專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗丙型肝炎病毒(hcv)人抗體及其用途的制作方法抗丙型肝炎病毒(HCV)人抗體及其用途相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求提交于2007年2月21日的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/902,432的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，因其所有的主題均與本申請(qǐng)相同。上述申請(qǐng)所公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容都通過(guò)引用方式結(jié)合于本文中。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(HCV)最初被稱(chēng)為"非甲非乙型肝炎病毒"(NANBH)，是一種屬于黃病毒科的正鏈、單鏈RNA病毒。其基因組包含一個(gè)編碼大約3000個(gè)氨基酸殘基的多蛋白的長(zhǎng)可讀框(Cho0等人(1989)Science244:359-362)。多蛋白被宿主細(xì)胞和病毒蛋白酶加工成為三種主要的結(jié)構(gòu)蛋白以及幾種病毒復(fù)制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV的核苷酸序列是高度可變的，最趨異的分離林(isolate)僅共享60%的核苷酸序列同源性。已經(jīng)鑒定出幾種具有略微不同的基因組序列的不同HCV基因型。目前基于序列數(shù)據(jù)，將來(lái)自全世界的分離抹分組為6種主要類(lèi)型，每組包含幾種亞型(Simmonds等人(1995)Hepatology21:570-83)。類(lèi)型1-3幾乎占據(jù)了歐洲所有的感染，類(lèi)型4在埃及和扎伊爾流行，類(lèi)型5在南非流行，類(lèi)型6在香港流行。該病毒主要經(jīng)過(guò)血液和血液產(chǎn)品傳〗番。大部分的感染個(gè)體或者在1990年(開(kāi)始執(zhí)行血液供給的HCV篩查)以前接受過(guò)輸血，或者使用過(guò)靜脈內(nèi)藥物。全世界大約2-4億人患慢性HCV感染，其中大約2-5百萬(wàn)人在美國(guó)。慢性HCV感染大約占總感染的80%，可持續(xù)終生，并且經(jīng)常導(dǎo)致發(fā)展成為肝硬化和肝癌。由于該病毒存在非常嚴(yán)重的抗原變異性，因而針對(duì)HCV的疫苗發(fā)展緩慢。即使當(dāng)疫苗可以獲得時(shí)，該疫苗也不能減輕全世界數(shù)百萬(wàn)慢性HCV攜帶者所面臨的問(wèn)題。盡管存在一些中和抗體，但是大多數(shù)HCV抗體對(duì)清除感染不起主要作用。但是，這些中和抗體傾向于是毒抹特異性的，并對(duì)新出現(xiàn)的毒才朱無(wú)效。目前，唯——種針對(duì)HCV誘發(fā)的肝病具有確證效果的治療為使用a-IFN的治療，但是這種方法僅取得有限的成功。即使是a-IFN治療的最佳臨床試驗(yàn)，也僅報(bào)告40-50%的慢性患者有響應(yīng)，并且當(dāng)治療停止之后，這些個(gè)體中的50%復(fù)發(fā)。還有證據(jù)顯示a-IFN治療對(duì)于一些HCV基因型的效果較差。目前，尚未研發(fā)出抗HCV感染的傳統(tǒng)藥物(除了a-IFN之外)。因此，需要改進(jìn)的用于治療和預(yù)防HCV感染的免疫治療。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種能夠與許多HCV分離林特異性結(jié)合、并抑制病毒感染細(xì)胞的能力的全人重組抗HCV單克隆抗體，從而解決了上述問(wèn)題。在一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)抗體在體外(例如在HCV假病毒中和試驗(yàn)中)中和(即抑制或阻斷)HCV的能力得到證實(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這通過(guò)抗體抑制受試者(例如動(dòng)物或人)的體內(nèi)HCV感染性的能力得到證實(shí)。本發(fā)明的人單克隆抗體可以有效地、實(shí)際上無(wú)限量地、以高度純化的形式制備。因此，該抗體適于預(yù)測(cè)、診斷和/或治療接觸過(guò)HCV的或懷疑接觸了HCV的個(gè)體。該抗體可以使用本領(lǐng)域已知的多種制備人抗體的技術(shù)來(lái)制備。例如，正如此處所列舉的，抗體可以在表達(dá)人免疫球蛋白基因片段的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生，例如在包含人Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。此外，抗體可以單獨(dú)給藥，或與例如抗HCV疫苗或其它抗體聯(lián)合給藥，以增加感染HCV的受試者(例如動(dòng)物和人)的存活率。因此，本發(fā)明具有一些優(yōu)勢(shì)，包括但不限于下述10一用于預(yù)測(cè)、診斷和/或治療受試者中的HCV的全人重組抗HCV抗體，例如預(yù)防或抑制受試者中HCV介導(dǎo)的發(fā)病或死亡；-一種組合物(例如藥物組合物)和/或一種試劑盒，包含可以單獨(dú)使用或與市售的治療HCV感染的疫苗聯(lián)合使用的一種或多種全人重組抗HCV抗體；以及-一種用于治療感染HCV的受試者的改進(jìn)的被動(dòng)免疫治療方法，其可以單獨(dú)使用，或者與主動(dòng)免疫治療(例如HCV疫苗)聯(lián)合使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與HCVE2蛋白質(zhì)的非構(gòu)象表位特異性結(jié)合。