專利名稱：用于監(jiān)測滅菌過程的生物組合物、制品和方法
用于監(jiān)測滅菌過程的生物組合物、制品和方法相關(guān)專利申請的交叉引用本申請要求2008年10月17日提交的美國臨時申請?zhí)?1/196，415的權(quán)利，該臨時申請以引用方式全文并入本文。
背景技術(shù)：
監(jiān)測用以對器材(如醫(yī)療器械、儀器和其他非一次性制品)進(jìn)行滅菌的過程的有效性，這在衛(wèi)生保健以及各種行業(yè)情景中都日常進(jìn)行。有效的滅菌過程預(yù)期能完全破壞所有的活微生物，包括諸如病毒和孢子的結(jié)構(gòu)在內(nèi)。作為測試滅菌過程的致死率的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范， 醫(yī)院會將滅菌狀況指示器與一批待滅菌的物品放在一起。生物滅菌指示器和化學(xué)滅菌狀況指示器都曾被用過。標(biāo)準(zhǔn)類型的生物滅菌指示器包括已知數(shù)量的試驗微生物，例如嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)(以前稱脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus))或萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)(以前稱枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis))孢子，這些孢子對滅菌過程的抵抗力比大多數(shù)污染性生物強許多倍。在指示器暴露于滅菌過程后，將孢子在營養(yǎng)物培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育，以確定是否有任何孢子經(jīng)歷了該滅菌過程而存活下來，如有孢子長出則表明滅菌過程不足以破壞所有的微生物。在另一個例子中，在進(jìn)行了滅菌過程后，測定可與孢子存活力相關(guān)聯(lián)的酶的活性。盡管這方面已取得了進(jìn)展，但確切地確定滅菌過程是否有效所需的時間可能過長而不合需要?，F(xiàn)有的化學(xué)滅菌狀況指示器可在滅菌過程結(jié)束時立即進(jìn)行讀數(shù)。但是，結(jié)果僅表明存在某種特定條件，例如表明某種特定化學(xué)藥品或某個溫度存在一定的時間。通常認(rèn)為，活生物對所有實際存在的條件的反應(yīng)，是檢驗滅菌過程能多么有效地實現(xiàn)滅菌的更直接可靠的試驗。因此，對于能指示滅菌過程的有效性而在滅菌過程完成后又沒有過長的延遲時間的生物滅菌指示器，一直存在著需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供生物滅菌指示器組合物、包含該組合物的滅菌狀況指示器以及用該指示器確定滅菌過程的有效性的方法。該組合物包含能抵抗滅菌過程的孢子和亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料與至少一種營養(yǎng)物的組合。如果任何孢子經(jīng)歷滅菌過程而存活下來，該染料能與至少在孢子的萌發(fā)期間(例如在萌發(fā)期間或在萌發(fā)和長出期間)存在的核酸發(fā)生相互作用，從而產(chǎn)生熒光強度的增加。在某些實施例中，可在一段短的溫育時間期間或之后檢測到核酸含量(如果存在的話)的增加及伴隨的熒光強度的增加。在某些實施例中，這種溫育可在孢子與含有熒光染料和至少一種營養(yǎng)物的組合的萌發(fā)培養(yǎng)基接觸的情況下進(jìn)行。能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料至少在用于溫育孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。在某些實施例中，另外地， 能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料在生物滅菌指示器所常規(guī)碰到的滅菌過程條件下是穩(wěn)定的。
因此，在一個實施例中，提供一種滅菌狀況指示組合物，其包含多個能抵抗滅菌過程的孢子；包含亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌發(fā)培養(yǎng)基；其中該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度與所述孢子萌發(fā)之前的熒光強度相比增加，表明有活孢子存在，且其中該能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。在另一個實施例中，提供滅菌過程指示器，其包含承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體；不能透過微生物且不能透過滅菌劑的容器，該容器含有包括亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌
發(fā)培養(yǎng)基；其中該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度與所述孢子萌發(fā)之前的熒光強度相比增加，表明有活孢子存在，且其中該能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。其中該載體靠近該容器且與該萌發(fā)培養(yǎng)基隔開。在又一個實施例中，提供一種確定滅菌過程的有效性的方法，該方法包括提供滅菌過程指示器，其包含承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體；不能透過微生物且不能透過滅菌劑的容器，該容器含有包括亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌
發(fā)培養(yǎng)基；其中該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度與所述孢子萌發(fā)之前的熒光強度相比增加，從而表明有活孢子存在，且其中該能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定；和其中該載體靠近該容器且與該萌發(fā)培養(yǎng)基隔開；將該滅菌過程指示器放置在滅菌箱中；將該滅菌過程指示器暴露于滅菌劑；將該多個能抵抗滅菌過程的孢子和該萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合；用該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子；和如果存在的話，測量該熒光強度的增加。^X術(shù)語“亞致死量”是指能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料的這樣的量 (例如濃度)，該量(濃度)使得能夠產(chǎn)生足夠的熒光信號，而又不會不利地影響所述孢子、 萌發(fā)中的孢子或營養(yǎng)細(xì)胞的存活力。有足夠的熒光信號，就可檢測到該熒光強度增加(如果存在的話)。術(shù)語“能透過細(xì)胞”是指這樣的染料，其被進(jìn)行被動轉(zhuǎn)運或主動轉(zhuǎn)運或者能夠充分地穿過芽孢外被和/或細(xì)胞膜以接觸所述孢子、萌發(fā)中的孢子或營養(yǎng)細(xì)胞中的核酸，而無需任何用以使孢子外被和/或細(xì)胞膜更能透過該染料分子的試劑的幫助。數(shù)字E5、E6和E7在本文中分別可與105、IO6和IO7互換使用。在說明書和權(quán)利要求書中出現(xiàn)的術(shù)語“包括”及其變型(如包含、含有等)沒有限制意義。如本文所用，除非上下文另行明確指出，否則“一個”、“所述”、“至少一個”和“一個
