專利名稱：結(jié)合丙型肝炎病毒的包膜蛋白2的抗體以及利用所述抗體鑒定丙型肝炎病毒的基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合丙型肝炎病毒的包膜蛋白2的抗體，以及利用所述抗體鑒定丙型肝炎病毒的基因型的方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(其在下文中也可以稱為“HCV”)是非甲型和非乙型肝炎的主要病因病毒，其主要通過輸血和性接觸來感染(Choo et al. , Science, Vol. 244 :359-362, 1989)。估計(jì)在日本有2，000，000或更多的HCV攜帶者，包括沒有顯示肝炎癥狀的那些(病毒攜帶者)，以及在世界上有170，000，000或更多的HCV攜帶者。HCV攜帶者數(shù)量不斷提高的主要原因是，由于HCV感染的肝炎慢性化率高達(dá)70%到80%的事實(shí)，以及除了干擾素之外沒有有效的抗病毒劑的事實(shí)。半數(shù)或更多的慢性丙型肝炎患者所展現(xiàn)的病理學(xué)狀況幾乎必然將每況愈下，并且已知會(huì)發(fā)展成肝硬化或肝癌。因此，可以說丙型肝炎是具有不良預(yù)后的嚴(yán)重的傳染性疾病。 因此，涉及丙型肝炎的治療和HCV的檢測的研究是醫(yī)學(xué)上重要的，并且新的療法和治療藥物的開發(fā)是期望的。HCV是單鏈的(+ ) RNA病毒，其基因組長度大約9. 6 1Λ，其中基因組編碼前體蛋白質(zhì)，前體蛋白質(zhì)通過宿主衍生的信號肽酶或HCV衍生的蛋白酶的翻譯后切割轉(zhuǎn)變成10種病毒蛋白質(zhì)(即，Core、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B 蛋白)。HCV 根據(jù)基因組的核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)生分析被分類為10種或更多種基因型(例如，la、lb、2a、2b、3a和3b) (Choo et al. , Science, 1989, Vol. 244, p. 359-362 ；Simmonds et al. , Hepatology, 1994，Vol. 10，p. 1321-1324 ；Okamoto et al.，J. Gen. Virol.，1992，Vol. 73，p. 73-679 ；以及 Mori et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1992, Vol. 183, p. 334-342)。近來，變?yōu)橐阎氖?，干擾素的效果取決于HCV基因型而顯著不同。已經(jīng)顯示的是，干擾素的抗病毒作用對基因型Ia或Ib的HCV難以發(fā)揮(Fried et al. , N. Engl. J. Med. , 2002，Vol. 347，p. 975-982 以及Lusida et al. , J. Clin. Microbiol. , 2001， Vol. 39，p. 3858-3864)。此外，變?yōu)橐阎氖?，干擾素的抗病毒作用對干擾素具有相對好的效果的基因型 2a的HCV和基因型2b的HCV不同地發(fā)揮，。已經(jīng)提出的是，相比基因型2b的HCV，干擾素對基因型加WHCV更顯著地發(fā)揮了它們的抗病毒作用(Murakami et al.，Hepatology, 1999，Vol. 30，ρ· 1045-1053)。HCV抗體測試作為HCV診斷方法是已知的，通過所述測試，利用C100-3抗原檢測血清中的抗HCV抗體，因?yàn)樽R別作為HCV的非結(jié)構(gòu)區(qū)的NS4區(qū)域(C100-3抗原)的抗HCV抗體在丙型肝炎患者的血清中以70%_80%的比率存在(Choo et al. , Science, 1989，Vol. 244, p. 359-362)。并且，作為這種方法的變種，已經(jīng)開發(fā)了利用C100-3抗原、核心抗原和來自NS3區(qū)域的抗原的組合改善了檢測靈敏度的第二代抗體分析系統(tǒng)，以及除了上述抗原之外還含有來自NS5區(qū)域的抗原的第三代抗體分析系統(tǒng)。已經(jīng)使用了利用這些分析系統(tǒng)的 HCV 抗體測試(Aucella et al.，Blood Purif. , 2000，Vol. 18，p. 110-114)。并且，除了前述的HCV抗體測試之外，HCV核心抗原測試(Fabrizi et al. , J. Clin. Microbiol. , 2005, Vol. 43，p. 414-420)被用于血清中HCV核心蛋白數(shù)量的直接測量，以及核酸擴(kuò)增測試(NAT)被用于通過PCR方法確認(rèn)HCV基因組的存在或缺乏(Velati et al. , Euro Serveill. , 2005，Vol. 10，p. 12-14)。然而，HCV抗體測試是有問題的，因?yàn)楫?dāng)受試者在過去經(jīng)歷了 HCV感染時(shí)，受試者將不可避免地成為丙型肝炎測試陽性，即使在完全痊愈之后。HCV抗體測試也是有問題的， 因?yàn)檠褐械目笻CV抗體僅在感染后1到3個(gè)月時(shí)被檢出。如果測試在這一時(shí)間之前進(jìn)行， 不能檢出HCV，并且受試者將是丙型肝炎測試陰性的。并且，HCV核心抗原測試需要通過利用SDS破壞包膜進(jìn)行處理來使得核心蛋白釋放，因?yàn)楹诵牡鞍?目標(biāo)分子)存在于HCV顆粒之內(nèi)。取決于SDS的處理時(shí)間，核心蛋白質(zhì)可能變性，或可能釋放抑制抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)，因而影響檢測靈敏度。此外，即使當(dāng)受試者在HCV抗體測試和HCV核心抗原測試中是HCV測試陽性時(shí)，當(dāng)前沒有可能鑒定HCV基因型。為了進(jìn)行干擾素治療，必需進(jìn)行進(jìn)一步的測試，例如，核酸擴(kuò)增測試以鑒定HCV基因型。這是因?yàn)楦蓴_素的抗病毒作用取決于HCV基因型而顯著地不同。 特別是對HCV基因型Ia和HCV基因型lb，不能產(chǎn)生有效的抗病毒作用，并且患者反而遭受干擾素的副作用。同時(shí)，相對于測試樣品的不充分的保存質(zhì)量和穩(wěn)定性，核酸擴(kuò)增測試是有問題的， 因?yàn)樵摐y試使用受試者的血清RNA作為目標(biāo)分子。核酸擴(kuò)增測試也呈現(xiàn)了各種問題，并且對于RT-PCR方法的使用預(yù)防措施是必需的。例如，PCR可能在作為目標(biāo)分子的RNA轉(zhuǎn)錄成 DNA之后進(jìn)行，引起由于RNA降解或逆轉(zhuǎn)錄酶的滅活和/或抑制的假陰性結(jié)果，或由于反應(yīng)系統(tǒng)的交叉污染的假陽性結(jié)果。因此，核酸擴(kuò)增測試被認(rèn)為就準(zhǔn)確性而言次于使用蛋白質(zhì)作為目標(biāo)分子的HCV抗體測試或HCV核心抗原測試。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題
本發(fā)明的目的是提供結(jié)合HCV表面的包膜、并且可以用于鑒定基因型Ia的HCV、基因型 Ib的HCV和基因型加的HCV的抗體，和提供利用這樣的抗體鑒定HCV基因型的方法。解決問題的手段
本發(fā)明人進(jìn)行了集中的研究來實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)。他們獲得了產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤， 所述單克隆抗體以HCV基因型加的包膜蛋白2作為抗原，從這些雜交瘤中獲得了僅特異性結(jié)合HCV基因型加的包膜蛋白2的抗體、僅結(jié)合HCV基因型加的包膜蛋白2和HCV基因型Ib的包膜蛋白2的抗體，以及結(jié)合HCV基因型加的包膜蛋白2、HCV基因型Ib的包膜蛋白2和HCV基因型Ia的包膜蛋白2的抗體，因而他們完成了本發(fā)明。特別地，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合基因型加WHCV的包膜蛋白2、但是不與基因型 Ia的HCV的包膜蛋白2免疫反應(yīng)的抗體。以上抗體優(yōu)選地是將序列表中SEQ ID NO :1中所示氨基酸序列識別為表位的抗體。這樣的抗體的實(shí)例是由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。并且，優(yōu)選地，上述抗體特異性地結(jié)合基因型加的HCV的包膜蛋白2，但是不與基因型Ia的HCV的包膜蛋白2以及基因型Ib的HCV的包膜蛋白2免疫反應(yīng)。以上抗體更優(yōu)選地是將序列表中SEQ ID NO :2或3中所示氨基酸序列識別為表位的抗體。這樣的抗體的實(shí)例是由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11180或FERM ABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。此外，上述抗體優(yōu)選地是特異性結(jié)合J6CF株的包膜蛋白2、但是不與JFHl株的包膜蛋白2免疫反應(yīng)的抗體。這樣的抗體的實(shí)例包括將序列表中SEQ ID NO :4所示氨基酸序列識別為表位的抗體，特別是由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11183的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。并且，本發(fā)明提供了鑒定HCV基因型的方法，其中如果病毒結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，但是不結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11180和FERM ABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的任一抗體，所述HCV的基因型被確定為是基因型Ib ；如果病毒結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，并且結(jié)合由具有登記號FERM ABP-11180和FERM ABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，所述HCV的基因型被確定為是基因型加；以及如果病毒結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11182的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，但是不結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181、 FERM ABP-11180和FERM ABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的任一種抗體，所述HCV的基因型被確定為是基因型la。本說明書包含日本專利申請?zhí)?008-2M338的說明書和/或附圖的內(nèi)容，本申請要求了它的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，HCV基因型la、HCV基因型Ib和HCV基因型加的簡單和非常精確的鑒定變?yōu)榭赡?，并可以有效地選擇干擾素治療合適的丙型肝炎患者。特別地，對于預(yù)計(jì)沒有來自干擾素治療的治療效果的、感染基因型Ia或Ib的HCV的丙型肝炎患者，可以減輕不良反應(yīng)，并且可以提供選擇新的治療方法的機(jī)會(huì)。


