，以便在緩沖引物延伸后取代擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物。例如，SEQIDN0:23(HSV1GGLB1.0)的HSV-I第一種緩沖引物的5'末端位于HSV-I基因組序列的137，256位堿基上(圖2)。SEQIDNO:25(HSV1GGRB1.1)的HSV-I第二種緩沖引物的5'末端位于HSV-I基因組序列的137，382位堿基上(圖2)。在SDA的初始循環(huán)過(guò)程中，緩沖引物與HSV靶序列雜交并通過(guò)聚合酶延伸取代下游擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物，從而產(chǎn)生單鏈DNA，它可以進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)制和/或指數(shù)式擴(kuò)增循環(huán)。術(shù)語(yǔ)“測(cè)定探針”指的是用于有利于檢測(cè)或鑒定核酸的任意核酸。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定探針用于檢測(cè)或鑒定HSV核酸。如下所述的檢測(cè)探針、檢測(cè)引物、俘獲探針和引物為測(cè)定探針的實(shí)例。特別地，標(biāo)記(labeled)或標(biāo)記(tagged)用于檢測(cè)和鑒定特異性HSV-類型的“檢測(cè)探針”。檢測(cè)探針的可檢測(cè)標(biāo)記為可以直接或間接檢測(cè)的部分，表明存在靶核酸序列。為了直接檢測(cè)，可以用放射性同位素標(biāo)記測(cè)定或檢測(cè)探針并通過(guò)放射自顯影術(shù)檢測(cè)或用熒光部分標(biāo)記且通過(guò)如本領(lǐng)域中公知的熒光檢測(cè)。另一方面，可以通過(guò)用能夠進(jìn)行檢測(cè)的其它試劑標(biāo)記間接檢測(cè)測(cè)定探針。間接可檢測(cè)標(biāo)記包括例如化學(xué)發(fā)光劑；產(chǎn)生可見或顯色反應(yīng)產(chǎn)物的酶；和配體-可檢測(cè)標(biāo)記的配體結(jié)合配偶體，其中可以通過(guò)與標(biāo)記的配體特異性結(jié)合配偶體結(jié)合來(lái)檢測(cè)配體(例如半抗原、抗體或抗原)。為了檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，可以如本領(lǐng)域公知的方式標(biāo)記包括本文公開的靶結(jié)合序列的擴(kuò)增引物，或可以將包括公開的靶結(jié)合序列的標(biāo)記的檢測(cè)引物與如美國(guó)專利US5,547,86UUS5,928,869,US5,593,867,US5,550,025,US5,935,79UUS5,888,739,US5，846，726中所述的擴(kuò)增引物聯(lián)合使用，以便對(duì)擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)均勻檢測(cè)。這類檢測(cè)引物可以包括直接或間接可檢測(cè)序列，該序列開始不會(huì)與靶物雜交，而一旦與靶物雜交且得到延伸，則有利于檢測(cè)引物的檢測(cè)。例如，這類可檢測(cè)序列可以為含有限制位點(diǎn)的序列或形成促使熒光團(tuán)與猝滅劑部分彼此極接近的二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，諸如，但不限于發(fā)夾和g_四集體序列或如本領(lǐng)域中公知的通過(guò)使其補(bǔ)體與標(biāo)記的寡核苷酸(有時(shí)被稱作報(bào)道探針)雜交而檢測(cè)的直鏈序列。另一方面，可以實(shí)時(shí)或在擴(kuò)增后通過(guò)使用嵌入染料或在擴(kuò)增后通過(guò)使選自本文公開的任意靶結(jié)合序列的探針雜交來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，其中上述的任意靶結(jié)合序列屬于選擇的一組擴(kuò)增引物。末端和內(nèi)部標(biāo)記法是本領(lǐng)域中公知的且可以用于連接檢測(cè)引物中相應(yīng)位點(diǎn)上的供體和受體染料。5'-末端標(biāo)記法的實(shí)例包括a)5'-5'偶聯(lián)核苷酸的高碘酸鹽氧化作用，隨后與含有胺的標(biāo)記反應(yīng)；b)乙二胺與5'-磷酸化多核苷酸縮合，隨后與胺反應(yīng)性標(biāo)記反應(yīng)；和c)在固相DNA合成中使用亞磷酸氨基己酯試劑引入脂族胺取代基，隨后與胺反應(yīng)性標(biāo)記反應(yīng)。還可以使用含特定的脂族胺的核苷酸亞磷酰胺試劑在特異性位置上將標(biāo)記與合成的DNA寡核苷酸連接在一起。用于使選擇的標(biāo)記與檢測(cè)引物連接并進(jìn)行連接反應(yīng)的合適方法的選擇是本領(lǐng)域中常規(guī)的。另一個(gè)實(shí)施方案使用與特異性靶序列雜交的檢測(cè)引物，從而隨檢測(cè)的靶序列的不同導(dǎo)致多檢測(cè)引物的必要性。然而，用于檢測(cè)和鑒定具特異性HSV-類型的實(shí)施方案使用通用的檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)其根據(jù)Nadeau等(1999)所述的實(shí)時(shí)SDA檢測(cè)方法進(jìn)行改變。通用的檢測(cè)系統(tǒng)允許對(duì)眾多測(cè)定使用同一對(duì)熒光檢測(cè)引物，從而提供了諸如成本、時(shí)間和技術(shù)復(fù)雜性降低這樣的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)?！靶盘?hào)”或“連接”引物含有與HSV靶序列雜交的靶結(jié)合部分和一般的且不與HSV靶序列結(jié)合的尾部分。將連接引物與檢測(cè)引物聯(lián)合用于通用檢測(cè)。檢測(cè)引物與補(bǔ)體連接引物的尾部分(即，非靶結(jié)合序列)雜交。將信號(hào)或連接引物設(shè)計(jì)成與至少部分在第一種與第二種擴(kuò)增引物之間的間插區(qū)內(nèi)的靶序列區(qū)雜交，使得所述的信號(hào)或連接引物在擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中被取代。具有SEQIDNOs19-22和44-45的HSV-I和HSV-2信號(hào)或連接引物分別如表1和2中所示。檢測(cè)探針可以為“通用檢測(cè)引物”或帶有以可檢測(cè)方式標(biāo)記的5'尾端部分和與補(bǔ)體連接引物尾序列結(jié)合的3'末端部分的“檢測(cè)引物”。一般來(lái)說(shuō)，檢測(cè)引物的3'末端不含與HSV或內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照(IAC)靶序列具有任何顯著互補(bǔ)性的序列。檢測(cè)引物還帶有5'末端上的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以同時(shí)且在與用于擴(kuò)增的SDA法相同的反應(yīng)容器中使用這種通用檢測(cè)系統(tǒng)。該通用檢測(cè)系統(tǒng)包括靶物依賴性的延伸未標(biāo)記的連接引物。連接引物包括HSV-I或HSV-2靶特異性3'序列和5'通用尾且分別以SEQIDNOs19-22和SEQIDNOs:44_45及其補(bǔ)體為典型。連接引物與Sl擴(kuò)增引物下游的擴(kuò)增HSV靶序列雜交。DNA聚合酶從連接引物和Sl擴(kuò)增引物的3'末端延伸，其中擴(kuò)增引物的延伸取代了連接引物延伸產(chǎn)物。S2擴(kuò)增引物退火至連接引物延伸產(chǎn)物。DNA聚合酶使S2擴(kuò)增引物的3'末端延伸，產(chǎn)生包括連接引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈分子，且該DNA聚合酶帶有可產(chǎn)生切口的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。產(chǎn)生切口指的是使DNA雙鏈體中的兩條鏈中僅一條的磷酸二酯鍵斷裂。相應(yīng)的限制酶使所述的雙鏈分子在限制酶識(shí)別位點(diǎn)上產(chǎn)生切口，生成包括短的產(chǎn)生切口尾的5'部分和包括帶長(zhǎng)切口的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物的3'部分。使用相應(yīng)的限制酶，諸如BsoBI酶使限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生切口并使鏈從產(chǎn)生切口的位點(diǎn)延伸取代了連接引物補(bǔ)體的單鏈拷貝。DNA聚合酶使產(chǎn)生切口尾的3'末端延伸，由此取代單鏈產(chǎn)生切口的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^(guò)SDA使Sl擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物和延伸的HSV靶序列進(jìn)一步以指數(shù)方式擴(kuò)增。然后由檢測(cè)引物俘獲取代的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物，其中檢測(cè)引物的3'末端退火至補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物的5'部分。檢測(cè)引物包括可檢測(cè)標(biāo)記且檢測(cè)靶序列。DNA聚合酶從檢測(cè)引物和補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物的3'末端延伸導(dǎo)致發(fā)夾開放(如果存在)，產(chǎn)生包括檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈檢測(cè)分子。各鏈含有可切割的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，它在被切割時(shí)使供體和猝滅劑染料分離，從而分離熒光團(tuán)和猝滅劑部分并產(chǎn)生靶特異性熒光。由于分離而使猝滅劑不再能夠抑制由熒光團(tuán)發(fā)射的熒光。