或多個”可互換地使用。另外在本文中，以端點表示的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包含的任何數(shù)值(例如 550-7000nm 包括 500、530、551、575、583、592、600、620、650、700 等)。本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容并非意圖描述本發(fā)明每一個公開的實施例或每種實施方式。以下“具體實施方式
”更具體地舉例說明了示例性實施例。


圖1是本發(fā)明的滅菌狀況指示器的一個實施例的截面圖，其中蓋沈沒有示出。圖2是圖1的滅菌狀況指示器的分解透視圖，其中包括蓋26。
具體實施例方式如上所指出，現(xiàn)提供了生物滅菌指示器組合物，其使用亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物，能在孢子萌發(fā)期間或者在萌發(fā)和長出期間檢測活孢子。該染料至少在用于溫育所述孢子的溫度下是穩(wěn)定的。當(dāng)用包含該至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和該至少一種營養(yǎng)物的該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子時，會遇到這種溫度。對于某些實施例，優(yōu)選地，該染料在可比用于溫育所述孢子的溫度顯著高得多的滅菌溫度下是穩(wěn)定的。所述生物滅菌指示器組合物可有利地用于生物滅菌指示器，如本文中所述的那些。所述組合物和含有所述組合物的指示器可用于確定滅菌過程的有效性，如用于本文所述的確定滅菌過程的有效性的方法中。對于某些實施例，包括本文所述的組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加。該染料與萌發(fā)期間的核酸的相互作用可提供關(guān)于活孢子(如果存在的話)的及早指示。對于某些實施例，包括本文所述的組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加。該染料與也在所述孢子長出期間存在的核酸的相互作用，由于例如當(dāng)活孢子存在時能提供更大的熒光增加，也可以是有用的。目前有多種已知和通用的滅菌過程，包括例如暴露于蒸汽、干熱、氣態(tài)或液態(tài)化學(xué)品(如環(huán)氧乙烷、過氧化氫、過氧乙酸和臭氧)和輻射。該多個能抵抗滅菌過程的孢子可根據(jù)所要用的滅菌過程來選擇。可使用任何孢子，只要它們對滅菌過程條件具有足夠抵抗力，使得它們比自然污染中遇到的大多數(shù)微生物更能抵抗滅菌過程條件。例如，對于蒸汽滅菌過程，可使用嗜熱脂肪地芽孢桿菌(以前稱嗜熱脂肪芽孢桿菌)。在另一個例子中，對于環(huán)氧乙烷滅菌過程，可使用萎縮芽孢桿菌(以前稱枯草芽孢桿菌)。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該多個能抵抗滅菌過程的孢子選自嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)以及它們的組合。對于這些實施例中的某些，該多個能抵抗滅菌過程的孢子選自嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌以及它們的組合。僅以舉例方式來說，本發(fā)明將用于生物滅菌指示器的微生物描述為“孢子”，但是應(yīng)理解，要對用于生物滅菌指示器的具體實施例的微生物類型(例如孢子)加以選擇，使其對所設(shè)想的具體滅菌過程具有高度的抵抗力。因此，本發(fā)明的不同實施例可使用不同的微生物，這取決于具體實施例所意圖的滅菌過程。使用能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料，本發(fā)明的組合物、指示器和方法能檢測所述孢子內(nèi)的核酸的存在以及當(dāng)所述孢子內(nèi)的核酸含量出現(xiàn)增加時檢測這一增加。在所述孢子萌發(fā)期間，所述孢子的代謝狀態(tài)從休眠轉(zhuǎn)向生長要求核酸含量伴隨增加。能透過細(xì)胞的熒光染料已知對微生物是有毒性或誘變性的。但是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以以這樣的量來使用能透過細(xì)胞的熒光染料，該量對于微生物是亞致死量，但又能在所述微生物萌發(fā)期間或者萌發(fā)和長出期間提供熒光的增加。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該能透過細(xì)胞的熒光染料在該培養(yǎng)基中的濃度不超過0. 10mM、0. 05mM或0. OlmM。對于這些實施例中的某些，該染料的濃度不小于0. OOOlmM、 0. 0005mM 或 0. OOlmM。在通用的滅菌過程中的一些(如果不是全部的話)中，在過程中包括或者可能遇到高溫，例如50°C、100°C、121 °C、132°C、1 ；34°C等。因此，對于某些實施例，包括上述組合物、 指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料在滅菌溫度下是穩(wěn)定的。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料在高達(dá)至少121°C的溫度下是穩(wěn)定的。對于這些實施例中的某些，該能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料在高達(dá)至少132°C的溫度下是穩(wěn)定的。對于這些實施例中的某些，該能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料在高達(dá)至少134°C的溫度下是穩(wěn)定的。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該培養(yǎng)基在用來檢測熒光強度的增加的發(fā)射和激發(fā)波長處基本上無任何背景熒光。這可在活孢子(如果存在的話)萌發(fā)期間或者萌發(fā)和長出期間提供改進(jìn)的靈敏度，因為任何在和與核酸發(fā)生相互作用的該染料的發(fā)射和激發(fā)相同的波長處出現(xiàn)的背景熒光水平都被減至最低。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該培養(yǎng)基基本上不含該多個孢子存在的和產(chǎn)生的核酸以外的任何核酸。這可在活孢子(如果存在的話)萌發(fā)期間或者萌發(fā)和長出期間提供改進(jìn)的靈敏度，因為任何由該染料與任何非該多個孢子產(chǎn)生的核酸的相互作用所產(chǎn)生的基線熒光水平都被減至最低。該能透過細(xì)胞的染料當(dāng)不與核酸發(fā)生相互作用時在發(fā)射波長處(或波長范圍內(nèi))具有較低的熒光水平，而當(dāng)與核酸發(fā)生相互作用時在此波長處具有較高的熒光水平。例如， 在某些實施例中，當(dāng)不與核酸發(fā)生相互作用時，該能透過細(xì)胞的染料的熒光量子產(chǎn)率小于 0. 