專利名稱：一種甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物保護領(lǐng)域，尤其是一種快速、靈敏、特異性鑒別甘蔗黃葉病毒BRA和 CHNl兩種基因型的方法。
背景技術(shù)：
甘蔗黃葉病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus, SCYLV)侵染甘蔗引起甘蔗黃葉 病，該病毒自1992年首先在夏威夷發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已蔓延至全球30多個國家和地區(qū)，2001年 傳至我國臺灣地區(qū)，研究表明，該病已擴散至我國廣東、廣西、海南、福建和云南等蔗區(qū)。廣 西已將該病毒列為檢疫對象。甘蔗黃葉病可引起甘蔗減產(chǎn)15% 20% ，糖產(chǎn)量減少6% 14%，該病害已成為甘蔗生產(chǎn)中的重要限制因子之一。SCYLV僅分布于寄主韌皮部伴胞細(xì)胞 質(zhì)中，可通過種莖傳播，病毒隨帶毒甘蔗種質(zhì)資源的調(diào)運實現(xiàn)遠(yuǎn)距離傳播。研究表明，該病 毒不經(jīng)機械摩擦傳播，但可經(jīng)高粱蚜、玉米蚜、甘蔗綿蚜等以持久性方式傳播。在我國蔗區(qū)， 甘蔗綿蚜發(fā)生普遍，因此該病害有大發(fā)生的可能。加強蔗區(qū)間引種的檢疫，防止該病毒隨種 莖傳入新的蔗區(qū)，可有效防止該病害的擴散、蔓延。 研究表明，甘蔗黃葉病毒存在豐富的遺傳多樣性，因甘蔗品種、傳毒介體、環(huán)境條 件及與病毒之間的相互作用，導(dǎo)致許多甘蔗黃葉病毒的分離物核苷酸序列存在很大的差 異。在我國，侵染甘蔗的SCYLV主要以BRA基因型為主，另外也發(fā)現(xiàn)存在一個新的基因型 CHN1，利用RT-PCR技術(shù)，根據(jù)BRA和CHN1基因型分離物序列設(shè)計各自基因型的特異引物 對，建立基因型特異引物對RT-PCR技術(shù)以鑒別兩種基因型，確定兩種基因型在我國蔗區(qū)的 分布，對病毒的檢疫和抗病育種策略有重要指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗黃葉病毒BRA和CHNl兩種基因型的鑒別方法，快 速、靈敏、特異性的鑒別甘蔗黃葉病毒BRA和CHN1基因型，相比測序可減少實驗經(jīng)費并節(jié)省 時間。 本發(fā)明包括以下步驟
1) RT-PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的代表甘蔗黃葉病毒BRA基因型的分離物
SCYLV-A(登錄號AF157029)序列和周國輝等在我國蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的代表CHNl基因型
SCYLV-chnl序列。經(jīng)序列比對，根據(jù)兩種基因型代表分離物的序列差異，設(shè)計只可擴增BRA
基因型分離物的特異引物對B1/B2，預(yù)期擴增片段為766bp ;設(shè)計只可擴增CHNl基因型分離
物的特異引物對C1/C2，預(yù)期擴增片段為448bp，引物序列如下 BRA基因型特異引物對Bl:5' GAAACCGATTTTGATAATCTGTC 3'B2:5' CGGAGACTCATACACAAAATTA 3'CHNl基因型特異引物對
CI :5' GCTTCTCCCGGAGGTTCACT 3'
C2:5' TCGAGAACAACCTCCGCCTT 3'
2)甘蔗葉組織總RNA的抽提 采用H. Q. &. Q.溶液型RNA抽提試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)抽提新鮮 葉片組織總RNA，具體步驟為 (1)稱取60mg新鮮甘蔗葉片放入已滅菌的研缽中，加入液氮研磨成粉末狀后，迅 速加入lmL Reagent,充分研磨混勻后，轉(zhuǎn)至1. 5mL滅菌的離心管中； (2)向裝有研磨混合液的離心管中加入200iiL的氯仿，劇烈振蕩15s，冰浴中放置 lOmin j (3)室溫下，12000rpm，離心15min ; (4)取上清液(約400iiL)轉(zhuǎn)移至新的1.5mL滅菌的離心管中，加入500iiL異丙
醇后，漩渦混勻，室溫靜置lOmin ; (5)室溫下，12000rpm，離心lOmin ; (6)棄上清，加入80%乙醇lmL，室溫下，7500rpm，離心5min ;
(7)棄上清，加入無水乙醇lmL，室溫下，7500rpm，離心5min ;