完全切割雙鏈檢測(cè)引物限制酶識(shí)別位點(diǎn)通過(guò)分離熒光團(tuán)和猝滅劑而增加了熒光信號(hào)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以標(biāo)記檢測(cè)引物以便使用熒光供體部分(或熒光團(tuán))和猝滅劑部分進(jìn)行熒光檢測(cè)，其中各部分位于限制酶識(shí)別位點(diǎn)側(cè)翼。表1和2表示了具有SEQIDN0s:30-35的檢測(cè)引物序列。在通用檢測(cè)中，用于檢測(cè)靶序列的檢測(cè)引物一般與連接引物結(jié)合使用。用供體染料羅丹明(ROX)和猝滅劑染料P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)標(biāo)記的具有SEQIDNOs30-33的檢測(cè)引物用于在本發(fā)明的實(shí)施方案中的HSV靶序列檢測(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于選擇其它用于SDA的供體和猝滅劑染料對(duì)，使得猝滅劑染料足以吸收由供體染料發(fā)射的熒光。例如，易于通過(guò)在不同波長(zhǎng)處的吸收檢測(cè)和區(qū)分供體和猝滅劑染料。隨供體和猝滅劑染料的不同，猝滅劑染料可以在一種情況中起猝滅劑的作用，而在另一種情況中起供體染料的作用。在該實(shí)施方案中，SEQIDNOs:30_35的檢測(cè)引物帶有由位于該檢測(cè)引物5'末端上的限制酶識(shí)別位點(diǎn)分離的供體和猝滅劑對(duì)。此外，SEQIDNO:30的檢測(cè)引物帶有包括位于供體與猝滅劑部分之間的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列的序列，在供體與猝滅劑部分中，限制酶識(shí)別位點(diǎn)位于其中。發(fā)夾結(jié)構(gòu)使兩種染料彼此極接近，使得猝滅劑染料抑制供體染料發(fā)射的熒光。然而，SEQIDNOs:31-35的檢測(cè)引物帶有兩種染料之間的直鏈序列，它的長(zhǎng)度足夠短以便猝滅劑吸收由熒光團(tuán)發(fā)射的任何熒光。本領(lǐng)域中公知的許多供體/猝滅劑染料對(duì)可用于本發(fā)明的實(shí)施方案。它們包括，但不限于熒光素(FAM；GlenResearch；Sterling,VA)/羅丹明(R0XTM；MolecularProbes；Eugene,OR)；R0X/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYLTM;GlenResearch)；FAM/DABCYL;異硫氰酸熒光素(FITC)/異硫氰酸四甲基羅丹明酯(TRITC)；FITC/TexasRed(MolecularProbes)；FITC/N-羥基琥珀酰亞氨基1_芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊紅異硫氰酸酯(EITC)；N-羥基琥珀酰亞氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/羅丹明X；和FITC/四甲基羅丹明(TAMRA)。對(duì)具體供體/猝滅劑對(duì)的選擇并不關(guān)鍵。然而，就能量傳遞猝滅機(jī)理而言，唯一必要的是供體熒光團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)與猝滅劑的激發(fā)波長(zhǎng)重疊，即，在兩種染料之間必須有足夠的光譜重疊以便進(jìn)行有效的能量傳遞、電荷傳遞或熒光猝滅。ROX具有的EMmax=608nm且FAM具有的EMmax為520nm。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力選擇合適的供體和猝滅劑染料對(duì)。P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)是非熒光的猝滅劑染料，它可以有效地使來(lái)自相鄰熒光團(tuán)，例如FAM或5-(2'-氨乙基)氨基萘(EDANS)的熒光猝滅。某些供體/猝滅劑對(duì)以本說(shuō)明書公開的為典型；不過(guò)，其它供體/猝滅劑對(duì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見且也可以用于本發(fā)明。在本發(fā)明檢測(cè)引物中產(chǎn)生熒光猝滅的任意染料對(duì)適用于本發(fā)明的方法，而與猝滅發(fā)生的機(jī)理無(wú)關(guān)。其它猝滅劑的非限制性實(shí)例包括BlackHoleQuencher(BiosearchTechnologies,Inc.；Novato，CA)禾口IowaBlack(IntegratedDNATechnologies,Inc.；Corralville,IA)。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中測(cè)定熒光以監(jiān)測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的蓄積。熒光信號(hào)與產(chǎn)生的特異性擴(kuò)增子的量成正比。在有HSV靶核酸序列存在下，熒光增加。在沒有靶物存在下，熒光在整個(gè)反應(yīng)中持續(xù)保持低水平。熒光增加或基本改變的熒光衰減分別表明存在或不存在HSV靶序列。一般在一段時(shí)間內(nèi)測(cè)定樣品的熒光以確定樣品是否含有HSVDNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以經(jīng)過(guò)1小時(shí)的時(shí)間監(jiān)測(cè)通過(guò)60次的熒光。簡(jiǎn)單地說(shuō)，約每分鐘采集一次有關(guān)在樣品容器內(nèi)測(cè)定的熒光量、校正值(如果必要)和每欄的校準(zhǔn)值的數(shù)據(jù)?？梢允褂酶鶕?jù)圖曲線下的面積表示結(jié)果的〃Μ0ΤΑ"(非加速度量(MetricOtherThanAcceleration))法分析數(shù)據(jù)。該圖測(cè)定了通過(guò)次數(shù)(X-軸)與相對(duì)熒光單位(Y-軸)(參見圖3)。MOTA面積越大，則產(chǎn)生的熒光越多且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)越有效。另一個(gè)實(shí)施方案使用如圖4中所示的閾值后通過(guò)次數(shù)(PassesAfterThreshold)(PAT)算法且特別研發(fā)用于BDProbeTecET系統(tǒng)。與MOTA類似，PAT得分越高，表明SDA反應(yīng)越有效。當(dāng)使用PAT算法時(shí)，將熒光強(qiáng)度的背景校正的信號(hào)通過(guò)預(yù)定的閾值時(shí)的時(shí)間定為T3(“時(shí)間-閾值”)。該圖還測(cè)定了通過(guò)次數(shù)與相對(duì)熒光單位的關(guān)系。相同的Τ3閾值用于每份樣品。PAT得分等于60減去Τ3值。陰性樣品沒有達(dá)到熒光的最低閾值且由此將PAT值定為0。陽(yáng)性樣品具有的PAT值大于0，優(yōu)選在1-60，更優(yōu)選在40-55，這取決于測(cè)定和靶物水平。較低的Τ3得分和相應(yīng)較高的PAT的值與更有效的SDA相關(guān)。PAT算法僅使用最能夠再現(xiàn)的擴(kuò)增曲線的區(qū)。作為結(jié)果，PAT算法使孔或樣品之間可辨別的差異減小到最低限度且比其它檢測(cè)物之間的比較法更為精確。PAT可以通過(guò)BDProbeTecET系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行。BDProbeTecET打印輸出提供了PAT得分和可報(bào)告的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將“內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照”("IAC")引入本發(fā)明的方法以驗(yàn)證陰性結(jié)果并鑒定可能抑制的樣本或有利于樣品中生物體載荷，諸如，但不限于病毒、細(xì)菌和真菌的定量。就診斷應(yīng)用而言，同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)兩種不同的DNA序列，S卩，HSV靶序列和IAC靶序列能夠利用IAC0“IAC靶序列”或“IAC序列”與HSV靶序列相似，但SEQIDNOs26-27和SEQIDNOs:48_49的IAC靶序列與HSV-I和HSV-2靶序列相比錯(cuò)配了約5-10個(gè)堿基。這些修飾的堿基足以使IAC連接引物特異性退火?！癐AC連接引物”與信號(hào)或連接引物所起的作用類似，但I(xiàn)AC連接引物與“IAC靶序列”或“IAC序列”通過(guò)IAC靶結(jié)合序列雜交。IAC連接引物還帶有含有不與IAC靶序列雜交的一般序列的5'尾部分。而檢測(cè)引物可以與IAC連接引物補(bǔ)體的尾部分雜交。用于HSV-I和HSV-2SDA測(cè)定的IAC連接引物可以分別選自SEQIDNOs:28_29和50-51且可用于IAC靶序列的擴(kuò)增。位于IAC連接引物3'末端的IAC靶結(jié)合序列與HSV靶序列非常不同，從而使HSV-I或HSV-2連接引物不雜交或不干擾IAC靶序列的擴(kuò)增。在表1和2中，用加下劃線的小寫字母表示位于IAC連接引物3'末端上的IAC靶結(jié)合序列。IAC連接引物可用于驗(yàn)證陰性結(jié)果和監(jiān)測(cè)抑制反應(yīng)的樣本。就定量SDA而言，在IAC與天然靶序列之間競(jìng)爭(zhēng)限速試劑也可能是有用的(Nadeau等，1999《生物化學(xué)分析》(Anal.Biochem.)276177-187).本發(fā)明的檢測(cè)引物可以用于檢測(cè)HSV靶序列或IAC靶序列。然而，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)HSV-I或HSV-2靶序列的檢測(cè)引物為SEQIDNOs:30_33的那些序列。用于檢測(cè)IAC靶序列的檢測(cè)引物為選自SEQIDNOs:34_35的那些序列，其中供體和猝滅劑染料對(duì)分別為熒光素(FAM)和DABCYL且在本文中被稱作“IAC檢測(cè)引物”。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力選擇帶有標(biāo)記的合適的檢測(cè)引物，使得對(duì)IAC靶序列的鑒定不同于對(duì)HSV-I或HSV-2靶序列的鑒定。