專利名稱：屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法。
背景技術(shù)：
屬于Geosmithia屬的菌類廣泛分布于自然界，在蔬菜、水果等農(nóng)作物上繁殖，并污染以這些農(nóng)作物為原料的飲食品。然而，由于屬于Geosmithia屬的菌類形成了具有高耐熱性的厚膜孢子，因此即使進(jìn)行對通常的其它真菌類的殺菌處理工序，例如對酸性飲料進(jìn)行加熱滅菌處理等，屬于Geosmithia屬的菌類也可以生存、繁殖，從而成為造成發(fā)霉的原因。因此，屬于Geosmithia屬的菌類被作為引起重大品質(zhì)事故的重要有害菌而被戒備。為了防止由于飲食品及其原材料中的屬于Geosmithia屬的菌類造成的事故，屬于 Geosmithia屬的菌類的檢測和鑒定變得非常重要?，F(xiàn)在，屬于Geosmithia屬的菌類的檢測和鑒定是在菌體培養(yǎng)后，通過觀察形態(tài)學(xué)上的特征來進(jìn)行的。由于這種方法需要持續(xù)培養(yǎng)直至產(chǎn)生形態(tài)學(xué)上的特征，因此最短也需要14天以上的長時間。此外，由于基于細(xì)微的形態(tài)學(xué)上的特征來鑒定菌類而需要高度的專業(yè)知識，因而不可否認(rèn)存在判定者不同而鑒定結(jié)果不同的危險性。而且，還存在由于加熱或者藥劑等造成損傷菌體等失去形態(tài)形成能力的情況，由于這些菌體即使進(jìn)行長時間培養(yǎng)也無法形成特征形態(tài)而在鑒定結(jié)果的信賴性方面產(chǎn)生問題。這樣的菌類的檢測需要長時間， 這從飲食品的衛(wèi)生管理、原材料的鮮度保證、流通上的限制等觀點(diǎn)來看，肯定無法得到滿足。因此，需要確立解決了迅速性以及信賴性的問題的檢測、鑒定方法。作為菌類的迅速且信賴性高的檢測方法，已知有將基因的特定的堿基序列作為目標(biāo)的擴(kuò)增法(例如PCR)法進(jìn)行的檢測方法(例如，參考專利文獻(xiàn)1 4)。但是，上述方法對于屬于Geosmithia屬的菌類的特異性基因區(qū)域沒有進(jìn)行闡明。因此，具有難于特異性且迅速地檢測屬于Geosmithia屬的菌類的問題。專利文獻(xiàn)1 特表平11-5057 號公報專利文獻(xiàn)2 特開2006-61152號公報專利文獻(xiàn)3 特開2006-304763號公報專利文獻(xiàn)4 特開2007-174903號公報

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供一種能夠特異性、簡便且迅速地檢測作為飲食品污染的主要的原因菌之一的屬于Geosmithia屬的菌類的方法。此外，本發(fā)明的課題還在于提供用于該檢測方法的屬于Geosmithia屬的菌類的特異性堿基序列所表示的DNA、能夠與該堿基序列所表示的核酸雜交的寡核苷酸、以及使用該寡核苷酸的引物對和檢測試劑盒。鑒于上述課題，本發(fā)明人對能夠特異性識別屬于Geosmithia屬的菌類的方法進(jìn)行了探索和深入的研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)在屬于Geosmithia屬的菌類的β -微管蛋白基因序列中，存在著與其他真菌的屬有明顯區(qū)別的具有特異性堿基序列的區(qū)域(以下，稱其為“可變區(qū)域”)。將該可變區(qū)域作為靶點(diǎn)，就可以特異性且迅速地檢測屬于Geosmithia屬的菌類?；诖税l(fā)現(xiàn)從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法，其特征在于，用以下述 (a)或者(b)所記載的堿基序列表示的核酸，對屬于Geosmithia屬的菌類進(jìn)行鑒定，(a)序列號1 3中任一個所記載的β -微管蛋白基因的部分堿基序列或者其互補(bǔ)序列；(b)在序列號1 3中任一個所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列。此外，本發(fā)明涉及一種由前述(a)或者(b)所記載的堿基序列來表示的DNA，其用于檢測屬于Geosmithia屬的菌類。此外，本發(fā)明涉及一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用寡核苷酸，其能夠與以前述(a)或者(b)所記載的堿基序列表示的核酸進(jìn)行雜交，并且作為用于特異性檢測屬于 Geosmithia屬的菌類的核酸探針或者核酸引物而發(fā)揮功能。此外，本發(fā)明涉及一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用寡核苷酸，其特征在于， 所述檢測用寡核苷酸為下述(c)或(d)的寡核苷酸；以及本發(fā)明涉及一種屬于Geosmithia 屬的菌類檢測用試劑盒，其中，所述試劑盒含有下述(c)或(d)的寡核苷酸。以(c)序列號4所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為檢測用寡核苷酸使用的寡核苷酸；以(d)序列號5所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為檢測用寡核苷酸使用的寡核苷酸。進(jìn)而，本發(fā)明涉及一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用核酸引物對，其中，所述檢測用核酸引物對由下述(e)和(f)的寡核苷酸構(gòu)成；以及，本發(fā)明涉及一種屬于 Geosmithia屬的菌類檢測用試劑盒，其中，所述檢測用試劑盒含有該引物對。以(e)序列號4所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸；以(f)序列號5所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，提供能夠特異性、簡便且迅速地檢測作為飲食品污染的主要的原因菌之一的屬于Geosmithia屬的菌類。此外，根據(jù)本發(fā)明，還提供用于在該檢測方法中使用的屬于Geosmithia屬的菌類的特異性β -微管蛋白基因的堿基序列所表示的DNA，能夠與該堿基序列所表示的核酸進(jìn)行雜交的寡核苷酸，以及使用該寡核苷酸的引物對和檢測試劑