附圖1是顯示HCV前體蛋白質(zhì)的示意圖。黑色方框表示跨膜區(qū)域。附圖2是顯示3 X FLAG蛋白和抗原E2蛋白的融合蛋白的示意圖。附圖3是顯示抗原E2蛋白和人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的示意圖。附圖4顯示了在純化3 X FLAGJ6E2dTM蛋白質(zhì)的步驟中獲得的每個(gè)級分的 SDS-PAGE結(jié)果。顯示了 3XFLAG-J6E2dTM在COSl細(xì)胞中的表達(dá)和純化。3XFLAGJ6E2dTM 蛋白質(zhì)在洗脫級分中檢出。附圖4中的電泳照片的泳道分別表示以下1，分子量標(biāo)志物；2， 培養(yǎng)物上清液；3，抗FLAG抗體柱孔隙級分；4，抗FLAG抗體柱洗脫級分1 ；5，抗FLAG抗體柱洗脫級分2 ;6，抗FLAG抗體柱洗脫級分3 ;7，抗FLAG抗體柱洗脫級分4 ；和8，分子量標(biāo)志物。附圖 5 顯示了 J6E2-Fc、JFH1E2-Fc、THE2_Fc、ConlE2_Fc、JlE2_Fc 和 H77E2_Fc 蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。每種類型的E2 Fc蛋白在還原條件下為約97 kDa。顯示了每種 HCV株衍生的抗原E2蛋白質(zhì)與人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的純化的融合蛋白。附圖5中的電泳照片的泳道分別表示以下1，分子量標(biāo)志物；2, J6E2-FC ；3，JFHlE2_Fc ；4，THE2_Fc ；5， ConlE2-Fc ；6，JlE2_Fc ；7，H77E2_Fc ；和 8，分子量標(biāo)志物。附圖6顯示了每種單克隆抗體的各種HCV基因型/株的E2蛋白質(zhì)的結(jié)合性質(zhì)和抗體亞型?？贵w與抗原E2蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度表示為-到+++(_，0D450 nm < 0. 1 ；+, 0. 1 彡 0D450 nm < 0.25;++，0. 25 彡 0D450 nm < 0.4;+++，0. 4 彡 0D450 nm)。附圖 6 表明8D10-3是結(jié)合基因型Ia的HCV、基因型Ib的HCV和基因型加的HCV的抗原E2蛋白質(zhì)的抗體；1G2-32和2F2-7是結(jié)合基因型加的HCV的抗原E2蛋白的抗體；4E8-8是結(jié)合基因型Ib的HCV和基因型加的HCV的抗原E2蛋白的抗體；M1E12-1是結(jié)合JFHl株的抗原E2 蛋白的單克隆抗體；以及9A5-4是結(jié)合JFHl株和H77株的抗原E2蛋白的單克隆抗體。附圖7顯示了 8D10-3單克隆抗體(附圖7A)、1G2_32單克隆抗體(附圖7B)、4E8-8 單克隆抗體(附圖7C)、2F2-7單克隆抗體(附圖7D)和M1E12-1單克隆抗體(附圖7E)與具有衍生自HCV J6CF株的抗原E2蛋白的氨基酸序列的肽的結(jié)合強(qiáng)度。附圖8顯示了檢測來自各種HCV基因型/HCV株的抗原E2蛋白的靈敏性，如通過利用1G2-32和8D10-3單克隆抗體的夾心ELISA測定的。在附圖8中，黑色圓圈表示J6E2_Fc、 白色圓圈表示JFH1E2-FC、黑色正方形表示THE2-FC、白色正方形表示ConlE2_Fc、黑色菱形表示J1E2-Fc、以及白色菱形表示H77E2-Fc。附圖9顯示了利用單克隆抗體8D10-3通過蛋白質(zhì)印跡方法檢測的，各種基因型/ 株的HCVE2蛋白質(zhì)的有無。
具體實(shí)施例方式在下文中說明實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。本發(fā)明的抗體的特征在于特異性結(jié)合基因型加的HCV (在下文中稱為HCV2a)的包膜蛋白2 (在下文中稱為E2蛋白)，但不與基因型Ia的HCV (在下文中稱為HCVla)的E2 蛋白免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這樣的抗體不與HCVla的E2蛋白和基因型Ib的HCV (在下文中稱為HCVlb)的E2蛋白兩者免疫反應(yīng)。上述抗體可以這樣制備用抗原蛋白或所述抗原蛋白的部分肽做為抗原免疫動(dòng)物，所述抗原蛋白由沒有HCV的E2蛋白的跨膜區(qū)域(也稱為跨膜結(jié)構(gòu)域)的區(qū)域組成，制備產(chǎn)生針對所述E2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤，然后篩選產(chǎn)生特異性結(jié)合HCVh的E2蛋白、 但不與HCVla的E2蛋白免疫反應(yīng)、并且進(jìn)一步優(yōu)選不與HCVla的E2蛋白和HCVlb的E2蛋白兩者免疫反應(yīng)的抗體的雜交瘤。在此，‘ 2蛋白”是通過用由宿主細(xì)胞衍生的信號肽酶和HCV自身編碼的2種蛋白酶切割HCV前體蛋白產(chǎn)生的功能性病毒蛋白質(zhì)。這使用HCVh的J6CF株作為例子來解釋， 當(dāng)位于前體蛋白的N-末端的甲硫氨酸被確定為是第1個(gè)氨基酸時(shí)，E2蛋白是從前體蛋白的氨基酸位置384到750的367個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。E2蛋白中從氨基酸位置722到750 的區(qū)域是跨膜結(jié)構(gòu)域(Cocquerel et al. , J. Virol. , 2000，Vol. 74，p. 3623-3633)。 附圖1是顯示HCV前體蛋白質(zhì)的示意圖。在下文中，將按順序描述獲得上述抗體的技術(shù)。1)作為抗原的E2蛋白衍生的蛋白或肽的選擇
作為為了獲得上述抗體而免疫動(dòng)物的抗原，可以使用由沒有HCVh E2蛋白的跨膜區(qū)域的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)(在下文中稱為抗原E2蛋白)、或所述蛋白質(zhì)的部分肽(抗原E2肽)。抗原E2肽必須由與加以外基因型的HCV的E2蛋白具有低同源性的區(qū)域組成。作為抗原E2蛋白，可以選擇包含HCMa的前體蛋白(例如，SEQ ID NO 5)的氨基酸384到720的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，選擇包含前體蛋白的氨基酸位置530到562的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且更優(yōu)選地，選擇包含選自以下的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的蛋白質(zhì)包含前體蛋白的氨基酸465到484的氨基酸序列；包含前體蛋白的氨基酸559到584的氨基酸序列；以及包含前體蛋白的氨基酸683到719的氨基酸序列。并且，作為抗原E2肽，可以選擇包含HCWa的前體蛋白(例如，SEQ ID NO :5)的氨基酸530到562 (更優(yōu)選地，氨基酸531到M9，進(jìn)一步優(yōu)選地，氨基酸531到M0)并具有 10到19個(gè)氨基酸的肽長度(更優(yōu)選地，10個(gè)氨基酸)的肽。更優(yōu)選地，選擇包含前體蛋白的氨基酸465到484 (更優(yōu)選地，氨基酸465到477，進(jìn)一步優(yōu)選地，氨基酸468到477)并具有10到13個(gè)氨基酸(更優(yōu)選地，10個(gè)氨基酸)的肽長度的肽；包含前體蛋白的氨基酸559 到584 (更優(yōu)選地，氨基酸564到576，進(jìn)一步優(yōu)選地，位置567到576的氨基酸殘基)并具有10到13個(gè)氨基酸(更優(yōu)選地，10個(gè)氨基酸)的肽長度的肽；或包含前體蛋白的氨基酸683 到719 (優(yōu)選地，氨基酸704到719，更優(yōu)選地，氨基酸709到719)并具有10到19個(gè)氨基酸(更優(yōu)選地，10個(gè)氨基酸)的肽長度的肽。此外，HCWa基因組的核苷酸序列已經(jīng)在許多病毒株(Yanagi et al. , Virology, 1999，Vol. 262, p. 250-263)中顯示，并可以從GenBank獲得。例如，HCMa的JFHl株的基因組的核苷酸序列在GenBank中以登記號AB047639公開，J6CF株的基因組的核苷酸序列在GenBank中以登記號AF177036公開。2)抗原E2肽的制備
以上選擇的抗原E2肽可以根據(jù)HCVh的前體蛋白的氨基酸序列信息直接地化學(xué)合成。 例如，可以用于動(dòng)物免疫的這樣的抗原可以通過使用肽合成儀容易地大量制備。3)抗原E2蛋白的制備
通過根據(jù)關(guān)于編碼所述HCVhW前體蛋白的區(qū)域的核苷酸序列信息合成編碼抗原E2 蛋白的DNA片段，然后在細(xì)胞中使來自這樣獲得的DNA片段的抗原E2蛋白翻譯，可以大量地制備上述選擇的抗原E2蛋白，作為可以用于動(dòng)物免疫的抗原。具體如下描述。通過構(gòu)建其中插入了編碼抗原E2蛋白的DNA片段的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等等中，可以在各細(xì)胞中產(chǎn)生抗原E2蛋白。優(yōu)選地，所述蛋白通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌性表達(dá)來生產(chǎn)。在這種情況下，編碼抗原E2肽的DNA片段按閱讀框連接到信號肽序列的下游使得密碼子的框架匹配，將終止密碼子添加到3’末端，然后產(chǎn)物可以插入到表達(dá)載體中。用于抗原E2蛋白的分泌表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括，COS-U C0S-7、Vero, CV-U CHO、dhfr基因缺陷的CH0、倉鼠細(xì)胞BHK、大鼠GH3、大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12、小鼠L細(xì)胞、小鼠C127細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、NSO和NS-1、小鼠淋巴瘤細(xì)胞EL4、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3和10T1/2、小鼠成肌細(xì)胞C2C12、小鼠基質(zhì)細(xì)胞PA6、ST2、0P9和Tst_4、人類成巨核細(xì)胞CMK、人類T細(xì)胞Jurkat、人類腎臟上皮細(xì)胞四3、人類肝癌細(xì)胞Huh7、!fepG2和 IMY-N9、人類骨肉瘤細(xì)胞MG-63、人類FL細(xì)胞、白色脂肪細(xì)胞、卵細(xì)胞和ES細(xì)胞。編碼蛋白質(zhì)的DNA在啟動(dòng)子的控制下插入，然后用于在細(xì)胞中抗原E2蛋白的重組表達(dá)?？梢杂糜谠诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中抗原E2蛋白的重組表達(dá)的這樣的啟動(dòng)子的實(shí)例包括SRa啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、LTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、EF-Ia (延伸因子-1 a )啟動(dòng)子、遍在蛋白啟動(dòng)子和PGK (磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抗原E2蛋白的分泌表達(dá)的表達(dá)載體的實(shí)例包括pSecTag/ FRT/V5-His (Invitrogen Corporation), p3XFLAG-CMV-9 (Sigma), p3XFLAG-CMV13 (Sigma)、pFUSE-Fc2 (InvivoGen)和 pTriEx-7 (Novagen)0 摻入到表達(dá)載體的信號肽序列優(yōu)選地是前胰蛋白酶原的信號肽。具有前胰蛋白酶原的信號肽序列的載體的實(shí)例包括 P3XFLAG-CMV-9 (Sigma)和 p3XFLAG_CMV_13 (Sigma)。此外，由于含有信號肽的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)信號肽被除去，這種信號肽對抗原E2蛋白的使用不構(gòu)成問題。在抗原E2蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌表達(dá)時(shí)，目標(biāo)抗原E2蛋白作為與標(biāo)記蛋白質(zhì)(例如，Tag)的融合蛋白表達(dá)，然后利用針對或特異性結(jié)合所述標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體或分子可檢測和純化所述抗原E2蛋白。標(biāo)記蛋白質(zhì)的實(shí)例包括FLAG肽、3XFLAG肽、HA肽、3XHA 肽、myc肽、6xHis肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ結(jié)構(gòu)域多肽、堿性磷酸酶、免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域和抗生物素蛋白。作為用于制備抗原E2蛋白的標(biāo)記蛋白質(zhì)，F(xiàn)LAG肽、HA肽和免疫球蛋白 Fc結(jié)構(gòu)域是適合的，免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域是更適合的。