因此，可以交換用于檢測(cè)HSV靶序列和IAC靶序列的檢測(cè)引物，從而使SEQIDNOs:30-33的檢測(cè)引物可以用于檢測(cè)IAC靶序列且SEQIDNOs34-35的檢測(cè)引物可以用于檢測(cè)HSV靶序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及在高流通量過(guò)程中同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品。樣品包括，但不限于那些采集自腦脊髓液(CSF)、生殖器損害、口腔損害、粘膜損害、眼部樣本、皮膚樣本、直腸拭子、陰道拭子、陰道分泌物、尿、外周血白細(xì)胞和組織(諸如來(lái)自腦活檢)的樣品?？梢栽谄桨?、載玻片、孔、平皿、珠、顆粒、杯、束、小片和條帶中檢測(cè)樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，在96微孔平板中按照與用于BDProbeTecETCT/GC擴(kuò)增的DNA測(cè)定一致的形式實(shí)施方法。該方法在干燥的微孔中進(jìn)行，其中干燥的組合物包括所有的引物和探針，這些引物和探針對(duì)進(jìn)行用于同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品的HSV-I或HSV-2的SDA檢測(cè)而言必不可少。可以在溶液中或在固相上按照本發(fā)明方法實(shí)施檢測(cè)存在的選擇的靶序列的測(cè)定。一般在溶液中進(jìn)行實(shí)時(shí)或終點(diǎn)均勻測(cè)定，其中檢測(cè)核酸起引物的作用。還可以在溶液中進(jìn)行使用本發(fā)明檢測(cè)引物的雜交測(cè)定(例如，作為均勻?qū)崟r(shí)測(cè)定)，而且特別適合于用于靶物的實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)的固相測(cè)定。在固相測(cè)定中，可以使用本領(lǐng)域中公知的方法通過(guò)內(nèi)部或末端標(biāo)記將檢測(cè)寡核苷酸固定在固相(例如珠、膜或反應(yīng)容器)上。例如，可以將生物素標(biāo)記的檢測(cè)寡核苷酸固定在抗生物素蛋白修飾的固相上，其中它在合適的雜交條件下接觸靶物時(shí)將產(chǎn)生熒光改變。按照這種方式俘獲靶物有利于從樣品中分離靶物并能夠除去樣品中可能干擾測(cè)定信號(hào)或其它方面的物質(zhì)。將用于檢測(cè)和鑒定HSV-I靶序列的引物和探針列在表1中。給特異性HSV靶結(jié)合序列加下劃線并用大寫字母表示，而用小寫的斜體字表示限制酶內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。就IAC連接引物而言，用加下劃線的小寫字母表示IAC靶結(jié)合序列。以5'-3'方向列出所有引物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將用于檢測(cè)和鑒定HSV-2靶序列的引物和探針列在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>基于通過(guò)分析各種菌株的HSV基因的糖蛋白G(US4)序列區(qū)產(chǎn)生的共有序列設(shè)計(jì)本發(fā)明的核酸引物(參見附圖1和6;表1和2)。還顯示了用于SDA和通用檢測(cè)方法的緩沖引物、連接引物和檢測(cè)引物。設(shè)計(jì)的HSV-I引物特異性擴(kuò)增在如表4中舉例說(shuō)明的所有菌株中識(shí)別的HSV-I靶序列。設(shè)計(jì)HSV-2引物以便特異性擴(kuò)增在如表7中舉例說(shuō)明的所有菌株中識(shí)別的HSV-2靶序列。由于HSV-I與HSV-2靶序列之間的同源性約為90%，謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)所述引物以便在HSV-I與HSV-2之間進(jìn)行特異性區(qū)分。本發(fā)明還關(guān)注基本上與靶結(jié)合序列同源的序列和含有這類表1和2中所列的基本上同源的靶結(jié)合序列的引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，HSV-I靶區(qū)首先選自具有152，261個(gè)堿基長(zhǎng)度的人HSV-I菌株17的完整HSV-I基因組序列(NCBI登記號(hào)X14112)。糖蛋白“US4”基因位于136，744-137，460位堿基之間。HSV-I左緩沖引物(HSV1LBl.0)(5‘末端)位于137，256位核酸上。HSV-I右緩沖引物(HSV1RB1.1)(5'末端)位于137，382位核酸上。用于所有HSV-ISDA系統(tǒng)的引物均位于這些緩沖引物坐標(biāo)內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及具有154，746個(gè)堿基長(zhǎng)度的人把￥_2菌株HG52HSV-1的完整HSV-2基因組序列(NCBI登記號(hào)Z86099)。糖蛋白“US4”基因位于137，878-139，977位堿基之間。HSV-2左緩沖引物(HSV2LB1.0)(5'末端)位于139，773位上。HSV-2右緩沖引物(HSV2RB1.0)(5'末端)位于139896位上。用于所有HSV-2SDA系統(tǒng)的引物均位于這些緩沖引物坐標(biāo)內(nèi)。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物用于將HSV靶DNA克隆入質(zhì)粒載體。SEQIDN0s:5_6和SEQIDNOs36-37的HSV-I和HSV-2PCR擴(kuò)增引物分別與HSV基因組的高度保守的靶序列區(qū)互補(bǔ)。PCR擴(kuò)增弓I物擴(kuò)增包括HSV糖蛋白G(US4)基因的DNA片段的HSV靶序列區(qū)。將含有HSV靶區(qū)的單純皰疹病毒(HSV)基因組的擴(kuò)增片段定向克隆入含有便利限制酶位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。盡管可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的將HSV片段克隆入任意質(zhì)粒載體，但是在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用對(duì)選擇的HSV靶區(qū)具有特異性的PCR擴(kuò)增引物將擴(kuò)增的HSV-I和HSV-2片段分別克隆入大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC19(Genbank/EMBL登記號(hào)L09137)和pUC18(Genbank/EMBL登記號(hào)L09136)。HSV片段被稱作HSV靶貯備物?？梢允褂肞〖coGreen雙鏈DNA定量測(cè)定(MolecularProbes,Inc.)對(duì)靶HSVDNA進(jìn)行定量。在用于擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，表1和2中所列引物名稱中存在的“L”或“R”分別表示“左”或“右”引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PCR擴(kuò)增引物SEQIDNOs:5_6和36_37最初分別擴(kuò)增HSV-I和HSV-2基因的糖蛋白G基因的152和254個(gè)堿基對(duì)片段。各自分別設(shè)計(jì)帶有EcoRI限制酶位點(diǎn)的SEQIDNOs5和36的HSV-I和HSV-2左PCR引物。SEQIDNOs6和37的HSV-I和HSV-2右PCR引物各自分別帶有BamHI限制酶位點(diǎn)。然后將該片段定位克隆入PUC質(zhì)粒載體。典型的質(zhì)粒載體分別為帶有限制酶位點(diǎn)EcoRI和BamHI的HSV-I和HSV-2的pUC19和pUC18。在通過(guò)限制酶消化進(jìn)行純化和線性化后，使用HSV擴(kuò)增引物和緩沖引物以指數(shù)方式擴(kuò)增HSV靶片段。本發(fā)明的靶結(jié)合序列和引物可用于核酸擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物特別可用于鏈置換擴(kuò)增(SDA)。這是一種等溫核酸擴(kuò)增法，其中引物的延伸、半修飾的限制酶識(shí)別/切割位點(diǎn)的產(chǎn)生切口、單鏈延伸產(chǎn)物的取代、引物退火至延伸產(chǎn)物(或原始靶序列)和隨后的引物延伸在反應(yīng)混合物中同時(shí)發(fā)生。此外，SDA使得靶序列復(fù)制在15分鐘以內(nèi)超過(guò)了1010倍。而在PCR中，反應(yīng)步驟在單獨(dú)期或循環(huán)中出現(xiàn)作為反應(yīng)中循環(huán)變溫的結(jié)果。主要如本文和Walker等(1992，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.SciUSA.)USA89392-396和1992，《核酸研究》(Nuc1.AcidsRes.)20:1691_1696)所述的常規(guī)SDA法進(jìn)行耐熱鏈置換擴(kuò)增(tSDA)，其中取代了熱穩(wěn)定性聚合酶和熱穩(wěn)定性限制酶?？梢詫囟日{(diào)節(jié)至適合于取代的酶的較高溫度。檢測(cè)HSV擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增的靶序列的可選方法可以通過(guò)用聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特征大小來(lái)進(jìn)行，其中用溴化乙錠染色瓊脂糖。還可以通過(guò)定量雜交或分子生物學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的用于核酸檢測(cè)的等同技術(shù)(Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpring,NY(1989))檢測(cè)使用HSV-I或HSV-2擴(kuò)增引物產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物。表1和2中所列引物可用于檢測(cè)和鑒定樣品中的HSV-I和HSV-2。本文所用的Sl和S2擴(kuò)增引物分別代表了第一種和第二種擴(kuò)增引物，而Bl和B2緩沖引物分別代表了第一種和第二種緩沖引物。