特定的抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與HCVE2蛋白質(zhì)的表位特異性結(jié)合。這樣的表位可以位于例如HCVE2蛋白質(zhì)的氨基酸1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-746之內(nèi)，或位于其任何間隔、部分或范圍之內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與位于大約氨基酸殘基412-464、412-423或413-420之間的表位特異性結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HCVE2蛋白質(zhì)的表位包含氨基酸殘基412-423。在另一個(gè)實(shí)施方案中，HCVE2蛋白質(zhì)的表位由氨基酸殘基412-423組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，HCVE2蛋白質(zhì)包含氨基酸殘基413、418和/或420。在其它實(shí)施方案中，人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的特征為與HCVE2蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的Kd小于大約10xl(T6M。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分與HCVE2蛋白質(zhì)(或其片段)特異性結(jié)合的KD為至少大約10x10—7M、至少大約10xl(T8M、至少大約10x10—9M、至少大約10x10—1GM、至少大約10xl(yHM、至少大約10x10"M或更有利的KD。在各種其它實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含與克隆83-128(SEQIDNO:1)、95-2(SEQIDNO:3)或073-1(SEQIDNO:5)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高程度相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含與克隆83-128(SEQIDNO:2)、95-2(SEQIDNO:4)或073-1(SEQIDNO:6)產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高程度相同的氨基酸序列。在另外其它的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)，該重《連可變區(qū)包含與克隆83-128(SEQIDNO:1)、95-2(SEQIDNO:3)或073-1(SEQIDNO:5)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高程度相同的氨基酸序列，該輕鏈可變區(qū)包含與克隆83-128(SEQIDNO:2)、95-2(SEQIDNO:4)或073-1(SEQIDNO:6)的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高程度相同的氨基酸序列。在其它某些實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與表位特異性結(jié)合，該表位與克隆83-128、95-2或073-1產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的表位相重疊，和/或與克隆83-128、95-2或073-1產(chǎn)生的抗體竟?fàn)幗Y(jié)合HCV或其部分?？贵w或其抗原結(jié)合部分的重鏈和輕鏈可變區(qū)通常包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。包括CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域。在特定的實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR與克隆83-128(SEQIDNOs:7-9)、95-2(SEQIDNOs:10-12)或073-1(SEQIDNO:13-15)產(chǎn)生的抗體的CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或更高程度地相同。在其它特定的實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)CDR與克隆83-128(SEQIDNOs:16-18)、95-2(SEQIDNOs:19-21)或073-1(SEQIDNO:22-24)產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)CDR至少80。/q、85%、90%、95%或99%或更高程度地相同。因此，本發(fā)明的特定的抗體或片段包含一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)與克隆83-128(SEQIDNOs:7-9)、95-2(SEQIDNOs:10-12)或073-1(SEQIDNO:13-15)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或更高程度相同的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),該輕鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)與克隆83-128(SEQIDNOs:16-18)、95-2(SEQIDNOs:19-21)或073-1(SEQIDNO:22-24)產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或更高程度相同的CDR?？