專利名稱：沙門氏菌血清組鑒定靶點的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化技術(shù)領(lǐng)域的血清的篩選方法，具體是一種沙門氏菌血清組鑒 定靶點的篩選方法。
背景技術(shù)：
沙門氏菌(Salmonella)是食源性致病菌中一個重要屬。全世界已分離出的沙門 氏菌有2500多種血清型，我國約有300種血清型，分屬42個血清組，但與人類疾病相關(guān)的 血清型主要集中于A E血清組，其中A D組的致病沙門氏菌占到70 %。對沙門氏菌 進(jìn)行血清分型鑒定是流行性病學(xué)鑒定研究的重要內(nèi)容，可以監(jiān)測疾病的爆發(fā)和傳播以及控 制疾病流行有著重要作用。目前，沙門氏菌的分離、鑒定與分型，主要是采用國標(biāo)的方法 (GBT4789. 4-2008)，依據(jù)沙門氏菌的生化反應(yīng)，以及抗原抗體凝集反應(yīng)進(jìn)行分型鑒定的。盡 管以血清學(xué)為基礎(chǔ)的鑒定方法可以得到比較可靠的分型結(jié)果，但是免疫反應(yīng)十分復(fù)雜，費 時費力，價格昂貴，對于一些粗糙型菌株和喪失抗原表達(dá)的分離株則不能鑒定。而以PCR方 法為基礎(chǔ)的沙門氏菌血清組鑒定方法快速、高效，可避免血清鑒定的不足。這一方法所使用 的鑒定靶點主要是來自于沙門氏菌0抗表達(dá)相關(guān)的rfb基因簇中的某些基因。自Luk J.M.， Kongmuang U.，Reeves P. R. ^Λ ((Journal of ClinicalMicrobiology)) ( I臨 學(xué)雜志)1993年第31卷第8期第2118 2213頁發(fā)表的題為《Selective amplification of abequose and paratose synthase genes(rfb)bypolymerase chain reaction for identification of Salmonella major serogroups (A, B, C2, and D)》(通過 PCR 選擇性 擴增β _脫氧巖藻糖和泊雷糖合成酶基因(rfb)鑒定沙門氏菌主要血清組(A，B，C2和D)) 之后，許多研究學(xué)者至今仍在沿用這些靶點。沙門氏菌的rfb基因簇具有很高的多態(tài)性，除 了血清組A和D基因簇的DNA序列非常相似外，其他的血清組間差異很大，即使是同一血清 組，rfb基因簇上的DNA序列也會會千差萬別，例如血清組E。因此，在選擇靶點前，需要了 解各個血清組rfb基因簇中基因的序列及排列次序，這使得選擇特定血清組的鑒定靶點困 難重重。由于目前各個血清組的靶點單一，不易設(shè)計用于PCR方法鑒定的多重引物，因此檢 測方法多數(shù)是用檢測芯片鑒定，使得鑒定成本過于高昂。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的主題“沙門氏菌血清組鑒定 靶點的篩選方法”有關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種沙門氏菌血清組鑒定靶點的篩 選方法。本發(fā)明的方法實施簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠為以多重PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因檢測方法 提供可靠的特異靶點。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟步驟一，獲取已經(jīng)測序完成的沙門氏菌的基因組DNA序列，按照沙門氏菌的血清 型進(jìn)行分類，拼接每種血清型下的所有基因組DNA序列，得長序列，利用BLASTN軟件格式化成BLASTN程序文件；步驟二，從目標(biāo)血清型中選擇一個代表菌株，切割其基因組DNA序列，得到小片 段，將所有小片段與該血清型對應(yīng)的長序列進(jìn)行比對，選擇E值趨近于0的DNA片段；之后 將得到的DNA片段與其余血清型對應(yīng)的長序列分別進(jìn)行比對，選擇最終E值均> 1的DNA 片段；步驟三，以步驟二最終所得DNA片段為模板，設(shè)計引物；利用引物擴增每種血清型 下對應(yīng)的所有基因組DNA，檢測擴增產(chǎn)物；只有屬于目標(biāo)血清型的基因組DNA序列能擴增到 特異擴增條帶時，則相應(yīng)DNA片段為目標(biāo)血清型的特異靶點。