專利名稱：一種不動桿菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種可降解尼古丁的不動桿菌。同時，還涉及所述的不動桿菌在煙草生產(chǎn)中的新用途。
背景技術(shù)：
煙草是我國財政的重要支柱之一，隨著我國卷煙和煙葉市場的國際化程度逐步加 深，《煙草控制框架公約》對煙草制品的限制愈加嚴格，中國煙草面臨著新的形勢與挑戰(zhàn)。為 此，國家煙草專賣局制定了《中國卷煙科技發(fā)展綱要》，明確提出中國卷煙發(fā)展的方向是以 市場為導(dǎo)向，大力發(fā)展中式卷煙。而發(fā)展中式卷煙的關(guān)鍵技術(shù)就是要在保持高香氣的前提 下“減害降焦”，開發(fā)“低焦油、低危害、高香氣”的中式卷煙品牌。因此，降低煙草中尼古丁 等有害成分的含量，是促進卷煙工業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)之一。尼古丁是煙草生物堿中的主要成分，在煙草中，尼古丁大部分是以有機酸(如檸 檬酸和蘋果酸)鹽的狀態(tài)存在，也有少量的以自由狀態(tài)存在。尼古丁進入人體內(nèi)，90%被肺 部吸收，進入血液后6秒鐘即可到達大腦。尼古丁對人體最顯著的作用是對交感神經(jīng)產(chǎn)生 影響，通常表現(xiàn)為短暫的興奮，緊接著就是抑制。尼古丁的作用除了增加煙味和感受刺激 夕卜，主要還在于它所產(chǎn)生的生理強度，通常稱為“勁頭”。一般來講，尼古丁含量高的煙葉，煙 氣勁頭大，反之則小。因此，煙氣中含有一定量的尼古丁是必要的，但尼古丁的含量也不能 過高，否則不但會增加煙氣的刺激性，影響卷煙吸味，而且從安全性的角度來講也是一個非 常不利的因素。我國部分煙區(qū)的煙葉外觀質(zhì)量已接近國際水平，但就其內(nèi)在質(zhì)量而言還有一定差 距，其中一個較普遍且較突出的問題就是尼古丁含量偏高。目前，我國烤煙尼古丁的平均含 量為3% 4%，白肋煙平均高達6%，而美國烤煙的尼古丁含量在1. 5% 3. 5%之間；一 般優(yōu)質(zhì)白肋煙的尼古丁含量在1. 5% 4. 0%之間，以3. 0%為佳，美國白肋煙的尼古丁含 量為2. 9%左右。國內(nèi)卷煙企業(yè)目前貯存的上部煙葉較多，一般因其尼古丁含量較高而難以 較多用于葉組配方中，不僅占用了大量的倉儲空間，而且也造成了大量的浪費。這個問題已 引起有關(guān)方面的重視，如何降低這些煙葉中的尼古丁含量是各卷煙企業(yè)所面臨的一個現(xiàn)實 問題。同時由于煙草的連續(xù)栽培和大量廢棄煙葉的存在使土壤中的尼古丁含量大大提高， 對土壤環(huán)境和地下水質(zhì)造成了較大的影響，如何有效的消除尼古丁對環(huán)境的污染也是當前 人類發(fā)展所面臨的關(guān)鍵問題。目前，關(guān)于利用微生物降解尼古丁(煙堿)的研究已有報道。但經(jīng)文獻檢索，尚未 發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的尼古丁降解微生物不動桿菌。本發(fā)明進一步的目 的是提供一種所述微生物不動桿菌在煙草生產(chǎn)中的應(yīng)用，即提供一種能有效降低煙草中尼 古丁含量的方法。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。*除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分數(shù)均為質(zhì)量百分數(shù)。A.本發(fā)明從云南省昆明市煙草栽培土壤中分離了一株具有降解尼古丁能力的細 菌ND12，對其進行了形態(tài)學、生理生化性質(zhì)和16S rRNA分析，鑒定結(jié)果表明該細菌屬于不 動桿菌屬。其分類命名為Acinetobacter sp. ND12，保藏編號為CGMCC No. 3410。本發(fā)明所述的不動桿菌ND12菌株的主要形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)為不動桿 菌ND12菌株在顯微鏡下觀察為棒狀，無芽孢，不能運動。革蘭氏染色陰性。硝酸鹽還原 和接觸酶試驗為陽性，能液化吲哚，不能液化明膠，不能水解淀粉，甲基紅(MR)實驗陽性， 苯丙氨基酸脫氨酶和乙酰甲基甲醇(VP)實驗均為陰性。本菌株對葡萄糖、D-木糖和乙醇 發(fā)酵產(chǎn)酸；蔗糖、乳糖和甘露醇發(fā)酵不產(chǎn)酸。另外本菌株不能在45°C生長。ND12菌株在 Luria-Bertani (LB)平板上于28°C下培養(yǎng)48小時的培養(yǎng)特征為圓形，不透明，中間突起，灰 白色，中間略帶橙色，邊緣整齊。在以尼古丁為唯一碳氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48后不產(chǎn)生色