贵w或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)還可以包含與克隆83-128(SEQIDNOs:7-9)、95-2(SEQIDNOs:10-12)或073-1(SEQIDNO:13-15)產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或更高程度相同的所有三個(gè)CDR，和/或與克隆83-128(SEQIDNOs:16-18)、95-2(SEQIDNOs:19-21)或073-1(SEQIDNO:22-24)產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或更高程度相同的所有三個(gè)CDR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)還可以包含一個(gè)或多個(gè)如SEQIDNOs:87-89所示的重鏈共有序列CDR和/或一個(gè)或多個(gè)如SEQIDNOs:90-92所示的輕鏈共有序列CDR。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分(a)包含一個(gè)由人VH3-33基因編碼或來(lái)自該基因(即，為該基因的產(chǎn)物)的重鏈可變區(qū)；和/或(b)包含一個(gè)由人VkL6基因編碼或來(lái)自該基因的輕《連可變區(qū)。本發(fā)明的人單克隆抗體包括全長(zhǎng)抗體，例如，包含效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域(例如Fc結(jié)構(gòu)域)的抗體，以及抗體部分或片^a,例如單^^連抗體和Fab片段?？贵w還可連接到多種治療劑(例如抗病毒劑或毒素)和/或標(biāo)記上。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含由雜交瘤克隆83-128、073-1、95-2、95-14、95-15、95-18、95-20、95-21、95-25、95-26、95-30、95-38、95-39、95-42、95-43、95-48、95-49、95-52、95-54、95-58、95-62及其組合產(chǎn)生的抗體的抗原結(jié)合部分的分離的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了包含與SEQIDNO:25、27或29至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高程度相同的抗體重鏈可變區(qū)編碼序列的分離的核酸。本發(fā)明還提供了包含與SEQIDNO:26、28或30至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高程度相同的抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列的分離的核酸。本發(fā)明還提供了包含單獨(dú)或組合的上述任何核酸(例如由一種或多種載體表達(dá))的表達(dá)載體，以及包含這樣的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。表達(dá)本發(fā)明的抗體的合適的宿主細(xì)胞包括多種真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如中國(guó)倉(cāng)鼠卯巢(CHO)細(xì)胞、NS0細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)力包或纟直物細(xì)月包。在另一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種此處所述的能夠與HCV特異性結(jié)合并抑制病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的組合物和試劑盒。該組合物或試劑盒還進(jìn)一步包含一種或多種能夠與HCV特異性結(jié)合的抗體(例如人單克隆或多克隆抗體)或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，多克隆抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與HCVE2蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該組合物或試劑盒包括(a)能夠與第一HCV分離抹特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體；和(b)能夠與第二HCV分離抹特異性結(jié)合的分離的人單克隆抗體。本發(fā)明還提供了治療受試者中HCV疾病的方法，包括以有效抑制HCV疾病(例如HCV介導(dǎo)的癥狀或發(fā)病)的量給予受試者此處所描述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(即特異性結(jié)合HCV的)。本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分(以及包含該抗體或其部分的組合物)可以經(jīng)多種合適的方式(例如靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SC)或肌肉內(nèi)(IM))對(duì)受試者給藥。