步驟二中，所述代表菌株具體為沙門氏菌A血清組為甲型副傷寒沙門氏菌 (S. ParatypiA) ATCC 9150，沙門氏菌B血清組為鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium) LT2,沙 門氏菌Cl血清組為豬霍亂沙門氏菌(S. Choleraesuis) SC-B67，沙門氏菌C2血清組為紐波 特沙門氏菌(S. Newport) SL254，沙門氏菌D血清組為傷寒沙門氏菌(S. Typhi) CT18。步驟二中，所述切割具體為以200 IOOObp為單元進(jìn)行切割，每切割完一次，向 后移動1 lOOObp，進(jìn)行二次切割，依次類推，直至基因組序列被切割完畢。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果利用本發(fā)明的方法能夠大規(guī)模篩 選沙門氏菌血清組的特異靶點，結(jié)果準(zhǔn)確；并且，本發(fā)明的方法步驟簡單，操作方便，所需基 因組數(shù)據(jù)和對比軟件均可從公共數(shù)據(jù)庫中獲得，篩選快捷，避免了盲目選擇靶點或者是所 選擇的靶點特異性不強等缺陷。


圖1篩選特異靶點的示意圖。本發(fā)明涉及的菌株公開信息如下S. Paratypi A str. ATCC 9150在如下文獻(xiàn)中公開(McClelland Μ, SandersonKE, Clifton SW等人在《Nature Genetics))(自然一遺傳學(xué))2004年第36卷12期第1268 1274 Μ^fitJIS^J ((Comparison of genome degradation in Paratyphi A andTyphi, human-restricted serovars of Salmonella enterica that cause typhoid〉〉(只弓|起人 類傷寒的沙門氏菌血清型——甲型副傷寒和傷寒沙門氏菌的基因組退化的比較))；S. Typhimurium str. LT2 在如下文獻(xiàn)中公開(McClelland Μ, Sanderson KE, Spieth J等人在《Nature》(自然)2001年第413卷第6858期第852 856頁上發(fā)表的 題為((Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)) (鼠傷寒沙門氏菌LT的全基因組序列))；S. Choleraesuis str. SC-B67在如下文獻(xiàn)中公開(Chiu CH, Tang P, Chu C等人在 ((Nucleic Acids Research))(核酸研究)2005年第33卷第5期第1690 1698頁上發(fā)表的 M為〈〈The genome sequence of Salmonella enterica serovar Choleraesuis, a highly invasive and resistant zoonotic pathogen》(一種高侵染性、高抗性的人畜共患致病 菌——豬霍亂沙門氏菌的基因組序列))；S. Newport str. SL254在如下文獻(xiàn)中公開(Welch TJ,Fricke WF，McDermottPF等 人在《PLoS One))(公共科學(xué)圖書館·綜合)2007年第2卷第3期第309網(wǎng)頁上發(fā)表的題 為〈〈Multiple antimicrobial resistance in plague :an emerging publichealth risk))(多重耐藥性的瘟疫一種新興的公共健康風(fēng)險))；S. Typhi str. CT18 在如下文獻(xiàn)中公開(Parkhill J, Dougan G，James KD 等人在 ((Nature))(自然)2001年第413卷第6858期第848 852頁上發(fā)表的題為《Completegenome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar TyphiCT18)) (傷寒沙門氏菌CT18的全基因組序列))。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一，數(shù)據(jù)庫的建立分別從NCBI (the National Center for Biotechnologylnformation), Sanger 石if 究院(the Sanger Institute),美國伊禾丨J i若斯 州大學(xué)(theUniversity of Illinois)和美國華盛頓大學(xué)基因組測序中心(the Genome SequencingCenter of Washington University)提供的基因組數(shù)據(jù)庫中下載沙門氏菌的 基因組DNA序列，共下載25株沙門氏菌的全基因組DNA序列；所有下載的基因組序列都按照沙門氏菌各自的血清組分屬的血清組進(jìn)行分類，除 A、B、Cl、C2和D血清組之外的其他沙門氏菌基因組DNA歸類于一組，命名為Others，下載 菌株名稱、數(shù)據(jù)來源和分類情況都列于表1中，注*為每一血清組的代表菌株，在步驟二 中將其基因組序列切割為小的片段。