1，優(yōu)選地小于0.05，更優(yōu)選地不超過0.01。在這些實施例中的某些中，當(dāng)與核酸發(fā)生相互作用時，該能透過細(xì)胞的染料的熒光量子產(chǎn)率為至少0. 1，優(yōu)選地至少0. 2，更優(yōu)選地至少 0. 4。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該能透過細(xì)胞的熒光染料是能與DNA、RNA發(fā)生相互作用或者同時與DNA和RNA發(fā)生相互作用的染料。該染料與DNA和RNA的相互作用可相同或不同。該染料與DNA發(fā)生相互作用時的最大激發(fā)和/或發(fā)射，可不同于其與RNA發(fā)生相互作用時的最大激發(fā)和/或發(fā)射。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該能透過細(xì)胞的熒光染料是能以多種本領(lǐng)域公知的方式與核酸發(fā)生相互作用的染料，所述方式包括插入、靜電吸引、電荷相互作用、親水-疏水相互作用或者它們的組合。如上所指出，該染料與核酸(包括總細(xì)胞核酸，如0嫩、1 嫩(1111 嫩，沙嫩41 嫩)和染色體外核酸)的這一相互作用或結(jié)合，會引起來自該染料的熒光的相對較大的增加。對于這些實施例中的某些，該能透過細(xì)胞的熒光染料選自吖啶橙、被取代的不對稱花菁染料以及它們的組合。結(jié)合于DNA 的吖啶橙在約490nm處有最大激發(fā)，在約520nm處有最大發(fā)射，但當(dāng)結(jié)合于RNA時分別為約 530nm 禾口 620nmo 參見 Maclnnes，J. W 禾口 McClintock，Μ.，Differences in Fluorescence Spectra of Acridine Orange-DNA Complexes Related-DNA Base Composition (與DNA減基組成相關(guān)聯(lián)的吖啶橙-DNA復(fù)合物熒光光譜的差異)，Biopolymers.致編輯的信，第9卷， 第1407-1411頁(1970)。對于某些實施例，結(jié)合于RNA的該染料的最大發(fā)射處的熒光可用來指示活孢子的萌發(fā)。當(dāng)在萌發(fā)中的孢子中RNA的量增加得比DNA的量更快時，這會是有用的，可以更早地確定是否有活孢子存在。被取代的不對稱花菁染料的合適例子包括以商品名SYTOanvitrogen Corp., Carlsbad, CA)出售的染料。各種SYTO染料能透過許多(如果不是所有的話)細(xì)胞膜，但它們互相之間例如在以下方面可能存在差異細(xì)胞透過性的程度、當(dāng)結(jié)合于核酸時熒光強度的增加量、最大激發(fā)和發(fā)射、與DNA和RNA結(jié)合的選擇性以及與DNA和RNA的結(jié)合親和力。 參見Tarnok，Cytometry Part A，73A，477-479 (2008)。對于某些實施例，優(yōu)選的是，被取代的不對稱花菁染料是SYTO M或SYTO 64。SYTO M在490nm處有最大激發(fā)，在515nm處有最大發(fā)射。SYTO 64在599nm處有最大激發(fā)，在619nm處有最大發(fā)射。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，優(yōu)選的是，熒光強度的增加是在500nm-700nm、優(yōu)選地500nm-675nm的波長處。這個波長范圍會是有利的，因為這種熒光不會被通常在較短波長(如小于500nm或小于400nm的波長)處出現(xiàn)的該萌發(fā)培養(yǎng)基其他成分的吸光度或熒光所遮掩，或者被遮掩的程度會明顯低得多。該至少一種營養(yǎng)物可誘導(dǎo)孢子(如果是活的話)的萌發(fā)且還可使孢子長出，而核酸同時產(chǎn)生。此外，已發(fā)現(xiàn)該至少一種營養(yǎng)物與該染料一起存在可降低該染料對孢子的有效毒性。該營養(yǎng)物包括一種或多種糖類，例如葡萄糖、果糖、纖維二糖等。該營養(yǎng)物還可包括鹽，如氯化鉀、氯化鈣等。該營養(yǎng)物還包括至少一種氨基酸，例如甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸中的至少一者。該萌發(fā)培養(yǎng)基還可包含一種或多種伴隨該營養(yǎng)物的其他材料?？梢允褂眠@種營養(yǎng)物和材料以及本領(lǐng)域公知用于誘導(dǎo)所述能抵抗滅菌過程的孢子的萌發(fā)和初始長出的其他營養(yǎng)物的數(shù)量。培養(yǎng)基成分和濃度是已知的，在例如WO 99/05310 (Tautvydas) 以及 kchman 等人，J. Food Sci.，56，5，第 1408-1411 頁(1991)(也稱為 Zechman 和 Pf lug, 1991)中有描述。對于某些實施例，包括本文所述的組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含碰撞猝滅成分。這種成分能通過碰撞猝滅降低處于游離狀態(tài)的(未結(jié)合于核酸的)能透過細(xì)胞的染料的背景熒光信號。已知能碰撞猝滅熒光的物質(zhì)的例子包括有機(jī)化合物如嘌呤、嘧啶、脂族胺以及硝基氧、某些離子如硝酸根陰離子和溶解的金屬離子。其他已知能碰撞猝滅熒光的物質(zhì)在例如!Principles of Fluorescence Spectroscopy,第 9 章，Joseph R. Lakowicz, Plenum Press, 1983 中有描述。對于某些實施例，包括本文所述的組合物、指示器或方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含至少一種參比染料。參比染料不會結(jié)合核酸，但與能透過細(xì)胞的染料一樣能響應(yīng)溫度變化或者由孢子萌發(fā)和長出所引起的培養(yǎng)基變化，例如PH、離子強度的升降或者會改變熒光信號的代謝副產(chǎn)物的濃度變化。通過監(jiān)測參比染料，可將由能透過細(xì)胞的染料結(jié)合于核酸所產(chǎn)生的信號與由溫度變化或培養(yǎng)基變化所產(chǎn)生的信號區(qū)分開來。參比染料優(yōu)選地在與能透過細(xì)胞的染料不同的波長下發(fā)熒光。使該萌發(fā)培養(yǎng)基和該能抵抗滅菌過程的孢子保持隔開但又互相緊靠，以便在需要時容易將該培養(yǎng)基與所述孢子進(jìn)行組合，例如在暴露于滅菌過程后進(jìn)行組合然后進(jìn)行溫育以確定是否存在任何活孢子(由熒光強度的增加指示出)，或者在暴露于滅菌過程后進(jìn)行組合但不進(jìn)行溫育以確定基線或背景熒光強度。例如，可測量某一特定波長處的熒光背景水平。因此，對于某些實施例，包括上述組合物、指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該多個能抵抗滅菌過程的孢子和所述萌發(fā)培養(yǎng)基相互隔開又相互接近。對于某些實施例，包括上述組合物、指示器和方法實施例中的任何一個在內(nèi)，所述萌發(fā)培養(yǎng)基是含水溶液或懸浮液?？蓪⒃撝辽僖环N能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和該至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物溶解或懸浮于該含水培養(yǎng)基中。