附圖2是顯示了抗原E2蛋白與3XFLAG蛋白的融合蛋白的示意圖。附圖3是顯示了抗原E2蛋白與免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的示意圖。作為這樣的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域，可以使用人類衍生的、猴衍生的、小鼠衍生的、 大鼠衍生的、兔衍生的、倉鼠衍生的、或雞衍生的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域，人類衍生的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域是優(yōu)選的。此外，免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白重鏈的種類可以是IgM、 IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4。人免疫球蛋白的氨基酸序列是由Edelman等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1969，Vol. 63，p. 78-85)報(bào)道的。并且，人免疫球蛋白重鏈的cDNA的核苷酸序列信息可以從GenBank獲得(例如，重鏈登記號BX640627)。根據(jù)獲得的核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR引物， 然后利用人類脾臟細(xì)胞的cDNA文庫或人類基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，從而可以克隆免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的cDNA。HCV E2蛋白可以直接在它們之間的連接位點(diǎn)處連接到免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域， 或通過插入其中的接頭肽來連接。接頭肽的實(shí)例包括Ser-Gly、Asp-Pro、Asp-Pro-Glu、 Gly-Asp-Pro-Glu, Gly-Gly-Gly-Ser 和(Gly-Gly-Gly-Ser) X 3。此外，例如，抗原E2蛋白由昆蟲細(xì)胞分泌表達(dá)時(shí)，昆蟲細(xì)胞如Sf21、Sf9和High Five 利用多角體蛋白(多角體)啟動(dòng)子、plO啟動(dòng)子等等表達(dá)載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后，可以表達(dá)抗原E2蛋白或抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白。另外，在抗原E2蛋白由酵母菌分泌表達(dá)時(shí)，例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述表達(dá)載體利用gall啟動(dòng)子、gal 10啟動(dòng)子、熱激蛋白啟動(dòng)子、MF α 1啟動(dòng)子、ΡΗ05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、AOXl啟動(dòng)子等等，然后可以表達(dá)抗原E2蛋白或抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白。當(dāng)抗原E2蛋白通過大腸桿菌分泌表達(dá)時(shí)，例如，大腸桿菌菌株如XLl-Blue菌株、 BL-21菌株、JM107菌株、TBl菌株、JM109菌株、C600菌株或HBlOl菌株用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體利用trp啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等等，然后可以表達(dá)抗原E2蛋白或抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白。用表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的抗原E2蛋白分泌性表達(dá)的方法的實(shí)例包括脂轉(zhuǎn)染方法、磷酸鈣方法、電穿孔方法、DEAE-葡聚糖方法和顯微注射方法。更具體地，轉(zhuǎn)導(dǎo)可以根據(jù) Molecular Cloning 3rd. Ed. 16. 1-16. 62 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001)中描述的方法來進(jìn)行。將表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌的方法沒有特別的限制，只要它是用于將DNA導(dǎo)入大腸桿菌的方法。這樣的方法的實(shí)例包括利用鈣離子的方法(Cohen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , U.S.A., 1972，Vol. 69，p. 2110-2114)和電穿孔方法。將表達(dá)載體導(dǎo)入酵母菌的方法沒有特別的限制，只要它是用于將DNA導(dǎo)入酵母菌的方法。這樣的方法的實(shí)例包括電穿孔方法(Becker et al.，Methods. Enzymo 1. , 1990， Vol. 194，p. 182-187)、原生質(zhì)球方法((Hinnen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1978，Vol. 75，p. 1929-1933)和醋酸鋰方法(Itoh et al.，J. Bacteriol., 1983，Vol. 153，p. 163-168)。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可以通過本身已知的方法來培養(yǎng)。用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基， 例如，使用含有約5%-20%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、 199 培養(yǎng)基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 1950, Vol. 73，p. 1)等等。pH值優(yōu)選是約6到8。作為無血清培養(yǎng)基，可以使用⑶_CH0、293 SFM-II 和Hybridoma-SFM(所有這些都由hvitrogen Corporation生產(chǎn))，可以根據(jù)需要向其中添加血清或補(bǔ)充物。細(xì)胞可以在30°C到40°C培養(yǎng)15小時(shí)到60小時(shí)，優(yōu)選地根據(jù)需要進(jìn)行通氣或攪動(dòng)。在細(xì)胞培養(yǎng)完成之后，通過離心等等從培養(yǎng)溶液除去細(xì)胞，然后可以從這樣獲得的培養(yǎng)上清液純化抗原E2蛋白或抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白。抗原E2蛋白或抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)分離和純化技術(shù)來純化。例如，蛋白質(zhì)可以通過硫酸銨沉淀、凝膠層析、離子交換層析、親和層析等等的任一的組合來分離和純化。例如，培養(yǎng)溶液中的抗原E2蛋白可以利用肝素柱或凝集素柱容易地純化。在與 3XFLAG肽的融合蛋白的情況下，抗原E2蛋白可以利用抗FLAG抗體柱來有效地純化，在與 6xHis肽的融合蛋白的情況下，抗原E2蛋白可以利用鎳柱、鋅柱或鈷柱來有效地純化，在與免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的情況下，抗原E2蛋白可以利用蛋白A柱、或蛋白G柱來有效地純化，在含有HA肽的嵌合蛋白質(zhì)的情況下，抗原E2蛋白可以利用抗HA抗體柱來有效地純化。這樣純化的抗原E2蛋白或抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白可以在通過 SDS-PAGE分級之后通過考馬斯亮藍(lán)染色或銀染色來檢測。在融合蛋白的情況下，融合蛋白可以利用針對融合的標(biāo)記蛋白質(zhì)的抗體通過蛋白質(zhì)印跡方法來檢測。4)利用抗原E2肽或抗原E2蛋白的免疫
為了獲得特異性結(jié)合HCMa的E2蛋白、但是不與HCVla的E2蛋白免疫反應(yīng)、更優(yōu)選地不與HCVla的E2蛋白和HCVlb的E2蛋白兩者免疫反應(yīng)的抗體，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行利用上述抗原E2 肽或抗原E2蛋白的動(dòng)物免疫，獲得多克隆抗體或篩選生產(chǎn)目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤。
免疫的動(dòng)物可以是具有能夠用于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的脾細(xì)胞的非人動(dòng)物。這樣的動(dòng)物的實(shí)例包括小鼠、大鼠、倉鼠、兔和雞?？梢愿鼉?yōu)選地使用小鼠。免疫方法的實(shí)例包括，與佐劑一起向4到10周齡的小鼠皮下地或腹膜內(nèi)施用上述抗原E2肽或抗原E2蛋白幾次，確認(rèn)血液抗體滴度的提高，通過單獨(dú)的抗原E2肽或抗原E2 蛋白的靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)的施用進(jìn)行強(qiáng)化，然后在第3到10天(優(yōu)選地在第4天)采集血液或脾細(xì)胞。測量從采集的血液獲得的血清的抗體滴度。在這種情況下，如果它特異性識別目標(biāo)抗原，它可以用作多克隆抗體。佐劑的實(shí)例包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁凝膠與百日咳疫苗的混合物、Titer Max Gold (Vaxel)和 GERBU 佐劑(GERBU Biotechnik)。通過經(jīng)由眼底靜脈叢或尾靜脈從免疫的動(dòng)物采集血液，然后通過酶免疫分析 (EIA)檢查獲得的血液中與抗原E2肽或抗原E2蛋白反應(yīng)的抗體的存在或缺乏，來測量血液中的抗體滴度。5)雜交瘤細(xì)胞的制備
在強(qiáng)化后3-10天從已經(jīng)確認(rèn)了血液中提高的抗體滴度的、免疫的動(dòng)物采集的脾臟細(xì)胞被融合到骨髓瘤細(xì)胞，從而可制備具有自主復(fù)制性的雜交瘤細(xì)胞。通過篩選產(chǎn)生具有目標(biāo)特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞可以大量地制備單克隆抗體。用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，可以使用，例如，小鼠衍生的建立的細(xì)胞系 P3-X63Ag8-Ul (P3-U1)、SP2/0_Agl4 (SP2/0)、P3-X63_Ag8653 (653)、P3_X63_Ag8 (X63)、 P3/NSl/l-Ag4-l (NSl)等等。這些細(xì)胞系可以從 RIKEN BioResource Center, ATCC (美國典型培養(yǎng)物保藏中心)或ECACC (歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)獲得。脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合通過洗滌兩種細(xì)胞、以1 :1-10的比例混合骨髓瘤細(xì)胞和脾臟細(xì)胞、然后添加平均分子量1000-6000的聚乙二醇或聚乙烯醇作為融合促進(jìn)劑，或利用商業(yè)的細(xì)胞融合裝置使用電刺激(例如，電穿孔)來進(jìn)行。在完成細(xì)胞融合的處理之后，融合的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中并用培養(yǎng)基洗滌，然后通過有限稀釋或集落形成方法在甲基纖維素培養(yǎng)基中克隆。有限稀釋的實(shí)例是以下方法， 該方法包括稀釋到IO3到IO7個(gè)細(xì)胞/mL，將細(xì)胞以IO2到IO6個(gè)細(xì)胞/孔播種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)微板中，然后培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆時(shí)，優(yōu)選地向培養(yǎng)基添加HAT補(bǔ)充物，以能夠選擇性地獲得單獨(dú)的目標(biāo)融合細(xì)胞。更具體地，根據(jù)Antibodies :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)或 Selected Methods in Cellular Immunology (W. H. Freeman and Company, 1980)中描述的方法，獲得和克隆目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞。6)雜交瘤細(xì)胞的篩選