將每一個血清組數(shù)據(jù)庫中所有測序沙門氏菌菌株的 基因組DNA序列拼接到一個TXT文件中，分別將6個血清組的基因組DNA序列所拼接成的 TXT 文件命名為 A-databank, txt、B-databank. txt、Cl-databank. txt、C2_databank. txt、 D-databank. txt和Others-databank, txt。這6個文件經(jīng)軟件BLASTN格式化為后，每個文 件形成一組后綴名nhr、nin、nSd、nSi和nsq的文件，數(shù)據(jù)庫建立完畢。表1下載的沙門氏菌菌株全基因組序列及其分屬的數(shù)據(jù)庫地址 步驟二，特異靶點的篩選分別選 S. Paratypi A str. ATCC 9150 (McClelland Μ, Sanderson KE, Clifton SW 等人在《Nature GeneticsK 自然-遺傳學(xué))2004 年第 36 卷 12 期第 1268 1274 頁上發(fā)表的題為((Comparison of genome degradation inParatyphi A and Typhi, human—restricted serovars of Salmonella enterica thatcause typhoid)) (只引起人類傷寒的沙門氏菌血清型——甲型副傷寒和傷寒沙門氏菌的基因組退化的比 較))、S. Typhimurium str. LT2 (McClelland Μ, Sanderson KE, SpiethJ 等人在《Nature》 (自然)2001年第413卷第6858期第852 856頁上發(fā)表的題為《Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2))(鼠傷寒沙門氏菌 LT 的 全基因組序列))、S. Choleraesuis str. SC-B67 (Chiu CH, Tang P, Chu C 等人在《NucleicAcids Research))(核酸研究)2005年第33卷第5期第1690 1698頁上發(fā)表的題為《The genome sequence of Salmonella entericaserovar Choleraesuis, a highly invasive
and resistant zoonotic pathogen》(一種高侵染性、高抗性的人畜共患致病菌-豬
霍亂沙門氏菌的基因組序列))、S. Newport str. SL254(Welch TJ, Fricke WF, McDermott PF等人在《PLoS One))(公共科學(xué)圖書館·綜合)2007年第2卷第3期第309網(wǎng)頁上發(fā)表 的題為((Multipleantimicrobial resistance in plague :an emerging public health risk))(多重耐藥性的瘟疫一種新興的公共健康風(fēng)險))和S. Typhi str. CT18 (Parkhill J, DouganG, James KD等人在《Nature》(自然)2001年第413卷第6858期第848 852 頁上發(fā)表的題為((Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonellaenterica serovar Typhi CT18》(傷寒沙門氏菌CT18的全基因組序列))作為 A、B、C1、C2和D5個沙門氏菌血清組的代表菌株。然后，分別將這5株菌的基因組DNA序列 切割為IOOObp的DNA片段。以血清組A為例說明，通過計算機軟件讀取儲存S. ParatypiA str. ATCC 9150 的 IOOObp 片段 DNA 序列的 TXT 文件，調(diào)用 BLASTN 程序與 A-databank, txt 文件中的所有A組的基因組DNA序列進(jìn)行BLASTN比對，篩選出A組的較為保守的片段。 然后這些保守片段再分別與B、Cl、C2、D和Others這5個血清組的基因組DNA分別進(jìn)行 BLASTN比對，再篩選出血清組A的特異片段來，作為候選特異靶點。