抗體或其抗原結(jié)合部分可以單獨(dú)給藥，或與另一種治療劑(例如第二人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分)聯(lián)合給藥。在一個(gè)例子中，第二人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與不同于第一抗體所結(jié)合的分離林的第二HCV分離抹特異性結(jié)合。在另一個(gè)例子中，抗體與另一種藥劑(例如抗病毒劑)聯(lián)合給藥。在另一個(gè)例子中，抗體與多克隆y-球蛋白(例如人？球蛋白)聯(lián)合給藥。在另一個(gè)例子中，抗體在給予HCV疫苗之前、之后或同時(shí)給藥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備與HCV特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使用包含HCV(例如活的或滅活的病毒)的組合物來(lái)免疫具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，并從動(dòng)物中分離抗體、產(chǎn)生抗體的細(xì)胞或編碼抗體的核酸?？梢岳缤ㄟ^(guò)化學(xué)處理和/或凍干法來(lái)將14HCV滅活。該方法可進(jìn)一步包括評(píng)價(jià)抗體與HCV或HCVE2蛋白質(zhì)的結(jié)合。碼抗體的抗原結(jié)合區(qū)部分的核酸)來(lái)制備抗體或其抗原結(jié)合部分的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了包含上述核酸的雜交瘤或轉(zhuǎn)染瘤。本發(fā)明還提供了制備表達(dá)能夠與HCV特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤的方法，包括用含有HCV或HCVE2蛋白質(zhì)的組合物免疫具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物；從該動(dòng)物中分離脾細(xì)胞；由脾細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤；以及選擇產(chǎn)生能夠與HCV或其HCVE2蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的雜交瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含HCVE2蛋白質(zhì)的非構(gòu)象表位一氨基酸412-464、412-423或413-420的抗原。該抗原可用于產(chǎn)生、篩選或檢測(cè)抗HCVE2抗體的存在，或者可用作主動(dòng)免疫療法中的制劑，即作為疫苗。作為疫苗，該抗原可以單獨(dú)使用，或與適當(dāng)?shù)淖魟┗虬肟乖?lián)合使用(例如通過(guò)化學(xué)或基因方法混合或偶聯(lián))。偶聯(lián)物包含但不限于類(lèi)毒素、病毒樣顆粒(VLP)和蛋白質(zhì)載體，所有這些都設(shè)計(jì)用于提高針對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答。當(dāng)用于主動(dòng)免疫療法時(shí)，抗原還可與被動(dòng)免疫療法(例如，使用此處所述的任何抗HCVE2抗體)聯(lián)合使用。使用人單克隆抗體治療人具有一些優(yōu)勢(shì)。例如，該抗體比非人抗體在人體中可能具有更低的免疫原性。該治療還非常迅速，因?yàn)橐坏┛贵w到達(dá)感染部位并直接中和導(dǎo)致疾病的HCV時(shí)，HCV就會(huì)失活。而且，人抗體比非人抗體在人體中能夠更加有效地定位于適當(dāng)?shù)牟课弧４送?，該治療劑是?duì)HCV特異性的，并且是經(jīng)過(guò)重組和高度純化的，與傳統(tǒng)治療相比，能夠避免被外來(lái)試劑污染的可能性。根據(jù)下述具體實(shí)施方式和權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將是明顯的。圖1A和IB中的曲線(xiàn)圖顯示人抗體95-2(圖1A)和人抗體83-128(圖IB)與可溶性HCV基因型laE2-660(三角形)和可溶性HCV基因型lbE2-661(正方形)的結(jié)合。ELISA板用2嗎/ml抗原包被，使用2倍稀釋的抗體進(jìn)行探測(cè)。使用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人第二抗體和PNPP底物一全測(cè)結(jié)合的抗體。圖2A和2B中的曲線(xiàn)圖顯示在人抗體95-2、83-128和17C7(無(wú)關(guān)人mAb)的存在下，使用不同的HCV基因型假病毒對(duì)Hep3B細(xì)胞感染的中和。在室溫下，5倍稀釋的抗體與每種HCV假病毒溫育1小時(shí)。將病毒-抗體混合物添加到Hep3B細(xì)胞，然后在37°C溫育72小時(shí)。使用Brightglo螢光素酶分析來(lái)對(duì)感染定量，并在Victor3讀板器上讀取光輸出量。抗狂犬病的人抗體(17C7)作為陰性對(duì)照。圖3A和3B中的蛋白質(zhì)印跡顯示抗體與來(lái)自HCV基因型la和lb的純化的哺乳動(dòng)物表達(dá)的可溶性E2蛋白(E2-661)的結(jié)合，所述E2蛋白(E2-661)先進(jìn)行還原(圖3A)或非還原(圖3B)SDS-PAGE，然后再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用抗his標(biāo)簽的單克隆抗體(his)、83-128和95-2，使用與HRP偶聯(lián)的抗小鼠IgG(his)或抗人IgG(95-2和83-128)，并使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。