品.ο本發(fā)明的上述以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)，通過參考適當(dāng)?shù)母綀D并從下述記載中更為明確。


圖1是實施例中PCR產(chǎn)物的電泳圖。
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圖2是實施例中PCR產(chǎn)物的電泳圖。
具體實施例方式以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明是使用屬于Geosmithia屬的菌類的β -微管蛋白基因的特定的部分堿基序列，即屬于Geosmithia屬的菌類的β -微管蛋白基因序列中存在的Geosmithia屬的特異性區(qū)域(可變區(qū)域)的堿基序列所表示的核酸，進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的鑒定， 對屬于Geosmithia屬的菌類進(jìn)行特異性識別、檢測的方法。本發(fā)明中的“屬于Geosmithia屬的菌類”是絲狀不完全菌類的一種。屬于 Geosmithia屬的菌類形成有即使在無性世代的生活環(huán)境下經(jīng)過75°C、30分鐘的加熱處理后也能夠生存的具有高耐熱性的厚膜孢子。作為屬于Geosmithia屬的菌類中危害性特另Ij 高的菌種，可列舉 Geosmithia eburneus、Geosmithia byssochlamydoide、以及 Geosmithia emersonii。此外，在本發(fā)明的Geosmithia屬的菌種還包含作為同屬的有性世代的 Talaromyces eburneus、Talaromyces byssochlamydoides、以及埃默森籃狀菌 (Talaromyces emersonii)。“ β -微管蛋白”是指構(gòu)成微管的蛋白質(zhì)，“ β -微管蛋白基因”是指編碼β -微管蛋白的基因。此外，本發(fā)明中“β_微管蛋白基因的可變區(qū)域”是指在微管蛋白基因中， 堿基的變異容易積累的特定區(qū)域。在本發(fā)明的檢測方法中“使用微管蛋白的部分堿基序列所表示的核酸進(jìn)行鑒定”是指，使用該部分堿基序列的全部或者其一部分的序列所表示的核酸進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的檢測方法的特征在于使用屬于Geosmithia屬的菌類的β-微管蛋白基因中的特定(可變)區(qū)域的堿基序列所表示的核酸。本發(fā)明人鑒定了含有Geosmithia屬的各種菌類的β-微管蛋白基因的堿基序列， 并對真菌屬之間的遺傳距離與堿基序列的同源性進(jìn)行了分析。具體而言，通過測序法來鑒定各真菌的微管蛋白基因的堿基序列，通過比對分析對共同的堿基區(qū)域進(jìn)行研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微管蛋白基因中具有同一屬內(nèi)保守性高而不同屬之間保守性低的，即，具有屬固有的堿基序列的區(qū)域(可變區(qū)域)。在此可變區(qū)域中屬于Geosmithia屬的菌類具有其固有的堿基序列。因此，該區(qū)域作為用于屬水平上識別、鑒定屬于Geosmithia屬的菌類的遺傳學(xué)的指標(biāo)有用。此外，本發(fā)明人對在上述可變區(qū)域中，從該區(qū)域中選擇的滿足以下4個條件的部分區(qū)域進(jìn)行了進(jìn)一步研究(1)含有屬于Geosmithia屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續(xù)出現(xiàn)的區(qū)域；(2)寡核苷酸的GC含量大概為30% 80% ； (3)寡核苷酸的自退火的可能性低；(4)寡核苷酸的Tm(解鏈溫度melting temperature)值大概為 55°C以上。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)了來源于可變區(qū)域的堿基序列的15 25個堿基的寡核苷酸。本發(fā)明將該可變區(qū)域以及來源于該可變區(qū)域的寡核苷酸作為目標(biāo)。本發(fā)明的檢測方法中所使用的屬于Geosmithia屬的菌類的β _微管蛋白基因的部分堿基序列(可變區(qū)域的堿基序列)所表示的核酸是以序列號1、序列號2或者序列號3 所記載的堿基序列或者其互補(bǔ)序列表示的核酸。序列號1所記載的堿基序列及其互補(bǔ)序列是從Geosmithia eburneus分離、鑒定的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列。