其他血清組的代表菌株 S. Typhimurium str. LT2、S.Choleraesuis str. SC-B67、S.Newport str.SL254 禾口 S. Typhi str. CT18的基因組DNA序列分別被分割為IOOObp的片段之后，經(jīng)過同樣的方式篩選出血清 組B、Cl、C2和D的各自的候選特異靶點來，所有篩選靶點列于表2中；表2血清組A、B、Cl、C2和D的特異候選靶點 步驟三，特異靶點的鑒定分別將所有候選的特異靶點的序列輸入引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5. 0中，按照軟件設(shè)計引物的原則設(shè)定參數(shù)，從備選的引物中選擇出評分 較優(yōu)的引物。引物序列列于表3中。這些引物經(jīng)合成后，以不同血清組的沙門氏菌(15株 標(biāo)準(zhǔn)菌株和30株分離菌株)的DNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴增。所選沙門氏菌菌株及PCR 擴增結(jié)果列于表4中，注+代表陽性結(jié)果，-代表陰性結(jié)果。從表4的結(jié)果中可以知道，由 候選靶點設(shè)計的引物，都能夠準(zhǔn)確的檢測出相應(yīng)血清組的沙門氏菌。本實施例中，所發(fā)掘的 靶點均是新的靶點，經(jīng)PCR驗證，具有相應(yīng)的血清組特異性，這表明本實施例的靶點篩選方 法是準(zhǔn)確可靠的。表3血清組A、B、Cl、C2和D的引物及序列 表4沙門氏菌菌株及PCR擴增結(jié)果
權(quán)利要求
一種沙門氏菌血清組鑒定靶點的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，獲取已經(jīng)測序完成的沙門氏菌的基因組DNA序列，按照沙門氏菌的血清型進(jìn)行分類，拼接每種血清型下的所有基因組DNA序列，得長序列，利用BLASTN軟件格式化成BLASTN程序文件；步驟二，從目標(biāo)血清型中選擇一個代表菌株，切割其基因組DNA序列，得到小片段，將所有小片段與該血清型對應(yīng)的長序列進(jìn)行比對，選擇E值趨近于0的DNA片段；之后將得到的DNA片段與其余血清型對應(yīng)的長序列分別進(jìn)行比對，選擇最終E值均＞1的DNA片段；步驟三，以步驟二最終所得DNA片段為模板，設(shè)計引物；利用引物擴增每種血清型下對應(yīng)的所有基因組DNA，檢測擴增產(chǎn)物；只有屬于目標(biāo)血清型的基因組DNA序列能擴增到特異擴增條帶時，則相應(yīng)DNA片段為目標(biāo)血清型的特異靶點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌血清組鑒定靶點的篩選方法，其特征是，步驟二中， 所述代表菌株具體為沙門氏菌A血清組為甲型副傷寒沙門氏菌ATCC 9150，沙門氏菌B血 清組為鼠傷寒沙門氏菌LT2，沙門氏菌Cl血清組為豬霍亂沙門氏菌SC-B67，沙門氏菌C2血 清組為紐波特沙門氏菌SL254，沙門氏菌D血清組為傷寒沙門氏菌CT18。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌血清組鑒定靶點的篩選方法，其特征是，步驟二中， 所述切割具體為以200 IOOObp為單元進(jìn)行切割，每切割完一次，向后移動1 lOOObp， 進(jìn)行二次切割，依次類推，直至基因組序列被切割完畢。
全文摘要
一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的沙門氏菌血清組鑒定靶點的篩選方法，包括如下步驟獲取所有沙門氏菌的基因組DNA序列，按照血清型進(jìn)行分類，拼接，得長序列，格式化成BLASTN程序文件；從目標(biāo)血清型中選擇一個代表菌株，切割其基因組DNA序列，得到小片段，將所有小片段與該血清型對應(yīng)的長序列進(jìn)行比對，選擇E值趨近于0的DNA片段；之后將得到的DNA片段與其余血清型對應(yīng)的長序列分別進(jìn)行比對，選擇最終E值均＞1的DNA片段；以步驟二最終所得DNA片段為模板，設(shè)計引物，擴增所有基因組DNA，檢測擴增產(chǎn)物；只有屬于目標(biāo)血清型的基因組DNA序列能擴增到特異擴增條帶時，則相應(yīng)DNA片段為目標(biāo)血清型的特異靶點。本發(fā)明的方法實施簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠提供可靠的特異靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101928772SQ20101011890
公開日2010年12月29日 申請日期2010年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者劉斌, 史賢明, 張利達(dá), 施春雷, 朱東升 申請人:上海交通大學(xué)