例如，通過如下所述的EIA方法篩選目標(biāo)雜交瘤細(xì)胞。具體地，首先，將抗原E2肽或抗原E2蛋白固定在載體上，添加每個(gè)克隆的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，在4°C到37°C的條件下反應(yīng)足以形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)間。接下來，用酶、染料、放射性同位素等等標(biāo)記的，能夠特異性結(jié)合由此形成的抗體-抗原復(fù)合物的抗體部分的二級抗體與形成的抗體-抗原復(fù)合物接觸，在4°C -37°C的條件下反應(yīng)足以形成抗體-抗原-二級抗體復(fù)合物的時(shí)間。最后，由此形成的抗體-抗原-二級抗體復(fù)合物的有無利用來自用于標(biāo)記二級抗體的酶、染料或放射性同位素的信號作為指標(biāo)來檢測，從而確定是否為具有目標(biāo)特征的抗體。7)單克隆抗體的制備
使通過上述方法選擇的雜交瘤細(xì)胞適應(yīng)于無血清培養(yǎng)基，例如，Hybridoma-SFM (Invitrogen Corporation)，然后可以從無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的上清液制備單克隆抗體。對于培養(yǎng)細(xì)胞，可以使用燒瓶、陪氏培養(yǎng)皿、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、滾瓶或高密度培養(yǎng)燒瓶 CELLine (Becton, Dickinson and Company)0另外，為了大量制備單克隆抗體，例如，6到8周齡裸鼠或SCID小鼠可以腹膜內(nèi)施用0. 5 mL異十八烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)，飼養(yǎng)2周，然后腹膜內(nèi)施用5X IO6到 2 X IO7個(gè)細(xì)胞/小鼠的雜交瘤細(xì)胞，飼養(yǎng)10到21天，從而可以從產(chǎn)生的腹腔積液制備單克隆抗體。通過離心從這樣采集的腹腔積液中除去細(xì)胞和細(xì)胞碎屑。純化方法，例如，利用 40%-50%飽和硫酸銨的鹽析、辛酸沉淀法、DEAE-瓊脂糖柱、蛋白A柱、蛋白質(zhì)G柱、HiTrap IgM純化HP-柱(GE Healthcare)、甘露聚糖結(jié)合蛋白柱(Pierce)和凝膠過濾柱單獨(dú)地或組合地使用，從而采集IgG或IgM級分，然后可以用作純化的單克隆抗體。8)單克隆抗體的表位的分析
通過合成具有8到12個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的肽，所述連續(xù)氨基酸被設(shè)計(jì)以在抗原E2蛋白中移位一個(gè)到幾個(gè)氨基酸，用該肽作為抗原時(shí)檢查單克隆抗體對所述肽的結(jié)合， 然后確定抗體的表位，可以分析單克隆抗體的線性表位。具體地，將這樣合成的肽固定在平板上，并與純化的抗體反應(yīng)。添加標(biāo)記的二級抗體，然后讓平板靜置。通過酶免疫分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)來測量結(jié)合能力。在某些情況下可能無法通過這種方法測定表位。在這種情況下，單克隆抗體的表位可能是構(gòu)象表位，因而抗體可識別抗原的構(gòu)象。特異性結(jié)合HCVh的E2蛋白、但是不與HCVla的E2蛋白免疫反應(yīng)的抗體的實(shí)例是將序列表中SEQ ID NO :1所示氨基酸序列識別為表位的抗體。這樣的抗體的具體實(shí)例是從具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。另外，特異性結(jié)合HCMa的E2蛋白、但是不與HCVla的E2蛋白和HCVlb的E2蛋白兩者免疫反應(yīng)的抗體的實(shí)例是將序列表中SEQ ID NO :2或3所示氨基酸序列識別為表位的抗體。這樣的抗體的具體實(shí)例是由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11180或FERM ABP-11179 的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。此外，特異性結(jié)合HCVh的J6CF株的包膜蛋白2、但是不與JHll株的包膜蛋白2 免疫反應(yīng)的抗體的實(shí)例是將序列表中SEQ ID NO :4所示氨基酸序列識別為表位的抗體。這樣的抗體的具體實(shí)例是由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11183的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。這種抗體可以從HCV基因型加中辨別J6CF株，因此它可以用于鑒定J6CF株。此外，上述具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181, FERM ABP-11180, FERM ABP-11179, FERM ABP-11183和FERM ABP-11182的雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)保藏在國際保藏機(jī)構(gòu)，國家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)學(xué)會(huì)國際專利生物保藏所(郵政編碼305-8566 Central 6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki,日本)(保藏日期2008年9月19日)，因而它們是可獲得的。這些細(xì)胞系原本各自被國內(nèi)保藏(原始保藏日期2008年9月19日)在同一保藏機(jī)構(gòu)，登記號FERMP-21677 (臨時(shí)登記號 FERM AP_21677)、FERM P-21676 (臨時(shí)登記號 FERM AP_21676)、FERM P-21675(臨時(shí)登記號 FERM AP_21675)、FERM P-21679(臨時(shí)登記號 FERM AP-21679)和 FERM P-21678 (臨時(shí)登記號FERM AP-21678)，然后根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏。另外，本發(fā)明的鑒定HCV基因型的方法包括如果HCV結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，但是不結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11180和 FERM ABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的任一抗體，確定HCV的基因型是基因型Ib ；如果HCV 結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，并且結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11180和FERM ABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，確定HCV的基因型是基因型加；以及如果HCV結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11182的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，但是不結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-1118UFERM ABP-11180和FERM ABP-11179 的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的任一種抗體，確定HCV的基因型是基因型la。未知基因型的HCV是否結(jié)合具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11181, FERM ABP-11180, FERM ABP-11179或FERM ABP-11182的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的抗體，可以使用沒有特別限制的任何分析系統(tǒng)來確定，只要它能夠檢測抗原抗體反應(yīng)的有無。這樣的方法的實(shí)例是如下所述的免疫分析和蛋白質(zhì)印跡方法。(免疫分析)
首先，含有未知基因型的HCV的測試樣品與載體或平板接觸，在所述載體或平板上要檢查有無結(jié)合的上述抗體已經(jīng)作為初級抗體固定，然后在4°C _37°C下反應(yīng)足以形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)間。接下來，用酶、染料、放射性同位素等等標(biāo)記的，以非基因型特異性方式結(jié)合HCV 的二級抗體與所述抗體-抗原復(fù)合物接觸，然后在4°C _37°C的條件下反應(yīng)足以形成抗體-抗原-二級抗體復(fù)合物的時(shí)間。最后，利用來自用于標(biāo)記所述二級抗體的酶、染料或放射性同位素的指示信號，檢測形成的抗體-抗原-二級抗體復(fù)合物的有無，從而可以確定與上述抗體有無結(jié)合。(蛋白質(zhì)印跡方法)
首先，將含有未知基因型的HCV的測試樣品點(diǎn)在膜，例如硝化纖維膜或PVDF膜上，然后所述測試樣品中所含的蛋白質(zhì)被固定。然后，將膜浸入5%脫脂乳、1% BSA溶液或商業(yè)的封閉試劑中用于封閉，用緩沖液充分洗滌，然后轉(zhuǎn)移到含有用酶、染料、放射性同位素等等標(biāo)記以檢查有無結(jié)合的上述抗體的緩沖液中。反應(yīng)在4°C _37°C下進(jìn)行足以形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)間。隨后，充分地洗滌膜，然后檢測來自用于標(biāo)記上述抗體的酶、染料或放射性同位素的信號用于檢查有無結(jié)合，從而確定與上述抗體有無結(jié)合。在此引用的所有出版物、專利和專利申請通過以它們的整體引用而合并在此。 實(shí)施例將參考以下實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。(實(shí)施例1)用于表達(dá)HCV株的抗原E2蛋白與標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白的載體的制備。
(1)用于表達(dá)來自HCVhW J6CF株的抗原E2蛋白與3XFLAG標(biāo)簽的融合蛋白的載體的構(gòu)建