(8)殘液用移液器吸出后，室溫下，風(fēng)干15min ; (9)加入100 ii L DEPC處理的滅菌ddH20，輕彈使充分溶解，稍離心后，置于_20°C 的冰箱中備用，作為RT-PCR擴增的模板。
3) RT-PCR擴增 以抽提的甘蔗葉組織的總RNA為模板，分別用兩對引物對RT-PCR進行一步法 RT-PCR擴增，擴增抽提的甘蔗樣品RNA， RT-PCR采用TaKaRa PrimeScriptOne St印RT-PCR
Kit Ver.2 (寶生物(大連)工程有限公司)試劑盒進行，具體步驟為
引物對B1/B2反應(yīng)體系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript lSt印Enzyme Mix2. Oil LBl(5iiM)1. Oil LB2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L總體積50. Oil L引物對C1/C2反應(yīng)體系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript lSt印Enzyme Mix2. Oil LBl(5iiM)1. Oil LB2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L總體積50. Oil L反應(yīng)體系在冰浴中配制，反應(yīng)程序:
5
50 °C 94 °C 94 °C 60 °C 72 。C 72 °C
30min ~^* 2min~^30s ~30s~lmin ~~5min
35cycles 4)電泳觀察結(jié)果 取5 ii L RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 2 %瓊脂糖凝膠，預(yù)先加入5 %的GoldenView。在 0. 5XTBE和90V的電壓下電泳40min后，用BI0-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察引物對B1/B2擴 增BRA基因型分離物可得到預(yù)期大小的目的條帶，而CHNl基因型分離物、健康的甘蔗植株 及清水對照中未擴增到任何條帶；引物對C1/C2擴增CHN1基因型分離物可得到預(yù)期大小的 目的條帶，而BRA基因型分離物、健康的甘蔗植株及清水對照中未擴增到任何條帶。
該發(fā)明的有益效果是根據(jù)甘蔗黃葉病毒兩種基因型BRA和CHNl的分離物的序列 差異，設(shè)計BRA基因型的特異性引物Bl/B2和CHNl基因型的特異性引物Cl/C2，提取甘蔗 葉組織的總RNA，采用RT-PCR擴增的方法，分別用兩種引物檢測甘蔗黃葉病毒，以此檢測 SCYLV及確定侵染甘蔗的SCYLV屬于哪種種基因型，提供了一種快速、靈敏、特異性的鑒別 甘蔗黃葉病毒兩種基因型的方法。


圖1是BRA基因型特異引物對B1/B2RT-PCR擴增檢測SCYLV基因型分離物電泳結(jié) 果圖，圖中 M :DL 2000DNA Marker ;1 :感染SCYLV BRA基因型的甘蔗葉片；2 :感染SCYLV CHNl 基因型的甘蔗葉片；3 :健康甘蔗葉片；4 :清水對照。 圖2是CHNl基因型特異引物對C1/C2RT-PCR擴增檢測SCYLV基因型分離物電泳
結(jié)果圖，圖中 M :DL 2000DNA Marker ;1 :感染SCYLV CHN1基因型的甘蔗葉片；2 :感染SCYLV BRA 基因型的甘蔗葉片；3 :健康甘蔗葉片；4 :清水對照。
具體實施例方式
l)RT-PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的代表甘蔗黃葉病毒BRA基因型的分離物 SCYLV-A(登錄號AF157029)序列和周國輝等在我國蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的代表CHNl基因型 SCYLV-chnl序列。經(jīng)序列比對，根據(jù)兩種基因型代表分離物的序列差異，設(shè)計只可擴增BRA 基因型分離物的特異引物對B1/B2，預(yù)期擴增片段為766bp ;設(shè)計只可擴增CHNl基因型分離 物的特異引物對C1/C2，預(yù)期擴增片段為448bp，引物序列如下
BRA基因型特異引物對
Bl:5' GAAACCGATTTTGATAATCTGTC 3'
B2:5' CGGAGACTCATACACAAAATTA 3'
CHNl基因型特異引物對
CI :5' GCTTCTCCCGGAGGTTCACT 3'