可溶性E2的基因型在印跡上方標(biāo)出。用于檢測(cè)的第一抗體在印跡下方列出。以千道爾頓為單位的分子量標(biāo)記列于每組印跡的左側(cè)。圖4中的表顯示人抗體95-2和83-128對(duì)于表達(dá)為細(xì)菌融合蛋白的E2412-423表位的親和力。山羊抗人IgGFc與Biacore芯片通過(guò)酰胺偶聯(lián)。人抗體95-2和83-128在芯片上分別被捕獲，含E2412-423氨基酸的E2-G細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)以不同濃度流過(guò)芯片。用BIAevaluationTM軟件擬合曲線(xiàn)，并計(jì)算親和常數(shù)。圖5是HCV多蛋白的圖示，顯示哺乳動(dòng)物表達(dá)的El和E2蛋白質(zhì)的位置。El和E2多蛋白在頂部用一個(gè)長(zhǎng)的白色方框表示，方框上方標(biāo)注氨基酸編號(hào)?？缒そY(jié)構(gòu)域(TM)用淺灰色方框表示，E2的高變結(jié)構(gòu)域(HVR1)用深灰色方框表示。由工程構(gòu)建體表達(dá)的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)在下方以深灰色條棒表示。信號(hào)肽酶酶切位點(diǎn)用箭頭指示。每種蛋白質(zhì)16的名稱(chēng)之后為編碼的氨基酸(括號(hào)內(nèi))和表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸總數(shù)。圖6A和6B中的圖顯示哺乳動(dòng)物表達(dá)的C末端截短的E2的凝集素捕獲ELISA的結(jié)果。將含有哺乳動(dòng)物表達(dá)的含E2氨基酸(如圖7所示)的C末端截短E2融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在ELISA板上包被，使用2倍稀釋的人抗體95-2(圖6A)和83-128(圖6B)和小鼠六組氨酸標(biāo)簽抗體(his標(biāo)簽)進(jìn)行探測(cè)。使用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人抗體(95-2和83-128)或山羊抗小鼠抗體(his標(biāo)簽)和PNPP底物碎全測(cè)結(jié)合的抗體。圖7中的圖示顯示細(xì)菌表達(dá)的跨越E2的氨基端80個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。E2蛋白質(zhì)的前80個(gè)氨基酸在頂部用一個(gè)白色方框表示，方框上方標(biāo)注氨基酸編號(hào)。位于氨基端的27個(gè)氨基酸的高變區(qū)1(HVR1)用深灰色方框表示。由工程構(gòu)建體表達(dá)的蛋白質(zhì)用淺灰色條棒表示，名稱(chēng)示于條棒的左側(cè)，蛋白質(zhì)起始和終止的氨基酸編號(hào)列于條棒下方。圖8A、8B和8C中的曲線(xiàn)圖顯示人抗體95-2(圖8A)和83-128(圖8B)和小鼠六組氨酸標(biāo)簽抗體(his標(biāo)簽)(圖8C)與細(xì)菌表達(dá)的E2前80個(gè)氨基酸片段的結(jié)合。將細(xì)菌表達(dá)的含E2氨基酸的融合蛋白(如圖7所示)包被在ELISA板上，使用2倍稀釋的抗體進(jìn)行探測(cè)。使用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人抗體(95-2和83-128)或山羊抗小鼠抗體(his標(biāo)簽)和PNPP底物檢測(cè)結(jié)合的抗體。圖9A、9B和9C中的曲線(xiàn)圖顯示人抗體95-2(圖9A)和83-128(圖9B)和小鼠六組氨酸標(biāo)簽抗體(his標(biāo)簽)(圖9C)與細(xì)菌表達(dá)的含突變E2氨基酸412-423的融合蛋白的結(jié)合。將細(xì)菌表達(dá)的含E2氨基酸412-423且所示氨基酸突變?yōu)楸彼岬娜诤系鞍谆虿缓蛔兊娜诤系鞍?WT)包被在ELISA板上，使用2倍稀釋的抗體進(jìn)行探測(cè)。使用與石威性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人抗體(95-2和83-128)或山羊抗小鼠抗體(his標(biāo)簽)和PNPP底物檢測(cè)結(jié)合的抗體。圖10中的表顯示來(lái)自NIH支持的LosAlamosHCV序列數(shù)據(jù)庫(kù)的E2氨基酸412-423比對(duì)。氨基酸412-423的原型基因型la序列的單字母氨基酸編碼列于圖的頂部左邊(la)。任何與la序列相同的氨基酸表示為虛線(xiàn)，并列出不同于原型基因型la序列的任何位置處的氨基酸。這個(gè)12個(gè)氨基酸的序列在精簡(jiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)的次數(shù)在"計(jì)數(shù)"下列出，占總數(shù)的百分比在"百分比，，下列出。本發(fā)明的可溶性E2蛋白質(zhì)基因型la和lb的序列列于最上面的兩行中。圖11是顯示來(lái)自其它基因型的E2氨基酸412-423的表。對(duì)于包含相對(duì)于原型基因型la序列的改變(下劃線(xiàn)表示)的分離抹，列出了氨基酸412-423的單字母氨基酸編碼?；蛐兔Q(chēng)列于右側(cè)，后面的括號(hào)中是Genbank登錄號(hào)。