ο不動桿菌ND12 (Acinetobacter sp. ND12)菌株的分子鑒定特征為利用通用引物 20F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1500R(5，-GGTTACCTTGTTACGA CT-3，)，以不動桿 菌ND12的基因組DNA作為模板擴增得到1500bp左右的PCR產(chǎn)物，回收測序、校正之后得 到的ND12菌株的部分16S rRNA基因序列1435bp，該序列已經(jīng)遞交國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫 (GenBank)，序列索引號為GU176412。本發(fā)明提供了一種不動桿菌的生物制劑，該制劑按常規(guī)方法制備，即將不動桿菌 ND12 (Acinetobacter sp. ND12)擴大發(fā)酵培養(yǎng)后得到。B.本發(fā)明提供了一種所述微生物不動桿菌在煙草生產(chǎn)中的應(yīng)用，即該不動桿菌作 為降低煙草中尼古丁含量的生物催化劑應(yīng)用。其具體作法如下利用發(fā)酵培養(yǎng)基制備IOOOmL的發(fā)酵液，SOOOrpm離心15min收集菌體，把菌體用滅 菌的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)進行懸浮洗滌，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌體濃度OD值為 0. 5，該菌懸液即為用于降解尼古丁的菌制劑。稱取2g煙葉，噴灑5ml菌制劑，置于28°C恒 溫恒濕培養(yǎng)箱中12-24小時。煙葉中的90%煙堿即可被有效降解。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點1.試驗數(shù)據(jù)表明，不動桿菌制劑能有效降低煙葉中尼古丁的含量。本發(fā)明成功地 將生物技術(shù)引入煙草生產(chǎn)中，是煙草生產(chǎn)技術(shù)的一個重要突破；2.通過調(diào)整煙葉原料的尼古丁含量，大大提高煙葉可用性；分解煙塵中的尼古 丁，減少了對環(huán)境的污染；3.工藝簡單，操作容易，成本低，適于推廣應(yīng)用，對促進卷煙工業(yè)健康發(fā)展具有積 極意義。


圖1為不動桿菌ND12耐受尼古丁濃度試驗結(jié)果；圖2為不動桿菌ND12降解尼古丁的生長曲線；圖3為不動桿菌ND12降解煙葉中尼古丁的降解曲線。保藏生物材料的說明
本發(fā)明的菌株，已于2009年11月5日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(CGMCG)；該中心地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。該菌株分類 命名為 Acinetobacter sp. ND12，保藏編號為 CGMCC No. 3410。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。實施例1—不動桿菌ND12制劑的降解保山紅大C3F煙葉中尼古丁試驗( 一 )不動桿菌 ND12 (Acinetobacter sp. ND12)的培養(yǎng)方法1)試管斜面培養(yǎng)采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，配方為10克蛋白胨，10克氯化鈉，5克酵 母提取物，20克瓊脂，蒸餾水定容到1000毫升。121°C滅菌25分鐘，擺成斜面。接種 Acinetobacter sp. ND12，28°C培養(yǎng) 24 小時，獲得試管種。2)液體擴大培養(yǎng)A.種子培養(yǎng)(LB培養(yǎng)基)，配方為(克/升，g/v) :10克蛋白胨，10克氯化鈉，5克 酵母提取物，蒸餾水定容到1000毫升。121°C滅菌25分鐘。接種Acinetobacter sp. ND12 試管種，28°C培養(yǎng)12小時，獲得液體菌種。B.發(fā)酵培養(yǎng)基，配方為(克/升，g/v) :1克尼古丁，0.26克磷酸氫二鉀，0.8克磷 酸二氫鉀，0. 41克硫酸鎂，0. 1克硫酸鈣，0. 0039克鉬酸鈉，0. 005克硫酸亞鐵，0. 3克硫酸 銨，蒸餾水定容到1000毫升，pH 7.0。培養(yǎng)基初始pH 7.0，接種量(體積百分比，v/v)， 轉(zhuǎn)速150rpm，溫度28°C。發(fā)酵培養(yǎng)24小時。( 二 )不動桿菌ND12 (Acinetobacter sp. ND12)耐受尼古丁濃度試驗將培養(yǎng)12小時的液體菌種(0D600 0. 8)以1 % (液體菌種體積百分比，ν/ν) 的接種量接于尼古丁梯度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，尼古丁的梯度為0g/L、0. 5g/L、l. 0g/L、l. 5g/L、 2. 0g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L、4. Og/L 和 4. 5g/L，轉(zhuǎn)速 150rpm，溫度 28°C，培養(yǎng) 48 小時離 心收集菌體，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌三次后用等體積緩沖液重懸并測定菌體 濃度(0D600)(圖 1)。由圖1的試驗結(jié)果可見不動桿菌ND12菌株在本試驗條件下，最適生長的尼古丁 濃度為2. 5g/L，最高尼古丁耐受濃度為3. 5g/L。