序列號2所記載的堿基序列及其互補(bǔ)序列是從Geosmithia byssochlamydoides分離、鑒定的β -微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列。序列號3所記載的堿基序列及其互補(bǔ)序列是從Geosmithia emersonii分離、鑒定的 β-微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列。由于這些序列在屬于Geosmithia屬的菌類間的同源性非常高，并且與屬于Geosmithia屬的菌類以外的菌類的同源性低，因此，通過確認(rèn)被檢測體是否具有這些堿基序列，從而能夠特異性地識別、鑒定僅屬于Geosmithia屬的菌類。此外，即使使用在序列號1、序列號2或者序列號3所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列所表示的核酸，也能夠特異性地識別、鑒定僅屬于Geosmithia屬的菌類。在此，“1個或者數(shù)個”優(yōu)選為1 25個，更優(yōu)選為1 20個，更優(yōu)選為1 15個，進(jìn)一步優(yōu)選為1 10個，更進(jìn)一步優(yōu)選為 1 5個。(以下，將序列號1、序列號2或者序列號3所記載的堿基序列或者其互補(bǔ)序列， 以及在序列號1、序列號2或者序列號3所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列統(tǒng)稱為“本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列”。)作為使用上述本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列所表示的核酸來鑒定屬于Geosmithia屬的菌類的方法沒有特別限制，可以用基因工程中通常使用的方法如測序法、雜交法、PCR法、LAMP法等進(jìn)行。在本發(fā)明的檢測方法中，使用上述本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列所表示的核酸來進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的鑒定時，優(yōu)選測定被檢測體的β -微管蛋白基因區(qū)域的堿基序列，然后確認(rèn)在該基因的堿基序列中是否含有上述(a)或者(b) 所記載的核酸的堿基序列。具體而言，本發(fā)明的檢測方法是分析、測定被檢測體所具有的 β-微管蛋白基因的堿基序列，將測定后的堿基序列與本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列進(jìn)行比較，根據(jù)其是否一致或者不同來進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的鑒定。作為堿基序列的分析、測定方法并沒有特別限定，可以利用通常進(jìn)行的RNA或者 DNA測序的方法。具體地，可以列舉Maxam-Gilbert法、Sanger法等的電泳法、質(zhì)譜法、雜交法等。在 Sanger法中，可以列舉用放射性標(biāo)記法、熒光標(biāo)記法等來標(biāo)記引物或者終止子的方法。在本發(fā)明的檢測方法中，在使用上述本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列所表示的核酸來進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的鑒定時，優(yōu)選將堿基序列的全部或者部分的區(qū)域作為目標(biāo)，進(jìn)行使用了核酸探針的雜交。在本發(fā)明中，為了使用上述本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列所表示的核酸對屬于Geosmithia屬的菌類進(jìn)行鑒定、檢測，可以使用能夠與本發(fā)明的β-微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列所表示的核酸進(jìn)行雜交，并且能夠作為核酸探針或者核酸引物而發(fā)揮功能的檢測用寡核苷酸。本發(fā)明的檢測用寡核苷酸，只要是能夠用于屬于Geosmithia屬的菌類的檢測的寡核苷酸即可。具體而言，可以是能夠作為用于檢測屬于Geosmithia屬的菌類的核酸引物或者核酸探針來使用的寡核苷酸，或者是在嚴(yán)格條件下能夠與屬于Geosmithia屬的菌類的微管蛋白基因進(jìn)行雜交的寡核苷酸。另外，這里，作為“嚴(yán)格條件”，例如可以列舉 Molecular Cloning-Α LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell. , Cold Spring Harbor LaboratoryPress]所記載的方法，例如， 將含有 6XSSC(1XSSC 的組成0. 15M 氯化鈉，0. 015M 檸檬酸鈉，pH7. 0),0. 5 % SDS, 5 XDenhardt' s溶液以及100mg/ml鯡魚精DNA的溶液與探針一起在65°C下保溫8 16 小時并進(jìn)行雜交的條件。作為本發(fā)明的上述檢測用寡核苷酸，是從前述本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列中選擇的區(qū)域，優(yōu)選能夠與滿足以下4個條件的區(qū)域雜交的寡核苷酸(1) 含有屬于Geosmithia屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續(xù)出現(xiàn)的區(qū)域；(2)寡核苷酸的GC含量大概為30% 80%; (3)寡核苷酸的自退火的可能性低；(4)寡核苷酸的Tm值大概為55°C以上。