專利名稱：利用紅曲霉生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種粗酶制劑的制備方法，尤其是利用高產(chǎn)酯化酶紅曲霉菌株采用固
態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法。所屬領(lǐng)域?yàn)槲⑸锇l(fā)酵技術(shù)。
背景技術(shù)：
濃香型白酒是我國白酒十二大香型中產(chǎn)量最大、分布面最廣、生產(chǎn)廠家最多、市場覆蓋最廣的一類白酒，在國民經(jīng)濟(jì)和人們?nèi)粘Ｉ钪姓加兄匾牡匚?。目前，?yōu)質(zhì)濃香型白酒的生產(chǎn)還存在生產(chǎn)周期長、優(yōu)級(jí)品率低等問題，嚴(yán)重制約了濃香型白酒企業(yè)的發(fā)展。主要原因之一為濃香型白酒主要香味物質(zhì)己酸乙酯的形成速度慢且最終含量低。目前生產(chǎn)上提高己酸乙酯含量的方法主要是己酸菌灌窖法，該法效果甚微，因?yàn)榧核峋饕饔檬钱a(chǎn)生己酸，酯化作用弱，將己酸轉(zhuǎn)化成己酸乙酯的能力差。因此使用催化劑催化己酸和乙醇生成己酸乙酯是提高濃香型白酒的質(zhì)量和縮短生產(chǎn)周期的主要措施之一。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、酵母、霉菌中的很多菌株都能合成能催化短鏈脂肪酸和乙醇酯化的脂肪酶，這類微生物被釀酒行業(yè)統(tǒng)稱為酯化菌，但是適合釀酒生產(chǎn)的酯化菌并不多。 紅曲霉是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，將其接種于大米經(jīng)發(fā)酵制備而成的紅曲是一種食療兼?zhèn)涞膫鹘y(tǒng)中藥，具有活血化瘀健脾消食等功效。研究表明，紅曲同時(shí)還具有降脂、降壓、降糖和抑制腫瘤生長等作用。20世紀(jì)60年代初，中國科學(xué)院成都生物所發(fā)現(xiàn)紅曲霉的某些菌株能夠使短鏈脂肪酸和醇生成酯，為紅曲在白酒生產(chǎn)上的應(yīng)用開拓了新途徑，是我國白酒工業(yè)的一項(xiàng)重大創(chuàng)新。由于紅曲霉能夠在大曲、制曲作坊、釀酒醪液、糟醅等釀酒場所繁殖生長，因而成為釀酒界研究的熱點(diǎn)。近年來國內(nèi)酒界對(duì)紅曲霉的研究取得了一定成效，如中國科學(xué)院成都生物所分離到瀘型酯化菌M101菌株，利用該菌株培養(yǎng)"強(qiáng)化菌曲"，用于發(fā)酵產(chǎn)酒，具有較強(qiáng)的生香功能。江蘇雙洋酒廠分離到一株具有極強(qiáng)產(chǎn)酯能力的紅曲霉菌株，該菌株用于濃香型白酒的生產(chǎn)，對(duì)提高大曲酒的產(chǎn)量、質(zhì)量，調(diào)整己酸乙酯/乳酸乙酯的比例都有明顯效果。 雖然近年釀酒行業(yè)在紅曲霉菌種的選育方面取得了顯著成績，但紅曲霉運(yùn)用方面還存在技術(shù)缺陷與不足。目前利用紅曲霉生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的主要工藝以麩皮為原料，淺盤固態(tài)發(fā)酵制備麩曲。因麩皮營養(yǎng)豐富，適宜眾多微生物生長，而紅曲霉與其它霉菌相比生長緩慢，導(dǎo)致該工藝容易被污染，對(duì)場地和操作要求嚴(yán)格，規(guī)?；a(chǎn)污染風(fēng)險(xiǎn)大。大米是紅曲霉生長的天然培養(yǎng)基，紅曲霉在大米基質(zhì)上生長，競爭優(yōu)勢明顯，不易污染，但采用以大米為原料的紅曲生產(chǎn)的傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)紅曲酯化酶粗酶制劑也存在缺陷，主要表現(xiàn)為傳統(tǒng)工藝以整粒大米為原料，紅曲霉與基質(zhì)接觸面小，菌絲往基質(zhì)內(nèi)生長滲透速度慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期長(一般在IO天以上)；工藝過程復(fù)雜繁瑣，耗時(shí)(要經(jīng)浸泡，瀝干，蒸熟，冷卻打散等前處理工序)；工藝關(guān)鍵點(diǎn)的控制對(duì)工人經(jīng)驗(yàn)要求高，實(shí)施難度大(如大米浸泡，蒸熟等都要恰到好處)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有紅曲酯化酶粗酶制劑生產(chǎn)工藝易污染，發(fā)酵周期長，工藝過程復(fù)雜 繁瑣，關(guān)鍵點(diǎn)控制難的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種利用紅曲霉生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的 方法，該方法以高產(chǎn)酯化酶紅曲霉菌株為生產(chǎn)菌株，以大米粉、黃豆粉、乳酸或黃水為主料， 以稻殼為輔料，采用固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒用酯化酶粗酶制劑，該法生產(chǎn)出的酯化酶粗酶制 劑的酯化力達(dá)(80-160)mg/100ml 7day。該方法工藝簡單，易操作，不易污染，對(duì)場地要求 不高，而且能顯著縮短發(fā)酵周期(可縮短到5天)。 