專利名稱：從人骨髓單核級(jí)分獲得結(jié)締間質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得間質(zhì)干細(xì)胞的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及一種從人骨髓細(xì)胞的單核級(jí)分獲得間質(zhì)干細(xì)胞的方法。所述方法包含獲得所述單核骨髓級(jí)分的階段，回收和預(yù)擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的階段，以及擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞直到獲得可能的治療應(yīng)用所必需的臨床劑量的階段。
背景技術(shù)：
間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是多能細(xì)胞，已被證實(shí)可有效地治療肌骨病變和提高心血管疾病中的心臟功能(Le Blanc K. ,Pittenger M. ,Mesenchymal stem cells progress toward promise. Cytotherapy 2005 ；7 :36-45)。MSC可從包括骨髓、脂肪組織和臍帶血在內(nèi)的多種成人組織分離。除此以外，這些細(xì)胞可在體外擴(kuò)增。單核骨髓級(jí)分(MMF)是通過(guò)基于離心從骨髓獲得的血液的分離操作來(lái)獲得。MMF 是異種細(xì)胞群，其除了包含間質(zhì)干細(xì)胞外，還可能包含造血祖細(xì)胞。相對(duì)于在MMF中同樣存在的成熟造血細(xì)胞，這兩個(gè)細(xì)胞群體以極小濃度存在。Fridenshtein 等人(Fridenshtein A. J. , Deriglazova U. F. , Kulagina N. N.等 A Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hemato1. 1974 第 2 卷第 83-92頁(yè))最先從骨髓獲得了間質(zhì)干細(xì)胞，其技術(shù)是基于間質(zhì)干細(xì)胞粘附塑料表面的能力，這是大多數(shù)造血細(xì)胞所不具有的性質(zhì)。這種方法的缺點(diǎn)是間質(zhì)細(xì)胞的回收產(chǎn)率很低， 這可能是因?yàn)樗黾?xì)胞在骨髓中的含量并不高，估計(jì)在0.001%與0.01%之間(Alhadlag A.禾口 Mao J. Mesenchymal Stem Cells :Isolation and Therapeutics. Stem Cells and Development. 2004. 13 :436-448 (3))。然而，所述細(xì)胞與塑料粘附已被確立為獲得間質(zhì)干細(xì)胞的方法的進(jìn)一步改良的起點(diǎn)。Heynesworth等人使用胎牛血清作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充物，已經(jīng)成功獲得了間質(zhì)干細(xì)胞，其具有高粘附能力、高增殖水平且歷經(jīng)長(zhǎng)時(shí)期仍保持多能性(Heynesworth S. Ε.， Goshima J.，Goldberg V. Μ.，Calplan Α. I. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow//Bone. 1995.第 13 卷·第 81-85 頁(yè))。這禾中方法的缺點(diǎn)是搜索細(xì)胞培養(yǎng)的合適批次和胎牛血清的相應(yīng)分析要花費(fèi)大量時(shí)間且非常繁瑣。 此外，因?yàn)樘ヅＱ宓呐闻c批次之間顯示巨大變化，所以無(wú)法確保結(jié)果可以再現(xiàn)。這種方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是，為了獲得足量的用于臨床應(yīng)用的間質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞必須培養(yǎng)4到6周，且在一些情況下，例如在患有骨代謝疾病的患者中，培養(yǎng)時(shí)間可能更長(zhǎng)。之所以需要所述長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間的原因是，如先前所述，從骨髓獲得的間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量很少。長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間可能增加污染風(fēng)險(xiǎn)且顯著增加培養(yǎng)物的維持成本。此外，由于復(fù)制數(shù)增加，因此細(xì)胞存在可能喪失多能性或進(jìn)入衰老的風(fēng)險(xiǎn)，這會(huì)損害其治療能力。通常用于縮短間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的方法的關(guān)注點(diǎn)集中在例如培養(yǎng)基的補(bǔ)充物、 塑料表面的性質(zhì)、接種劑量和所用培養(yǎng)方式等因素(Sotiropolou P.A.，Perez S. A.，