圖12A、12B和12C中的曲線(xiàn)圖顯示人抗體95-2(圖12A)和83-128(圖12B)和小鼠六組氨酸標(biāo)簽抗體(his標(biāo)簽)(圖12C)與來(lái)自其它基因型的E2氨基酸412-423的結(jié)合。將細(xì)菌表達(dá)的包含E2氨基酸412-423和所示基因型的序列的融合蛋白包被在ELISA板上，并使用2倍稀釋的抗體纟笨測(cè)。使用與石成性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人抗體(95-2和83-128)或山羊抗小鼠抗體(his標(biāo)簽)和PNPP底物檢測(cè)結(jié)合的抗體。圖13顯示了密碼子優(yōu)化的El/E2laH77序列(SEQIDNO:27),包括添加的末端，添加的末端包含限制性酶切位點(diǎn)(用粗體小寫(xiě)表示)、優(yōu)化限制性?xún)?nèi)切酶切割的附加的突出端(用下劃線(xiàn)小寫(xiě)表示)、共有Kozak序列(由粗體下劃線(xiàn)小寫(xiě)表示)和ATG起始密碼子(由粗體下劃線(xiàn)大寫(xiě)表示)。圖14描述了來(lái)自克隆83-128(SEQIDNO:l)、95-2(SEQIDNO:3)、95-14(SEQIDNO:32)、95-38(SEQIDNO:33)、95-25(SEQIDNO:34)、95-42(SEQIDNO:35)、95-43(SEQIDNO:36)、95-49(SEQIDNO:37)、95-54(SEQIDNO:38)、95-58(SEQIDNO:39)和95-62(SEQIDNO:40)并且對(duì)E2-660HCV糖蛋白表位412-423具有反應(yīng)性的抗體的重鏈可變區(qū)的比對(duì)。圖15顯示了來(lái)自克隆83-128(SEQIDNO:2)、073-1(SEQIDNO:6)、95-2(SEQIDNO:4)、95-14(SEQIDNO:44)和95-38(SEQIDNO:53)的抗體的輕鏈可變區(qū)的比對(duì)。具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明更易理解，首先定義了一些術(shù)語(yǔ)。其他定義在整個(gè)詳細(xì)描述中說(shuō)明。定義術(shù)語(yǔ)"丙型肝炎病毒"、"HCV"、"非甲非乙型肝炎病毒"或"NANBH"在此可互換使用，包括病毒體的任何"基因型"或"亞基因型"(還被稱(chēng)為"亞型")或其部分(例如HCV基因型la的E2蛋白質(zhì)的一部分)，且是由丙型肝炎病毒RNA編碼的或由天然等位基因變異發(fā)生的。HCV包括5'-非翻i斧區(qū)，其后是編碼大約3010個(gè)氨基酸的可讀框(ORF)。ORF跨越核普酸堿基對(duì)342至8955,其后在3，端是另一個(gè)非翻譯區(qū)。從5，至3'將氨基酸再分為下述10個(gè)蛋白質(zhì)C;El;E2;NS1;NS2;NS3;NS4(a和b);和NS5(a和b)。這些蛋白質(zhì)是由宿主和病毒蛋白酶切割較大的多蛋白形成的。C、El和E2蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)蛋白，NS1-NS5為非結(jié)構(gòu)蛋白。C區(qū)編碼核心核殼體蛋白。El和E2為包裹病毒的糖基化包膜蛋白。NS2可以為鋅金屬蛋白酶。NS3為解旋酶。NS4a作為絲氨酸蛋白酶輔因子，參與NS4b和NS5b之間的切割。NS5a為絲氨酸磷蛋白，其功能未知。NS5b區(qū)既具有RNA依賴(lài)性RNA聚合酶活性又具有末端轉(zhuǎn)移酶活性。根據(jù)核心蛋白中的變異進(jìn)行分類(lèi)，大約存在6種截然不同的基因型(例如基因型1、2、3、4、5和6)，在每種基因型中有顯示進(jìn)一步變異的80種以上的亞基因型，其中的一些包括la、lb、lc、2a、2b、2c、3a、3b、4a、4b、4c、4d、4e、5a和6a。此處的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整的抗體及其任何抗原結(jié)合部分(即"抗原結(jié)合部分")或其單鏈。"抗體"是指包含通過(guò)二硫鍵鏈間連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(在此簡(jiǎn)稱(chēng)VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)枸域Ch1、Ch2和Ch3。每條輕鏈包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)(在19此簡(jiǎn)稱(chēng)VJ和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域C^。Vh和VL可以進(jìn)一步分為高變區(qū)，被稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中散布有更加保守的區(qū)域，被稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)。每個(gè)Vh和Vl由三個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成，從氨基端至羧基端的排列順序?yàn)镕R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結(jié)合。此處所使用的術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)稱(chēng)為"抗體部分")是指保留了與抗原(例如HCV)特異性結(jié)合的能力的一種或多種抗體片段。已經(jīng)證明抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段完成。