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在SDA法中，Sl擴(kuò)增引物與單鏈HSV靶序列雜交。恰在Sl擴(kuò)增引物的上游或5'，第一種緩沖引物Bl與單鏈HSV靶序列雜交。DNA聚合酶使Bl緩沖引物和Sl擴(kuò)增引物的3'末端延伸，其中Bl緩沖引物的延伸最終取代了SlSDA延伸產(chǎn)物。SlSDA延伸產(chǎn)物被S2擴(kuò)增引物和在S2擴(kuò)增引物上游退火的B2緩沖引物俘獲。DNA聚合酶使S2SDA和B2緩沖引物的3'末端延伸，其中B2緩沖引物的延伸取代了下游S2SDA延伸產(chǎn)物。Sl擴(kuò)增引物退火至取代的S2擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物且DNA聚合酶使雜交的Sl擴(kuò)增引物的3'末端延伸，產(chǎn)生帶有S2擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體鏈的雙鏈分子。各鏈在任一端上帶有可產(chǎn)生切口的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。在添加相應(yīng)的限制酶時(shí)，使含有硫醇化胞嘧啶的修飾的DNA鏈產(chǎn)生切口，形成短的帶切口尾和切口位點(diǎn)的長(zhǎng)延伸產(chǎn)物3'。DNA聚合酶使短的帶切口尾從該短的帶切口尾的3'末端以5'-3'方向延伸，從而取代單鏈長(zhǎng)延伸產(chǎn)物。簡(jiǎn)單地說(shuō)，S2擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物的帶切口的尾及其補(bǔ)體的帶切口的尾分別取代單鏈帶切口的S2擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物和單鏈帶切口的補(bǔ)體S2擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，BsoBI酶用于使分別帶有SEQIDNOs:52_53和54-55序列的各鏈產(chǎn)生切口并切割或切斷它們。將如下所示的切口位點(diǎn)引入擴(kuò)增引物序列且需要半-硫代磷酸化識(shí)別序列(dCsTP，硫醇化胞嘧啶)。盡管具有切口位點(diǎn)，SEQIDNO53甚至在有dCsTP存在下也易于進(jìn)行雙鏈切割且并非設(shè)計(jì)可產(chǎn)生切口的擴(kuò)增引物中的優(yōu)選序列。切口位點(diǎn)5'-CTCGGG-3‘(SEQIDNO:52)和5‘-CCCGGG-3‘(SEQIDNO53)切斷位點(diǎn)5'-CTCGAG-3‘(SEQIDNO:54)和5‘-CCCGAG-3‘(SEQIDNO55)在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)探針可用于檢測(cè)HSV靶序列。可以使用對(duì)HSV靶序列具有特異性的Sl擴(kuò)增引物和檢測(cè)引物，其中所述的檢測(cè)引物帶有HSV靶結(jié)合序列。DNA聚合酶從Sl引物和檢測(cè)引物的3'末端延伸。Sl引物的延伸取代下游檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物進(jìn)入溶液，它在其中被俘獲并與互補(bǔ)S2擴(kuò)增引物雜交。DNA聚合酶使S2擴(kuò)增引物的3'末端延伸并打開檢測(cè)引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成雙鏈限制酶位點(diǎn)并使兩種染料(熒光團(tuán)和猝滅劑對(duì))分離至使猝滅劑失去猝滅能力并產(chǎn)生熒光的距離。通過(guò)切割限制酶識(shí)別位點(diǎn)并進(jìn)一步分離熒光團(tuán)和猝滅劑產(chǎn)生附加熒光?？捎糜赟DA法的酶為在半-硫代磷酸硫代化識(shí)別序列內(nèi)產(chǎn)生單鏈切口的那些酶，其中引入硫代磷酸化核苷酸不會(huì)防止產(chǎn)生切口和修復(fù)的進(jìn)一步循環(huán)。具有這些特征的酶的非限制性實(shí)例包括HincII、BsoBI,Aval、NciI和Fnu4HI。有用的DNA聚合酶為這類聚合酶，它們?cè)趩捂溓锌谖稽c(diǎn)上啟動(dòng)DNA合成、將硫代磷酸化核苷酸引入延伸的核酸鏈并取代沒有5'-3'外切核酸酶活性的鏈。切割指的是打斷雙鏈或單鏈DNA的磷酸二酯鍵。表現(xiàn)出這些特征的DNA聚合酶的非限制性實(shí)例包括外切核酸酶缺損克列諾片段和Bst聚合酶和Bca聚合酶的外切核酸酶缺損片段。盡管其它DNA聚合酶和限制酶適合于SDA(Walker等《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.SciUSA)，第89卷，392-396頁(yè)，1992年1月，AppliedBiologicalSciences)，但是因它們的熱特性和彼此的相容性而選擇exo-Bst聚合酶和BsoBI。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用BsoBI限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)并以斜體字標(biāo)明(參見，表1和2)。顯而易見的是，可以單獨(dú)使用HSV靶結(jié)合序列以擴(kuò)增不需要特異性序列或結(jié)構(gòu)的反應(yīng)(例如，PCR)中的HSV靶物，且非SDA的擴(kuò)增反應(yīng)所要求的其它特異性序列(例如，RNA聚合酶啟動(dòng)子)可以在系統(tǒng)中例如取代本文所述的含RERS的序列。然后在有單獨(dú)或與緩沖引物組合形式的擴(kuò)增引物、用于通用檢測(cè)的信號(hào)/連接引物和通用檢測(cè)引物存在下可以擴(kuò)增靶貯備物。為了進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，選擇包括一個(gè)“左”擴(kuò)增引物的至少一對(duì)且選擇一個(gè)“右”擴(kuò)增引物來(lái)擴(kuò)增HSV靶貯備序列的各鏈。在SDA反應(yīng)中，除左和右擴(kuò)增引物外，開始還使用一個(gè)左和右緩沖引物對(duì)。此外，為了進(jìn)行檢測(cè)，選擇信號(hào)/連接引物和檢測(cè)引物并用于檢測(cè)和鑒定HSV靶序列。特異性擴(kuò)增和檢測(cè)HSV-I或HSV-2DNA的幾種HSV系統(tǒng)包括在本發(fā)明中。例如，HSV-I系統(tǒng)可以包括下列引物HSV1GGLP1.1、HSV1GGRP5.2、HSVIGGAD2.1、HSV1GGLB1.O、HSV1GGRB1.1和TBD16(D/R)；或可以選擇HSV1GGLP1.1、HSV1GGRP5.2、HSV1GGAD3.O或HSVIGGAD3.UHSV1GGLB1.0、HSV1GGRB1.UMPC.DR.HSVlIACAD8.1或HSV1IACAD8.7、MPC2.FD。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將使用引物的各種組合的HSV-2系統(tǒng)列在表3中。關(guān)注引物的其它組合，不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力將所述引物組合以檢測(cè)樣品中的HSV-I或HSV-2。所述的引物可以選自表1和2中所列的那些且在按照統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)中測(cè)試以便鑒定樣品中的HSV-I或HSV-2。另一方面，對(duì)HSV-I或HSV-2具有特異性且基本上與表1和2中所列的那些同源的引物也可以用于檢測(cè)HSV-I或HSV-2靶序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>為了商業(yè)上的便利性，可以以試劑盒的形式包裝用于特異性檢測(cè)和鑒定核酸的擴(kuò)增引物。一般來(lái)說(shuō)，這類試劑盒含有至少一個(gè)HSV擴(kuò)增引物對(duì)。用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的試劑也可以包括在靶特異性擴(kuò)增引物中，例如，緩沖劑、其它引物、核苷酸三磷酸、酶等?？梢詫⒃噭┖械某煞止餐b在普通容器內(nèi)，其中任選包括用于實(shí)施本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案的技術(shù)說(shuō)明書。試劑盒中還可以包括其它任選的成分，例如用適合于用作測(cè)定探針的標(biāo)記標(biāo)記的引物和/或用于檢測(cè)所述標(biāo)記的試劑或用具。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包括第一種擴(kuò)增引物或SlSDA擴(kuò)增引物和第二種擴(kuò)增引物或S2SDA擴(kuò)增引物的試劑盒。該試劑盒可以進(jìn)一步包括第一種Bl緩沖引物和第二種B2緩沖引物；連接引物；檢測(cè)引物；和任選用于同時(shí)檢測(cè)內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照(IAC)靶序列，包括IAC連接引物和IAC靶序列的試劑。該試劑盒可以由對(duì)HSV-I或HSV-2具有特異性的引物組成或該試劑盒可以由定向于HSV-I和HSV-2的引物組成，其中本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解檢測(cè)和鑒定HSV-I的擴(kuò)增反應(yīng)使用了HSV-I引物且檢測(cè)和鑒定HSV-2的擴(kuò)增反應(yīng)使用了HSV-2引物。為了鑒定樣品中是否含有HSV-I或HSV-2DNA，不應(yīng)將用于HSV-I和HSV-2的引物混合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒和引物可以用于檢測(cè)和診斷臨床樣品是否含有HSV-I或HSV-2DNA?？梢允褂肧DA擴(kuò)增引物擴(kuò)增和檢測(cè)臨床樣品或可以將該臨床樣品用于進(jìn)一步包括緩沖引物、連接引物和檢測(cè)引物的SDA反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，除用于HSV-I或HSV-2的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照夕卜，還可以將IAC連接引物用作反應(yīng)的內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從閱讀本文的描述和從本領(lǐng)域中的一般方法和技術(shù)中理解如何制備和使用所述引物檢測(cè)和鑒定樣品中的HSV-I和HSV-2。