監(jiān)測滅菌處理的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于監(jiān)測滅菌處理的方法，所述方法包括：(A)在滅菌處理中將待滅菌的物品和生物指示劑暴露于滅菌介質(zhì)，所述生物指示劑包含具有質(zhì)膜的細(xì)胞；和(B)測量所述細(xì)胞的膜電位以檢測所述細(xì)胞的活力。
【專利說明】監(jiān)測滅菌處理的方法
[0001] 本申請是申請日為2011年6月16日、申請?zhí)枮?01180035647. 2、發(fā)明名稱為"監(jiān) 測滅菌處理的方法"的申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交互引用
[0003] 本申請與官方申請日為2010年7月20日的美國臨時申請61/355, 307相關(guān)，并根 據(jù)美國專利法35U.S.C. § 119(e)要求其權(quán)利，該美國臨時申請通過引用整體并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本發(fā)明涉及一種用于監(jiān)測滅菌處理的方法。更特別地，本發(fā)明涉及一種用于監(jiān)測 滅菌處理的方法，其中將包含具有質(zhì)膜的細(xì)胞的生物指示劑暴露于滅菌介質(zhì)，然后測量所 述生物指示劑的膜電位以檢測所述細(xì)胞的活力。

【背景技術(shù)】
[0005] 通常，在滅菌處理中采用諸如細(xì)菌的生物指示劑來測定待滅菌物品是否已暴露于 有效水平的滅菌劑活性成分。生物指示劑可用來確認(rèn)處理器或所處理的載荷（processed load)本身內(nèi)滅菌條件已滿足。生物指示劑可通過在指示劑內(nèi)或指示劑上提供極大量的對 所述特定處理具有高度抗性的生物體來體現(xiàn)處理系統(tǒng)的最壞情形。通常使用孢子（spore) 作為選擇的生物體用于監(jiān)測所述滅菌處理。通常，生物指示劑的使用者根據(jù)任何存活生物 體繁殖后的可視效果來測定采用生物指示劑的滅菌處理的效力。如果使用該指示劑，此處 理可需要數(shù)小時至數(shù)天才能產(chǎn)生可視的變化，如培養(yǎng)基渾濁或PH指示劑顏色改變。
[0006] 已提出將孢子外被內(nèi)存在的內(nèi)源性（內(nèi)部來源的，預(yù)先存在的）熱穩(wěn)定酶的活性 與生物體的實際活力關(guān)聯(lián)起來的生物指示劑。這導(dǎo)致使用熒光計或色度計的生物讀取時間 為數(shù)分鐘至數(shù)小時。盡管這些生物指示劑提供酶活性與生物體活力之間的關(guān)聯(lián)，但實際獲 得的結(jié)果完全歸因于酶活性而與生物體活力無直接聯(lián)系。
[0007] 還提出將經(jīng)重組基因化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的外源性（外部來源的，非預(yù)先存在的）酶的 活性與在滅菌處理事件之后是否存在活的測試生物（test organism)評價為是否攜帶該重 組基因關(guān)聯(lián)起來的生物指示劑。這導(dǎo)致使用熒光計的生物讀取時間為數(shù)分鐘至數(shù)小時并且 提供與生物體活力的直接聯(lián)系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 這些早期技術(shù)的問題涉及一個事實：現(xiàn)有技術(shù)主要根據(jù)生物體的生長和分裂或酶 活性的存在來檢測活力。生物體的生長和分裂需要數(shù)小時至數(shù)天來檢測。酶活性需要數(shù)分 鐘至數(shù)小時產(chǎn)生足夠高的信號以進(jìn)行熒光或色度檢測。因此，需要一種快速獲得結(jié)果的方 法，所述方法的結(jié)果確定性與利用生長和分裂技術(shù)獲得的相同。本發(fā)明提供了此問題的解 決方案。
[0009] 本發(fā)明涉及一種方法，所述方法包括：(A)在滅菌處理中將待滅菌物品和生物指 示劑暴露于滅菌介質(zhì)，所述生物指示劑包含具有質(zhì)膜的細(xì)胞；和（B)測量經(jīng)處理的所述細(xì) 胞的膜電位以檢測所述滅菌處理完成后細(xì)胞群內(nèi)的任何剩余活力。此活力可通過與離子流 事件或指示劑孢子萌發(fā)有關(guān)的膜電位改變來例示，但不限于此。
[0010] 本發(fā)明涉及一種滅菌指示劑，所述滅菌指示劑包含安置在基材上的導(dǎo)電材料，和 安置在部分或整個導(dǎo)電材料上的生物指示劑（例如，孢子）。
[0011] 本發(fā)明涉及一種用于制備滅菌指示劑的方法，所述方法包括：利用例如噴墨式印 刷機(jī)將導(dǎo)電材料沉積到基材（例如，利用印刷法，如例示的噴墨印刷，但不限于此）上和將 生物指示劑（例如，孢子）沉積到部分或整個所述導(dǎo)電材料上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是顯示實施例1中測試的孢子膜電位改變的圖。
[0013] 圖2是突光偏振器不意圖。
[0014] 圖3是與萌發(fā)的電子監(jiān)測聯(lián)合作用的生物指示劑的示意圖。
[0015] 圖4和5是通過電信號評價膜電位的替代生物指示劑的圖解。
[0016] 圖6是本發(fā)明滅菌指示劑的一種電學(xué)實施方式的底部元件示意圖。
[0017] 圖7是諸如圖6所示的本發(fā)明滅菌指示劑的電學(xué)實施方式的頂部元件示意圖。 [0018] 圖8是諸如圖4-7所示的本發(fā)明實施方式所用的頂部密封件層的俯視示意圖。 [0019] 圖9是本發(fā)明另一種實施方式的底部元件700的俯視示意圖，所述實施方式是滅 菌指示劑的基于熒光的實施方式。
[0020] 圖10是與一種本發(fā)明實施方式的基于電子型的滅菌指示劑一起使用的讀取儀的 主視示意圖，以及例示的電子滅菌指示劑卡的主視圖和后視圖。
[0021] 圖IlA和IlB是與本發(fā)明一種實施方式的基于熒光型的滅菌指示劑一起使用的讀 取儀分別處于關(guān)閉和打開狀態(tài)的主視示意圖。
[0022] 圖12是如圖11所示的熒光讀取儀的內(nèi)部組件的透視示意圖，以及例示的基于熒 光的滅菌指不劑卡的主視圖和后視圖。
[0023] 圖13是與FABI自含式生物指示劑一起使用的讀取儀的主視示意圖。

【具體實施方式】
[0024] 術(shù)語"滅菌"是指使物質(zhì)不能繁殖、代謝和/或生長。雖然該術(shù)語通常是指活生物 體完全不存在，但該術(shù)語在本文中是指物質(zhì)的活生物體喪失達(dá)到預(yù)先批準(zhǔn)或確定為可接受 的水平。除非另有說明，術(shù)語"滅菌"在本文中還指不如滅菌嚴(yán)格的方法和程序，例如，消毒 和衛(wèi)生處理等。
[0025] 本文記載的方法和設(shè)備可用于衛(wèi)生保健領(lǐng)域和科研領(lǐng)域等。這些方法和設(shè)備還可 用于需要滅菌、消毒、衛(wèi)生處理、排污和清潔等的商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用中。所述商業(yè)和工業(yè)應(yīng)用 可包括諸如食品加工、巴氏殺菌、土壤修復(fù)和水修復(fù)等處理。