該至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料在該培養(yǎng)基中的濃度，取決于為在所述孢子萌發(fā)期間或者在萌發(fā)和長出期間提供熒光強度的增加所需的最小水平，和取決于所述孢子能承受而不對所述孢子的萌發(fā)有顯著不利影響的最大水平。可以使用的染料濃度的例子在上文中以及下文實例中有描述。當(dāng)存在活孢子時，熒光強度的增加可在小于1小時、優(yōu)選地小于30分鐘、更優(yōu)選地小于15分鐘時出現(xiàn)?；蛘?，對于某些實施例，所述萌發(fā)培養(yǎng)基為干燥的形式。該至少一種能透過細(xì)胞、 能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和該至少一種營養(yǎng)物可一起進(jìn)行干燥或分別進(jìn)行干燥， 以在支撐膜上或在載體材料上形成膜或?qū)樱芜x地按所需的形狀來形成，或者一起進(jìn)行復(fù)合或分別進(jìn)行復(fù)合而成為干燥固體，以形成片劑、膠囊形片劑或膠囊劑。可將任何這些形式保持接近孢子，并可在適當(dāng)?shù)臅r間加入水或含水緩沖液，以用所產(chǎn)生的培養(yǎng)基懸浮液或溶液溫育孢子。當(dāng)重懸或溶解時，所產(chǎn)生的培養(yǎng)基可為液體或凝膠?？捎糜诒疚拿枋龅慕M合物、指示器和方法實施例中的干燥形式的培養(yǎng)基的另外實施例，在2008年10月17日提交的、標(biāo)題為《生物滅菌指示器、系統(tǒng)及其使用方法》的共同待審的美國專利申請系列號 61/196，438 (Chandrapati 等人)中有描述。當(dāng)用該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子時，可使用高于室溫的溫育溫度。對于某些實施例，溫育溫度為至少37°C。對于某些實施例，優(yōu)選地溫育溫度為至少50°C。對于某些實施例，溫育溫度為50_60°C。如上所指出，本發(fā)明提供的滅菌過程指示器包括承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體。對于某些實施例，該載體是片狀材料如紙張、織造布、非織造布、塑料、聚合物材料、 微孔聚合物材料、金屬箔、玻璃、瓷器、陶瓷等或者它們的組合。對于某些實施例，片狀材料可吸水或可被濕潤，以有助于在適當(dāng)?shù)臅r間快速地使該萌發(fā)培養(yǎng)基與所述孢子緊密接觸。該滅菌過程指示器還包括容器，其含有該萌發(fā)培養(yǎng)基而又不讓滅菌劑或任何微生物進(jìn)入其中。如上所指出，該載體接近該容器，以便在要開始溫育時容易使該載體所承載的所述孢子與該萌發(fā)培養(yǎng)基接觸。該容器可容易地通過移除塞子、將其壓破或刺穿等方式來打開，以使所述孢子與該培養(yǎng)基接觸。該容器可裝配有塞子，或者該容器的至少一部分可以是易破材料如玻璃(例如玻璃安瓿)，或者是其他的可通過物理壓力破壞但又足夠堅韌以在制造、保藏、運輸和滅菌條件中保持完整的材料。已知的生物滅菌過程指示器構(gòu)造，如美國專利號5，073，488 (Matner等人)中所描述的那些構(gòu)造，可用于上述的組合物。也可使用其他的指示器構(gòu)造，如2008年10 月17日提交的、標(biāo)題為《生物滅菌指示器、系統(tǒng)及其使用方法》的美國專利申請系列號 61/196，438 (Chandrapati等人)中所描述的那些構(gòu)造。本文描述的滅菌過程指示器的一個實施例在圖1和2中示出。該指示器包括具有開放腔14的殼體10，該開放腔由不透氣體和液體的壁12所界定。這些結(jié)構(gòu)的另選實施例在2008年10月17日提交的、標(biāo)題為《生物滅菌指示器、系統(tǒng)及其使用方法》的美國專利申請系列號61/196，438 (Chandrapati等人)中示出。該殼體示出為圓形管，但也可使用其他已知的構(gòu)形。壁優(yōu)選是透明的，或者是半透明的，只要在某一特定波長處的熒光強度可測量到。壁的合適材料可包括玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯、聚酯等。對于某些實施例，該殼體的至少一個壁能透射至少500-700nm、優(yōu)選地至少 500-675nm的波長范圍內(nèi)的入射光的至少90%。該腔包含載體16，例如紙張、玻璃或聚合物片材，該載體承載著預(yù)定數(shù)量的能抵抗滅菌過程的活孢子。圖中示出容器18在腔14內(nèi)，該容器裝著萌發(fā)培養(yǎng)基20。或者，容器18可設(shè)置在腔14外部并鄰近該腔。密封的容器18可以是易破的安瓿，或者也可以是裝有塞子或其他當(dāng)被觸發(fā)時能讓萌發(fā)培養(yǎng)基20接觸載體16及其上所承載的孢子的機(jī)構(gòu)的容器。容器18 示出為細(xì)長的安瓿，但也可使用其他已知的構(gòu)形。圖中示出載體16在容器18和殼體10的壁12之間，以便容易透過壁12確定熒光強度的變化?；蛘?，壁12的一部分可用作載體16?？梢圆捎幂d體16的其他布置方式，例如可采用靠近底壁12A布置的方式?？苫跉んw10的形狀將載體16成形為適合此布置方式， 或者底壁12A本身可用作載體16。對于某些實施例，載體16能透射至少500-700nm、優(yōu)選地至少500-675nm的波長范圍內(nèi)的入射光的至少90%。腔14的開口 15提供有透氣但不透過微生物的閉合構(gòu)件22，其可通過粘合劑、熱密封等粘附到殼體10?；蛘撸捎镁哂锌卓谟^的蓋26將閉合構(gòu)件22保持在開口 15上。在暴露于滅菌劑期間，滅菌劑穿過閉合構(gòu)件22進(jìn)入腔14而與載體16上的孢子接觸。這些結(jié)構(gòu)的另選實施例在2008年10月17日提交的、標(biāo)題為《生物滅菌指示器、系統(tǒng)及其使用方法》的美國專利申請系列號61/196，438 (Chandrapati 等人)中示出。本文所提供的確定滅菌過程的有效性的方法，包括提供滅菌過程指示器的上述實施例中的任何一個并將該滅菌過程指示器放置在滅菌箱中。滅菌器(許多是可市售獲得的)包括這樣滅菌箱，其尺寸通常被設(shè)置成可容納多個待滅菌的制品，并裝配有用以將空氣和/或其他氣體從其中排出并將滅菌劑加入其中的裝置。該生物滅菌指示器可放在該滅菌器中的最困難的部位(例如在排水管上方)?；蛘?，該生物滅菌指示器當(dāng)放在該滅菌箱中時可鄰近待滅菌的制品放置。另外，可將該生物滅菌指示器裝到常規(guī)使用的過程挑戰(zhàn)裝置 (process challenge device)中再方文在滅菌器中。該方法包括將該滅菌過程指示器暴露于滅菌劑。可在將滅菌箱中存在的任何空氣或其他氣體的至少一部分排出滅菌箱后，將滅菌劑加到滅菌箱?；蛘?，可不對滅菌箱進(jìn)行排氣就將滅菌劑加入滅菌箱。通常采用一系列的排氣步驟，以確保滅菌劑達(dá)到滅菌箱內(nèi)的所有區(qū)域并接觸待滅菌的制品的所有區(qū)域。當(dāng)將滅菌劑加到滅菌箱時，在滅菌劑達(dá)到滅菌箱內(nèi)的所有區(qū)域的條件下滅菌劑還接觸到孢子。該方法還包括將該多個能抵抗滅菌的孢子和該萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合，從而使孢子和萌發(fā)培養(yǎng)基互相接觸。這可在滅菌過程完成后進(jìn)行，也就是說在提供了這樣的條件后進(jìn)行，所述條件使得滅菌劑達(dá)到滅菌箱內(nèi)的所有區(qū)域并在一定溫度下保持一定的時間，該溫度和時間據(jù)認(rèn)為足以殺滅滅菌箱內(nèi)存在的任何微生物。