此外，在一個(gè)商業(yè)化實(shí)施方案中，可以將包括本發(fā)明引物和用于SDA的試劑的組合物制成干燥或液體形式。該組合物在干燥形式下更為穩(wěn)定和易于操作?？梢詫⒏稍锏慕M合物加入或預(yù)處理至固相中，諸如微量滴定板、微陣列或其它合適的貯器，其中僅需要加入樣品和SDA緩沖液。這種方式有利于同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品并用于高流通量方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用BDProbeTecET儀。可以理解由靶結(jié)合序列和任選選擇的擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列或選擇的檢測(cè)反應(yīng)所需的序列組成的本發(fā)明核酸還可以包括用作間隔區(qū)、接頭、用于標(biāo)記或結(jié)合酶或其它應(yīng)用的序列的某些其它序列。一般已知這類其它序列對(duì)在選擇的反應(yīng)中獲得核酸的最佳功能是必不可少的。將本文引述的所有專利、專利申請(qǐng)、公開的PCT申請(qǐng)和文章、書籍、參考文獻(xiàn)、參考手冊(cè)和摘要的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考，以便更完整地描述本發(fā)明涉及的科學(xué)發(fā)展動(dòng)態(tài)。因?yàn)榭梢栽诓幻撾x本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)的情況下對(duì)上述主題做出各種改變，所以將上述描述中包含或在所附權(quán)利要求中定義的所有主題解釋為對(duì)本發(fā)明的描述和說(shuō)明。能夠根據(jù)上述教導(dǎo)對(duì)本發(fā)明做出許多修改和改變。具體實(shí)施例方式本文的實(shí)施例旨在以典型實(shí)例說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的不同方面且不以任何方式來(lái)限定本發(fā)明的范圍。這些實(shí)施例不包括對(duì)所用常規(guī)方法的詳細(xì)描述，諸如構(gòu)建載體或?qū)DNA插入這類載體的常規(guī)方法。這類方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的且描述在大量出版物中，例如J.Sambrook和D.W.Russell《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:aLaboratoryManual)M3Afe,ColdSpringHarborLaboratoryPress,USA,(2001)。實(shí)施例1HSV-I糖蛋白-G鏈置換擴(kuò)增靶區(qū)的克隆使用表1中鑒定的SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的PCR擴(kuò)增引物對(duì)來(lái)自HSV-1(菌株ATCC:VR-539)的DNA進(jìn)行PCR。設(shè)計(jì)這些引物以便擴(kuò)增HSV-I的糖蛋白G(US4)基因內(nèi)的152個(gè)堿基對(duì)片段。將PCR擴(kuò)增的DNA插入pUC19質(zhì)粒載體(GibcoBRL；Grandlsland,NY)。將該重組克隆命名為HSVIGG質(zhì)粒#1。純化質(zhì)粒#1DNA并通過(guò)用BamHI限制酶消化使其線性化。然后使用QIAquick(Qiagen，Inc.；Valencia,CA)自旋柱純化DNA并通過(guò)用熒光PiCOgreen試劑分析進(jìn)行定量。在含有IOng/μ1人DNA的水中制備用于將要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的靶HSV-IDNA稀釋液。特異性HSV-I菌株稀釋液和在每種稀釋液中的HSV-I檢測(cè)結(jié)果如圖5中所示?！?”號(hào)表示樣品中存在HSV-I；“_”號(hào)表示樣品中不存在HSV-I；且問(wèn)號(hào)表示樣品中可疑的污染物。所有菌株在110的儲(chǔ)備溶液稀釋液下呈陽(yáng)性，但不包括樣品0-2526。在11，000的儲(chǔ)備溶液稀釋液下，23種菌株中的20種呈陽(yáng)性。在1100，000的儲(chǔ)備溶液稀釋液下，23種菌株中的15種呈陽(yáng)性。實(shí)施例2克隆的HSV-IDNA的擴(kuò)增作為用于檢測(cè)HSV-IDNA的測(cè)定中的起始步驟，使用實(shí)施例1中所述的靶核酸法研發(fā)用于擴(kuò)增HSV-IDNA的SDA系統(tǒng)。使用克隆的質(zhì)粒稀釋液評(píng)價(jià)DNA擴(kuò)增測(cè)定中的分析靈敏度。在每一靶水平下進(jìn)行8次重復(fù)的SDA反應(yīng)。這8次反應(yīng)等同于每次反應(yīng)中雙鏈DNA的100、50、25、12·5、6·25和0個(gè)拷貝。如下進(jìn)行擴(kuò)增在52°C下，使用BDProbeTecET儀(BDDiagnosticSystems；Sparks,MD)與各50nM的HSV1GGLB1.0和HSV1GGRB1.0緩沖引物、IOOnM的HSV1GGLP1.0左擴(kuò)增引物、500nMHSV1GGRP1.0右擴(kuò)增引物、250nMHSVlGGAD1.0連接引物、500nMTBD10.2D/R檢測(cè)引物。將這些引物的序列列在表1中。最終緩沖液條件如下143mMN-二(羥乙基)甘氨酸；82mMKOH；25mMKiPO4；12.5%DMSO；5mM乙酸鎂；500mM2‘-脫氧胞嘧啶-5-0-(1-硫代三磷酸)(dCsTP)；各IOOnM的dATP、dGTP和dTTP；IOOng/μ1BSA；約12個(gè)單位的Bst聚合酶；和約30個(gè)單位的BsoBI限制性內(nèi)切核酸酶。監(jiān)測(cè)1小時(shí)內(nèi)通過(guò)60次的熒光。根據(jù)曲線下的面積或“Μ0ΤΑ”得分表示結(jié)果。易于通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)定陽(yáng)性MOTA得分。就本發(fā)明的目的而言，將MOTA得分大于或等于3500視為“陽(yáng)性”。測(cè)定產(chǎn)生100%陽(yáng)性結(jié)果時(shí)的HSVIGG靶DNA的最低水平為100個(gè)拷貝/反應(yīng)。在50個(gè)拷貝的靶DNA/反應(yīng)下，8次重復(fù)中有7次(87.5%)也呈陽(yáng)性。實(shí)施例3通過(guò)SDA檢測(cè)1型單純皰疹病毒粒子為了驗(yàn)證本發(fā)明引物和探針檢測(cè)HSV-I的能力，對(duì)獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)的4株HSV-1、獲自QuestDiagnostic(Baltimore，MD)的10株和來(lái)自俄亥俄州立大學(xué)(OSU)的14份未分型的HSV樣品進(jìn)行SDA。HSV的未分型株的特征在于通過(guò)PCR擴(kuò)增了DNA聚合酶基因的區(qū)。設(shè)計(jì)一組擴(kuò)增HSV-I和HSV-2中相同區(qū)的擴(kuò)增引物。兩種類型的病毒可通過(guò)在HSV-2PCR片段中存在Apal限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，而HSV-2PCR片段在由HSV-I株產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中不存在加以區(qū)分。當(dāng)與Apal限制酶一起保溫時(shí)，將HSV-2-衍生的擴(kuò)增產(chǎn)物切割成兩個(gè)較短的片段，而獲自HSV-I的那些擴(kuò)增產(chǎn)物保持完整。使用瓊脂糖凝膠電泳與合適的對(duì)照品分離限制酶切片段。用于評(píng)價(jià)SDA系統(tǒng)中存在或不存在HSV的病毒儲(chǔ)備液的濃度是未知的。按110在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋病毒儲(chǔ)備液并通過(guò)SDA測(cè)試10μL該混懸液。結(jié)果如表4中所示。使用HSV-I擴(kuò)增引物檢測(cè)所有HSV-I株，證實(shí)了所公開的引物和探針檢測(cè)來(lái)自各種不同來(lái)源的HSV-I株的能力。在通過(guò)Apal限制酶切消化分型的HSV中的預(yù)先未分型的14株中，經(jīng)測(cè)定9株為HSV-I，4株為HSV-2且1株未通過(guò)PCR擴(kuò)增(參見表4和5)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例4SDA法的分析靈敏度為了使用本發(fā)明公開的引物和探針測(cè)定HSV-I測(cè)定法的檢測(cè)極限，對(duì)克隆的靶核酸的稀釋液和病毒粒子的連續(xù)稀釋液進(jìn)行SDA反應(yīng)。通過(guò)電子顯微鏡檢查法(ElectronMicroscopyBioservices)對(duì)病毒粒子儲(chǔ)備液進(jìn)行計(jì)數(shù)。在每一靶水平下重復(fù)測(cè)試16份樣品。為了驗(yàn)證本測(cè)定法的靈敏度和特異性，在110、11，000和1100，000的生物體儲(chǔ)備溶液稀釋液下測(cè)試來(lái)自不同地域位置的23株HSV-1。來(lái)自預(yù)先未分型株的和來(lái)自QuestDiagnostics的樣品滴度是未知的。來(lái)自ATCC的兩種HSV-I儲(chǔ)備溶液的滴度近似如下:VR260,1.5xl04TCID/yL；禾口VR-539,2.OxIO5TCID/μ1。結(jié)果如圖5中所示。所有菌株在110的儲(chǔ)備混懸液稀釋液下呈陽(yáng)性，但不包括菌株#0-2526。在23株中，20株在11000儲(chǔ)備溶液稀釋液下測(cè)試呈陽(yáng)性，且15株在1100，000稀釋液下測(cè)試呈陽(yáng)性。實(shí)施例5用于HSV-IDNA的SDA特異性用HSVlGGSDA系統(tǒng)測(cè)試HSV-2中的16株。每次反應(yīng)各加入10微升HSV-2稀釋液混懸液。