[0026] 使用本發(fā)明方法的滅菌處理可包括任何滅菌處理。滅菌處理可包括其中滅菌介 質(zhì)或滅菌劑可包括蒸汽、干熱、輻射、等離子體以及一種或多種氣體滅菌劑和一種或多種液 體滅菌劑等的滅菌處理。所用的基于輻射的處理可包括電子束或任何電磁光譜，所述電磁 光譜包括電離輻射、脈沖白光或脈沖紫外線光、和微波等。輻射可包括Y或β輻射。氣體 滅菌劑可包括環(huán)氧乙烷和氣體過氧化氫等。液體滅菌劑可包括福爾馬林（溶于水的甲醛氣 體，任選含有甲醇以抑制毒性物質(zhì)的形成）、戊二醛、過氧乙酸和液體過氧化氫等。可使用生 物指示劑來檢驗滅菌劑針對任何對滅菌處理的抗性小于生物指示劑提供的測試生物的微 生物的致命性。這些微生物可包括諸如大腸桿菌（Escherichia coli)、軍團(tuán)菌（Legionella sp.)、彎曲菌（Campylobacter sp.)和其他腸細(xì)菌以及葡萄球菌和鏈球菌的細(xì)菌，和諸如 隱孢子蟲的其他人致病微生物。生物指示劑可包括一種或多種測試生物。測試生物可包 括對目標(biāo)滅菌處理的抗性大于滅菌處理被設(shè)計要破壞的其他生物體的任何具有質(zhì)膜的細(xì) 胞。用作生物指示劑的測試生物類型可取決于所用滅菌處理類型例示的各種因素，但不限 于此。測試生物可以是微生物。所用株系可為對滅菌所用的處理抗性最大的那些株系。測 試微生物可包括細(xì)菌。細(xì)菌微生物可為形成內(nèi)生孢子（即，細(xì)菌芽孢）的那些微生物。測 試生物可包括芽孢桿菌屬或梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌。測試生物可包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophilus)、萎縮芽抱桿菌（Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱桿 菌（Bacillus subtilis)、球形芽抱桿菌（Bacillus sphaericus)、炭疽芽抱桿菌（Bacillus anthracis)、短小芽抱桿菌（Bacillus pumilus)、凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、 生抱梭菌（Clostridium sporogenes)、艱難梭菌（Clostridium difficile)、肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)、枯草芽抱桿菌球形變種（Bacillus subtilis globigii)、錯狀 芽孢桿菌（Bacillus cereus)、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans)、大腸桿菌，或它們中 的兩種或多種的混合物。
[0027] 測試生物可包括真菌、分枝桿菌、原生動物、植物細(xì)菌、營養(yǎng)細(xì)胞（vegetative cel 1)和/或它們的組成部分等。可使用的真菌實例可包括黑曲霉（AspergiIIus niger)、白色念珠菌（Candida albicans)、須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes) 和皮炎萬氏霉（Wangiella dermatitis)等。可使用的分枝桿菌實例可包括龜分枝桿菌 (Mycobacterium chelonae)、戈氏分枝桿菌（Mycobacterium gordonae)、恥垢分枝桿菌 (Mycobacterium smegmatis)和地分枝桿菌（Mycobacterium terrae)等。可使用的原生 動物實例可包括藍(lán)氏賈第鞭毛蟲（Giardia Iamblia)和微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum)等?？墒褂玫闹参锛?xì)菌實例可包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、 奠腸球菌（Enterococcus faecalis)、|^鏈球菌（Streptococcus faecalis)、屎腸球菌 (Enterococcus faecium)、化胺性鏈球菌（Streptococcus pyrogenes)、大腸桿菌、肺炎 克雷伯菌（Klebsiella (pneumoniae))、嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila)、甲基營 養(yǎng)菌（Methylobacterium)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、豬霍亂沙門氏 菌（Salmonella choleraesuis)、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)和嗜麥芽窄食 單胞菌（Stenotrophomonas maltophiIia)等。諸如嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、 枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和生孢梭菌等的生物體可用于測定濕熱滅菌（高壓滅菌）的 效力，其中嗜熱脂肪地芽孢桿菌特別有用。
[0028] 測試生物可包括黑曲霉、白色念珠菌、須毛癬菌、皮炎萬氏霉、龜分枝桿菌、戈氏 分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、地分枝桿菌、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)、結(jié)核分枝 桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲、微小隱孢子蟲、嗜水氣單胞菌、 糞腸球菌、糞鏈球菌、屎腸球菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺軍團(tuán)菌、 甲基營養(yǎng)菌、銅綠假單胞菌、豬霍亂沙門氏菌、幽門螺桿菌、耐輻射微球菌（Micrococcus radiodurans)、耐福射奇球菌（Deinococcus radiodurans)、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球 菌、嗜麥芽窄食單胞菌，或它們中的兩種或多種的混合物。
[0029] 除了基于是否代表最具抗性的生物體（例如，嗜熱脂肪地芽孢桿菌和萎縮芽孢 桿菌）而選擇的測試生物，生物指示劑可進(jìn)一步包括生物恐怖或生物戰(zhàn)的試劑，例如，炭 疽芽孢桿菌等。這些抗性生物體可還包括因天然修飾或人工修飾而對先前有效的抗菌處 理手段或化學(xué)消毒變得有抗性的株系。先前類型的實例可包括VRE (抗萬古霉素腸球菌 (vancomycin resistant enterococci))、MSRA(抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphyloccusaureus))和龜分枝桿菌（Mycobacterium cheloni)等。這些抗性 生物體是所需的，因為VRE和MRSA最近已發(fā)展為對治療對策顯抗性（例如，抗生素抗性） 而龜分枝桿菌已發(fā)展為對某些方式的消毒顯抗性（例如，戊二醛抗性），因此提供適合的測 試生物作為"最壞情形"的模型。
[0030] 在諸如細(xì)菌的活生物體內(nèi)，產(chǎn)生跨細(xì)胞質(zhì)膜的電位。此膜電位在諸如產(chǎn)生三磷酸 腺苷（ATP)、趨化作用、葡萄糖運輸和生物體在低pH下生存的活動所需的生物體質(zhì)子驅(qū)動 力中具有至關(guān)重要的作用。建立膜電位是當(dāng)生物體開始萌發(fā)或?qū)Νh(huán)境改變作出反應(yīng)時所發(fā) 生的首要事件之一。建立膜電位能夠使細(xì)胞與其環(huán)境交流物質(zhì)/信息。因此，通過測量膜 電位，本發(fā)明方法提供對細(xì)胞活力的即時或快速讀取。