(三)不動桿菌NDl2 (Acinetobacter sp. ND12)的尼古丁降解曲線將培養(yǎng)12小時的液體菌種(0D600 0. 8)以1 % (液體菌種體積百分比，ν/ν)的 接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度28°C，每隔2小時取菌液，用高效 液相測定尼古丁含量，并測定菌體的濃度(0D600)(圖2)。由圖2的試驗結(jié)果可見隨著不動桿菌ND12菌株在培養(yǎng)液中的OD值增加，尼古丁 的濃度逐漸下降。當發(fā)酵時間為14小時，尼古丁基本被完全降解。在本試驗條件下，尼古 丁減少和菌體濃度的增加保持一致，0 6小時為其延滯期，6 14小時為指數(shù)生長期，到 16小時尼古丁降解完畢細菌生長進入穩(wěn)定期。
(四)不動桿菌ND12(Acinetobactersp. ND12)降解尼古丁菌制劑的制備利用發(fā)酵培養(yǎng)基制備IOOOmL的發(fā)酵液，SOOOrpm離心15min收集菌體，把菌體用滅 菌的緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)進行懸浮洗滌，SOOOrpm離心15min收集菌體，重 復(fù)兩次，菌體細胞最后用磷酸鹽緩沖液進行懸浮，并調(diào)整菌體濃度OD值為0. 5，該菌懸液即 為用于降解尼古丁的菌制劑。(五)不動桿菌ND12(Acinetobacter sp. ND12)制劑的降解煙葉中尼古丁試驗分別稱取2g保山紅大C3F煙葉，噴灑5ml菌制劑(0D為0. 5)，三個重復(fù)，反應(yīng)體 系為30ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)，以未噴灑菌制劑的煙葉作為對照，置于28°C、 150rpm搖床培養(yǎng)，每隔2h小時取樣一次，12000rpm離心5min，上清稀釋2倍后用過濾器(45 微米)過濾，最后用HPLC對煙堿進行定量檢測，而后還原為未稀釋時的煙堿濃度作出降解 曲線(圖3)。由圖3可得出結(jié)論在本試驗的條件下，ND12菌株降解煙葉 中尼古丁的效果明顯， 可以在Ilh內(nèi)在液體反應(yīng)液中降解C3F煙葉中90%的煙堿。同時，對照組煙堿含量基本保 持不變。因此，菌株ND12的菌制劑在煙草醇化，降解高濃度煙堿含量的煙草廢棄物中都有 潛在的應(yīng)用價值。實施例2——不動桿菌制劑用于降低煙葉K326中尼古丁含量1)不動桿菌制劑的制備不動桿菌的液體和固體培養(yǎng)，降解尼古丁菌制劑的制備 方法同實施例1.2)不動桿菌制劑用于降低煙葉K326中尼古丁含量稱取2g煙葉K326，噴灑5ml菌制劑，置于28°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中12_24小時。煙 葉中的90 %煙堿即可被有效降解。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種不動桿菌，其特征在于該不動桿菌的分類命名為Acinetobacter sp.ND12；保藏編號為CGMCC No.3410。
2.權(quán)利要求1所述的不動桿菌的應(yīng)用，其特征在于將該不動桿菌作為降低煙草中尼古 丁含量的生物催化劑應(yīng)用，其具體做法如下利用發(fā)酵培養(yǎng)基制備IOOOmL的發(fā)酵液，SOOOrpm離心15min收集菌體，把菌體用滅菌的 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)進行懸浮洗滌，并用磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌體濃度OD值為0.5， 該菌懸液即為用于降解尼古丁的菌制劑；稱取2g煙葉，噴灑5ml菌制劑，置于28°C恒溫恒 濕培養(yǎng)箱中12-24小時，煙葉中的90%煙堿即可被有效降解。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種不動桿菌及其用途。本發(fā)明由生產(chǎn)菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后得到相應(yīng)的制劑。生產(chǎn)菌株為不動桿菌(Acinetobacter sp.ND12)，該菌株已于2009年11月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3410。該菌株具有較強的尼古丁降解能力和尼古丁毒性抗性能力，可在高達3.5g/L尼古丁濃度下生長。通過大量培養(yǎng)該菌株，利用該菌株的完整細胞為生物催化劑可以降解純的尼古丁，同時能降解煙葉中的尼古丁含量。本發(fā)明具有能調(diào)整煙葉原料的尼古丁含量，提高煙葉可用性，及可分解煙塵中的尼古丁，減少其對環(huán)境污染等優(yōu)點。
文檔編號C12R1/01GK101818123SQ20101010420
公開日2010年9月1日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者張克勤, 曾曉鷹, 楊金奎, 段焰青, 王明鋒, 黃立斌, 黃靜文 申請人:紅云紅河煙草(集團)有限責任公司