來自HCVh的J6CF株的抗原E2蛋白，即，由沒有HCVh的J6CF株的E2蛋白的跨膜區(qū)域的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)，如下所述地制備。首先，利用HCV2a 的 J6CF 株的基因組 RNA 的 cDNA (GenBank Accession No. AF177036)作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc .)，和 J6E2dTM_s (SEQ ID NO 6 :CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)與 J6E2dTM-as (SEQ ID NO 7 :GCTCTAGATTA CCATCGGACGATGTATTTTGT)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼由相應(yīng)于J6CF株的前體蛋白 (SEQ ID NO :5)的氨基酸位置384到720的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的基因，此時(shí)N-末端的起始甲硫氨酸被確定為是第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA片段克隆到pCR-TOPO (Invitrogen Corporation)中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和I消化，從具有正確的核苷酸序列插入物的克隆上切下?；蚱伟撮喿x框插入到P3XFLAG-CMV-9 (Sigma)的III和漢3 H I位點(diǎn)之間，使得閱讀框匹配。結(jié)果，獲得了表達(dá)抗原E2蛋白的CMV-3XFLAGJ6E2dTM載體，所述抗原E2蛋白上連接了 3XFLAG_tag (在下文中稱為 3XFLAG-J6E2dTM 蛋白)。(2)用于來自HCVh的J6CF株的抗原E2蛋白與添加到所述抗原E2蛋白的人類 IgG Fc蛋白的融合蛋白表達(dá)的載體的構(gòu)建
首先，禾丨J 用 HCV2a 的 J6CF 株的 cDNA 的基因組 RNA (GenBank Accession No. AF177036)作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc ·)，和 J6E2Fc_s (SEQ ID NO 8 :CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)禾口 J6E2Fc_as (SEQ ID NO :9 : ACAGGATCCCATCGGACGATGTATTTTGTG)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼由與J6CF株的前體蛋白(SEQ ID NO 5)的氨基酸位置384到720相應(yīng)的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的基因，此時(shí) N-末端的起始甲硫氨酸確定為第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA片段克隆到pCR-TOPO (Invitrogen Corporation)中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和I消化，由此從具有正確的核苷酸序列插入物克隆上切下。基因片段插入到p3XFLAG-CMV-13(Sigma) 的信號肽序列的下游III位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間，使得閱讀框(可讀框)匹配，也就是說，按閱讀框插入的。產(chǎn)生的載體被稱為CMV-13-J6E2。隨后，CMV-13-J6E2用Sac I和漢I消化。編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的 DNA片段各自分別通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用GeneElute (Sigma)純化。此后，編碼上述信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段分別按閱讀框插入(使得閱讀框匹配)到 CDM-mIL7R-Ig 載體(Sudo et al. , Proc Natl. Acad Sci U.S.A.，1993， Vol. 90, p. 9125-9129)的fee I位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間，所述載體表達(dá)包含小鼠IL-7 受體-人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。因而，獲得表達(dá)抗原E2蛋白的CDM-J6E2Fc載體，所述抗原E2蛋白上連接了人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為J6E2-FC蛋白)。(3)用于來自HCVh的JFHl株的抗原E2蛋白與人類IgG Fc蛋白的融合蛋白表達(dá)的載體的構(gòu)建
首先，利用 HCV2a 的 JFHl 株的基因組 RNA 的 cDNA(GenBank Accession No. AB047639)作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc .)，和 JFE2Fc_s (SEQ ID NO :10 CACAAGCTTGGCACCACCACCGTTGGAG)和 JFE2Fc-as (SEQ ID NO :11 :ACAGGATCCTCCCATCGAACGA CGTATTTTGTG)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼與JFHl株的前體蛋白的氨基酸位置384 到721相應(yīng)的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的基因，此時(shí)N-末端的起始甲硫氨酸確定為第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA片段克隆到pCR-TOPO (Invitrogen Corporation)中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和I消化， 由此從具有正確核苷酸序列插入物的克隆上切下，然后按閱讀框插入到P3XFLAG-CMV-13 (Sigma)的信號肽序列下游的III位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間。該載體被稱為 CMV-13-JFH1E2。隨后，CMV-13-JFH1E2用fee I和漢3 H I消化。編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段各自分別通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用GeneElute (Sigma)純化。此后，編碼上述信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段分別按閱讀框插入到CDM-mIL7R-Ig的Sac I位點(diǎn)和Bam込I位點(diǎn)之間。因而，獲得表達(dá)抗原E2蛋白的 CDM-JFH1E2FC載體，所述抗原E2蛋白上連接了人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為 JFH1E2-Fc 蛋白)。(4)用于來自HCVlb的TH株的抗原E2蛋白與人類IgG Fc蛋白的融合蛋白表達(dá)的載體的構(gòu)建
首先，利用HCVlb的TH株的基因組RNA的cDNA (國際專利公開W02006/022422)作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc .)禾口 THE2Fc_s (SEQ ID NO 12 =CAAA GCTTGCGACCTACGTGACGGGGGGGTCG)，和 THE2Fc_as (SEQ ID NO :13 CCTCTAGATTATGGATCCCAT TTGATTGCATAGGAGACAACCG)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼由與TH株的前體蛋白的氨基酸位置384到717相應(yīng)的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的基因，此時(shí)N-末端的起始甲硫氨酸確定為第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA 片段克隆到 pCR-TOPO (Invitrogen Corporation) 中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和
I消化，這樣從具有正確的核苷酸序列插入物的克隆切下?；蚱伟撮喿x框插入到 P3XFLAG-CMV-13 (Sigma)的信號肽序列下游的歷/ d III位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間。該載體被稱為CMV-13-THE2。隨后，CMV-13-THE2用fee I和及I消化。編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的 DNA片段各自分別通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用GeneElute (Sigma)純化。此后，編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段分別按閱讀框插入到 CDM-mIL7R-Ig的fee I位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間。因而，獲得表達(dá)抗原E2蛋白的CDM_THE2Fc 載體，所述抗原E2蛋白上連接了人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為THE2-FC蛋白)。(5)用于來自HCVlb的Conl株的抗原E2蛋白與人類IgG Fc蛋白的融合蛋白表達(dá)的載體的構(gòu)建
首先，利用 HCVlb 的 Conl 株的基因組 RNA 的 cDNA(GenBank Accession No. AJ238799) 作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc ·)和 ConlE2Fc_s (SEQ ID NO: 14 :CAAAGCTTGGAACCTATGTGACAGGGGGGACGAT)，和 ConlE2Fc-as (SEQ ID NO : 15 :CCTCTAGATTATGGATCCCATTTGATTGCAAAGGAGACAAC)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼與Conl株的前體蛋白的氨基酸位置384到716相應(yīng)的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的基因，此時(shí)N-末端的起始甲硫氨酸確定為第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA 片段克隆到 pCR-TOPO (Invitrogen Corporation) 中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和
I消化，這樣從具有正確的核苷酸序列插入物的克隆切下?；蚱伟撮喿x框插入到 P3XFLAG-CMV-13 (Sigma)的信號肽序列下游的歷/ d III位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間。該載體被稱為 CMV-13-ConlE2。隨后，CMV-13_ConlE2用fee I和漢3 H I消化。編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段各自分別通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用GeneElute (Sigma)純化。此后，編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段分別按閱讀框插入到 CDM-mIL7R-Ig的Sac I位點(diǎn)和Bam込I位點(diǎn)之間。因而，獲得表達(dá)抗原E2蛋白的 CDM-C0nlE2Fc載體，所述抗原E2蛋白上連接了人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為 ConlE2-Fc 蛋白)。(6)用于來自HCVlb的Jl株的抗原E2蛋白與人類IgG Fc蛋白的融合蛋白表達(dá)的載體的構(gòu)建