[0031] 在有活力的、活躍代謝的生物體內(nèi)的膜電位可以是高的，而具有高膜電位的細(xì)胞 通常被稱作是能化態(tài)的或超極化的。非活生物體和休眠生物體可顯示低至零的膜電位且通 常被稱作是非能化態(tài)的或去極化的。
[0032] 本發(fā)明的方法可依賴于測試生物萌發(fā)和生長時發(fā)生的膜電位改變作為檢測測試 生物活力的手段。當(dāng)活生物體置于有利于萌發(fā)和生長的條件下時，生物體的膜電位可能改 變。另一方面，如果生物體是非活生物體，則不能萌發(fā)且其膜電位不會改變。
[0033] 生物指示劑可包括基因工程生物指示劑，所述基因工程生物指示劑可進(jìn)一步包括 測試生物（例如，細(xì)菌微生物）利用適合的載體（例如，質(zhì)?；虿《荆┧奢d（taken up) 的適于提高膜電位的報告基因。阻遏基因可活躍阻斷報告基因的表達(dá)。報告基因的表達(dá)可 一直被阻斷直至阻遏基因暴露于可存在于恢復(fù)介質(zhì)（recovery medium)中的誘導(dǎo)物。用于 基因工程生物指示劑中的測試生物可包括上述任一種測試生物。在一種實施方式中，測試 生物直至滅菌處理完全后才暴露于誘導(dǎo)物，因此，在滅菌前或滅菌過程中將不存在指示酶。 可暴露于滅菌處理的有測試生物用以存活和生長的多種至關(guān)重要的裝置，所述裝置也用于 生成指示酶。這些裝置可包括用于細(xì)胞生長（和質(zhì)粒復(fù)制）的DNA聚合酶、用于轉(zhuǎn)錄測試 生物（和攜帶報告基因的質(zhì)?；虿《荆┐x必需物的RNA聚合酶和細(xì)胞蛋白翻譯（以及指 示劑酶和/或離子運輸機(jī)構(gòu)的表達(dá)）需要的核糖體多核糖體。
[0034] 有兩類重要的膜電位熒光染料，每類結(jié)合細(xì)胞的方法不同。第一類的膜電位染料 碳菁（carbocyanine)可積聚在超極化膜上且可遷移到脂質(zhì)雙層中。有用的碳菁是碘代 3, 3'-二己氧基碳菁[Di0C6(3)]?？墒褂玫牡诙惸る娢蝗玖习ㄑ蹼s菁類（oxonols)。氧 雜菁類染料可進(jìn)入去極化細(xì)胞且結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白或膜。有用的氧雜菁類染料是雙（1，3-二 丁基巴比妥酸）三次甲基氧雜菁[DiBAC4(3)]。使用碳菁染料時，熒光可隨時間和膜電位的 增加而增加，而使用氧雜菁染料時，熒光隨時間的增加和膜電位的降低而減少。膜電位存在 與否則可隨時間與熒光正相關(guān)。
[0035] 培養(yǎng)基可稱作生長介質(zhì)或恢復(fù)介質(zhì)。培養(yǎng)基可為固體或液體形式。培養(yǎng)基可包括 特別緩沖的水溶液以使生物指示劑對PH變化、氧化還原電位和酶活性等更敏感。
[0036] 滅菌指示劑可在任何處理中使用，其中滅菌指示劑在滅菌處理中暴露于滅菌介 質(zhì)，然后暴露于恢復(fù)和誘導(dǎo)。培養(yǎng)基可包括一種或多種營養(yǎng)源。營養(yǎng)源可用來為經(jīng)滅菌處 理而存活的任何測試生物的生長提供能量。營養(yǎng)源的實例可包括酪蛋白胰酶消化物、大豆 粉酶消化物、蔗糖、右旋葡萄糖、酵母提取物、L-胱氨酸，和它們中的兩種或多種的混合。在 活測試生物存在下改變顏色或天然狀態(tài)的微生物生長指示劑可與培養(yǎng)基一起使用。
[0037] 培養(yǎng)基（恢復(fù)/誘導(dǎo)介質(zhì)）可含有例如膜電位染料或電壓敏感性染料。使用這些 微生物生長指示劑可導(dǎo)致熒光因響應(yīng)于微生物生長的現(xiàn)象（如pH改變、氧化還原電位、酶 活性以及其他生長指標(biāo)）而改變。
[0038] 培養(yǎng)基可進(jìn)一步包括一種或多種pH緩沖液、一種或多種中和劑、一種或多種保 持滲透平衡的試劑，或它們中的兩種或多種的混合物。pH緩沖液可包括K 2HP04、ΚΗ2Ρ04、 (順4) 2冊04、2,2-雙（羥基甲基）-2,2、2"-次氮基三乙醇收8 1'1^)、1，3-雙[三（羥 基甲基）-甲基氨基]丙烷（BiS-三丙烷）、4-(2-羥基乙基）哌嗪-乙磺酸（HEPES)、2-氨 基-2-(羥基甲基）-1，3-丙二醇（TrizmaJris堿）、N-[三（羥基甲基）甲基]甘氨酸 (Tricine)、二甘氨酸（Gly-Gly)、N，N-雙（2-羥基乙基）甘氨酸（Bicine)、N-(2-15 乙酰 氨基）亞氨基二乙酸（ADA)、N-(2-乙酰氨基）-2-氨基乙磺酸（aces)、1，4-哌嗪二乙磺酸 (PIPES)、對羥基-4-嗎啉丙磺酸（MOPSO)、N，N-雙（2-羥基乙基）-2-氨基乙磺酸（BES)、 3-(N-嗎啉基）丙磺酸（M0PS)、2-[(2-羥基-1，1-雙（羥基甲基）乙基）氨基]乙磺酸 (TES)、3-[N，N-雙（2-羥基乙基）氨基]-2-羥基-1-丙磺酸（DIPSO)、4-(N-嗎啉基）丁 磺酸（MOBS)、2_羥基-3-[三（羥基甲基）甲基氨基]-1-丙磺酸（TAPSO)、4-(2_羥基乙 基）哌嗪-1-(2-羥基丙磺酸水合物（HEPPSO)、哌嗪-1，4-雙（2-羥基丙磺酸）二水合物 (POPSO)、4- (2-25羥基乙基）-1-哌嗪丙磺酸（EPPS)、N- (2-羥基乙基）-哌嗪-Ν' - (4- 丁磺 酸）（HEPBS)、[ (2-羥基-1，1-雙（羥基甲基）乙基）氨基]-1-丙磺酸（TAPS)、2_氨基-2-甲 基-1,3-丙二醇（AMPD)、N-三（羥基甲基）甲基-4-氨基丁磺酸（TABS)、N-(l，1-二甲 基-2-羥基乙基）-3-氨基-2-羥基丙磺酸（AMPSO)、2-(環(huán)己基氨基）乙磺酸（CHES)、3-(環(huán) 己基氨基）-2_羥基-1-丙磺酸（CAPSO)、2_氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、3-(環(huán)己基氨 基）-1_丙磺酸（CAPS)、4-(環(huán)己基氨基）-1- 丁磺酸（CABS)、2-(N-嗎啉基）乙磺酸水合物 (MES)、N- (2-乙酰氨基）-2-氨基乙磺酸（ACES)，和它們中的兩種或多種的混合物。
[0039] 中和劑可包括但不限于巰基乙酸鈉、硫代硫酸鈉、過氧化氫酶、硫酸氫鈉、亞硫酸 氫鈉卵磷脂、聚山梨酯20、聚山梨酯80、碳酸氫鈣，和它們中的兩種或多種的混合物。
[0040] 用于保持滲透平衡的試劑可包括鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、錳鹽、鈣鹽以及其他試劑（例 如，過渡金屬鹽、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鐵），和它們中的兩種或多種的混合物。
[0041] 在一種實施方式中，培養(yǎng)基包括水性組合物,所述水性組合物包含：水；每升水 約0. 01至約100g(g/l)和在一種實施方式中約0. 1至約50g/l的一種或多種營養(yǎng)源；約 I. OX KT5至約10g/l和在一種實施方式中約I. OX KT4至約1. Og/Ι的一種或多種微生物 生長指示劑；高達(dá)約5000g/l、和在一種實施方式中約0. 001至約5000g/l和在一種實施方 式中約0. 1至約1000g/l的一種或多種pH緩沖液；高達(dá)約100g/l、和在一個實施方式中約 0. 01至約100g/l和在一種實施方式中約0. 1至約50g/l的一種或多種中和劑；高達(dá)約50g/ I、和在一種實施方式中約0. 1至約50g/l和在一種實施方式中約0. 1至約25g/l的一種或 多種保持滲透平衡的試劑。