3Salagianni M, Baxevanis C. N. , Papamichail M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006 ；24 :462-471)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種用于體外培養(yǎng)人骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞的方法，其中獲得間質(zhì)干細(xì)胞的臨床劑量所必需的時(shí)間和復(fù)制數(shù)相比常規(guī)方法有所減少。這種程序是基于組合用于從單核骨髓級(jí)分分離間質(zhì)細(xì)胞的高特異性條件和使用AB血型的人血清作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充物的協(xié)同效應(yīng)。所述程序可用作昂貴且很難再現(xiàn)的胎牛血清的替代方案。此外， 人AB血清具有以下優(yōu)點(diǎn)，即其比胎牛血清更經(jīng)濟(jì)且提供更好的再現(xiàn)性。另外，與常規(guī)策略中使用的條件相比，提議的分離條件允許從單核級(jí)分容易地回收大量間質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)認(rèn)識(shí)到分離的可用間質(zhì)細(xì)胞的起始數(shù)量越多，獲得必需臨床劑量所需要的時(shí)間和資源就越少時(shí)， 所述事實(shí)尤其重要。通過(guò)系統(tǒng)性研究這些分離條件對(duì)于從接種體回收間質(zhì)細(xì)胞以及在補(bǔ)充有人AB血清的培養(yǎng)基中的單核骨髓細(xì)胞的洗滌時(shí)間的影響，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了所述條件。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種可獲得間質(zhì)干細(xì)胞的相同備用拷貝的方法，所述備用拷貝在增殖和分化能力方面具有與初始間質(zhì)干細(xì)胞相同的特征。根據(jù)本發(fā)明的方法可用于從例如脂肪組織、胰腺、肝臟、肌骨、真皮、滑膜、小梁骨、 臍帶血、肺組織、牙髓和牙周結(jié)締組織等其它來(lái)源獲得間質(zhì)細(xì)胞。在間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源不是骨髓的情況下，對(duì)于用作來(lái)源的每一種細(xì)胞類型，初始治療將適當(dāng)?shù)赜兴鶇^(qū)別。
具體實(shí)施例方式因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種從通過(guò)密度梯度離心獲得的人骨髓單核級(jí)分獲得間質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于其包含以下階段a)遵循以下培養(yǎng)方案，通過(guò)原代培養(yǎng)回收和預(yù)擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞，其中將單核骨髓細(xì)胞接種到補(bǔ)充有人AB血清(10%)的DMEM培養(yǎng)基中-在第5天用鹽水溶液洗滌單核培養(yǎng)細(xì)胞，并加入補(bǔ)充有人AB血清(10%)的培
養(yǎng)基，-在9天后用如上所述的相同培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，-在第12天用胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)物。這些細(xì)胞產(chǎn)生擴(kuò)增培養(yǎng)物(C)，b)繼代培養(yǎng)遵循以下培養(yǎng)方案，將在(a)中經(jīng)洗滌的單核細(xì)胞再接種到補(bǔ)充有人AB血清(10%)的培養(yǎng)基中-在第5天用鹽水溶液洗滌培養(yǎng)物，并加入補(bǔ)充有人AB血清(10%)的培養(yǎng)基，-在第9天用如前所述的相同培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，-在第12天用胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)物。回收間質(zhì)干細(xì)胞并在氮?dú)馊萜髦欣鋬龊蛢?chǔ)存。c)擴(kuò)增培養(yǎng)在第12天擴(kuò)增a)中獲得的間質(zhì)細(xì)胞。遵循以下培養(yǎng)方案，將這些細(xì)胞在補(bǔ)充有人AB血清(10% )的培養(yǎng)基中再接種和擴(kuò)增-在第3天和第6天用如前所述的相同培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基，