在此，“GC含量”是指鳥嘌呤和胞嘧啶的總數(shù)相對于寡核苷酸的全部堿基數(shù)的比例(％)。在上述(1)中，“含有屬于Geosmithia屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約 10個堿基連續(xù)出現(xiàn)的區(qū)域”是指，即使在前述本發(fā)明的β -微管蛋白基因的可變區(qū)域中，不同屬之間的堿基序列的保守性特別低(即，屬于Geosmithia屬的菌類的特異性特別高)，屬于Geosmithia屬的菌類所固有的堿基序列以大約10個堿基連續(xù)出現(xiàn)的區(qū)域。此外，在上述(3)中，“寡核苷酸的自退火的可能性低”是指，從引物的堿基序列預(yù)想到引物之間無法結(jié)合。作為本發(fā)明的檢測用寡核苷酸的堿基數(shù)，沒有特別限制，優(yōu)選為13個堿基 30個堿基，更優(yōu)選為18個堿基 23個堿基。雜交時的寡核苷酸的Tm值優(yōu)選在55°C 65°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在59°C 62°C的范圍內(nèi)。寡核苷酸的GC含量優(yōu)選為30 % 80%，更優(yōu)選為45% 65%，進(jìn)一步優(yōu)選為55%左右。作為本發(fā)明的上述檢測用寡核苷酸，更優(yōu)選以序列號4或者5所記載的堿基序列或者其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸。此外，本發(fā)明的檢測用寡核苷酸也可以是以相對于序列號4或者5所記載的堿基序列具有70%以上的同源性的堿基序列或者其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸，更優(yōu)選同源性為80%以上，進(jìn)一步優(yōu)選同源性為90%以上，特別優(yōu)選同源性為 95%以上。此外，能夠在本發(fā)明中使用的檢測用寡核苷酸中還包括，在序列號4或者5所記載的堿基序列或者其互補(bǔ)序列中1個或者數(shù)個、更優(yōu)選為1 4個、進(jìn)一步優(yōu)選為1 3個、 更進(jìn)一步優(yōu)選為1 2個、特別優(yōu)選為1個堿基經(jīng)缺失、插入或者置換等變異或者修飾后的堿基序列所表示的寡核苷酸。此外，還可以在序列號4或者5所記載的堿基序列或者其互補(bǔ)序列中添加適當(dāng)?shù)膲A基序列。關(guān)于堿基序列的同源性，是由Lipman-Pearson法Science，227，1435，1985)等計算的。具體地，可以使用基因信息處理軟件Genetyx-Wir^Software開發(fā)制)的同源分析 (Search homology)程序，將參數(shù)Unit size to compare (ktup)設(shè)定為2進(jìn)行分析而算出來的。本發(fā)明的檢測用寡核苷酸可以作為核酸引物以及核酸探針使用。核酸探針可以通過用標(biāo)記物標(biāo)記上述寡核苷酸來制備。作為上述標(biāo)記物沒有特別的限定，可以使用放射性物質(zhì)、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、抗原、半抗原、酶底物、不溶性載體等通常的標(biāo)記物。標(biāo)記方法，既可以是末端標(biāo)記，也可以是在序列的途中標(biāo)記，此外，也可以是在糖、磷酸基、堿基部
9分上的標(biāo)記。作為該標(biāo)記的檢測方法，例如，在用放射性同位素對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記時可以列舉放射自顯影等，在用熒光物質(zhì)標(biāo)記時可以列舉熒光顯微鏡等，在用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記時可以列舉使用感光膠卷分析或者使用CCD照相機(jī)的數(shù)碼分析等。此外，上述檢測用寡核苷酸可以與固相載體結(jié)合而作為捕捉探針使用。此時，可以通過聯(lián)合捕捉探針和標(biāo)記核酸探針來進(jìn)行夾心雜交(sandwich assay)，也可以對目標(biāo)核酸進(jìn)行標(biāo)記并捕捉。在本發(fā)明的檢測法中，為了鑒定、檢測屬于Geosmithia屬的菌類，優(yōu)選使用下述 (c)和/或(d)的寡核苷酸作為核酸探針進(jìn)行雜交，進(jìn)一步優(yōu)選使用以序列號4和序列號5 所記載的堿基序列表示的寡核苷酸；以(c)序列號4所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸探針使用的堿基序列表示的寡核苷酸；以(d)序列號5所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸探針使用的堿基序列表示的寡核苷酸。為了檢測被檢測體中的屬于Geosmithia屬的菌類，可以將前述(c)和/或(d)所示的寡核苷酸標(biāo)記作為核酸探針，使得到的核酸探針與DNA或RNA雜交，通過適當(dāng)?shù)臋z測法來檢測雜交后的探針的標(biāo)記。