首先，利用衍生自HCVlb的Jl株的基因組RNA的cDNA (GenBank Accession No. D89815)作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc .)，和 JlE2Fc_s (SEQ ID NO :16 :CAAAGCTTCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGC)，和 JlE2Fc-as (SEQ ID NO 17 :CCTCTAGAT TATGGATCCCACTTGATGGCAATGGAGACGACC)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼由與Jl株的前體蛋白的氨基酸位置384到716相應(yīng)的區(qū)域組成的蛋白質(zhì)的基因，此時(shí)N-末端的起始甲硫氨酸確定為第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA 片段克隆到 pCR-TOPO (Invitrogen Corporation) 中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和
I消化，這樣從具有正確的核苷酸序列插入物的克隆切下。基因片段按閱讀框插入到 P3XFLAG-CMV-13 (Sigma)的信號肽序列下游的歷/ d III位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間。該載體被稱為CMV-13-J1E2。隨后，CMV-13-J1E2用Tthlll I消化，用T4 DNA聚合酶平端化，然后用BemM I消化。產(chǎn)生的編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段各自分別通過瓊脂糖凝膠電泳分離， 然后利用GeneElute (Sigma)純化。此后，CDM-mILR7R_Ig用漢3 H I和損a I消化來切下含有編碼人免疫球蛋白 Fc結(jié)構(gòu)域的序列的DNA片段。然后將該片段插入到pcDL-SRa四6 (Takebe et al., Proc Natil Acad Sci. U.S.A., 1987，Vol. 84，p. 7388-7392)中啟動(dòng)子區(qū)域的下游來制備SRa IgGlFc0此外，編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段分別按閱讀框插入到SRa IgGlFc中EcoR V位點(diǎn)和及I位點(diǎn)之間。因而，獲得了表達(dá)抗原E2蛋白的SRa-JlE2Fc載體，所述抗原E2蛋白上連接了人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為 J1E2-FC 蛋白)。(7)用于來自HCVla的H77株的抗原E2蛋白與人類IgG Fc蛋白的融合蛋白表達(dá)的載體的構(gòu)建首先，利用 HCVla 的 H77 株的基因組 RNA 的 cDNA(GenBank Accession No. AFOl 1751) 作為模板，Advantage GC2 PCR 試劑盒(Takara Bio Inc ·)，和 H77E2Fc_s(SEQ ID NO :18 CAAAGCTTGAAACCCACGTCACCGGGGGAAA)和 H77E2Fc-as (SEQ ID NO 19 :CCTCTAGATTATGGAT CCCACTTAATGGCCCAGGACGCGAT)作為引物，通過PCR方法來擴(kuò)增編碼由與H77株的前體蛋白的氨基酸位置384到716相應(yīng)的區(qū)域組成，此時(shí)N-末端的起始甲硫氨酸確定為第一個(gè)氨基酸。然后，將這樣擴(kuò)增的DNA 片段克隆到 pCR-TOPO (Invitrogen Corporation) 中，然后對3個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。編碼抗原E2蛋白的基因片段用Z/i/7d III和Zh I消化，這樣從具有正確的核苷酸序列插入物的克隆切下?；蚱伟撮喿x框插入到 p3XFLAG-CMV-13)(h0載體的信號肽序列下游的歷/7d III位點(diǎn)和損a I位點(diǎn)之間，所述載體通過在P3XFLAG-CMV-13 (Sigma)中將fee I位點(diǎn)轉(zhuǎn)變成煬ο I位點(diǎn)來制備。產(chǎn)生的載體被稱為 CMV-13-)(hoH77E2。隨后，CMV-13_XhoH77E2用煬ο I和I消化，然后編碼信號肽序列和抗原E2 蛋白的DNA片段各自分別通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然后使用GeneElute (Sigma)來純化。此后，編碼信號肽序列和抗原E2蛋白的DNA片段分別按閱讀框插入到上文5) 中構(gòu)建的SRa-IgGlFc的損ο I位點(diǎn)和I位點(diǎn)之間。獲得了表達(dá)抗原E2蛋白的 SRa-H77E2FC載體，所述抗原E2蛋白上連接了人免疫球蛋白FC結(jié)構(gòu)域(在下文中稱為 H77E2-Fc 蛋白)。(實(shí)施例2)抗原E2蛋白和標(biāo)記蛋白質(zhì)的融合蛋白的表達(dá)
將實(shí)施例 1 中構(gòu)建的 CMV-3XFLAGJ6E2dTM, CDM_J6E2Fc、CDM-JFHlE2Fc, CDM_THE2Fc、 CDM-ConlE2Fc、SRa -JlE2Fc和SRa -H77E2Fc導(dǎo)入到來自猴腎的COSl細(xì)胞中，然后每種融合蛋白如以下描述地表達(dá)。首先，COSl細(xì)胞在含有 10% 胎牛血清(Invitrogen Corporation)、100 U/ml 青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基Gnvitrogen Corporation)中傳代培養(yǎng)。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)前一天，COSl細(xì)胞以1 :2的分離比播種到150 cm2培養(yǎng)燒瓶(Corning Coaster Corporation)中，然后在5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)過夜。隨后，將DEAE 葡聚糖(GE Healthcare)和氯喹(Sigma)分別以 400 μ g/ml 和 100 μ M的終濃度添加到RPMI1640培養(yǎng)基中。50 μ g的上述表達(dá)載體(CMV_3XFLAGJ6E2dTM、 CDM-J6E2Fc、CDM-JFHlE2Fc, CDM_THE2Fc、CDM_ConlE2Fc、SRa -JlE2Fc 或 SRa -H77E2Fc) 以每13 mL 0. 1 μ g/μ 1的濃度添加，然后培養(yǎng)細(xì)胞3到4天。此后，吸出培養(yǎng)的COSl細(xì)胞的上清液。添加IOml的PBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co. , Ltd)，再一次地，吸出 PBS (_)以洗滌細(xì)胞。隨后，以 13 ml/150 cm2 燒瓶添加DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后產(chǎn)物在存在5% CO2的情況下在37°C保持靜止。四小時(shí)后，吸出DEAE dextran_DNA混合物，每個(gè)燒瓶用10 ml PBS洗滌一次， 以50 ml/燒瓶添加Hybridoma-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation)，然后細(xì)胞在存在 5% CO2的條件下在37°C培養(yǎng)4天。此后，將培養(yǎng)物上清液采集在50 ml離心管(Corning Coaster Corporation)中，然后在2500 rpm在4°C離心30分鐘。上清液通過0. 2 μπι濾過器(Whatman)過濾。(實(shí)施例3)抗原E2蛋白和標(biāo)記蛋白的融合蛋白的純化已經(jīng)導(dǎo)入了 CMV-3XFLAG-J6E2dTM的細(xì)胞的培養(yǎng)上清液如下所述利用抗-FLAG M2瓊脂糖(Sigma)進(jìn)行純化。首先，將1 ml抗-FLAG M2瓊脂糖添加到500 ml培養(yǎng)物上清液中，然后在4°C反應(yīng)2小時(shí)，其間在旋轉(zhuǎn)瓶子中攪動(dòng)。在2小時(shí)后，將上清液和抗-FLAG M2瓊脂糖的混合物轉(zhuǎn)移到 Econocolumn (Bio-Rad Laboratories Inc.)，除去孔隙級分，然后采集抗-FLAG M2 瓊脂糖。然后，抗-FLAGM2 瓊脂糖用 10 ml TBS(50 mm Tris-HCl, 150 mM NaCl，pH 7.4) 洗滌兩次。六個(gè)級分(抗-FLAG抗體柱洗脫級分1-6)用0. 1 M甘氨酸-HCKpH 3. 5)洗脫到1 ml/級分。在洗脫之后立即添加IM Tris-HCKpH 9. 5)使pH值回到中性。20 μ 1的每個(gè)級分在還原條件下通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分級，然后用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，確認(rèn)的是，純化了 J6CF菌株衍生的抗原Ε2蛋白與3XFLAG標(biāo)簽的融合蛋白(3XFLAG-J6E2dTM 蛋白)(附圖4)。導(dǎo)入了CDM-J6E2Fc、CDM-JFHlE2Fc, CDM_THE2Fc、CDM_ConlE2Fc、SRα -JlE2Fc 或 SRa -H77E2Fc的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液利用結(jié)合了蛋白-A的載體印-A (Millipore)如下所述進(jìn)行純化。首先，用1 mL的印-A填充Econocolumn，使500 ml的培養(yǎng)物上清液以1-1. 5 mL/分鐘的流速通過，然后用20 mL的PBS (-)洗滌。然后，5個(gè)級分用0. 1 M甘氨酸-HCl CpH 3. 0)洗脫到1 ml/級分。在洗脫之后立即添加IM Tris-HCl CpH 9. 5)使pH值回到中性。20 μ 1的每個(gè)級分在還原條件下通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分級，然后用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果，純化了來自每種HCV株的抗原Ε2蛋白與人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，在還原條件下分子量顯示為約97 kDa (附圖5)。(實(shí)施例4)用HCVh的J6CF株的抗原E2蛋白免疫小鼠
混合含有10 μ g 3XFLAG-J6E2dTM蛋白的0. 3 ml的PBS溶液和0. 3 ml弗氏完全佐劑來制備乳劑。用一半數(shù)量的乳劑皮下接種7周齡Balb/c小鼠(雌性)。2周后，混合含有10 μ g 3XFLAG-J6E2dTM蛋白的0. 3 ml PBS溶液和0. 3 ml弗氏不完全佐劑來制備乳劑，將一半數(shù)量的乳劑皮下地施用給小鼠。再2周后，將含有10 yg 3XFLAG-J6E2dTM蛋白的0.15 ml PBS溶液向小鼠腹膜內(nèi)施用。3天后，從小鼠制備脾臟細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，混合含有20 μ g J6E2-Fc蛋白的0. 3 ml PBS溶液和0. 3 mL Alum (Pierce)來制備施用的溶液。用全部數(shù)量的乳劑腹膜內(nèi)接種7周齡Balb/c小鼠(雌性)。在2、4和6周之后，類似地，混合含有20 yg J6E2_Fc蛋白的0. 3 ml PBS溶液和 0.3 ml Alum來制備要施用的溶液，將全部數(shù)量的乳劑向小鼠腹膜內(nèi)施用。再2個(gè)月后，將含有20 yg J6E2-FC蛋白的0.3 ml PBS溶液向小鼠腹膜內(nèi)施用。3天后，從小鼠制備脾臟細(xì)胞。(實(shí)施例5)雜交瘤細(xì)胞的制備