-在第12天用胰蛋白酶消化培養(yǎng)基。包裝這些細(xì)胞以便轉(zhuǎn)移到手術(shù)室。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在原代培養(yǎng)中每平方厘米表面積接種200，000到400，000 個(gè)細(xì)胞。此外，用于原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)(階段b)的培養(yǎng)基優(yōu)選是補(bǔ)充有10% (ν/ν)人 AB血清的杜貝卡改良依格培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle ;DMEM)。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)是，與常規(guī)方法相比，在介于6與8之間的低復(fù)制數(shù)下和較短時(shí)期(約20天)內(nèi)可獲得介于40xl06與50xl06之間的大量間質(zhì)干細(xì)胞。此外，另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，通過(guò)冷凍在繼代培養(yǎng)(步驟b))中獲得的間質(zhì)干細(xì)胞，可以產(chǎn)生必需劑量的細(xì)胞以防止該方法因意外原因失敗，或獲得間質(zhì)干細(xì)胞的相同備用拷貝根據(jù)本發(fā)明的方法還具有操作簡(jiǎn)單和成本低的額外優(yōu)點(diǎn)，這是因?yàn)榧炔恍枰笠?guī)模培養(yǎng)也不需要使用胎牛血清。下文參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明。然而，此實(shí)施例并不打算限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。實(shí)施例實(shí)施例1將通過(guò)骨髓血提取物的梯度離心而獲得的單核骨髓細(xì)胞以每平方厘米300，000 個(gè)的密度接種到636cm2商用培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶含有補(bǔ)充有人AB血清(10%)的DMEM培養(yǎng)基。5天后洗滌培養(yǎng)物，并將上清液接種到另一個(gè)636cm2商用培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶含有補(bǔ)充有人AB血清(10% )的DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基(補(bǔ)充有人AB血清(10% )的DMEM) 加入所述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)面積與培養(yǎng)基體積的比率是3 1。在第9天，置換培養(yǎng)基并加入培養(yǎng)基(補(bǔ)充有人AB血清(10%)的DMEM)，培養(yǎng)面積/培養(yǎng)基體積的比率是3 1。在第 12天，用胰蛋白酶消化培養(yǎng)物，并獲得15xl06到20xl06個(gè)間質(zhì)干細(xì)胞，純度為約80%。這些細(xì)胞以4000個(gè)細(xì)胞/平方厘米的密度接種到兩個(gè)636cm2商用培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶含有補(bǔ)充有人AB血清(10%)的DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)8天，期間使用補(bǔ)充有人AB血清 (10% )的DMEM培養(yǎng)基，以3 1的培養(yǎng)面積/培養(yǎng)基體積比置換兩次培養(yǎng)基(第3天和第6天)。將原代培養(yǎng)中的非粘附細(xì)胞接種到繼代培養(yǎng)(步驟b))中，在繼代培養(yǎng)(步驟b)) 開(kāi)始5天后洗滌，并丟棄洗滌液。在第9天，置換培養(yǎng)基并加入培養(yǎng)基(補(bǔ)充有人AB血清 (10%)的DMEM)，培養(yǎng)面積/培養(yǎng)基體積的比率是3 1。在第12天，用胰蛋白酶消化培養(yǎng)物，并獲得3xl06到6xl06個(gè)間質(zhì)干細(xì)胞，純度為約65%。所得細(xì)胞在氮?dú)夤拗欣鋬觥Ｔ谠囵B(yǎng)中獲得的細(xì)胞所展示的免疫表型譜圖中，展示了標(biāo)志物105、90、73的共表達(dá)，但未展示標(biāo)志物⑶45、⑶31、HLA-DR的表達(dá)，這通常和來(lái)源于骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)。此外，所得細(xì)胞展示了從骨細(xì)胞系分化的能力，這證明已經(jīng)保持了多能性。另一方面， 在繼代培養(yǎng)(步驟b))中獲得的細(xì)胞的免疫表型譜圖中，展示了標(biāo)志物105、90、73的共表達(dá)，但未展示標(biāo)志物⑶45、⑶31、HLA-DR的表達(dá)，這通常和來(lái)源于骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)。 除此以外，所得細(xì)胞展示了從骨和脂肪細(xì)胞系分化的能力，這證明已經(jīng)保持了多能性。雖然已參考優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明，本發(fā)明是由以下權(quán)利要求的最廣泛的解釋限定范圍。