C2:5' TCGAGAACAACCTCCGCCTT 3'
2)甘蔗葉組織總RNA的抽提 采用H. Q. &. Q.溶液型RNA抽提試劑盒(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)抽提新鮮 葉片組織總RNA，具體步驟為 (1)稱取60mg新鮮甘蔗葉片放入已滅菌的研缽中，加入液氮研磨成粉末狀后，迅 速加入lmL Reagent,充分研磨混勻后，轉(zhuǎn)至1. 5mL滅菌的離心管中； (2)向裝有研磨混合液的離心管中加入200 L的氯仿，劇烈振蕩15s，冰浴中放置 lOmin j (3)室溫下，12000rpm，離心15min ; (4)取上清液(約400 L)轉(zhuǎn)移至新的1. 5mL滅菌的離心管中，加入500 y L異丙
醇后，漩渦混勻，室溫靜置lOmin ; (5)室溫下，12000rpm，離心lOmin ; (6)棄上清，加入80%乙醇lmL，室溫下，7500rpm，離心5min ;
(7)棄上清，加入無水乙醇lmL，室溫下，7500rpm，離心5min ;
(8)殘液用移液器吸出后，室溫下，風(fēng)干15min ; (9)加入100 ii L DEPC處理的滅菌ddH20，輕彈使充分溶解，稍離心后，置于_20°C 的冰箱中備用，作為RT-PCR擴增的模板。
3)RT-PCR擴增 分別用兩對引物RT-PCR擴增抽提的甘蔗樣品RNA， RT-PCR采用 TaKaRaPrimeScript One St印RT-PCR Kit Ver.2(寶生物(大連)工程有限公司)試劑盒 進行，具體步驟為引物對B1/B2反應(yīng)體系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript 1St印Enzyme Mix2. Oil LBl(5iiM)1. Oil LB2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L總體積50. Oil L引物對C1/C2反應(yīng)體系RNase Free dH2020. Oil L2XlSt印Buffer25. Oil LPrimeScript lSt印Enzyme Mix2. Oil LCI (5 ii M)1. Oil LC2 (5 ii M)1. Oil LRNA模板1. Oil L總體積50. Oil L反應(yīng)體系在冰浴中配制，反應(yīng)程序94 °C 60 °C 72 °C 72 °C
30s 30s lmin ~^ 5min
35cycles
4)電泳觀察結(jié)果 取5 ii L RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 2 %瓊脂糖凝膠(預(yù)先加入5 %的GoldenView)在 0. 5XTBE和90V的電壓下電泳40min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察引物對B1/B2擴 增BRA基因型分離物可得到預(yù)期大小的目的條帶，而CHNl基因型分離物、健康的甘蔗植株 及清水對照中未擴增到任何條帶；引物對C1/C2擴增CHN1基因型分離物可得到預(yù)期大小的 目的條帶，而BRA基因型分離物、健康的甘蔗植株及清水對照中未擴增到任何條帶。
50 C 94 C
30min ~2min
8
權(quán)利要求
一種甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法，其特征在于步驟如下1)RT-PCR引物設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的代表甘蔗黃葉病毒BRA基因型的分離物SCYLV-A(登錄號AF157029)序列和周國輝等在我國蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的代表CHN1基因型的SCYLV-chn1序列，經(jīng)序列比對，根據(jù)兩種基因型代表分離物的序列差異，設(shè)計只可擴增BRA基因型分離物的特異引物對B1/B2，預(yù)期擴增片段766bp；設(shè)計只可擴增CHN1基因型分離物的特異引物對C1/C2，預(yù)期擴增片段448bp，引物序列如下BRA基因型特異引物對B15’GAAACCGATTTTGATAATCTGTC 3’，B25’CGGAGACTCATACACAAAATTA 3’，CHN1基因型特異引物對C15’GCTTCTCCCGGAGGTTCACT 3’，C25’TCGAGAACAACCTCCGCCTT 3’，2)甘蔗葉組織總RNA的抽提采用H.Q.