首先，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0(獲自ECACC)在含有55μΜ的2-巰基乙醇、100 U/ml 青霉素、100μ g/ml 鏈霉素和 10% 胎牛血清(FCS ；Invitrogen Corporation)的 Dulbecco's修飾的fegle’ s培養(yǎng)基(DMEM ；Invitrogen Corporation)中培養(yǎng)，獲得處在對數(shù)生長期的 SP2/0細(xì)胞。用無血清DMEM洗滌細(xì)胞3次。然后，從已經(jīng)施用了 3XFLAG-J6E2dTM蛋白或J6E2-FC蛋白的小鼠制備脾臟細(xì)胞， 然后用無血清DMEM洗滌3次。將SP2/0細(xì)胞和小鼠脾臟細(xì)胞以1 :5的比例添加到50 ml 離心試管中，然后在1，OOOrpm進(jìn)行離心10分鐘。通過抽吸完全地除去上清液。隨后，輕敲離心管來疏松沉淀。添加在37°C預(yù)熱的1 ml 50%聚乙二醇-1500溶液(Roche) 1分鐘，并在37°C反應(yīng)1分鐘。隨后，向上述離心管中用1分鐘添加1 ml無血清DMEM，再次用1分鐘添加無血清 DMEM 1 ml，然后用3分鐘添加最后的7 ml無血清DMEM，從而稀釋乙二醇溶液。此后，將上述離心管在1，000 rpm離心10分鐘來采集細(xì)胞。使細(xì)胞以1 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml懸浮在含有55 μ M的2-巰基乙醇、100 U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、15% FCS和10%雜交瘤克隆因子(BioVeris)的 DMEM 中。將這樣獲得的細(xì)胞懸浮液以100 μ 1/孔播種在96孔平板的每個(gè)孔中，然后在5% CO2培養(yǎng)箱中在37 °C培養(yǎng)。在第二天，向每個(gè)孔添加含有2XHAT anvitrogen Corporation)、15% FCS和10%雜交瘤克隆因子的DMEM 100 μ 1，然后將細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱中在37°C連續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)10到14天后，采集每個(gè)反應(yīng)孔中的培養(yǎng)物上清液，如實(shí)施例6中描述地篩選培養(yǎng)物上清液中含有的識別抗原E2蛋白的抗體。(實(shí)施例6)篩選產(chǎn)生結(jié)合抗原E2蛋白的抗體的雜交瘤細(xì)胞
通過將抗原E2蛋白固定在平板上，然后通過EIA評估雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中的抗體是否與固定在平板上的抗原E2蛋白結(jié)合，來篩選雜交瘤細(xì)胞。(1)抗原E2蛋白固定的平板的制備將3XFLAG-J6E2dTM蛋白或J6E2-Fc蛋白用PBS稀釋到l yg/ml，然后將50 μ 的
每種產(chǎn)物添加到免疫平板(Nunc)的每個(gè)孔中。免疫平板在4°C靜置過夜，使得蛋白質(zhì)固定在平板上。從每個(gè)孔除去蛋白溶液，將200 μ 1每份的根據(jù)所包含的手冊制備的Blocking One溶液(NACALAI TESQUE, INC .)添加到每個(gè)孔，然后在室溫下進(jìn)行封閉2小時(shí)。(2)雜交瘤細(xì)胞的篩選
上述進(jìn)行了封閉的蛋白質(zhì)固定的平板用于篩選雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中含有的抗E2蛋白抗體。固定了 J6E2-FC蛋白的平板用于篩選從施用3Xflag-J6E2dTM蛋白的小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。固定了 3XFLAG-J6E2dTM蛋白的平板用于篩選從施用J6E2-FC蛋白的小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體。具體地，上述蛋白質(zhì)固定的平板用含有0. 1% Tween20 (Sigma)的PBS洗滌4次。 以50 μ 1/孔添加實(shí)施例5中獲得的每個(gè)雜交瘤細(xì)胞的上清液樣品，然后在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)完成后，用含有0. 1% Tween20的PBS洗滌孔4次。隨后，以50 μ 1/孔添加用含有0. 1% Tween20的PBS稀釋5，000倍的HRP-標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare) 在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)完成后，用含有0. 1% Tween20的PBS洗滌孔4次，使用過氧化物酶顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)顯色，然后測量450 nm處的吸光度， 選擇陽性克隆。結(jié)果，對于從施用3XFLAG_J6E2dTM蛋白的小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞，可從進(jìn)行篩選的980個(gè)孔中確定地選出11個(gè)克隆。這些克隆通過有限稀釋來進(jìn)行克隆，從而獲得具有良好增殖性和抗體生產(chǎn)性的雜交瘤細(xì)胞系1G2-32、2F2-7、2F3-7、4E8-8、5D4-6、9G3-2、 9A5-4、9C4-2、8D10-3 和 10G4-1。同時(shí)，對于從施用了 J6E2-FC蛋白的小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞，從篩選的2064個(gè)孔中可以確定地選擇10個(gè)克隆。這些克隆的克隆通過有限稀釋來進(jìn)行，從而獲得具有良好的增殖性和抗體生產(chǎn)性的M1E12-1雜交瘤細(xì)胞系。(3)同種型和亞型分析
利用ImmimoPure單克隆抗體同種型試劑盒(Pierce)根據(jù)所包含的手冊來分析由此獲得的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的同種型和亞型。結(jié)果，每個(gè)克隆的抗體亞型如附圖6 所示。它們都被發(fā)現(xiàn)具有κ-免疫球蛋白輕鏈。(4) IgG抗體的純化
將獲得的雜交瘤細(xì)胞通過逐步降低培養(yǎng)基中的FCS濃度使其最終適應(yīng)于無血清培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞各自在無血清培養(yǎng)基Hybridoma SFM (Invitrogen Corporation)中培養(yǎng)到匯合。將培養(yǎng)溶液采集到離心管中，然后在1500 rpm離心5分鐘。將培養(yǎng)物上清液添加到印-G (Millipore)中，然后用30倍床體積(bed volumn)的PBS洗滌。隨后， 用1倍床體積的0.1 M甘氨酸-HCl CpH 3.0)洗脫了 6個(gè)級分。在洗脫之后立即地，添加 IM Tris-HCl CpH 9. 5)使pH值回到中性。20 μ 1的每種級分在還原條件和非還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分級。通過用考馬斯亮藍(lán)染色來確認(rèn)蛋白質(zhì)的有無。集中IgG級分，然后用PBS進(jìn)行透析，或通過凝膠過濾來脫礦質(zhì)，從而制備抗體樣品。(實(shí)施例7)針對抗原Ε2蛋白的單克隆抗體的HCV基因型特異性
檢查通過用HCVh的J6CF株的抗原Ε2蛋白免疫制備的每種雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體是否結(jié)合衍生自基因型加的J6CF株以及基因型加的JFHl株的Ε2蛋白，衍生自基因型Ib的TH株、基因型Ib的Jl株和基因型Ib的Conl株的Ε2蛋白，以及衍生自基因型Ia 的Η77株的Ε2蛋白。作為抗原，使用實(shí)施例1-3制備的J6E2-FC蛋白、JFHlE2_Fc蛋白、THE2_Fc蛋白、 J1E2-FC蛋白、ConlE2-FC蛋白和H77E2_Fc蛋白，它們是抗原E2蛋白與人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。將這些蛋白固定在平板上，然后如實(shí)施例6中描述地用于評估。具體地，將每種上述融合蛋白用PBS稀釋到1 yg/ml，將稀釋溶液以50 μ 1/孔添加到免疫平板，然后使免疫平板在4°C保持靜置過夜，使得每種融合蛋白固定在平板上。除去蛋白溶液，然后以200 μ 1/孔添加根據(jù)包含的手冊制備的Blocking One溶液(NACALAI TESQUE, INC.)，隨后在室溫下封閉2小時(shí)。接下來，將每種雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體用PBS稀釋到1 yg/ml，以50 μ 1/ 孔添加到上述蛋白固定的平板中，然后在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)完成之后，用含有 0. 05% Tween20的PBS洗滌孔4次，以50 μ 1/孔添加用含0. 05% Tween20的PBS稀釋5，000 倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體，然后在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)完成后，用含有0. 05% Tween20的PBS洗滌孔4次，使用過氧化物酶顯色試劑盒顯色，然后測量450 nm處的吸光度。附圖6顯示了每種單克隆抗體與各種HCV基因型或株的抗原E2蛋白的結(jié)合。對于吸光度值，小于0. 1的值用“_”表示，0. 1或更高并且小于0. 25的值用“ + ”表示，0. 25或更高并且小于0.4的值用“++”表示，0.4或更高的值用“+++”表示。這些值表示與抗原E2 蛋白結(jié)合的強(qiáng)度。如附圖6中所示，8D10-3是結(jié)合HCV基因型la、lb和加的抗原E2蛋白的抗體，1G2-32和2F2-7是結(jié)合基因型加的抗原E2蛋白的抗體，4E8-8是結(jié)合基因型Ib 和加的抗原E2蛋白的抗體。此外，如附圖6中所示，M1E12-1是結(jié)合J6CF株的抗原E2蛋白的單克隆抗體。這些結(jié)果表明，可以使用上述單克隆抗體組用于鑒定HCV基因型或HCV株。另外，于2008年9月19日，產(chǎn)生單克隆抗體8D10-3的雜交瘤細(xì)胞(8D10-3)以臨時(shí)登記號FERM ABP-11182保藏，產(chǎn)生單克隆抗體1G2-32的雜交瘤細(xì)胞(1G2-32)以臨時(shí)登記號FERM ABP-11179保藏，產(chǎn)生單克隆抗體2F2-7的雜交瘤細(xì)胞(2F2-7)以臨時(shí)登記號FERM ABP-11180保藏，產(chǎn)生單克隆抗體4E8-8的雜交瘤細(xì)胞(4E8-8)以臨時(shí)登記號 NO. FERM ABP-11181保藏，以及產(chǎn)生單克隆抗體M1E12-1的雜交瘤細(xì)胞(M1E12-1)以臨時(shí)登記號FERM ABP-11183保藏在日本國家先進(jìn)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)學(xué)會(huì)，國際專利生物保藏所 (central 6, 1—1， Higashi 1， Tsukubaj Ibarakij Japan)。(實(shí)施例8)單克隆抗體的表位的分析
合成了一組肽(肽編號1-110)，每種肽具有10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其被設(shè)計(jì)以在相應(yīng)于氨基酸位置384到720的抗原E2蛋白氨基酸序列中從N-末端移位三個(gè)氨基酸， 此時(shí)在J6CF株的前體蛋白(SEQ ID NO :5)的N-末端的起始甲硫氨酸被確定為第一個(gè)氨基酸。每種肽的N-末端被生物素化，甘氨酰胺位于肽的C-末端(由委托的JPT來合成)。由此合成的肽各自溶于DMSO中，然后在PBS中以0.01 nmol/μ 溶解。肽溶液以 50 μ 1/孔添加到鏈霉抗生物素蛋白包被的平板(Nunc)，然后在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。棄去肽溶液，以200 μ 1/孔添加根據(jù)所包含的手冊制備的Blocking One溶液(NACALAI TESQUE, INC .)，然后孔在4°C保持靜置過夜，從而進(jìn)行封閉。隨后，丟棄封閉溶液，孔用含有0.05% Tween20的PBS洗滌4次，然后以50 μ 1/ 孔添加用含有0. 05% Tween20的PBS稀釋到1 μ g/ml的每種單克隆抗體，隨后在室溫下反應(yīng)1. 5小時(shí)。在反應(yīng)完成后，棄去抗體溶液，孔用含有0. 05% Tween20的PBS洗滌4次，以 50 μ 1/孔添加用含有0. 05% Tween20的PBS稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG山羊抗體(GE Healthcare)，然后在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。在反應(yīng)之后，棄去抗體溶液，然后用含有 0. 05% Tween20的PBS洗滌孔5次。在洗滌之后，利用過氧化物酶顯色試劑盒顯色，然后在 450 nm測量吸光度，從而可以檢測結(jié)合肽的抗體。附圖7A-E顯示了每種單克隆抗體與衍生自J6CF株衍生的抗原E2蛋白的肽的結(jié)合強(qiáng)度。OD 450 nm的高測量值(在附圖7A-E的縱軸上顯示)表明單克隆抗體與相關(guān)的肽的結(jié)合強(qiáng)度是強(qiáng)的，抗體特異性地識別所述肽。每種單克隆抗體識別來自J6CF株的抗原E2 蛋白的某些肽。單克隆抗體8D10-3的特別強(qiáng)的表位是DRCGAPTYTW (SEQ ID NO 20 ；肽編號47)， 以及與該表位肽重疊的GAPTYTWGEN (SEQ ID NO 21 ；肽編號48)(附圖7A)。根據(jù)該結(jié)果， 認(rèn)為表位可能包含氨基酸序列DRLGAPTYTWGEN (SEQ ID NO :22)中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。YPYRLffHYPC (SEQ ID NO :23 ；肽編號78)是弱表位(附圖7A)。單克隆抗體4E8-8的特別強(qiáng)的表位是WGENETDVFL(SEQ ID NO 1 ；肽編號50)。與肽編號 50 重疊的 NETDVFLLNS (SEQ ID NO』4 ；肽編號 51)、DVFLLNSTRP (SEQ ID NO :25;