權(quán)利要求
1.一種從通過(guò)密度梯度離心獲得的人骨髓的單核級(jí)分獲得間質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于包含以下階段a)遵循以下培養(yǎng)方案，通過(guò)原代培養(yǎng)回收和預(yù)擴(kuò)增所述間質(zhì)干細(xì)胞，其中該單核骨髓細(xì)胞接種到補(bǔ)充有人AB血清(10% )的DMEM培養(yǎng)基中1.在第5天用鹽水溶液洗滌所述單核培養(yǎng)細(xì)胞，并加入補(bǔ)充有人AB血清(10%)的培養(yǎng)基， .在第9天用如前所述的相同培養(yǎng)基置換所述培養(yǎng)基，iii.在第12天用胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)物，這些細(xì)胞產(chǎn)生擴(kuò)增培養(yǎng)物(c)，b)繼代培養(yǎng)遵循以下培養(yǎng)方案，將在(a)中經(jīng)洗滌的所述單核細(xì)胞再接種到補(bǔ)充有人AB血清(10%)的培養(yǎng)基中iv.在第5天用鹽水溶液洗滌所述培養(yǎng)物，并加入補(bǔ)充有人AB血清(10%)的培養(yǎng)基，v.在第9天用如前所述的相同培養(yǎng)基置換所述培養(yǎng)基，vi.在第12天用胰蛋白酶消化所述原代培養(yǎng)物，回收所述間質(zhì)干細(xì)胞并在氮?dú)馊萜髦欣鋬龊蛢?chǔ)存，c)擴(kuò)增培養(yǎng)在第12天擴(kuò)增(a)中獲得的所述間質(zhì)細(xì)胞，遵循以下培養(yǎng)方案，將這些細(xì)胞在補(bǔ)充有人AB血清(10% )的培養(yǎng)基中再接種和擴(kuò)增vii.在第3天和第6天用如前所述的相同培養(yǎng)基置換所述培養(yǎng)基，viii.在第12天用胰蛋白酶消化所述原代培養(yǎng)物，包裝這些細(xì)胞以便轉(zhuǎn)移到手術(shù)室。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在階段(a)中接種的單核骨髓細(xì)胞的數(shù)量介于每平方厘米表面積200，000與400，000個(gè)細(xì)胞之間。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在階段(b)中接種的間質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量介于每平方厘米表面積3000與5000個(gè)細(xì)胞之間。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在來(lái)自階段(a)的所述原代培養(yǎng)物中獲得15x IO6到20x IO6個(gè)間質(zhì)干細(xì)胞。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述繼代培養(yǎng)物(階段(b))中獲得 3x IO6到6x IO6個(gè)間質(zhì)干細(xì)胞。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在階段(a)的所述原代培養(yǎng)物中獲得的所述間質(zhì)干細(xì)胞的純度是80%。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述繼代培養(yǎng)物(階段(b))中獲得的所述間質(zhì)干細(xì)胞的純度是65%。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在階段(c)中獲得40xIO6到50x IO6 個(gè)間質(zhì)干細(xì)胞。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞復(fù)制數(shù)介于6與8之間。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中獲得間質(zhì)干細(xì)胞的總時(shí)間不超過(guò)21天。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述繼代培養(yǎng)物(階段(b))被冷凍和保存以作為備份拷貝。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用AB型人血清作為補(bǔ)充物，從人骨髓細(xì)胞單核級(jí)分獲得結(jié)締間質(zhì)干細(xì)胞的方法。所述方法包含獲得所述骨髓單核級(jí)分的步驟，回收和預(yù)擴(kuò)增結(jié)締干細(xì)胞的步驟，以及擴(kuò)增結(jié)締干細(xì)胞直到獲得其治療應(yīng)用所必需的臨床劑量的步驟。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102388129SQ200980157235
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月2日
發(fā)明者喬迪·瓊·開(kāi)羅巴迪洛, 盧西亞諾·羅德里格斯戈麥斯, 弗朗西斯科·戈迪亞卡薩布蘭卡斯, 瓊·加西亞洛佩茲, 阿爾諾·普拉卡爾韋 申請(qǐng)人:血液與組織庫(kù)