使用HSVlGG系統(tǒng)測(cè)試17種儲(chǔ)備溶液之一呈陽(yáng)性。結(jié)果如表5中所示。此外，使用本發(fā)明公開方法的引物和探針測(cè)試23種其它微生物。這些微生物包括臨床樣本中可能遇到的細(xì)菌、酵母和其它病毒。經(jīng)測(cè)試，這些生物體中沒有一種呈HSV-I的陽(yáng)性。結(jié)果如表6中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*臨床19通過(guò)Quest被分型為HSV-2而通過(guò)ApaI分析被分型為HSV-1。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>ATCC-美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；ABi-AdvancedBiotechnologies,Inc.實(shí)施例6HSV-2糖蛋白-GSDA靶區(qū)的克隆使用弓丨物HSV2PCRR和HSV2PCRL與69"C的退火溫度對(duì)來(lái)自HSV-2株ATCCVR-540的DNA進(jìn)行PCR。這些引物擴(kuò)增了HSV-2的糖蛋白G(US4)基因內(nèi)的254個(gè)堿基對(duì)片段。將擴(kuò)增的DNA插入pUC18質(zhì)粒載體(Invitrogen)。該重組克隆稱作pHSV2-NT#9_l。純化質(zhì)粒DNA并通過(guò)用BamHI限制酶消化使其線性化。使用QIAGENQIAquick自旋柱純化DNA并通過(guò)使用熒光PiCOgreen試劑分析進(jìn)行定量。在含有7ng/μL鮭精DNA的水中制備用于即將進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的靶DNA稀釋液。實(shí)施例7克隆的HSV-2DNA的擴(kuò)增使用克隆的質(zhì)粒稀釋液評(píng)價(jià)DNA擴(kuò)增測(cè)定法的分析靈敏度。使用2.O和5.2系統(tǒng)在各自的靶水平下進(jìn)行8次重復(fù)的SDA反應(yīng)。這8次反應(yīng)等同于每次反應(yīng)中雙鏈DNA的500、250、100、50、25、10和O個(gè)拷貝。如下進(jìn)行擴(kuò)增在52°C下，使用BDProbeTecET儀與各50nM的HSV2GGLB1.O和HSV2GGRB1.OUOOnM的HSV2GGLP1.0、500nMHSV2GGRP2.O或5.2、250nMHSV2GGAD1.0、500nMMPC.D/R。將這些引物的序列列在表2中。最終緩沖液條件如下71mMN-二(羥乙基)甘氨酸；56.6mMKOH；23.9mMKPO4；15.4%DMSO；5mM乙酸鎂；500mM2‘-脫氧胞嘧啶-5-0-(1-硫代三磷酸)(dCsTP)；各IOOnM的dATP、dGTP和dTTP；100μg/μLBSA；約3.515個(gè)單位的Bst聚合酶；和約30個(gè)單位的BsoBI限制性內(nèi)切核酸酶。監(jiān)測(cè)1小時(shí)內(nèi)通過(guò)60次的熒光。根據(jù)曲線下的面積或“Μ0ΤΑ”得分表示結(jié)果并表示為PAT得分(閾值后通過(guò)次數(shù))。就本發(fā)明的目的而言，將MOTA得分大于或等于3500和PAT得分大于O視為“陽(yáng)性”。測(cè)定產(chǎn)生100%陽(yáng)性結(jié)果時(shí)的HSV2GG靶DNA的最低水平對(duì)系統(tǒng)2.0和5.2而言為50個(gè)拷貝/反應(yīng)。對(duì)系統(tǒng)2.0而言，在25個(gè)拷貝下，8次重復(fù)中有7次呈陽(yáng)性，而對(duì)系統(tǒng)5.2而言，在25個(gè)拷貝下，8次重復(fù)中有6次呈陽(yáng)性。實(shí)施例8用SDA檢測(cè)HSV-2病毒粒子為了驗(yàn)證本發(fā)明弓丨物和探針檢測(cè)HSV-2的能力，對(duì)獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的2株HSV-2、獲自QuestDiagnostic(Baltimore,MD)的9株和來(lái)自俄亥俄州立大學(xué)(OSU)的通過(guò)ApaI分析被分型為HSV-2的5株進(jìn)行SDA。來(lái)自O(shè)SU的株的特征在于通過(guò)PCR擴(kuò)增了DNA聚合酶基因的區(qū)。設(shè)計(jì)一組擴(kuò)增HSV-I和HSV-2中相同區(qū)的PCR引物。兩種類型的病毒可通過(guò)在HSV-2PCR片段中存在ApaI限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，而HSV-2PCR片段在由HSV-I株產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中不存在加以區(qū)分。當(dāng)與ApaI限制酶一起保溫時(shí)，將HSV-2衍生的PCR產(chǎn)物切割成兩個(gè)較短的片段，而獲自HSV-I的那些PCR產(chǎn)物保持完整。使用瓊脂糖凝膠電泳與合適的對(duì)照品分離限制酶切片段。用于評(píng)價(jià)SDA系統(tǒng)的病毒儲(chǔ)備液的濃度是未知的。按110在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋病毒儲(chǔ)備液并在SDA中測(cè)試10μL該混懸液。結(jié)果如表7中所示。使用來(lái)自系統(tǒng)1.0、2.0和5.2的擴(kuò)增引物檢測(cè)所有HSV-2株，證實(shí)了所公開的引物和探針檢測(cè)來(lái)自各種不同來(lái)源的HSV-I株的能力。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>OSU=俄亥俄州立大學(xué)；ATCC=美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；Quest=QuestDiagnostics實(shí)施例9用于HSV-2DNA的SDA的特異性用HSV2GGSDA系統(tǒng)1.0、2.O和5.2測(cè)試25株HSV-1。每次反應(yīng)各加入10微升HSV-I稀釋液混懸液。使用HSV-2系統(tǒng)沒有檢測(cè)出25株中的任何一種。結(jié)果如表8中所示。此外，使用本發(fā)明公開方法的引物和探針測(cè)試了一組其它微生物。這些微生物包括臨床樣本中可能遇到的細(xì)菌、酵母和其它病毒。經(jīng)測(cè)試，這些生物體中沒有一種呈HSV-2的陽(yáng)性。結(jié)果如表9中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>OSU=俄亥俄州立大學(xué)；ATCC=美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；Quest=QuestDiagnostics<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>權(quán)利要求擴(kuò)增2型單純皰疹病毒(HSV-2)靶序列的方法，包括(a)使多核苷酸雜交，該多核苷酸包括主要由SEQIDNOs36-47中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列。2.擴(kuò)增2型單純皰疹病毒(HSV-2)靶序列的方法，包括(a)使用第一種擴(kuò)增引物擴(kuò)增HSV-2靶序列，所述的第一擴(kuò)增引物包括主要由SEQIDNO38的靶結(jié)合序列組成的序列；(b)使用第二種擴(kuò)增引物擴(kuò)增HSV-2靶序列，所述的第二擴(kuò)增引物包括主要由SEQIDNOs39-43中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列。3.擴(kuò)增2型單純皰疹病毒(HSV-2)靶序列的方法，包括(d)使用第一種擴(kuò)增引物擴(kuò)增HSV-2靶序列，所述的第一種擴(kuò)增引物包括主要由SEQIDNOs38的靶結(jié)合序列組成的序列；(e)使用第二種擴(kuò)增引物擴(kuò)增HSV-2靶序列，所述的第二種擴(kuò)增引物包括主要由SEQIDNOs39-43中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列。4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的擴(kuò)增反應(yīng)是鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)。5.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的擴(kuò)增方法選自由下列方法組成的組直接檢測(cè)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、原位雜交、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、Qi3復(fù)制酶系統(tǒng)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。6.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的第一種擴(kuò)增引物進(jìn)一步包括選自由發(fā)夾、g-四集體、限制酶識(shí)別序列和結(jié)合檢測(cè)探針的序列組成的組的序列。7.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的第一種擴(kuò)增引物進(jìn)一步包括可檢測(cè)標(biāo)記。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的標(biāo)記為熒光部分。9.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的第一種擴(kuò)增引物包括選自由限制酶識(shí)別位點(diǎn)和RNA聚合酶啟動(dòng)子組成的組的序列。10.權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括擴(kuò)增內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照(IAC)。11.權(quán)利要求10所述的方法，其中IAC選自SEQIDNOs48-49組成的組。12.