20肽編號52)和LLNSTRPPLG (SEQ ID NO :26 ；肽編號53)是弱表位(附圖7C)。根據(jù)該結(jié)果， 認(rèn)為每種表位具有WGENETDVFLLNSTRPPLG (SEQ ID N0:27)中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨
基酸序列。單克隆抗體2F2-7的特別強(qiáng)的表位是GWGALQYEDN (SEQ ID NO 2 ；肽編號四)(附圖7D)。與肽編號四重疊的frvgwgai^qy (seq id no :28 ；肽編號觀)是弱表位(附圖7D)。 根據(jù)該結(jié)果，認(rèn)為的是每種表位具有氨基酸序列FRVGWGALQYEDN (SEQ ID NO :29)中的至少 10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。單克隆抗體1G2-32的特別強(qiáng)的表位是KTCGAPPCRT (SEQ ID NO 3 ；肽編號61)和 GAPPCRTRAD (SEQ ID NO :30 ；肽編號62)(附圖7B)。根據(jù)該結(jié)果，認(rèn)為每種表位具有氨基酸序列KTCGAPPCRTRAD (SEQ ID NO :31)中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。單克隆抗體M1E12-1的特別強(qiáng)的表位是NYTinQRMY (SEQ ID NO :4 ；肽編號82) 和IFKIRMYVGG (SEQ ID NO 32 ；肽編號83)(附圖7E)。根據(jù)該結(jié)果，認(rèn)為每種表位具有氨基酸序列NYTIHQRMYVGG (SEQ ID NO 33)中的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列。(實(shí)施例9)利用單克隆抗體的HCV包膜蛋白的檢測
通過夾心ELISA方法和蛋白質(zhì)印跡方法檢查利用從上述制備的雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體是否檢測到衍生自基因型Ia的H77株的抗原E2蛋白，衍生自基因型加的J6CF株和基因型加的JFHl株的抗原E2蛋白，以及衍生自基因型Ib的TH株、基因型Ib的Jl株、 基因型Ib的Conl株的抗原E2蛋白。⑴夾心ELISA
單克隆抗體1G2-32用PBS稀釋到1 μ g/ml?？贵w溶液以50 μ 1/孔添加到免疫平板(Nunc)，然后孔在室溫保持靜止2小時(shí)，使得抗體固定在平板上。除去抗體溶液，以200 μ 1/孔添加根據(jù)包含的手冊制備的Blocking One溶液(NACALAI TESQUE, INC .)，然后孔在室溫保持靜止2小時(shí)用于封閉。接下來，抗原E2蛋白與添加在其上的人免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的每一種(即，JFH1E2-Fc 蛋白、J6E2-Fc 蛋白、THE2_Fc 蛋白、ConlE2_Fc 蛋白、JlE2_Fc 蛋白或 H77E2-FC蛋白)用PBS稀釋，然后以50 μ 1/孔添加到上述固定了蛋白的平板上，隨后在室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)。在反應(yīng)完成后，用含有0.05% Tween20的PBS洗滌孔3次。以50 μ 1/孔添加用含有0. 05% Tween20的PBS稀釋到1 μ g/ml的生物素化的8D10-3單克隆抗體，然后在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。在反應(yīng)之后，孔用含有0. 05% Tween20的PBS洗滌3次。 添加用含有0. 05% Tween20的PBS稀釋5，000倍的HRP-標(biāo)記的抗鏈霉抗生物素蛋白(GE Healthcare) 50 μ 1，然后在室溫下反應(yīng)1. 5小時(shí)。在反應(yīng)完成后，孔用含有0. 05% Tween20的PBS洗滌4次，使用過氧化物酶顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd .)顯色，然后測量490 nm處的吸光度。結(jié)果在附圖 8中示出。附圖8顯示了利用單克隆抗體1G2-32和8D10-3通過夾心ELISA測定的各種基因型/株的抗原E2蛋白的檢測靈敏度。水平軸表明抗原E2蛋白的數(shù)量，縱軸表明490 nm處的吸光度；也就是，抗原E2蛋白的檢測的數(shù)量。利用單克隆抗體1G2-32和8D10-3的夾心 ELISA顯示了僅可以檢測HCV基因型加的抗原E2蛋白，不能檢測基因型Ia和基因型Ib的抗原E2蛋白。這些結(jié)果表明，HCV基因型或株可以利用根據(jù)本發(fā)明獲得的抗體的組來鑒定。
(2)蛋白質(zhì)印跡方法
將五分之一體積的5X樣品緩沖液(0. 3125 M Tris-HCl, pH 6. 8,5% SDS 50%甘油， 0. 05% BPB 5% 2-ME)添加到0. 1 μ g到0. 3 μ g的抗原E2蛋白與添加在其上的Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的每一種中(JFH1E2-FC蛋白、J6E2-FC蛋白、THE2_Fc蛋白、ConlE2_Fc蛋白、 J1E2-FC蛋白或H77E2-FC蛋白)，隨后在100°C處理5分鐘。產(chǎn)物用作樣品。每種樣品施加到4%-20%梯度凝膠(TEFCO)上，使用40 mA的恒定電流進(jìn)行電泳，然后利用半干型印跡裝置以120 mA的恒定電流印跡到PVDF膜上。在印跡之后，PVDF膜在室溫下浸入 Block Ace (Snow Brand Milk Products Co.
，Ltd .)中1小時(shí)用于封閉，用含有0. 1% Tween20的TBS洗滌，浸入到用Can Get Signal (Toyobo Co.，Ltd .)稀釋到1 μ g/ml的8D10-3單克隆抗體中，然后在室溫下反應(yīng)1 小時(shí)。在反應(yīng)之后，膜用含有0. 1% Tween20的TBS洗滌，隨后浸入用Can Get Signal稀釋5，000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體中，然后在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。膜用含有0. 1% Tween20的TBS洗滌，然后利用ECL試劑盒(GE Healthcare)檢測條帶。附圖9顯示了利用8D10-3單克隆抗體通過蛋白質(zhì)印跡方法，各種基因型/株的抗原E2蛋白的檢出或未檢出。所有六種株類型的抗原E2蛋白可以用8D10-3單克隆抗體檢出ο工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明的抗體使得以高精度簡單地鑒定HCV基因型la、lb和加成為可能。因而，對干擾素療法的治療效果不可以預(yù)先預(yù)期的感染基因型Ia或Ib的HCV的丙型肝炎患者，可以減輕副作用并可以提供選擇新的治療方法的機(jī)會(huì)。
權(quán)利要求
1.一種抗體，其特異性結(jié)合基因型加的丙型肝炎病毒的包膜蛋白2，但是不與基因型 Ia的丙型肝炎病毒的包膜蛋白2免疫反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其將序列表中SEQID NO :1所示的氨基酸序列識別為表位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗體，其由具有臨時(shí)登記號FERMABP-11181的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其不與基因型Ib的丙型肝炎病毒的包膜蛋白2免疫反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體，其將序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列識別為表位。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體，其將序列表中SEQID NO :3所示的氨基酸序列識別為表位。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5的抗體，其由具有臨時(shí)登記號FERMABP-11180的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或6的抗體，其由具有臨時(shí)登記號FERMABP-11179的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的抗體，其特異性地結(jié)合J6CF株的包膜蛋白2，但是不與JFHl毒株的包膜蛋白2免疫反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的抗體，其將序列表中SEQID NO :4所示的氨基酸序列識別為表位。
11.11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的抗體，其由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11183的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
12.一種鑒定丙型肝炎病毒基因型的方法，其中如果病毒結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求3的抗體，但是不與根據(jù)權(quán)利要求7和8的任一抗體結(jié)合， 所述丙型肝炎病毒的基因型被確定為基因型Ib ；如果病毒結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求3的抗體，并且結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求7和8的抗體，所述丙型肝炎病毒的基因型被確定為基因型加；以及如果所述病毒結(jié)合由具有臨時(shí)登記號FERM ABP-11182的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體，但是不結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求3、7和8的任一抗體，所述丙型肝炎病毒的基因型被確定為基因型 Ia0
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合基因型2a的HCV的包膜蛋白2、但是不與基因型1a的HCV的包膜蛋白2免疫反應(yīng)的抗體。
文檔編號C12Q1/68GK102227445SQ20098014784
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者中村紀(jì)子, 脅田隆字, 赤澤悠子 申請人:東麗株式會(huì)社, 日本國立感染癥研究所