[0042] 培養(yǎng)基可包括營養(yǎng)肉湯、D/E中和肉湯、Davis基本培養(yǎng)基、無菌試驗肉湯、以及任 何基于大豆-酪蛋白消化物或牛肉提取物的培養(yǎng)基。這些可包括大豆-酪蛋白消化物肉湯、 流體巰基乙酸鹽和右旋葡萄糖胰蛋白胨（Difco Laboratories, Inc.)的水溶液。可使用無 葡萄糖的改良的胰蛋白胨大豆肉湯基礎(chǔ)。還可添加膜電位染料或電壓敏感性染料。
[0043] 可使用的培養(yǎng)基實例是Bac toTM胰蛋白胨大豆肉湯，其含有酪蛋白胰酶消化物 (17. Og/Ι)、大豆粉酶消化物（3. Og/Ι)、氯化鈉（5. Og/Ι)、磷酸氫二鉀（2. 5g/l)和右旋葡萄 糖（2. 5g/l)。這些成分可分散或溶解于水中。以g/Ι表示的濃度是指每升水的組分克數(shù)。 酪蛋白胰酶消化物、大豆粉酶消化物和右旋葡萄糖為微生物的生長提供能量來源。這些可 稱作營養(yǎng)源。氯化鈉可用來保持液體介質(zhì)內(nèi)的滲透平衡。磷酸氫二鉀可用作PH緩沖液。例 如，可將膜電位染料DiOC 6 (3) (3ug/l)添加到BactoTM胰蛋白胨大豆肉湯配方中。
[0044] 培養(yǎng)基可包括僅用以強(qiáng)化離子流事件和/或啟動孢子萌發(fā)的非常基礎(chǔ)的配方。該 培養(yǎng)基可包含氨基酸、鹽和/或糖。氨基酸實例包括L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、 L-纈氨酸、L-乳酸鹽、L-蘇氨酸、L-酒石酸、葉酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸和天冬酰胺。鹽的 實例是氯化鈉和氯化鉀。糖的實例包括葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖。另外的離子流事件或萌 發(fā)事件可通過生長的生物體的上清液中發(fā)現(xiàn)的組分（如肽聚糖和胞壁肽）來觸發(fā)。
[0045] 膜電位染料是熒光染料，因此選擇的檢測方法必須具有區(qū)分來自膜內(nèi)結(jié)合的染料 分子的熒光與來自游離染料分子的熒光的能力。特別適合區(qū)分這兩種來源的熒光發(fā)射的兩 種方法是基于突光偏振（也稱作突光各向異性）的技術(shù)和基于突光共振能量轉(zhuǎn)移（基于 FRET)的技術(shù)，包括時間分辨FRET。
[0046] 熒光偏振是依賴于所檢測的熒光分子的表觀尺寸變化的檢測方法。偏振測量可基 于通過偏振光來選擇性激發(fā)熒光團(tuán)的原理。熒光團(tuán)有沿?zé)晒鈭F(tuán)分子軸的特定取向排列的吸 收和發(fā)射躍遷矩，優(yōu)選吸收其電矢量平行于這些躍遷矩排列的光子。在等向性溶液中，熒光 團(tuán)可以隨機(jī)取向。當(dāng)用偏振光激發(fā)時，可優(yōu)選激發(fā)其吸收躍遷矩偶極平行于激發(fā)的電矢量 的那些熒光團(tuán)分子。此選擇性激發(fā)可產(chǎn)生部分取向的熒光團(tuán)群并進(jìn)一步產(chǎn)生部分偏振的熒 光發(fā)射。也發(fā)生光沿?zé)晒鈭F(tuán)中的固定軸偏振的發(fā)射。熒光偏振可用平面偏振光激發(fā)分子。 于是在初始平面偏振位置和偏離平面偏振光的位置（通常偏離90° )均可測量發(fā)射光。例 如，如果激發(fā)光電矢量是垂直平面偏振的，則可在垂直和水平位置測量發(fā)射光。與激發(fā)光的 電矢量"并排"的熒光團(tuán)優(yōu)選吸收光。然后可在水平偏振位置和垂直偏振位置測量發(fā)射光。 偏振可表示為光強(qiáng)度比，是激發(fā)與發(fā)射之間的時段中分子旋轉(zhuǎn)程度的量度。小分子可比大 分子旋轉(zhuǎn)得較快且具有較小的內(nèi)在偏振值。另一方面，較大分子可旋轉(zhuǎn)得較慢，因此具有較 高的內(nèi)在偏振值。利用熒光偏振，可以區(qū)分結(jié)合的膜電位染料與未結(jié)合的膜電位染料。
[0047] 基于熒光偏振的培養(yǎng)器或/讀取儀可如圖2所示設(shè)計。圖2是熒光偏振器的示意 圖。參照圖2,提供樣品110測試的培養(yǎng)器/讀取儀100包括單色光源120、分束器130和 偏振器140、150和160。來自單色光源120的單色光經(jīng)過偏振器140以使所有的激發(fā)光偏 振。此偏振光優(yōu)選僅激發(fā)樣品110中與濾光器在相同偏振狀態(tài)的分子。當(dāng)這些分子旋轉(zhuǎn)時， 它們移出平面偏振位置。分束器130拆分發(fā)射光。分束器拆分光并使約一半的光經(jīng)過與激 發(fā)光在相同平面取向的偏振器150,另一半光經(jīng)過與初始激發(fā)光成一個角度取向的偏振器 160。測量并比較經(jīng)過各偏振器150和160的光。
[0048] 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)是將能量從初始激發(fā)的供體熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體熒光 團(tuán)。供體熒光團(tuán)通常在與受體吸收光譜重疊的較短波長發(fā)射。共振能量轉(zhuǎn)移在沒有光子出 現(xiàn)時就可發(fā)生，是供體與受體熒光團(tuán)之間長程偶極-偶極相互作用的結(jié)果。
[0049] 為了用FRET監(jiān)測膜電位的改變，需要兩種熒光團(tuán)。FRET供體可以是為受體提供足 夠的吸收光譜的任何熒光團(tuán)。受體熒光團(tuán)是膜電位染料。優(yōu)選供體熒光團(tuán)附著或粘附至孢 子壁，從而能夠緊密接近膜電位染料。另外，所選擇的熒光檢測（FRET)可用本文其他部分 和所提供的實施例中描述的相同類型熒光計來監(jiān)測。
[0050] 除了膜電位染料，電壓敏感性染料（voltage sensing dye 或 voltage-sensitive dye)也可利用另一套原理檢測生物體膜電位的相同改變。使用電壓敏感性染料檢測膜電 位是基于稱為電致變色的物理機(jī)制。電壓改變導(dǎo)致這些染料的激發(fā)和發(fā)射光譜顯示出顯著 的位移。光譜中的這些位移起因于反映膜電位改變的電荷重排。最常使用的電壓敏感性 染料類型是苯乙烯基染料，具體的實例包括二-8- 丁基-氨基-萘基-乙烯基-吡啶-丙 基-磺酸鹽（二-8-ANEPPS)和二-4- 丁基-氨基-萘基-乙烯基-吡啶-丙基-磺酸鹽 (二-4-ANEPPS)。
[0051] 結(jié)合FRET類技術(shù)使用電壓敏感性染料能容易檢測膜電位改變。例如，當(dāng)萌發(fā)的生 物體（例如孢子）的膜內(nèi)發(fā)生電荷重排時，電壓敏感性染料的發(fā)射波長就開始位移。發(fā)射 波長內(nèi)的該位移則可通過位于培養(yǎng)基內(nèi)的第二熒光團(tuán)檢測。該第二波長的發(fā)射可通過檢測 器檢測。例如，根據(jù)電壓/電荷特性，二-8-ANEPPS激發(fā)光譜中的峰在450nm和520nm之間 位移。這導(dǎo)致發(fā)射光譜中在530nm至640nm之間的相應(yīng)峰位移?？蓪晒庥?培養(yǎng)器設(shè)計 成在450nm或520nm處激發(fā)二-8-ANEPPS，然后在二-8-ANEPPS的相應(yīng)發(fā)射峰處檢測具有激 發(fā)峰的第二熒光團(tuán)。