可將含有能透過細(xì)胞的熒光染料的培養(yǎng)基與所述孢子進(jìn)行組合，并將組合的孢子和培養(yǎng)基進(jìn)行溫育，這兩方面都如上所述?？稍谟迷撁劝l(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子的同時，連續(xù)地或間歇地監(jiān)測和測量熒光強度。對于某些實施例，包括上述方法實施例中的任何一個在內(nèi)外，該方法還包括通過在用該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子，并且如果存在的話，測定熒光強度的增加速度的同時，如果存在的話，測量熒光強度的增加，來確定在將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。對于某些實施例，當(dāng)溫育期間中的至少一部分時間里的熒光強度的速率增加時，可檢測到能抵抗滅菌的孢子的萌發(fā)。相對于溫育時間，這個速率可以是線性速率、 指數(shù)速率等?？捎嬎愠鏊俾食?shù)并用作孢子的萌發(fā)的指標(biāo)，從而用作活孢子的存在的指標(biāo)?；铈咦?如果存在的話)一旦接觸培養(yǎng)基和溫育條件，會發(fā)生一系列的變化，包括 DNA.RNA和其他額外的染色體核酸的從頭產(chǎn)生?？赏ㄟ^測量某一特定波長處的光學(xué)性質(zhì)如熒光強度的變化，來測量與核酸發(fā)生相互作用的染料中所產(chǎn)生的可檢測變化。這種測量可便利地使用已知的儀器如熒光計、發(fā)光計等來進(jìn)行。對于某些實施例，優(yōu)選地通過測量某一特定波長處的熒光強度來測量可檢測變化。或者，溫育步驟的一部分或全部可在測量熒光強度的任何增加之前進(jìn)行。對于某些實施例，包括上述方法實施例中的任何一個在內(nèi)，除測定熒光強度的增加速率之外，該方法還包括通過測量用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子之后的如果存在的話，熒光強度的增加，與用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子之前相比較，來確定在將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。再者，可在能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的染料和至少一種營養(yǎng)物分開的情況下進(jìn)行溫育，其中孢子與含有該至少一種營養(yǎng)物的培養(yǎng)基一起溫育，隨后將含有該染料的培養(yǎng)基加到溫育過的孢子。然后可測量任何在閾值以上的熒光強度增加。在上述方法實施例中，任選地，剛將孢子和萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合后該組合的熒光強度可當(dāng)作基線熒光或閾值，隨后的熒光強度測量值可與該基線熒光或閾值作比較。在將該組合進(jìn)行溫育期間或之后比該基線熒光強的熒光強度可表明有活孢子存在。對于某些實施例，比該基線熒光強至少10%、優(yōu)選至少5%的熒光強度表明有活孢子存在。對于某些實施例，包括上述方法實施例中的任何一個在內(nèi)，確定是否存在少至100 個活孢子，并且其中溫育進(jìn)行至多8小時。對于這些實施例中的某些，優(yōu)選地溫育進(jìn)行至多 1小時。對于這些實施例中的某些，更優(yōu)選地溫育進(jìn)行至多30分鐘。對于這些實施例中的某些，甚至更優(yōu)選地溫育進(jìn)行至多15分鐘?；蛘?，對于某些實施例，該方法還包括通過測量可檢測變化(如果存在的話)的速率，如熒光強度變化的速率，來確定在將該滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。例如，在將孢子和萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合并開始溫育步驟之后，可在溫育期間連續(xù)地或間歇地測量可檢測變化，從而確定可檢測變化的速率。對于某些實施例，當(dāng)溫育期間信號速率增加時，可檢測到能抵抗滅菌的孢子的萌發(fā)。相對于溫育時間，這個速率可以是線性速率、指數(shù)速率等。速率常數(shù)可用作孢子的萌發(fā)的指標(biāo)?；蛘?，對于某些實施例，該方法還包括通過在指定的時間獲取最終熒光測量值，來確定在將滅菌過程指示器暴露于滅菌劑后是否有活孢子存在，從而如果比此前對該產(chǎn)品確立的基線熒光高的話，則表明存在活孢子。比基線值高可以是高出至多10%或高出至多 5%。例如，在將孢子與萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合并開始溫育步驟后，可在溫育結(jié)束時測量最終熒光并用作孢子萌發(fā)或無萌發(fā)的指標(biāo)。因此，使用上述組合物和指示器的本發(fā)明方法可對活孢子的存在足夠靈敏，以在短時間內(nèi)提供關(guān)于孢子的指示。另外，即使當(dāng)存在的活孢子數(shù)目相對較低時，也能提供該指
7J\ ο對于某些實施例，包括上述方法實施例中的任何一個在內(nèi)，該方法還包括將待滅菌的制品隨該滅菌過程指示器一起放置在該滅菌箱中。對于這些實施例中的某些，該方法還包括確定該滅菌過程對于該制品的滅菌是否有效。無活孢子的指示結(jié)果可用來確定該滅菌過程對于該制品的滅菌是有效的，而活孢子的指示結(jié)果可用來確定該過程不是有效的。 因此，使用上述的組合物、指示器和方法實施例，通過直接測量任何活孢子中核酸的產(chǎn)生， 可在相對較短時間內(nèi)作出有關(guān)經(jīng)歷了滅菌過程的制品的滅菌狀況的評估。示例性實施例1. 一種指示滅菌狀況的組合物，其包含多個能抵抗滅菌過程的孢子；包含亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌發(fā)培養(yǎng)基；其中該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中該能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。2.根據(jù)實施例1所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料的濃度為至多 0.10mM。3.根據(jù)實施例1或?qū)嵤├?所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在滅菌溫度下足夠穩(wěn)定。4.根據(jù)實施例1、2和3中任一項所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在高達(dá)至少121°C的溫度下足夠穩(wěn)定。5.根據(jù)實施例4所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在高達(dá)至少132°C 的溫度下足夠穩(wěn)定。6.根據(jù)實施例1-5中任一項所述的組合物，其中該培養(yǎng)基在用來檢測熒光強度的增加的發(fā)射和激發(fā)波長處基本上無任何背景熒光。7.根據(jù)實施例1-6中任一項所述的組合物，其中該培養(yǎng)基基本上不含該多個孢子存在的和產(chǎn)生的核酸以外的任何核酸。8.