由于上述核酸探針與屬于Geosmithia屬的菌類的β _微管蛋白基因的可變區(qū)域的一部分特異性雜交，因此能夠迅速且簡便地檢測被檢測體中的屬于 Geosmithia屬的菌類。此外，作為測定與DNA或者RNA雜交后的核酸探針標(biāo)記的方法，可以使用通常的方法(FISH法、點(diǎn)雜交(dot blot)法、DNA雜交(southern blot)法、RNA雜交 (northern blot)法等)。在本發(fā)明的檢測法中，為了使用前述本發(fā)明的微管蛋白基因的可變區(qū)域的堿基序列所表示的核酸來進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的鑒定，優(yōu)選對包含該堿基序列的全部或者部分的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，確認(rèn)有無擴(kuò)增產(chǎn)物。作為對包含該區(qū)域的DNA 片段進(jìn)行括增的方法，沒有特別限制，可以使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction))法、LCR(連接酶鏈反應(yīng)(Ligase Chain Reaction))法、SDA(鏈置換擴(kuò)增 (Strand Displacement Amplification))法、NASBA(核酸序列依賴性擴(kuò)增(Nucleic Acid Sequence-based Amplification))法、RCA(滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling-circle amplification)) 法、LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop mediated isothermal amplification))法等通常的方法。但是，本發(fā)明中，從迅速性以及簡便性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使用PCR法。在本發(fā)明中，對使用PCR法進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的檢測的情況進(jìn)行說明。為了檢測屬于Geosmithia屬的菌類，優(yōu)選使用下述(e)或(f)的寡核苷酸作為核酸引物，進(jìn)一步優(yōu)選使用以序列號4和序列號5所記載的堿基序列表示的寡核苷酸；以(e)序列號4所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸；以(f)序列號5所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸。
此外，本發(fā)明的屬于Geosmithia屬的菌類檢測用核酸引物對是由前述(e)的寡核苷酸和前述(f)的寡核苷酸構(gòu)成的寡核苷酸對。序列號4和序列號5所表示的寡核苷酸是存在于β -微管蛋白基因區(qū)域，并具有與可變區(qū)域的一部分堿基序列或者其互補(bǔ)序列相同的堿基序列的寡核苷酸。這些寡核苷酸能夠與屬于Geosmithia屬的菌類的DNA的一部分特異性雜交。前述(e)和⑴所表示的寡核苷酸分別與序列號1所記載的堿基序列中的62位 79位、223位 243位的區(qū)域相對應(yīng)；分別與序列號2所記載的堿基序列中的49位 66位、 196位 214位的區(qū)域相對應(yīng)；以及分別與序列號3所記載的堿基序列中的45位 61位、 182位 200位的區(qū)域相對應(yīng)。因此，通過使前述寡核苷酸與屬于Geosmithia屬的菌類的 β -微管蛋白基因進(jìn)行雜交，能夠特異性檢測屬于Geosmithia屬的菌類。本發(fā)明的PCR反應(yīng)的條件，只要能夠?qū)⒛繕?biāo)DNA片段擴(kuò)增至能夠檢出的程度，就沒有特別的限制。作為PCR的反應(yīng)條件的優(yōu)選的一個例子，例如，在95 98°C下進(jìn)行使雙鏈 DNA變成單鏈DNA的熱變性反應(yīng)10 60秒，在55 59°C下進(jìn)行引物對與單鏈DNA雜交的退火反應(yīng)約60秒，在約72 °C下進(jìn)行使DNA聚合酶起作用的延伸反應(yīng)約60秒，上述反應(yīng)構(gòu)成一個循環(huán)，進(jìn)行約30 35次該循環(huán)。在本發(fā)明中，利用PCR法擴(kuò)增的基因片段的確認(rèn)可以用通常的方法進(jìn)行。例如可以列舉將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳以確認(rèn)是否具有與擴(kuò)增了的基因的大小相對應(yīng)的條帶的方法；經(jīng)時測量PCR反應(yīng)產(chǎn)物量的方法；解讀PCR反應(yīng)產(chǎn)物的堿基序列的方法，但本發(fā)明并不限定于這些方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選在基因擴(kuò)增處理后進(jìn)行電泳，以確認(rèn)是否具有與擴(kuò)增了的基因的大小相對應(yīng)的條帶的方法。此外，在本發(fā)明中，檢測通過PCR法擴(kuò)增的基因片段可以采用通常的方法進(jìn)行。例如，在擴(kuò)增反應(yīng)時，引入被放射性物質(zhì)標(biāo)記的核苷酸的方法； 使用被熒光物質(zhì)標(biāo)記的引物的方法；在擴(kuò)增了的DNA雙鏈之間加入溴化乙錠等通過與DNA 結(jié)合而增強(qiáng)熒光強(qiáng)度的熒光物質(zhì)的方法等，但本發(fā)明并不限定于這些方法。