[0052] 用于檢測膜電位改變的替代檢測方法是使用電子信號。當(dāng)生物體（例如孢子）開 始萌發(fā)時，膜電位增加，使更多電流和更大的電壓降，導(dǎo)致離子運輸增加，由此觀察到因膜 電位增加而電流增加。可將電鉛（electronic lead)置于介質(zhì)中或穿過生物指示劑基材或 在生物指示劑基材內(nèi)以電學(xué)測量膜電位。圖3-5中示出了用于測量電信號的生物指示劑的 三種電位設(shè)計。參照圖3,將生物指示劑200置于容器204內(nèi)容納的介質(zhì)202中。將電鉛 206和208置于介質(zhì)202中并使用它們測量膜電位。參照圖4,使用電鉛210和212測量穿 過生物指示劑214的膜電位。參照圖5,使用電鉛220和222測量生物指示劑224內(nèi)的膜電 位。
[0053] 滅菌指示劑可包括安置在基材上的導(dǎo)電材料（例如，在諸如硅的非導(dǎo)電性基材上 形成銅電路的導(dǎo)電材料）和安置在部分或整個導(dǎo)電材料上的生物指示劑（例如，孢子）。例 如，可利用噴墨式印刷機(jī)（例如可來自Fuji FilmDimatix材料印刷機(jī)DMP-2800)在非導(dǎo)電 性基材（例如，硅基材）上沉積生物指示劑（例如，孢子）和電路或包含導(dǎo)電材料（例如， 銅）的導(dǎo)電數(shù)字圖案?？衫萌魏嗡璧膱D案在基材上沉積電子電路或?qū)щ姅?shù)字圖案。然 后可利用噴墨式印刷機(jī)在部分或整個的電子電路或?qū)щ姅?shù)字圖案上沉積生物指示劑。生物 指示劑可分散于液體載體或介質(zhì)（例如，水）中，然后以小至約5皮升或約10皮升的小滴 沉積在部分或整個電路或數(shù)字圖案上。通常孢子量為每個孢子約3皮升。
[0054] 當(dāng)活生物體（例如，孢子）開始萌發(fā)時，可通過監(jiān)測電壓（電位）、電流、電阻和/ 或阻抗來電學(xué)評價生物指示劑。測量方法的選擇將決定電子設(shè)計。優(yōu)點包括降低了讀取生 物指示劑所需的時間。由于檢測方法依賴于級聯(lián)生物體萌發(fā)事件中最早步驟之一而不依賴 于結(jié)果或具體的報告酶，因此檢測時間可以大大降低。
[0055] 圖6是諸如圖4和5中所示的本發(fā)明一種實施方式的電子型滅菌指示劑的底部元 件600的示意圖。圖6更詳細(xì)顯示了滅菌指示劑底部元件600的元件。底部元件600包括 安置在非導(dǎo)電基材604上的導(dǎo)電材料602,如單層聚丙烯酰胺/聚苯胺。導(dǎo)電材料602可包 括任何適合的材料，只要該材料適于在使用滅菌指示劑的滅菌條件下使用。非導(dǎo)電基材604 可為任何適合的氣體/液體不可滲透的基底材料（例如PET)或適于在使用滅菌指示劑的 滅菌條件中使用的其他適合的材料。如圖6所示，安置在導(dǎo)電材料602與604層之間的是 導(dǎo)電襯層606，所述導(dǎo)電襯層606與導(dǎo)電材料602和檢測電路發(fā)生電通訊。檢測電路包括電 連接至電連接器610和接地器611的一系列連續(xù)的晶體管前置放大器608。電連接器610 提供從底部元件600至讀取設(shè)備的電通訊（如下所述）。前置放大器608將經(jīng)過滅菌指示 劑的電流改變逐級放大（詳見下文）。由于具有一系列放大器，可適宜放大來自生物指示劑 卡的信號而不引入過多噪音。通過接地器611完成電路。
[0056] 如圖6所示，適合的測試生物的孢子612可沉積在導(dǎo)電單層602上或嵌入導(dǎo)電單 層602中。孢子612可作為單獨的孢子或多個孢子進(jìn)行沉積。孢子612可沉積在例如聚丙 烯酰胺/緩沖混合物中，在這種情況下，認(rèn)為孢子在緩沖物質(zhì)的"泡（bubble) "內(nèi)，該"泡" 嵌入諸如聚丙烯酰胺的基質(zhì)內(nèi)?？蛇x地，孢子612可直接嵌入例如聚苯胺的層。
[0057] 現(xiàn)在參照圖7,該圖是滅菌指示劑的頂部元件614的俯視圖，示出了本發(fā)明該實施 方式的其他細(xì)節(jié)。圖7所示的頂部元件614的面是面向且接觸圖6所示結(jié)構(gòu)的上層的面。 頂部元件614包括可移動氣體/液體不可滲透的保護(hù)膜616,在其上形成氣體/蒸汽可滲 透層618?？蓾B透層618上疊加有導(dǎo)電層620。當(dāng)滅菌指示劑裝配好時，導(dǎo)電層620與孢子 612和任何周圍的導(dǎo)電材料（如導(dǎo)電單層602)電通訊，并且還經(jīng)由鉛626與連接器622電 通訊。如圖7所示，連接器622被安置在絕緣墊624下。連接器622經(jīng)由電線626通過導(dǎo) 電層620、孢子612、導(dǎo)電襯層606、前置放大器608和連接器610完成電路。利用經(jīng)過此電 路的電流改變來檢測是否任何測試生物經(jīng)使用滅菌指示劑600的滅菌處理而存活。如圖7 所示，頂部元件614包括粘附線628,頂部元件614通過該粘附線628緊密附著于底部元件 600,由此形成該實施方式的滅菌指示劑。
[0058] 在使用滅菌指示劑前，氣體/液體不可滲透保護(hù)膜616將保持不動以防止滅菌指 示劑600暴露于環(huán)境。在滅菌指示劑用于滅菌處理前立即移走膜616,以使滅菌介質(zhì)接觸滅 菌指示劑中的孢子612。
[0059] 圖8是如圖4-7中所示的本發(fā)明一種實施方式使用的頂部密封層630的俯視示意 圖。在圖8所示的實施方式中，頂部密封件630包括流體填充室632,該流體填充室632包 含活化和支撐下面的孢子612的熱穩(wěn)定誘導(dǎo)物和介質(zhì)。流體填充室632通過易分離的脫離 區(qū)（break-away zone) 634連接至頂部密封件層630的余部（remainder),所述室可通過該 易分離的脫離區(qū)634從頂部密封件630的余部移除。頂部密封件630進(jìn)一步包括與頂部元 件614的氣體/液體可滲透層618相連通的窗口 636。頂部密封件630進(jìn)一步包括用于使 頂部密封件630附至頂部元件614的熱焊縫（thermal weld) 638和可剝離的粘附區(qū)640。 熱焊縫638使所述室632附著至頂部元件630。
[0060] 圖9是本發(fā)明另一種實施方式的底部元件700的俯視示意圖，所述實施方式是基 于突光的滅菌指示劑的實施方式。圖9所示滅菌指示劑依賴生長孢子產(chǎn)生的突光作為滅菌 處理成功或失敗的指示。
[0061] 在圖9所示的實施方式中，底部元件700包括沉積有上覆材料或元件的背襯基材 702。背襯基材702可為任何適合的氣體/液體不可滲透材料，如PET(例如，Mylar? )、 聚丙烯、金屬或漆箔（lacquered foil)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于滅菌指示劑的任何 適合的聚烯烴。在背襯基材702上沉積有水合單層704。水合單層704可以是例如聚丙烯 酰胺，且可具有添加的孢子附著物，或孢子可嵌入水合單層704內(nèi)。底部元件702覆蓋有氣 體/蒸汽可滲透的熒光波長可透射的密封件（未示出），所述密封件粘附或焊接至底部元件 702。可透射密封件使滅菌介質(zhì)進(jìn)入測試生物孢子并使得用于讀取滅菌指示劑的激發(fā)波長 和熒光波長通過。
[0062] 在圖9所示的實施方式中，在10X10網(wǎng)格706的孢子"位點（spot)"處供應(yīng)孢 子。每個位點可含有例如，約150至約300個孢子。在圖9的實施方式中，有10X10網(wǎng)格 的8X 12陣列。因為每個位點含有約150至約300個孢子，在陣列96個單元的每個單元中 有100個位點，因此在圖9所示的滅菌指示劑上存在約I. 44X IO6至約2. 88X IO6個孢子。