技術(shù)方案將大米粉碎成粉狀作碳源，黃豆粉補(bǔ)充氮源，用量為大米粉質(zhì)量 的3% _7%，用乳酸或黃水調(diào)節(jié)^值，乳酸用量為大米粉質(zhì)量的0.5% _1%，黃水為大 米粉質(zhì)量的19% —27%，以稻殼為支持輔料，起蓬松透氣供氧的作用，彌補(bǔ)大米粉遇 水成團(tuán)，透氣性變差，供氧不足而導(dǎo)致紅曲霉不能生長的缺陷，其用量為大米粉質(zhì)量的 40%-50%?？刹捎萌瞧抗虘B(tài)發(fā)酵模式或淺盤固態(tài)發(fā)酵模式進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)采用三角瓶 固態(tài)發(fā)酵時(shí)，在上面所述的物料中加入大米粉質(zhì)量的80%的水，充分拌勻，分裝到三角瓶 中(裝瓶量為90g/500ml-100g/500ml三角瓶或200g/1000ml-220g/1000ml三角瓶)，高 壓滅菌(121°C )30分鐘，呈熱打散，冷卻到4(TC左右時(shí)，接入10ml紅曲霉菌液，搖勻，在 34t:下恒溫培養(yǎng)115-125小時(shí)，待整個(gè)培養(yǎng)基質(zhì)長滿菌絲，略帶紅色，到培養(yǎng)終點(diǎn)，收曲于 45t:下烘干即為紅曲酯化酶粗酶制劑成品；當(dāng)采用淺盤固態(tài)發(fā)酵時(shí)，加入大米粉質(zhì)量的 120% _150%的水，充分拌勻，用紗布或白布包被基質(zhì)，高壓滅菌(121°C )30分鐘，呈熱打 散，冷卻到4(TC左右時(shí)，接入物料質(zhì)量的8X _10%的三角瓶二級(jí)固態(tài)種子，拌勻并攤平到 淺盤中，使物料厚度為4cm，在上面覆蓋4層濕紗布或2層濕白布，于34t:下恒溫培養(yǎng)48小 時(shí)，降溫到32t:，補(bǔ)入物料質(zhì)量的10%的水，此時(shí)所覆蓋的紗布或白布已變干，更換成濕紗 布或濕白布，繼續(xù)培養(yǎng)52h-62h，待整個(gè)培養(yǎng)基質(zhì)長滿菌絲，略帶紅色，到培養(yǎng)終點(diǎn)，收曲于 45 °C下烘干即為紅曲酯化酶粗酶制劑成品。 本發(fā)明的有益效果是提供一種利用紅曲霉生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，該方法 克服了現(xiàn)有工藝以麩皮為原料生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑時(shí)易污染的缺點(diǎn)，并提高了酯化酶粗酶 制劑的酯化力(從40-80mg/100ml 7day提高到80-160mg/100ml 7day);該方法省去了 以大米為原料的生產(chǎn)工藝中潤糧( 一般需要24小時(shí)，使吸水在60% -70%之間)、瀝干、蒸 熟(要求剛好過心，熟而不膩，較難控制)、培養(yǎng)過程中需要多次補(bǔ)水等繁瑣耗時(shí)的步驟，并 且顯著縮短了發(fā)酵周期(從10天以上縮短為5天左右)。本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝簡單，易 操作，污染風(fēng)險(xiǎn)小，易規(guī)模化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
實(shí)施列1
(1)斜面培養(yǎng) 斜面培養(yǎng)基10°8乂麥芽汁，瓊脂3%， ra自然；將紅曲霉菌種接種于斜面培養(yǎng)基
上，在34t:下培養(yǎng)7天，待菌絲長滿試管并產(chǎn)生孢子時(shí)備下一步使用。
(2)菌液的制備 將3支(1)所述的試管種子洗入盛有100ml無菌水的500ml三角瓶中，加入一定量的玻璃珠和lg葡萄糖，在34°C， 180r/min的轉(zhuǎn)速下恒溫震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，得紅曲霉菌液。[OOM] (3)三角瓶固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基大米粉400g，黃豆粉20g，乳酸4ml，稻殼200g，蒸餾水320ml ;
將大米粉和黃豆粉拌勻后加入稻殼并拌勻。將蒸餾水，乳酸充分混勻后加入上述固體基質(zhì)
中，輕輕搓勻(不能用大力)，讓大米粉充分分散到稻殼上并保證物料蓬松。將上述物料平
均分裝到10個(gè)500ml三角瓶中，塞上棉塞，用牛皮紙將棉塞包好，高壓(121°C )滅菌30分
鐘。取出后呈熱將成團(tuán)的基質(zhì)搖散，待冷卻到4(TC左右時(shí)，每個(gè)三角瓶接入10ml (2)所述的
菌液，搖勻后，在34t:下恒溫培養(yǎng)72小時(shí)后扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，此時(shí)發(fā)酵基質(zhì)長滿菌
絲，略帶紅色，到培養(yǎng)終點(diǎn)，收曲于45t:下烘干得紅曲酯化酶粗酶制劑成品390g，酯化力為
110mg/100ml 7day。 實(shí)施列2 (l)斜面培養(yǎng) 同實(shí)施列l(wèi)。
(2)菌液的制備 同實(shí)施列l(wèi)。