在本發(fā)明中，優(yōu)選在擴(kuò)增了的DNA雙鏈之間加入通過與DNA結(jié)合而增強(qiáng)熒光強(qiáng)度的熒光物質(zhì)的方法。在被檢測體中含有屬于Geosmithia屬的菌類的情況下，使用本發(fā)明的寡核苷酸對作為引物組來進(jìn)行PCR反應(yīng)，對得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，確認(rèn)這些菌類中具有特異性的約150 ISObp的DNA片段的擴(kuò)增。通過進(jìn)行該操作，從而不管是有性還是無性世代， 均能夠確認(rèn)被檢測體中是否含有屬于Geosmithia屬的菌類。本發(fā)明中所用的檢測用寡核苷酸、核酸引物以及核酸探針，可以根據(jù)設(shè)計的序列進(jìn)行化學(xué)合成，也可以從試劑制造商處購入。具體地，可以用寡核苷酸合成裝置進(jìn)行合成。 此外，也可以使用在合成后用吸附柱、高效液相色譜、或者電泳法進(jìn)行純化后的產(chǎn)物。另外， 對于含有1個或者數(shù)個堿基被置換、缺失、插入或者添加的堿基序列的寡核苷酸，也可以用公認(rèn)的方法合成。上述檢測用寡核苷酸、核酸引物或者核酸探針的結(jié)合方式，不僅可以是天然核酸中存在的磷酸二酯鍵，還可以是，例如磷酰胺鍵、硫代磷酸酯鍵等。作為在本發(fā)明中使用的被檢測體沒有特別限制，可以使用飲食品自身、飲食品的原材料、分離的菌體、培養(yǎng)的菌體等。作為從被檢測體中制備DNA的方法，只要能夠得到足夠純度和量的DNA用于進(jìn)行屬于Geosmithia屬的菌類的檢測，就沒有特別限制，即使是沒有純化的狀態(tài)也可以使用，也可以經(jīng)過進(jìn)一步分離、提取、濃縮、純化等前處理再使用。例如，可以進(jìn)行苯酚和氯仿的提取來純化，或者用市售的純化試劑盒來純化，從而提高核酸的純度后使用?？梢詫⒈景l(fā)明的前述檢測用寡核苷酸、核酸探針或者核酸引物與進(jìn)行屬于 Geosmithia屬的菌類的檢測時所必需的各種試劑一起預(yù)先打包，做成屬于Geosmithia屬的菌類檢測用試劑盒。本發(fā)明的檢測用試劑盒是例如含有前述本發(fā)明的檢測用寡核苷酸作為核酸探針的試劑盒，或者是含有前述本發(fā)明的檢測用寡核苷酸對作為核酸引物對的試劑盒。這些試劑盒優(yōu)選用于通過雜交法或者PCR法來檢測屬于Geosmithia屬的菌類的情況。本發(fā)明的試劑盒除了含有前述檢測用寡核苷酸、核酸探針或者核酸引物以外，也可以根據(jù)目的含有標(biāo)記檢測物質(zhì)、緩沖液、核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)、酶底物(dNTP， rNTP等)等菌類檢測中常用的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在約5 12小時的短時間內(nèi)進(jìn)行從被檢測體的制備工序到菌類的檢測工序。實施例以下，基于實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不受其限制。實施例1屬于Geosmithia屬的菌類的特異性堿基序列的分析通過下述方法確定Geosmithia屬的各種β-微管蛋白基因的堿基序列。使用GenTorukim (Takara Bio (株)社制)，從用馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基在25°C、 暗處培養(yǎng)7天的Geosmithia屬菌體，提取DNA。作為目標(biāo)部位的PCR擴(kuò)增，使用PuRe TaqTM Ready-To-GoPCR Beads (GE Health Care UK LTD 制)，作為引物使用 Bt2a (5，-GG TAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，序列號 6)、Bt2b(5，-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3，序列號 7) (Glass and Donaldson, Appl Environ Microbiol 61:1323—1330,1995)。擴(kuò)增條件為變性溫度為95°C，退火溫度為59°C，延伸溫度為72°C，實施35次循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用 Auto SegTM G-50 (Amersham Pharmacia Biotech 社制)進(jìn)行純化。PCR 產(chǎn)物使用 BigDye terminator Ver. 1. 1(商品名Applied Biosystems社制)標(biāo)記，以ABI PRISM3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems社制)實施電泳。在從電泳時的熒光信號來確定堿基序列時，使用軟件“ATGC Ver. 4” (Genetyx社制)?；诶脺y序法確定的各種菌類(Geosmithia eburneus、Geosmithia byssochlamydoides、Geosmithia emersonii、黑曲霄(Aspergillus niger)(保藏編號 ΑΥ5855!35)、以及芽枝狀枝孢(Cladosporium cladosporioides)(參照特愿 2008-139999)) 的β-微管蛋白基因的堿基序列信息，使用DNA分析軟件(商品名DNAsis pro，日立軟件社制)進(jìn)行比對分析，確定含有屬于Geosmithia屬的菌類的特異性堿基序列的β-微管蛋白基因中的特定區(qū)域(序列號1 3)。