根據(jù)實施例1-7中任一項所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料是能與 DNA、RNA發(fā)生相互作用或者同時與DNA和RNA發(fā)生相互作用的染料。9.根據(jù)實施例1-8中任一項所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料是通過插入、靜電吸引、電荷相互作用、疏水-親水相互作用或者它們的組合與所述核酸發(fā)生相互作用的染料。10.根據(jù)實施例9所述的組合物，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料選自吖啶橙、被取代的不對稱花菁染料以及它們的組合。11.根據(jù)實施例1-10中任一項所述的組合物，其中該熒光強度的增加是在 500-675nm的波長處。12.根據(jù)實施例1-11中任一項所述的組合物，其中該營養(yǎng)物包含至少一種糖。13.根據(jù)實施例1-12中任一項所述的組合物，其中該營養(yǎng)物包含至少一種氨基酸。14.根據(jù)實施例1-13中任一項所述的組合物，其中該營養(yǎng)物包含至少一種鹽。15.根據(jù)實施例1-14中任一項所述的組合物，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含碰撞猝滅成分。16.根據(jù)實施例1-15中任一項所述的組合物，其中所述萌發(fā)培養(yǎng)基還包含至少一種參比染料。17.根據(jù)實施例1-16中任一項所述的組合物，其中該多個能抵抗滅菌過程的孢子選自嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、生孢梭菌 (Clostridium sporogenes)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)以及它們的組合。18.根據(jù)實施例1-17中任一項所述的組合物，其中該多個能抵抗滅菌過程的孢子和該萌發(fā)培養(yǎng)基相互隔開又相互接近。19.根據(jù)實施例1-18中任一項所述的組合物，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基是含水溶液或懸浮液。20.根據(jù)實施例1-18中任一項所述的組合物，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基為干燥的形式。21. 一種滅菌過程指示器，其包括承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體；不能透過微生物且不能透過滅菌劑的容器，該容器含有包括亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌
發(fā)培養(yǎng)基；其中該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中該能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。其中該載體靠近該容器且與該萌發(fā)培養(yǎng)基隔開。22.根據(jù)實施例21所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料的濃度為至多 0.10mM。23.根據(jù)實施例21或?qū)嵤├?2所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在滅菌溫度下足夠穩(wěn)定。24.根據(jù)實施例21、22和23中任一項所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在高達(dá)至少121°C的溫度下足夠穩(wěn)定。25.根據(jù)實施例20所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在高達(dá)至少 132 °C的溫度下足夠穩(wěn)定。26.根據(jù)實施例21-25中任一項所述的指示器，其中該培養(yǎng)基在用來檢測熒光強度的增加的發(fā)射和激發(fā)波長處基本上無任何背景熒光。27.根據(jù)實施例2146中任一項所述的指示器，其中該培養(yǎng)基基本上不含該多個孢子存在的和產(chǎn)生的核酸以外的任何核酸。28.根據(jù)實施例21-27中任一項所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料是能與DNA、RNA發(fā)生相互作用或者同時與DNA和RNA發(fā)生相互作用的染料。29.根據(jù)實施例21- 中任一項所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料是通過插入、靜電吸引、電荷相互作用、疏水-親水相互作用或者它們的組合與所述核酸發(fā)生相互作用的染料。30.根據(jù)實施例四所述的指示器，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料選自吖啶橙、被取代的不對稱花菁染料以及它們的組合。31.根據(jù)實施例21-30中任一項所述的指示器，其中該熒光強度的增加是在 500-675nm的波長處。32.根據(jù)實施例21-31中任一項所述的指示器，其中該營養(yǎng)物包含至少一種糖。33.根據(jù)實施例21-32中任一項所述的指示器，其中該營養(yǎng)物包含至少一種氨基酸。34.根據(jù)實施例21-33中任一項所述的指示器，其中該營養(yǎng)物包含至少一種鹽。35.根據(jù)實施例21-34中任一項所述的指示器，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含碰撞猝滅成分。36.根據(jù)實施例21-35中任一項所述的指示器，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含至少一種參比染料。37.根據(jù)實施例21-36中任一項所述的指示器，其中該多個能抵抗滅菌過程的孢子選自嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、生孢梭菌、凝結(jié)芽孢桿菌以及它們的組合。38.根據(jù)實施例21-37中任一項所述的指示器，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基是含水溶液或懸浮液。39.根據(jù)實施例21-37中任一項所述的指示器，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基為干燥的形式。40. 一種確定滅菌過程的有效性的方法，該方法包括
提供滅菌過程指示器，其包含承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體；不能透過微生物且不能透過滅菌劑的容器，該容器含有包括亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌
發(fā)培養(yǎng)基；其中該至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與該多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中該能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定；和其中該載體靠近該容器且與該萌發(fā)培養(yǎng)基隔開；將該滅菌過程指示器放置在滅菌箱中；將該滅菌過程指示器暴露于滅菌劑；將該多個能抵抗滅菌過程的孢子和該萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合；用該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子；和測量該熒光強度的增加，如果存在的話。41.根據(jù)實施例40所述的方法，其還包括通過在用該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子， 并且如果存在的話，測定熒光強度的增加速度的同時，如果存在的話，測量熒光強度的增加，來確定在將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。42.根據(jù)實施例40所述的方法，其還包括通過測量用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子之后的如果存在的話，熒光強度的增加，與用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子之前相比較， 來確定在將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。43.根據(jù)實施例41或?qū)嵤├?2所述的方法，其中確定是否存在少至100個活孢子，并且其中溫育進(jìn)行至多8小時。44.根據(jù)實施例43所述的方法，其中溫育進(jìn)行至多1小時。45.根據(jù)實施例44所述的方法，其中溫育進(jìn)行至多30分鐘。46.根據(jù)實施例40-45中任一項所述的方法，其還包括將待滅菌的制品隨該滅菌過程指示器一起放置在該滅菌箱中。47.根據(jù)實施例46所述的方法，其還包括確定該滅菌過程對于該制品的滅菌是否有效。48.根據(jù)實施例40-47中任一項所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料的濃度為至多0. 10mM。49.根據(jù)實施例40-48中任一項所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在滅菌溫度下足夠穩(wěn)定。50.根據(jù)實施例40-49中任一項所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在高達(dá)至少121°C的溫度下足夠穩(wěn)定。51.根據(jù)實施例50所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料在高達(dá)至少132°C 的溫度下足夠穩(wěn)定。52.根據(jù)實施例40-51中任一項所述的方法，其中該培養(yǎng)基在用來檢測熒光強度的增加的發(fā)射和激發(fā)波長處基本上無任何背景熒光。53.根據(jù)實施例40-52中任一項所述的方法，其中該培養(yǎng)基基本上無該多個孢子存在的和產(chǎn)生的核酸以外的任何核酸。54.根據(jù)實施例40-53中任一項所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料是能與DNA、RNA發(fā)生相互作用或者同時與DNA和RNA發(fā)生相互作用的染料。55.根據(jù)實施例40-54中任一項所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料是通過插入、靜電吸引、電荷相互作用、疏水-親水相互作用或者它們的組合與所述核酸發(fā)生相互作用的染料。56.根據(jù)實施例55所述的方法，其中該能透過細(xì)胞的熒光染料選自吖啶橙、被取代的不對稱花菁染料以及它們的組合。57.根據(jù)實施例40-56中任一項所述的方法，其中該熒光強度的增加是在 500-675nm的波長處。58.根據(jù)實施例40-57中任一項所述的方法，其中該營養(yǎng)物包含至少一種糖。59.根據(jù)實施例40-58中任一項所述的方法，其中該營養(yǎng)物包含至少一種氨基酸。60.根據(jù)實施例40-59中任一項所述的方法，其中該營養(yǎng)物包含至少一種鹽。61.根據(jù)實施例40-60中任一項所述的方法，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含碰撞猝滅成分。62.根據(jù)實施例40-61中任一項所述的方法，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基還包含至少一種參比染料。63.根據(jù)實施例40-62中任一項所述的方法，其中該多個能抵抗滅菌過程的孢子選自嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、生孢梭菌、凝結(jié)芽孢桿菌以及它們的組合。64.根據(jù)實施例40-63中任一項所述的方法，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基是含水溶液或懸浮液。65.根據(jù)實施例40-63中任一項所述的方法，其中該萌發(fā)培養(yǎng)基為干燥的形式。下面的實例進(jìn)一步說明本發(fā)明的目的和優(yōu)點，但這些實例中列舉的具體材料及其量以及其他條件和細(xì)節(jié)不應(yīng)被解釋為是對本發(fā)明的不當(dāng)限制。SM孢子懸浮液嗜熱脂肪地芽孢桿菌(也稱為嗜熱脂肪芽孢桿菌)的孢子懸浮液按已知的方法來制備，如美國專利號5，418，167 (Matner等人)的實例1中所述的方法。這些方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的另選方法的修改方案，也可用于制備這些懸浮液。實例1能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料檢測出孢子萌發(fā)將來自以下類別的代表性的能透過細(xì)胞的染料與嗜熱脂肪地芽孢桿菌的孢子一起試驗綠色熒光核酸染液、紅色熒光核酸染液和吖啶橙。具體而言，將上述孢子懸浮液 100微升和該染料與無菌沖洗用水(Baxter，Deerfield, IL)或者與營養(yǎng)物即葡萄糖、果糖和氯化鉀水溶液(分別為lmg/mL、lmg/mL和3. 3mg/mL)、0. 2M纈氨酸、0. 04M異亮氨酸、0. 2M 甲硫氨酸、細(xì)g/ml肌苷及0. 4M丙氨酸的1 5000稀釋液200微升進(jìn)行組合。在50°C的溫育溫度下，用下述染料在以下指定濃度下及激發(fā)和發(fā)射波長處，檢測每個所得的懸浮液的熒光強度SYTO 24 :1.0 μ M(微摩爾)；485nm 處激發(fā)，530nm 處發(fā)射;吖啶橙6. 6 μ M ；485nm處激發(fā)，530nm處發(fā)射；SYTO 64 :1· ΟμΜ ;530nm 處激發(fā)，620nm 處發(fā)射。以上染料可獲自 hvitrogen (Carlsbad，CA)。在 Biotek FL600 熒光計或 Biotek Synergy 4讀板機(jī)(Biotek，Winooski，VT)中監(jiān)測熒光。結(jié)果示于表1中。^ 1.不好辦貼疆力鄉(xiāng)縦睛胃驢棚咖白喊刺躺。
權(quán)利要求