擴(kuò)增2型單純皰疹病毒(HSV-2)靶序列的方法，包括(a)使一種或多種多核苷酸雜交，它們包括主要由SEQIDNOs38-43中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸進(jìn)一步包括可檢測(cè)標(biāo)記。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的可檢測(cè)標(biāo)記為熒光部分。15.多核苷酸，包括主要由SEQIDNOs:36-47中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列。16.權(quán)利要求15所述的多核苷酸，進(jìn)一步包括主要由SEQIDNOs38-43中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列。17.權(quán)利要求15所述的多核苷酸，進(jìn)一步包括選自由發(fā)夾、g-四集體、限制酶識(shí)別位點(diǎn)和結(jié)合檢測(cè)探針的序列組成的組的序列。18.權(quán)利要求16所述的多核苷酸，其中用可檢測(cè)標(biāo)記標(biāo)記該多核苷酸。19.權(quán)利要求18所述的多核苷酸，其中所述的標(biāo)記為熒光部分。20.用于檢測(cè)序列的試劑盒，包括一種或多種含有主要由SEQIDNOs:38-43中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的序列的引物。21.權(quán)利要求20所述的試劑盒，進(jìn)一步包括緩沖引物。22.權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述的緩沖引物選自由SEQIDNOs:46-47組成的組。23.權(quán)利要求20所述的試劑盒，進(jìn)一步包括連接引物。24.權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述的連接引物選自由SEQIDNOs44-45組成的組。25.權(quán)利要求20所述的試劑盒，進(jìn)一步包括檢測(cè)引物。26.權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述的檢測(cè)引物選自由SEQIDNOs30-35組成的組。27.組合物，包括一種或多種主要由SEQIDNOs:36-47中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的引物。28.權(quán)利要求27所述的組合物，包括一種或多種主要由SEQIDNOs36-43和46-47中任意一個(gè)的靶結(jié)合序列組成的引物。29.權(quán)利要求28所述的組合物，進(jìn)一步包括(g)能夠通過(guò)位于連接引物3'末端上的靶結(jié)合序列與靶序列雜交的連接引物序列，其中所述的連接引物包括5'通用尾且該連接引物選自由SEQIDN0s:19-22組成的組；和(h)能夠通過(guò)檢測(cè)引物的3'部分與連接引物5'尾的補(bǔ)體雜交的檢測(cè)引物序列，其中所述的檢測(cè)引物序列包括5'限制酶識(shí)別位點(diǎn)和可檢測(cè)標(biāo)記，所述的可檢測(cè)標(biāo)記選自由熒光部分、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光劑、能夠顯現(xiàn)可見反應(yīng)產(chǎn)物的酶底物和配體-可檢測(cè)標(biāo)記的配體結(jié)合配偶體組成的組。30.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的檢測(cè)引物序列包括選自由發(fā)夾和g-四集體組成的組的結(jié)構(gòu)部分。31.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的可檢測(cè)標(biāo)記為熒光部分。32.權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述的熒光部分包括供體和猝滅劑染料對(duì)，所述的猝滅劑染料對(duì)選自由下列物質(zhì)組成的組熒光素(FAM)/羅丹明(ROX)；FAM/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；R0X/DABCYL；異硫氰酸熒光素(FITC)/異硫氰酸四甲基羅丹明酯(TRITC)；FITC/TexasRedTM;FITC/N_羥基琥珀酰亞氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊紅異硫氰酸酯(EITC)；N-羥基琥珀酰亞氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC;FITC/羅丹明X；和FITC/四甲基羅丹明(TAMRA)。33.權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述的檢測(cè)引物選自由SEQIDNOs30-35組成的組。34.組合物，包括一種或多種主要由SEQIDNOs36-43和46-47中任意一個(gè)的HSV-2靶結(jié)合序列組成的引物。35.權(quán)利要求34所述的組合物，進(jìn)一步包括(k)能夠通過(guò)位于連接引物3'末端上的靶結(jié)合序列與靶序列雜交的連接引物序列，其中所述的連接引物包括5'通用尾且該連接引物選自由SEQIDNOs:19-22組成的組；和(1)能夠通過(guò)檢測(cè)引物的3'部分與連接引物5'尾的補(bǔ)體雜交的檢測(cè)引物序列，其中所述的檢測(cè)引物序列包括5'限制酶識(shí)別位點(diǎn)和可檢測(cè)標(biāo)記，所述的可檢測(cè)標(biāo)記選自由熒光部分、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光劑、能夠顯現(xiàn)可見反應(yīng)產(chǎn)物的酶底物和配體-可檢測(cè)標(biāo)記的配體結(jié)合配偶體組成的組。36.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述的檢測(cè)引物序列包括選自由發(fā)夾和g-四集體組成的組的結(jié)構(gòu)部分。37.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述的可檢測(cè)標(biāo)記為熒光部分。38.權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的熒光部分包括供體和猝滅劑染料對(duì)，所述的猝滅劑染料對(duì)選自由下列物質(zhì)組成的組熒光素(FAM)/羅丹明(ROX)；FAM/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；R0X/DABCYL;異硫氰酸熒光素(FITC)/異硫氰酸四甲基羅丹明酯(TRITC)；FITC/TexasRed;FITC/N_羥基琥珀酰亞氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊紅異硫氰酸酯(EITC)；N-羥基琥珀酰亞氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC;FITC/羅丹明X；和FITC/四甲基羅丹明(TAMRA)。39.權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述的檢測(cè)引物選自由SEQIDNOs30-35組成的組。40.檢測(cè)樣品中存在HSV-2靶序列的方法，所述的方法包括(y)將樣品加入到SEQIDNO38的第一種擴(kuò)增引物和選自由SEQIDNOs39-43組成的組的第二種擴(kuò)增引物中，產(chǎn)生擴(kuò)增的HSV-2核酸產(chǎn)物；和(ζ)檢測(cè)擴(kuò)增的HSV-2核酸產(chǎn)物，其中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)表明樣品中存在HSV-2。41.權(quán)利要求40所述的方法，其中通過(guò)選自由通用檢測(cè)、凝膠電泳和定量雜交組成的組的方法檢測(cè)所述的擴(kuò)增HSV-2核酸產(chǎn)物。42.權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括(aa)將樣品加入到SEQIDNO46的第一種緩沖引物和SEQIDNO47的第二種緩沖引物中。43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的檢測(cè)步驟進(jìn)一步包括(bb)使第一種擴(kuò)增引物和選自由SEQIDN0s:44-45組成的組的連接引物與擴(kuò)增的HSV-2靶序列雜交，其中所述的連接引物在第一種擴(kuò)增引物的下游雜交；(cc)使第一種擴(kuò)增引物與連接引物的3'末端延伸，產(chǎn)生連接引物延伸產(chǎn)物，其中第一種擴(kuò)增引物的延伸取代了所述的連接引物延伸產(chǎn)物；(dd)使第二種擴(kuò)增引物與所述的連接引物延伸產(chǎn)物雜交；(ee)使第二種擴(kuò)增引物的3'末端延伸，產(chǎn)生包括所述連接引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈分子，其中各鏈包括可產(chǎn)生切口的限制酶位點(diǎn)；(ff)使所述的雙鏈分子產(chǎn)生切口，生成5'部分和3'部分，其中5'部分包括產(chǎn)生切口的尾且3'部分包括產(chǎn)生切口的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物；(gg)使產(chǎn)生切口尾的3'末端延伸，取代產(chǎn)生切口的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物，其中取代的產(chǎn)生切口的補(bǔ)體連接延伸產(chǎn)物為單鏈；(hh)使檢測(cè)引物與所述的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物雜交，其中所述的檢測(cè)引物包括可檢測(cè)標(biāo)記；(ii)使檢測(cè)引物與補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物的3'末端延伸，產(chǎn)生包括檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈檢測(cè)分子，其中各鏈包括可切割的限制酶識(shí)別位點(diǎn)；(jj)切割所述的雙鏈檢測(cè)分子；和(kk)檢測(cè)所述的可檢測(cè)標(biāo)記。