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)包括的結(jié)合性片段的例子包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab，)2片段，一種包含在其鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的V^和Vh結(jié)枸域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，(1989)7V^w"341:544-546);和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或(vii)可以任選地由合成連接體連接的兩個(gè)或更多個(gè)分離的CDR的組合。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(Vl和VH)由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可通過(guò)重組方法使用合成連接體進(jìn)行連接，該合成連接體能夠?qū)⑵渲瞥梢粭l蛋白質(zhì)鏈，其中Vl和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(也被稱(chēng)為單鏈Fv(scFv);例如參見(jiàn)Bird等人(1988)Sd置e242,423-426;和Huston等人(1988)尸rac.A^/.Jcac丄L/iSJ85,5879-5883。這樣的單鏈抗體也包含在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分，，之內(nèi)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)獲得這些抗體片段，并以篩選完整抗體的相同方式來(lái)篩選片段的用途?？梢酝ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)完整免疫球蛋白的酶或化學(xué)切割來(lái)制備抗原結(jié)合部分。"雙特異性"或"雙功能性抗體"是包含兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)的人工雜合抗體?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法(包括雜交瘤的融合或Fab，片段的連接)來(lái)制備雙特異性抗體。例如參見(jiàn)Songsivilai&Lachmann，(1990)C""./mmtmo/.79,315-321;Kostelny等人(1992)//mww"o/.148，1547-1553(1992)。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是指對(duì)一個(gè)特定的表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力的抗體。因此，術(shù)語(yǔ)"人單克隆抗體，，是指顯示單一結(jié)合特異性并具有來(lái)自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體，該雜交瘤包含與無(wú)限增殖化細(xì)胞融合的從具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的B細(xì)胞。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"重組人抗體"包括通過(guò)重組方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤中分離的抗體，(b)從轉(zhuǎn)化后表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞(例如從轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體，(c)從重組、組合人抗體庫(kù)分離的抗體，和(d)使用涉及將人免疫球蛋白基因序列和其它DNA序列進(jìn)行剪接的任何其它方式制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離出的抗體。這樣的重組人抗體具有來(lái)自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是，在某些實(shí)施方案中，可以對(duì)這些重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或者當(dāng)使用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列盡管來(lái)自人種系VH和VL序列并與其相關(guān)，但是可能并非天然存在于體內(nèi)的人抗體種系所有組成成分(repertoire)中。術(shù)語(yǔ)"人抗體"包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在的話(huà))的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)(參見(jiàn)Lonberg,N.等人(1994)iVa似"368(6474):856-859;Lonberg,N.(1994)Z/aw必ooA:o/五x/en'me"to/尸/wr扁co/c^113:49-101;Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)/"femAev./mww"o/.Vol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.