實施例2利用PCR法的屬于Geosmithia屬的菌類的檢測(1)引物的制作在上述得到的屬于Geosmithia屬的菌類的特異性堿基序列區(qū)域(堿序列號1 3)中，從3’末端側(cè)屬于Geosmithia屬的菌類的特異性特別高的區(qū)域開始，對滿足如下4個條件的部分區(qū)域進(jìn)行了研究1)屬固有的基因的堿基序列為大約10個堿基連續(xù)，2)寡核苷酸的GC含量大概為30^-80%, 寡核苷酸的自退火的可能性低，4)寡核苷酸的Tm值大
12概為55 65°C左右?；谠摬糠謪^(qū)域的堿基序列，設(shè)計5組引物對，使用從各種菌體提取的DNA作為模板，利用PCR反應(yīng)研究Geosmithia屬檢測的有效性。即，進(jìn)行了以下研究在以Geosmithia屬DNA作為模板的反應(yīng)中，確認(rèn)150 180bp的DNA擴(kuò)增反應(yīng)，在以其它霉菌的基因組DNA作為模板的反應(yīng)中，沒有確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果確認(rèn)了 5組引物對中的1組引物對對于Geosmithia屬檢測的有效性。確認(rèn)了有效性的引物對是由序列號4和5記載的堿基序列所表示的寡核苷酸構(gòu)成的引物對。另外，使用的引物是委托Sigma Aldrich Japan 公司合成(脫鹽純化品，0.02μπιΟ1等級)后購入的。(2)被檢測體的制備使用表1和表2中記載的菌作為屬于Geosmithia屬的菌類。還使用表1和表2所示的其它屬于Geosmithia屬的菌類以及其它菌類，以示出序列號4和5中記載的堿基序列所表示的寡核苷酸構(gòu)成的引物相對于屬于Geosmithia屬的菌類的β _微管蛋白基因的特異性。這些購入并使用的菌類由千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部真菌醫(yī)學(xué)研究中心所保管，并利用IFM序號進(jìn)行管理。在最適條件下培養(yǎng)各菌體。培養(yǎng)條件為使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(商品名 Pearlcore馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，榮研化學(xué)株式會社制)，在25°C下培養(yǎng)7天。表 權(quán)利要求
1.一種屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法，其特征在于，用以下述(a)或者(b)所記載的堿基序列表示的核酸，對屬于Geosmithia屬的菌類進(jìn)行鑒定，(a)序列號1 3中任一個所記載的微管蛋白基因的部分堿基序列或者其互補(bǔ)序列；(b)在序列號1 3中任一個所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中，所述屬于 Geosmithia 屬的菌類為選自 Geosmithia eburneus>Geosmithia emersonii 禾口 Geosmithia byssochlamydoides 中的至少 1 種菌類。
3.如權(quán)利要求1或2所述的屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法，其特征在于，確定被檢測菌的微管蛋白基因的堿基序列，確認(rèn)在該基因的堿基序列中是否含有所述(a)或(b)所記載的核酸的堿基序列，從而進(jìn)行鑒定。
4.如權(quán)利要求1或2所述的屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法，其特征在于， 使用將所述(a)或(b)所記載的核酸的堿基序列中的區(qū)域作為目標(biāo)的核酸探針進(jìn)行雜交，從而進(jìn)行鑒定。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法使用下述(c)和/或(d)的寡核苷酸作為核酸探針進(jìn)行雜交， 以(c)序列號4所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸探針使用的堿基序列表示的寡核苷酸；以(d)序列號5所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為核酸探針使用的堿基序列表示的寡核苷酸。