[0063] 在圖9所示的實施方式中，進(jìn)一步包括容納有例如熱穩(wěn)定誘導(dǎo)物和介質(zhì)的流體填 充室708,所述熱穩(wěn)定誘導(dǎo)物和介質(zhì)為活化和支撐將產(chǎn)生待檢測的熒光事件的孢子所需要 的。流體填充容器708通過易分離的脫離區(qū)710附著于底部元件700的余部。當(dāng)易分離的 脫離區(qū)710斷開時，容器708的內(nèi)容物被提供給網(wǎng)格706內(nèi)的孢子。
[0064] 底部元件700進(jìn)一步包括周界粘附線712,氣體/蒸汽可滲透的封蓋（未示出）通 過該周界粘附線712緊密附著至底部元件。
[0065] 圖10是與根據(jù)本發(fā)明一種實施方式的基于電子型的滅菌指示劑一起使用的電子 讀取儀1000的主視不意圖，以及諸如圖6的例不電子滅菌指不劑卡的主視圖和后視圖。電 子讀取儀1000包括顯示從所述電子讀取儀讀取生物指示劑卡獲得的相關(guān)信息的前顯示板 1002。電子讀取儀1000進(jìn)一步包括前罩板1004和用于插入生物指示劑卡的狹槽1006。圖 10還包括例示的電子型生物指示劑卡1008的描述,該卡包括如圖6所示的上述生物組件和 電子組件，并包括電連接器1010。
[0066] 電子讀取儀1000包括適合的電組件以與生物指示劑卡1008的電連接器1010接 觸。前罩板1004可包括用來激活流體儲存庫的整體式輥子類元件和培養(yǎng)用的加熱器。
[0067] 圖10顯示了例示的電子生物指示劑卡1008的主視圖和后視圖。圖6的實施方 式基本已描述主視圖組件。指示劑卡1008的背面可包括，例如，關(guān)于生物指示劑的具體類 型、滅菌介質(zhì)、滅菌處理參數(shù)、批號、日期和生物指示劑測試結(jié)果的信息。指示劑卡1008上 顯示的信息不限于這些具體實例；可以理解的是，認(rèn)為重要的其他信息也包括在內(nèi)?？梢岳?解的是，指示劑卡1008可包括便于自動讀取和存儲滅菌處理、測試結(jié)果等相關(guān)信息的磁條 1012。
[0068] 圖IlA和IlB是與根據(jù)本發(fā)明一種實施方式的基于熒光型的滅菌指示劑一起使用 的熒光讀取儀1100分別處于關(guān)閉和打開位置的主視示意圖。圖IlA顯示處于關(guān)閉位置的 熒光讀取儀1100。熒光讀取儀1100包括顯示從所述熒光讀取儀讀取生物指示劑卡獲得的 相關(guān)信息的前顯示板1102。熒光讀取儀1100進(jìn)一步包括如圖IlB所示的可打開的前罩板 1104。
[0069] 如圖IlB所示，前罩板1104向外打開，包括可插入如圖9所示的上述基于熒光的 生物指示劑卡的狹槽1106。當(dāng)指示劑卡已插入狹槽1106時，前罩板1104關(guān)閉，將指示劑卡 置入讀取儀室1108,所述讀取儀室包含從狹槽中的指示劑卡獲取信息的組件。作為例示， 圖12描述了讀取儀室1108的適合組件。前罩板1104可包括用來激活流體儲存庫的整體 式輥子類元件和培養(yǎng)用的加熱器。
[0070] 圖12是如圖11所示的熒光讀取儀1200內(nèi)部組件的透視示意圖，以及例示的基于 滅光的滅囷指不劑卡的王視圖和后視圖。
[0071] 熒光讀取儀1200包括用于讀取基于熒光的滅菌指示劑的適合的組件。圖12描述 了一些例示的組件。讀取儀1200可包括適合諸如冷卻的CCD (電荷耦合器）照相機(jī)的讀取 設(shè)備和圖像處理器1202,該圖像處理器1202包括用于處理從C⑶照相機(jī)所獲得的數(shù)據(jù)的合 適硬件和軟件。讀取儀1200可包括適合的光學(xué)件1204,如LED激發(fā)器和熒光檢測器。讀 取儀1200可包括適合的機(jī)械組件1206,如照相機(jī)板、LED控制器和USB接口。讀取儀1200 可進(jìn)一步包括用于支撐生物指示劑卡的適合的設(shè)備1210,所述設(shè)備1210用于排列該卡并 在配準(zhǔn)位置支撐該卡以激發(fā)和讀取。讀取儀1200可進(jìn)一步包括適合的圖像掃描口 1214。
[0072] 圖12顯示了例示的電子生物指示劑卡1208的主視圖和后視圖。圖9實施方式整 體描述了主視圖的組件。指示劑卡1208的背面包括關(guān)于生物指示劑的具體類型、滅菌劑、 滅菌處理、批號、日期、滅菌條件和生物指示劑測試結(jié)果的各種信息。指示劑卡1208上顯示 的信息不限于這些具體的實例，可以理解的是，認(rèn)為重要的其他信息也包括在內(nèi)?？梢岳?解的是，指示劑卡1208可包括便于自動讀取和存儲滅菌處理、測試結(jié)果等相關(guān)信息的磁條 1212。
[0073] 圖13是與如圖3所述和所示的FABI自含式生物指示劑（SCBI) -起使用的瓶式 讀取儀1300的主視示意圖。瓶式讀取儀1300包括前顯示板1302和前罩板1304,類似于上 述基于電子的和基于突光的實施方式的那些前顯不板和前罩板。前罩板1304包括多個孔 1306, SCBI可插入所述孔1306。前罩板1304向外轉(zhuǎn)動以使SCBI插入或移除，而且該前罩板 可封閉到讀取儀室1308中。瓶式讀取儀1300可與基于熒光的SCBI或與基于電子的SCBI 一起使用，應(yīng)用本文公開的相同基本原理讀取本發(fā)明生物指示劑指示的滅菌處理結(jié)果。圖 13包括例示的FABI SCBI 1310。
[0074] 使用本發(fā)明方法，可利用活生物體膜電位的改變來評價滅菌處理的有效性。該技 術(shù)可與本領(lǐng)域已知的適合的滅菌指示劑或SCBI -起使用。該技術(shù)也可與位于安瓿中的生 物體（例如，孢子）懸浮液一起使用。該技術(shù)還可以與包括安置在基材上的導(dǎo)電材料（例 如，形成于或沉積在非導(dǎo)電基材（如硅）上的銅電路）與安置在部分或整個導(dǎo)電性材料上 的生物指示劑（例如，細(xì)菌孢子）的滅菌指示劑一起使用。本發(fā)明方法靈活，足以用于所有 的滅菌技術(shù)。本發(fā)明方法可用來提供即時讀取或接近即時讀取的生物指示劑。所述生物指 示劑可稱作快速反應(yīng)生物指示劑。
[0075] 構(gòu)造材料的實例包括如下材料：支撐體、隔板（separator)和/或絕緣體：玻璃、 硅、金屬箔、紙和其他纖維素形式，包括聚丙烯的聚烯烴、聚碳酸酯類或它們的共混物，醋酸 纖維素和Mylar等；半滲透或可滲透的膜：玻璃紙、天然或合成來源的透析膜、多孔聚烯烴 和其他塑料材料；導(dǎo)體：金屬、箔、導(dǎo)電墨、納米管和富勒烯等；可轉(zhuǎn)換的導(dǎo)體/絕緣體或其 他半導(dǎo)體材料（如聚苯胺等）；附著化學(xué)物質(zhì)（例如，SPDP等）；生物體：包括嗜熱脂肪地芽 孢桿菌和萎縮芽孢桿菌等；熒光團(tuán)和/或熒光發(fā)生素，例如，MUG和碘化丙啶、熒光素、若丹 明等，包括所有對物理激發(fā)（如光致激發(fā)）、化學(xué)誘導(dǎo)和電物理活化作出反應(yīng)的物質(zhì)。
[0076] 在一種實施方式中，質(zhì)膜電位是唯一的檢測手段。在另一種實施方式中，通過膜 電位和電誘導(dǎo)熒光（例如，利用二-4-ANEPPS等）檢測。ANEP(氨萘基乙基吡啶）染料 二-4-ANEPPS是檢測亞毫秒膜電位改變的敏感探針。在該后一種情況下，讀取儀是如圖10 所不的基于電子的讀取儀與如圖12所不的基于突光的讀取儀的混合。在一種實施方式中， 誘導(dǎo)和酶活化后的熒光化合物的熒光可以是唯一的檢測手段。在另一種實施方式中，還可 使用第二表面結(jié)合的熒光團(tuán)（例如，德克薩斯紅WGA)，該熒光團(tuán)提供持續(xù)的熒光作為參比 對照且作為確保所有孢子仍與生物指示劑卡結(jié)合的手段。每個熒光團(tuán)可具有單獨的發(fā)射波 長和激發(fā)波長。