1.一種滅菌狀況指示組合物，其包含 多個能抵抗滅菌過程的孢子；包含亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌發(fā)培養(yǎng)基；其中所述至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與所述多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料的濃度為至多 0.10mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料在滅菌溫度下足夠穩(wěn)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的組合物，其中所述培養(yǎng)基在用來檢測熒光強度的增加的發(fā)射和激發(fā)波長處基本上無任何背景熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的組合物，其中所述培養(yǎng)基基本上不含所述多個孢子存在的和產(chǎn)生的核酸以外的任何核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的組合物，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料是通過插入、靜電吸引、電荷相互作用、疏水-親水相互作用或者它們的組合與所述核酸發(fā)生相互作用的染料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的組合物，其中所述熒光強度的增加是在500-675nm 的波長處。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的組合物，其中所述萌發(fā)培養(yǎng)基還包含碰撞猝滅成分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的組合物，其中所述萌發(fā)培養(yǎng)基還包含至少一種參比染料。
10.一種滅菌過程指示器，其包括 承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體；不能透過微生物且不能透過滅菌劑的容器，所述容器含有包括亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌發(fā)培養(yǎng)基；其中所述至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與所述多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。其中所述載體靠近所述容器且與所述萌發(fā)培養(yǎng)基隔開。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的指示器，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料的濃度為至多 0.10mM。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的指示器，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料在滅菌溫度下足夠穩(wěn)定。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項所述的指示器，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料是通過插入、靜電吸引、電荷相互作用、疏水-親水相互作用或者它們的組合與所述核酸發(fā)生相互作用的染料。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項所述的指示器，其中所述熒光強度的增加是在 500-675nm的波長處。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14任一項所述的指示器，其中所述萌發(fā)培養(yǎng)基還包含碰撞猝滅成分。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15任一項所述的指示器，其中所述萌發(fā)培養(yǎng)基還包含至少一種參比染料。
17.一種確定滅菌過程的有效性的方法，所述方法包括提供滅菌過程指示器，其包含承載多個能抵抗滅菌過程的孢子的載體；不能透過微生物且不能透過滅菌劑的容器，所述容器含有包括亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌發(fā)培養(yǎng)基；其中所述至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與所述多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定；和其中所述載體靠近所述容器且與所述萌發(fā)培養(yǎng)基隔開；將所述滅菌過程指示器放置在滅菌箱中；將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑；將所述多個能抵抗滅菌過程的孢子和所述萌發(fā)培養(yǎng)基進(jìn)行組合；用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子；禾口如果存在的話，測量所述熒光強度的增加。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其還包括通過在用該萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子，并且如果存在的話，測定熒光強度的增加速度的同時，如果存在的話，測量熒光強度的增加， 來確定在將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其還包括通過測量用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子之后的如果存在的話，熒光強度的增加，與用所述萌發(fā)培養(yǎng)基溫育所述孢子之前相比較，來確定在將所述滅菌過程指示器暴露于滅菌劑之后是否有活孢子存在。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19任一項所述的方法，其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料的濃度為至多0. IOmM0
全文摘要
本發(fā)明提供一種滅菌狀況指示組合物，其包含多個能抵抗滅菌過程的孢子；包含亞致死量的至少一種能透過細(xì)胞、能與核酸發(fā)生相互作用的熒光染料和至少一種供所述孢子萌發(fā)的營養(yǎng)物的萌發(fā)培養(yǎng)基；其中所述至少一種能透過細(xì)胞的熒光染料能與所述多個孢子在其萌發(fā)期間或在其萌發(fā)和長出期間存在的和產(chǎn)生的核酸發(fā)生相互作用，以產(chǎn)生熒光強度的增加，表明有活孢子存在，且其中所述能透過細(xì)胞的熒光染料至少在用于溫育所述孢子以產(chǎn)生熒光強度的增加的溫度下足夠穩(wěn)定。本發(fā)明還提供一種包含所述組合物的滅菌過程指示器以及用所述組合物和指示器確定滅菌過程的有效性的方法。
文檔編號C12Q1/22GK102245782SQ200980149547
公開日2011年11月16日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者塞拉嘉·常德拉帕蒂, 希瑟·M·韋布, 庫爾特·J·霍爾沃森 申請人:3M創(chuàng)新有限公司