(3)三角瓶固態(tài)種子 前期操作同實(shí)施列l(wèi)，在34t:下恒溫培養(yǎng)約72小時(shí)，具體時(shí)間依基質(zhì)生長情況而
定，待基質(zhì)長滿白色菌絲，鏡檢具有大量的分生孢子產(chǎn)生時(shí)，此時(shí)扣搖使基質(zhì)盡量分散作種
子備淺盤培養(yǎng)使用。
(4)淺盤固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基大米粉750g，黃豆粉37. 5g，黃水180ml，稻殼375g，蒸餾水900ml ;將大米粉和黃豆粉拌勻后加入稻殼并拌勻。將蒸餾水，黃水充分混勻后加入上述固體基質(zhì)中，輕輕搓勻(不能用大力)，讓大米粉充分分散到稻殼上并保證物料蓬松。用紗布或白布包被基質(zhì)，高壓滅菌(121°C )30分鐘，呈熱打散，待冷卻到4(TC左右時(shí)，接入100g(3)所述的三角瓶固態(tài)種子(約2瓶500ml三角瓶培養(yǎng)物)拌勻，將物料攤平到淺盤中使其的厚度為4cm，在上面覆蓋4層濕紗布或2層濕白布，于34t:下，濕度^ 80%的條件下恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，把溫度降到32t:，補(bǔ)入物料重量10%的水，此時(shí)所覆蓋的紗布或白布已變干，更換成濕紗布或濕白布，保持濕度^ 90%的條件下繼續(xù)培養(yǎng)58h，待整個(gè)培養(yǎng)基質(zhì)長滿菌絲，略帶紅色，到培養(yǎng)終點(diǎn)，收曲于45t:下烘干得紅曲酯化酶粗酶制劑730g，酯化力為100mg/100ml 7day。
權(quán)利要求
利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，其特征在于以大米粉、黃豆粉、乳酸或黃水為主料，稻殼為輔料，高產(chǎn)酯化酶的紅曲霉菌株為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒用酯化酶粗酶制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，其特征在于 以大米粉為碳源，大豆粉為氮源，以稻殼為填充料，以乳酸或黃水調(diào)節(jié)Kl值。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，其特征在于大豆粉:大米粉的比例(w/w)為3/100-7/100 ;稻殼:大米粉(w/w)為40/100-50/100 ; 乳酸大米粉(v/m)為0. 5/100-1/100或黃水大米粉(v/m)為19/100-27/100。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l-3所述的利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，其特征在 于三角瓶固態(tài)發(fā)酵時(shí)，含水量為80% (大米粉質(zhì)量的80% )，接種量為10ml紅曲霉菌液， 裝瓶量為(90-100) g/500ml三角瓶或(200g_220) g/1000ml三角瓶，培養(yǎng)溫度為34。C，培養(yǎng) 時(shí)間為115h-125h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-3所述的利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，其特征在 于淺盤固態(tài)發(fā)酵時(shí)，含水量為120% -150% (大米粉質(zhì)量的百分?jǐn)?shù))，接種量為8% -10% (物料質(zhì)量的百分?jǐn)?shù))的三角瓶固態(tài)種子，物料厚度為4cm，培養(yǎng)溫度前48小時(shí)為34t:，后 期為32。C，培養(yǎng)時(shí)間為100h-110h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法，其特征在于 淺盤固態(tài)發(fā)酵時(shí)，物料在發(fā)酵期間由4層濕紗布或2層濕白布覆蓋，在培養(yǎng)48h后補(bǔ)入10% 水分(物料質(zhì)量的百分?jǐn)?shù))并更換滅菌了的濕紗布或濕白布。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用紅曲霉菌株生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑的方法。該方法以高產(chǎn)酯化酶的紅曲霉菌株為生產(chǎn)菌株，以大米粉、黃豆粉、乳酸或黃水為主料，以稻殼為輔料，采用固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)酯化酶粗酶制劑。本發(fā)明工藝簡單，不易污染，易操作，發(fā)酵時(shí)間短(5天)，生產(chǎn)出的酯化酶粗酶制劑的酯化力達(dá)80-160mg/100ml·7day。
文檔編號(hào)C12R1/66GK101775384SQ20101011594
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者劉念, 劉緒, 潘建軍 申請(qǐng)人:四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院