6.如權(quán)利要求1或2所述的屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法，其特征在于，對以所述(a)或(b)所記載的堿基序列表示的核酸中的區(qū)域進(jìn)行基因擴(kuò)增，確認(rèn)有無基因擴(kuò)增產(chǎn)物，從而進(jìn)行鑒定。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法來進(jìn)行所述基因擴(kuò)增反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法使用能夠與以下區(qū)域雜交的寡核苷酸作為核酸引物來進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，其中，所述區(qū)域為以所述(a)或(b)所記載的堿基序列表示的核酸中的區(qū)域且滿足下述 (1) ⑷這4個條件(1)含有屬于Geosmithia屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續(xù)出現(xiàn)的區(qū)域；(2)寡核苷酸的GC含量為30% 80%；(3)寡核苷酸的自退火的可能性低；(4)寡核苷酸的Tm值為55°C 65°C。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法使用下述(e)和(f)的寡核苷酸作為所述核酸引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)， 以(e)序列號4所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有 70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸；以(f)序列號5所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有 70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸。
10.一種DNA，其中，所述DNA用于檢測屬于Geosmithia屬的菌類且由下述(a)或者(b)所記載的堿基序列表示，(a)序列號1 3中任一個所記載的β-微管蛋白基因的部分堿基序列或者其互補(bǔ)序列；(b)在序列號1 3中任一個所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列。
11.一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用寡核苷酸，其中，所述檢測用寡核苷酸能夠與以下述(a)或者(b)所記載的堿基序列表示的核酸進(jìn)行雜交，并且作為用于特異性檢測屬于Geosmithia屬的菌類的核酸探針或者核酸引物而發(fā)揮功能，(a)序列號1 3中任一個所記載的β-微管蛋白基因的部分堿基序列或者其互補(bǔ)序列；(b)在序列號1 3中任一個所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的屬于Geosmithia屬的菌類檢測用寡核苷酸，其特征在于， 所述檢測用寡核苷酸為能夠與以下區(qū)域雜交的寡核苷酸，其中，所述區(qū)域為以所述(a)或(b)所記載的堿基序列表示的核酸中的區(qū)域且滿足下述(1) (4)這4個條件(1)含有屬于Geosmithia屬的菌類所固有的基因的堿基序列以大約10個堿基連續(xù)出現(xiàn)的區(qū)域；(2)寡核苷酸的GC含量為30% 80%；(3)寡核苷酸的自退火的可能性低；(4)寡核苷酸的Tm值為55°C 65°C。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的屬于Geosmithia屬的菌類檢測用寡核苷酸，其特征在于， 所述檢測用寡核苷酸為下述(c)或(d)的寡核苷酸，以(c)序列號4所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為檢測用寡核苷酸使用的寡核苷酸；以(d)序列號5所記載的堿基序列或其互補(bǔ)序列表示的寡核苷酸、或者相對于該堿基序列或其互補(bǔ)序列具有70%以上的同源性并且能夠作為檢測用寡核苷酸使用的寡核苷酸。
14.一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用核酸引物對，其中， 所述檢測用核酸引物對由下述(e)和(f)的寡核苷酸構(gòu)成，以(e)序列號4所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有 70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸；以(f)序列號5所記載的堿基序列表示的寡核苷酸、或者以相對于該堿基序列具有 70%以上的同源性并且能夠作為核酸引物使用的堿基序列表示的寡核苷酸。
15.一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用試劑盒，其中，所述檢測用試劑盒含有如權(quán)利要求14所述的寡核苷酸對作為核酸引物對。
16.一種屬于Geosmithia屬的菌類檢測用試劑盒，其中，所述檢測用試劑盒含有如權(quán)利要求13所述的(c)和/或(d)的寡核苷酸作為核酸探
全文摘要
本發(fā)明提供一種屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法。本發(fā)明的屬于Geosmithia屬的菌類的檢測方法用以下述(a)或者(b)所記載的堿基序列表示的核酸，對屬于Geosmithia屬的菌類進(jìn)行鑒定，(a)序列號1～3中任一個所記載的β-微管蛋白基因的部分堿基序列或者其互補(bǔ)序列；(b)在序列號1～3中任一個所記載的堿基序列中1個或者數(shù)個堿基被缺失、置換、插入或者添加而得到的堿基序列或者其互補(bǔ)序列。
文檔編號C12Q1/68GK102272305SQ20098015422
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者中山素一, 弘佑介, 德田一, 矢口貴志, 細(xì)谷幸一 申請人:花王株式會社