[0077] 實施例
[0078] 本文提供的實施例僅出于說明的目的。這些實施例旨在提供充分而復(fù)雜的細(xì)節(jié)以 使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┖褪褂帽景l(fā)明，并且提供適合的設(shè)備和方法的說明性實施例。 優(yōu)選的實施方式可包括本文記載的部分或全部材料、組件、方法或應(yīng)用；但不僅限于所示出 的這些?？蛇M(jìn)行簡單的替代，由此可改變組分或應(yīng)用效力，但這些也都是預(yù)期的。最終的生 產(chǎn)設(shè)備可米取本發(fā)明的一種或另一種實施方式的形式，使用一種或多種記載的選擇方式， 但例示的設(shè)置不代表放棄了本領(lǐng)域技術(shù)人員可將其延伸到本公開的本發(fā)明所作出的任何 其它實施變化形式或?qū)嵤┓绞健?br> [0079] 實施例1
[0080] 活的/死的萎縮芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜電位改變的評價說明了膜電位改變與活力之 間的相關(guān)性。利用Di0C6 (3)和Picofluor熒光計測量膜電位。在37°C下經(jīng)代表性的時間 于胰蛋白胨大豆肉湯和Di0C6(3)中培養(yǎng)經(jīng)高壓滅菌的活芽孢和非活芽孢。在指明的培養(yǎng) 時間下，移除生物體并在Tris/EDTA(pH 7.4)中洗滌。然后進(jìn)行熒光測量。結(jié)果如圖1所 /Jn 〇
[0081] 實施例2 :平坦表面上活的嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的電檢測
[0082] 將導(dǎo)電的金屬化材料均一燒鑄至約信用卡大小的非導(dǎo)電的Mylar片上。Mylar片 是氣體和液體不可滲透的。將聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物澆鑄至金屬化層頂部。聚丙烯酰 胺/聚苯胺混合物對氣體和蒸汽是可滲透的。將嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢以l〇 8cfu/ml的 濃度重懸于聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物中。該芽孢濃度相當(dāng)于噴墨式印刷機(jī)的每IOpL (皮 升）小滴中有一個芽孢。芽孢聚丙烯酰胺/聚苯胺混合物以陣列形式沉積在澆鑄的聚丙 烯酰胺/聚苯胺膜上。將第二導(dǎo)電的金屬化材料澆鑄在芽孢陣列上。由此形成了生物指 示劑（BI)卡。當(dāng)芽孢萌發(fā)時，材料的導(dǎo)電性開始增加。通過連續(xù)晶體管前置放大器（如 Darlington對）來檢測電流。由于這些Darlington晶體管是成對的，因此它們能夠放大電 流。將Darlington晶體管連接至監(jiān)測系統(tǒng)電流的鉛。通過可剝離的粘合劑將氣體屏障（如 mylar)粘附至指示劑頂部直至使用。在使用時，將該屏障移除以使蒸汽或氣體在放入滅菌 器中時可以滲透系統(tǒng)。指示劑的遠(yuǎn)端是容納有能使活芽孢萌發(fā)的培養(yǎng)基的易分離小室。在 利用蒸汽或蒸氣過氧化氫進(jìn)行滅菌處理后，培養(yǎng)生物指示劑。
[0083] 將BI卡插入整合至滅菌器中的卡讀取儀/培養(yǎng)器狹槽中。讀取儀/培養(yǎng)器由以 下組件組成：保持培養(yǎng)溫度的加熱塊、其中連接有BI卡的電連接、以用戶可讀取形式標(biāo)記 循環(huán)參數(shù)和載荷標(biāo)識（Load ID)的印刷頭、引導(dǎo)BI卡進(jìn)入狹槽并通過斷開容納有培養(yǎng)基的 易分離室和幫助培養(yǎng)基分散而自動激活BI的輥子、磁條掃描器和將BI卡的結(jié)果送回設(shè)備 載荷和滅菌循環(huán)的條碼讀取儀。
[0084] 在55_60°C (嗜熱脂肪地芽孢桿菌的最佳溫度）下培養(yǎng)指示劑并監(jiān)測指示劑的電 導(dǎo)率。以分鐘的方式檢測到由萌發(fā)的活芽孢引起的電流小改變，這提醒用戶他們的滅菌處 理可能不成功。如果滅菌處理成功，則隨培養(yǎng)時間測量的電流不會增長。
[0085] 實施例3 :平坦表面上活的嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢的熒光檢測
[0086] 將聚丙烯酰胺層澆鑄至約信用卡大小的聚丙烯背襯上。聚丙烯酰胺層作為水合 單層。然后將嗜熱脂肪地芽孢桿菌芽孢印刷到生物體的位點內(nèi)。以陣列或網(wǎng)格形式印刷 所述位點，每個位點容納150-300個芽孢。一端是容納有帶所需熒光團(tuán)的培養(yǎng)基的易分離 室。在滅菌處理完成時，將BI卡插入整合至滅菌器中的卡讀取儀/培養(yǎng)器狹槽中。讀取儀 /培養(yǎng)器由以下組件組成：保持培養(yǎng)溫度的加熱器、LED激發(fā)源、用于熒光檢測的光電二極 管、以用戶可讀取形式標(biāo)記循環(huán)參數(shù)和載荷標(biāo)識的印刷頭、引導(dǎo)BI卡進(jìn)入狹槽并通過斷開 容納有培養(yǎng)基的易分離室和幫助培養(yǎng)基分散而自動活化BI的輥子、磁條掃描器和將BI卡 的結(jié)果送回設(shè)備載荷和滅菌循環(huán)的條碼讀取儀。
[0087] 在55_60°C (嗜熱脂肪地芽孢桿菌的最佳溫度）下培養(yǎng)指示劑?？稍谠撟x取儀中 采用非訂制的成像儀，如LumiSens。這樣能夠進(jìn)行兩個或多個感興趣的波長的檢測。其中 一個波長將測量染色的芽孢以確保所有對照均在適當(dāng)位置，另一個波長將測量用于檢測活 生物體的熒光團(tuán)。如果滅菌處理成功，則所有的芽孢是非活芽孢，檢測器將僅檢測到用于對 生物體染色的熒光團(tuán)。如果滅菌處理不成功，則能通過兩種截然不同的熒光信號檢測到活 芽孢。
[0088] 實施例4 :獨立的讀取儀/培養(yǎng)器
[0089] 實施例2和實施例3中所記載的任一種讀取儀/培養(yǎng)器可以是獨立的單元。在獨 立的單元中，所有的電子件與它們本身整合至滅菌器中的讀取儀/培養(yǎng)器相同。
[0090] 盡管以【具體實施方式】解釋了本發(fā)明，但是可以理解的是，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說，在閱讀本說明書后【具體實施方式】的各種修改都是顯而易見的。因此，可以理解的是，本 文公開的發(fā)明旨在涵蓋落入所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的這樣的修改。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備滅菌指示劑的方法，所述方法包括： 利用噴墨式印刷機(jī)將導(dǎo)電材料沉積在基材上； 利用所述噴墨式印刷機(jī)在部分或整個導(dǎo)電材料上以陣列沉積生物指示劑；以及 提供與所述導(dǎo)電材料電通訊且適合檢測所述導(dǎo)電材料電性能改變的電路。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基材是非導(dǎo)電的。
3. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述電路包含用于檢測所述電性能改變的 檢測電路。
4. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法還包括在至少所述生物指示劑的 上方施加可移動氣體/液體不可滲透膜。
5. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物指示劑包含細(xì)胞，所述細(xì)胞具有 能夠顯示出膜電位的細(xì)胞膜且與所述導(dǎo)電材料電接觸。
6. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述生物指示劑包含孢子。
7. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中，所述生物指示劑包括： 嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus)、萎縮芽孢桿菌 (Bacillus atrophaeus)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、球形芽抱桿菌（Bacillus sphaericus)、炭疽芽抱桿菌（Bacillus anthracis)、短小芽抱桿菌（Bacillus pumilus)、 凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)、生抱梭菌（Clostridium sporogenes)、艱難梭菌 (Clostridium difficile)、肉毒梭菌（Clostridium botulinum)、枯草芽抱桿菌球形變 種（Bacillus subtilis globigii)、錯狀芽抱桿菌（Bacillus cereus)、環(huán)狀芽抱桿菌 (Bacillus circulans)、大腸桿菌（Escherichia coli)，或它們中的兩種或更多種的混合 物；或者 黑曲霉（Aspergillus niger)、白色念珠菌（Candida albicans)、須毛癬菌 (Trichophyton mentagrophytes)、皮炎萬氏霉(Wangiella dermatitis)、龜分枝桿 菌（Mycobacterium chelonae)、戈氏分枝桿菌（Mycobacterium gordonae)、恥垢分枝 桿菌（Mycobacterium smegmatis)、地分枝桿菌（Mycobacterium terrae)、牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲 (Giardia lamblia)、微小隱抱子蟲（Cryptosporidium parvum)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、幾腸球菌（Enterococcus faecalis)、幾鏈球菌（Streptococcus faecalis)、 屎腸球菌（Enterococcus faecium)、化胺性鏈球菌（Streptococcus pyrogenes)、大腸桿 菌、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila)、甲 基營養(yǎng)菌（Methylobacterium)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、豬霍亂沙門 氏菌（Salmonella choleraesuis)、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori)、耐福射微球菌 (Micrococcus radiodurans)、耐福射奇球菌（Deinococcus radiodurans)、金黃色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)、嗜麥芽窄食 單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)，或它們中的兩種或更多種的混合物；或者 抗萬古霉素腸球菌（enterococci)、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌、龜分枝桿菌，或它們 中的兩種或更多種的混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其中，所述生物指示劑包括基因工程生物指 示劑，所述基因工程生物指示劑包含： 至少一種測試生物和至少一種適于產(chǎn)酶的報告基因，所述測試生物荷載所述報告基 因，其中，優(yōu)選地，所述測試生物利用至少一種質(zhì)粒和/或至少一種病毒荷載所述報告基 因； 其中，所述基因工程生物指示劑進(jìn)一步包含至少一種阻遏基因，所述阻遏基因抑制所 述報告基因的表達(dá)直至所述報告基因暴露于至少一種誘導(dǎo)物，其中，優(yōu)選地，所述測試生物 利用至少一種質(zhì)粒和/或至少一種病毒荷載所述報告基因和所述阻遏基因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述測試生物包括： 嗜熱脂肪地芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、短 小芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、生孢梭菌、艱難梭菌、肉毒梭菌、枯草芽孢桿菌球形變種、蠟狀 芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、大腸桿菌，或它們中的兩種或更多種的混合物；或者 黑曲霉、白色念珠菌、須毛癬菌、皮炎萬氏霉、龜分枝桿菌、戈氏分枝桿菌、恥垢分枝桿 菌、地分枝桿菌、牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲、微小隱孢子蟲、嗜水氣單胞 菌、糞腸球菌、糞鏈球菌、屎腸球菌、化膿性鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺軍團(tuán)菌、 甲基營養(yǎng)菌、銅綠假單胞菌、豬霍亂沙門氏菌、幽門螺桿菌、耐輻射微球菌、耐輻射奇球菌、 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌，或它們中的兩種或更多種的混合物； 或者 抗萬古霉素腸球菌、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌、龜分枝桿菌，或它們中的兩種或更多 種的混合物。
10. 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法還包括： 使所述導(dǎo)電材料上的生物指示劑暴露于滅菌介質(zhì)； 培養(yǎng)所述導(dǎo)電材料上的生物指示劑；以及 測定培養(yǎng)期間所述導(dǎo)電材料的電性能是否發(fā)生任何改變。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述滅菌介質(zhì)包括： 至少一種液體滅菌劑，優(yōu)選至少一種過氧乙酸、至少一種過氧化物、或其中的兩種或多 種的混合物，或者 至少一種氣體滅菌劑，優(yōu)選過氧化氫或過氧化氫和氨氣；或者 蒸汽。
【文檔編號】C12Q1/04GK104263805SQ201410419173
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2010年7月20日
【發(fā)明者】菲利普·P·弗蘭契什科維奇, 特里西婭·A.·克雷格 申請人:美國消毒公司