44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的可檢測(cè)標(biāo)記為熒光部分。45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的熒光部分包括供體和猝滅劑染料對(duì)，所述的猝滅劑染料對(duì)選自由下列物質(zhì)組成的組熒光素(FAM)/羅丹明(ROX)；FAM/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；R0X/DABCYL；異硫氰酸熒光素(FITC)/異硫氰酸四甲基羅丹明酯(TRITC)；FITC/TexasRed;FITC/N_羥基琥珀酰亞氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊紅異硫氰酸酯(EITC)；N-羥基琥珀酰亞氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/羅丹明X；和FITC/四甲基羅丹明(TAMRA)。46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的檢測(cè)引物選自由SEQIDNOs:30-35組成的組。47.權(quán)利要求43所述的方法，進(jìn)一步包括(11)擴(kuò)增選自SEQIDNOs:47_48組成的組的內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照(IAC)靶序列；(mm)使第一種擴(kuò)增引物和選自由SEQIDNOs50-51組成的組的IAC連接引物與IAC雜交，其中所述的連接引物在第一種擴(kuò)增引物的下游雜交；(nn)使第一種擴(kuò)增引物和IAC連接引物的3'末端延伸，產(chǎn)生IAC連接引物延伸產(chǎn)物，其中第一種擴(kuò)增引物的延伸取代了IAC連接引物延伸產(chǎn)物；(O0)使第二種擴(kuò)增引物與IAC連接引物延伸產(chǎn)物雜交；(PP)使第二種擴(kuò)增引物的3'末端延伸，產(chǎn)生包括IAC連接引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈分子，其中各鏈包括可產(chǎn)生切口的限制酶位點(diǎn)；(qq)使所述的雙鏈分子產(chǎn)生切口，生成5'部分和3'部分，其中5'部分包括產(chǎn)生切口的尾且3'部分包括產(chǎn)生切口的補(bǔ)體IAC連接引物延伸產(chǎn)物；(rr)使產(chǎn)生切口尾的3'末端延伸，取代產(chǎn)生切口的補(bǔ)體IAC連接引物延伸產(chǎn)物，其中取代的產(chǎn)生切口的補(bǔ)體連接引物延伸產(chǎn)物為單鏈；(ss)使IAC檢測(cè)引物與所述的單鏈補(bǔ)體IAC連接引物延伸產(chǎn)物雜交，其中所述的IAC檢測(cè)引物包括可檢測(cè)標(biāo)記且檢測(cè)IAC靶序列；(tt)使IAC檢測(cè)引物和補(bǔ)體IAC連接引物延伸產(chǎn)物的3'末端延伸，產(chǎn)生包括檢測(cè)引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈檢測(cè)分子，其中各鏈包括可切割的限制酶位點(diǎn)；(uu)切割所述的雙鏈檢測(cè)分子；和(vv)檢測(cè)所述的可檢測(cè)標(biāo)記。48.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的IAC檢測(cè)引物序列選自由SEQIDNOs34-35組成的組且用于檢測(cè)HSV-2靶序列的檢測(cè)引物選自由SEQIDNOs30-33組成的組。49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的可檢測(cè)標(biāo)記為熒光部分。50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的熒光部分包括供體和猝滅劑染料對(duì)，所述的猝滅劑染料對(duì)選自由下列物質(zhì)組成的組熒光素(FAM)/羅丹明(ROX)；FAM/P-(二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；R0X/DABCYL；異硫氰酸熒光素(FITC)/異硫氰酸四甲基羅丹明酯(TRITC)；FITC/TexasRed;FITC/N_羥基琥珀酰亞氨基1-芘丁酸酯(PYB)；FITC/伊紅異硫氰酸酯(EITC)；N-羥基琥珀酰亞氨基1-戊磺酸酯(PYS)/FITC；FITC/羅丹明X；和FITC/四甲基羅丹明(TAMRA)。51.權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的檢測(cè)引物選自由SEQIDNOs:30-35組成的組。52.包含用于通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)樣品中HSV-2靶序列的引物的組合物，包括(a)與HSV-2靶序列雜交的第一種擴(kuò)增引物，其中所述的第一種擴(kuò)增引物為SEQIDNO38；(b)與HSV-2靶序列的補(bǔ)體雜交的第二種擴(kuò)增引物序列，其中所述的第二種擴(kuò)增引物選自由SEQIDNO39-43組成的組；(c)在第一種擴(kuò)增引物的上游與HSV-2靶序列雜交的第一種緩沖引物序列，其中所述的第一種緩沖引物為SEQIDNO46；和(d)在第二種擴(kuò)增引物的上游與HSV-2靶序列的補(bǔ)體雜交的第二種緩沖引物序列，其中所述的第二種緩沖引物為SEQIDN0:47。53.用于擴(kuò)增樣品中HSV-2靶序列的方法，包括(a)使SEQIDNO38的第一種擴(kuò)增引物與HSV-2靶序列雜交；(b)使SEQIDNO:46的第一種緩沖引物與HSV-2靶序列雜交，其中所述的第一種緩沖引物在第一種擴(kuò)增引物的上游與HSV-2靶序列雜交，且所述的第二種緩沖引物在第二種擴(kuò)增引物的上游與補(bǔ)體靶序列雜交；(c)使第一種緩沖引物和第一種擴(kuò)增引物的3’末端延伸，產(chǎn)生第一種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物，其中第一種緩沖引物的延伸取代了第一種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物；(d)使含有選自由SEQIDNO:39-43組成的組的序列的第二種擴(kuò)增引物與第一種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物雜交；(e)使SEQIDNO47的第二種緩沖引物與第一種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物雜交；(f)使第二種緩沖引物和第二種擴(kuò)增引物的3’末端延伸，產(chǎn)生第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物，其中第二種緩沖引物的延伸取代了第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物；(g)使第一種擴(kuò)增引物與第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物雜交；(h)使步驟(g)的第一種擴(kuò)增引物3'末端延伸，產(chǎn)生包括第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體的雙鏈分子，其中各鏈包括可產(chǎn)生切口的限制酶位點(diǎn)；(i)使所述的雙鏈分子產(chǎn)生切口，生成5'部分和3'部分，其中5'部分包括產(chǎn)生切口尾且3'部分包括產(chǎn)生切口的第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物及其補(bǔ)體；(j)使3'產(chǎn)生切口的尾延伸，取代帶產(chǎn)生切口的第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物，其中帶產(chǎn)生切口的補(bǔ)體第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物為單鏈；(k)使產(chǎn)生產(chǎn)生切口尾的3'末端延伸，取代產(chǎn)生切口的補(bǔ)體第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物，其中產(chǎn)生切口的補(bǔ)體第二種擴(kuò)增引物延伸產(chǎn)物為單鏈；(1)通過(guò)使第一種擴(kuò)增引物和第二種擴(kuò)增引物分別與各單鏈分子雜交并重復(fù)步驟(h)-(k)使兩種單鏈分子以指數(shù)方式擴(kuò)增，由此擴(kuò)增HSV-2靶序列。54.用于檢測(cè)HSV-2靶序列的試劑盒，包括一種或多種選自由38-43組成的組的擴(kuò)增引物和選自由SEQIDNOs46-47組成的組的緩沖引物。55.權(quán)利要求54所述的試劑盒，進(jìn)一步包括一種或多種選自由SEQIDNOs44-45組成的組的連接引物和一種或多種選自由SEQIDNOs=SEQIDNOs:30_35組成的組的檢測(cè)引物。56.權(quán)利要求55所述的試劑盒，進(jìn)一步包括一種或多種選自由SEQIDNOs48-49組成的組的IAC靶序列和一種或多種選自由SEQIDNOs50-51組成的組的IAC連接引物。全文摘要本發(fā)明涉及基于擴(kuò)增一部分單純皰疹病毒(HSV)的糖蛋白G(US4)基因檢測(cè)樣品中存在或不存在HSV和使用如本文所述的引物和檢測(cè)引物檢測(cè)擴(kuò)增的核酸的方法。本發(fā)明的方法進(jìn)一步鑒定了樣品中的HSV類型，HSV-1或者HSV-2。本發(fā)明還包括試劑盒，該試劑盒包括可以用于本文所述擴(kuò)增方法的引物和檢測(cè)引物。文檔編號(hào)C12N15/11GK101824409SQ20101012133公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2004年4月26日優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日發(fā)明者C·A·馬丁奈蒂斯,D·A·尤爾西斯,D·M·沃爾夫申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司