&.Q.溶液型RNA抽提試劑盒抽提新鮮葉片組織總RNA，具體步驟為(1)稱取60mg新鮮甘蔗葉片放入已滅菌的研缽中，加入液氮研磨成粉末狀后，迅速加入1mL Reagent，充分研磨混勻后，轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌的離心管中；(2)向裝有研磨混合液的離心管中加入200μL的氯仿，劇烈振蕩15s，冰浴中放置10min；(3)室溫下，12000rpm，離心15min；(4)取上清液(約400μL)轉(zhuǎn)移至新的1.5mL滅菌的離心管中，加入500μL異丙醇后，漩渦混勻，室溫靜置10min；(5)室溫下，12000rpm，離心10min；(6)棄上清，加入80％乙醇1mL，室溫下，7500rpm，離心5min；(7)棄上清，加入無水乙醇1mL，室溫下，7500rpm，離心5min；(8)殘液用移液器吸出后，室溫下，風(fēng)干15min；(9)加入100μL DEPC處理的滅菌ddH2O，輕彈使充分溶解，稍離心后，置于-20℃的冰箱中備用，作為RT-PCR擴增的模板；3)RT-PCR擴增以抽提的甘蔗葉組織的總RNA為模板，分別用兩對引物對RT-PCR進行一步法RT-PCR擴增，擴增抽提的甘蔗樣品RNA，RT-PCR采用TaKaRa PrimeScript OneStep RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進行，具體步驟為引物對B1/B2的反應(yīng)體系RNase Free dH2O 20.0μL2×1 Step Buffer 25.0μLPrimeScript 1Step Enzyme Mix 2.0μLB1(5μM) 1.0μLB2(5μM) 1.0μLRNA模板 1.0μL總體積50.0μL引物對C1/C2的反應(yīng)體系RNase Free dH2O 20.0μL2×1 Step Buffer 25.0μLPrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0μLC1(5μM) 1.0μLC2(5μM) 1.0μLRNA模板 1.0μL總體積50.0μL所述反應(yīng)體系在冰浴中配制，反應(yīng)程序4)電泳觀察結(jié)果取5μL RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠在0.5×TBE和90V的電壓下電泳40min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察引物對B1/B2擴增BRA基因型分離物可得到預(yù)期大小的目的條帶，而CHN1基因型分離物、健康的甘蔗植株及清水對照中未擴增到任何條帶；引物對C1/C2擴增CHN1基因型分離物可得到預(yù)期大小的目的條帶，而BRA基因型分離物、健康的甘蔗植株及清水對照中未擴增到任何條帶。FSA00000019449000021.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法，其特征在于BRA基因型的RT-PCR擴增特異引物對為Bl/B2，目的條帶為766bp。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法，其特征在于CHN1基因型的RT-PCR擴增特異引物對為Cl/C2，目的條帶為448bp。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法，其特征在于RT-PCR擴增中的退火溫度為60°C。
全文摘要
一種甘蔗黃葉病毒兩種基因型的鑒別方法，根據(jù)甘蔗黃葉病毒BRA和CHN1兩種基因型分離物的序列差異，設(shè)計只可擴增BRA基因型分離物的特異引物對B1/B2和只可擴增CHN1基因型分離物的特異引物對C1/C2，以抽提的甘蔗葉組織的總RNA為模板，分別用兩對引物對RT-PCR進行一步法RT-PCR擴增，通過觀察檢測SCYLV并同時確定侵染甘蔗的SCYLV的基因型；該方法能快速、靈敏、特異性的鑒別甘蔗黃葉病毒BRA和CHN1基因型，相比測序可減少實驗經(jīng)費并節(jié)省時間。
文檔編號C12Q1/68GK101736093SQ20101010382
公開日2010年6月16日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者李文鳳, 王明強, 王曉燕, 羅志明, 黃應(yīng)昆 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所