(1995)JcW.764:536-546)。但是，術(shù)語(yǔ)"人抗體"并不包括來(lái)自另一哺乳21動(dòng)物種(例如小鼠)種系的CDR序列已移植到人構(gòu)架序列上的抗體(例如人源化抗體)。此處所使用的"異種抗體"的定義與產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物體相關(guān)。該術(shù)語(yǔ)是指具有與在不包括轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的生物體中發(fā)現(xiàn)的并且通常來(lái)自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物以外的物種的序列相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列或編碼核酸序列的抗體。此處所使用的"分離的抗體"是指基本上不含其它具有不同的抗原特異性的抗體(例如，能夠與HCV特異性結(jié)合的分離的抗體基本上不含能夠與HCV以外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。此外，分離的抗體通?；旧弦膊缓衅渌募?xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，具有不同HCV特異性的"分離的"單克隆抗體的組合是在確定的組合物中進(jìn)行組合的。術(shù)語(yǔ)"表位"或"抗原決定簇"是指抗原上被免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的位點(diǎn)(例如HCV的El或E2，例如E2的氨基酸412-464)。表位可以由相鄰的氨基酸形成，或由不相鄰的氨基酸通過(guò)蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊并列形成。由相鄰的氨基酸形成的表位在接觸變性溶劑后通常仍會(huì)保留，而由三級(jí)折疊形成的表位在經(jīng)過(guò)變性溶劑處理以后通常喪失。一個(gè)表位通常在其獨(dú)特的空間構(gòu)型中包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸。確定表位空間構(gòu)型的方法包括本領(lǐng)域已知的技術(shù)和此處所描述的技術(shù)，例如，X射線(xiàn)結(jié)晶法和二維核磁共振。^列^口參見(jiàn)五p"o/^s1A/fl//7,"g^Votoco/sZ"M^/odyMo/ecw/ar5,o/ogy,Vol.66,G.E.Morris，Ed.(1996)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表位(或抗原決定簇)是一個(gè)線(xiàn)性表位，即使是一個(gè)較大的氨基酸片段(例如具有三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì))，也不會(huì)觀察到對(duì)表位/抗原決定簇的親和力的額外增力口。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"、"選擇性結(jié)合"、"選擇性地結(jié)合"和"特異性地結(jié)合"是指抗體與預(yù)先確定的抗原上的表位的結(jié)合。通常，當(dāng)使用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)、在BIACORE3000儀器中、使用重組HCV作為分析物以及使用抗體作為配體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，抗體結(jié)合的親和力(kd)大約小于10々m",例如大約小于1(T8m、1(T9m或1(T"M或甚至更低)；并且，抗體與預(yù)先確定的抗原結(jié)合的親和力至少為與預(yù)先確定的抗原或其密切相關(guān)的抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合的親和力的兩倍。此處所使用的用語(yǔ)"識(shí)別抗原的抗體"和"抗原特異性的抗體"與術(shù)語(yǔ)"與抗原特異性結(jié)合的抗體"可互換使用。本發(fā)明還包括與此處所述的人抗體結(jié)合相同的表位的抗體，即竟?fàn)幗Y(jié)合HCV的抗體。可以使用常規(guī)技術(shù)(例如免疫測(cè)定，比如通過(guò)顯示一種抗體阻斷另一種抗體與革巴抗原相結(jié)合的能力，即竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定)來(lái)鑒定識(shí)別相同表位的抗體。在其中測(cè)試的免疫球蛋白可以抑制參考抗體與共同抗原(例如HCV)的特異性結(jié)合的試驗(yàn)中確定竟?fàn)幮越Y(jié)合。已知多種類(lèi)型的竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定，例如固相直接或間接放射免疫測(cè)定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測(cè)定(EIA)、夾心竟?fàn)帨y(cè)定(參見(jiàn)Stahli等人，(1983)Me"c^^五w2";wo/ogy9:242)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見(jiàn)Kirkland等人//mmw"o/.137:3614(1986))、固相直接標(biāo)記測(cè)定、固相直接標(biāo)記夾心測(cè)定(參見(jiàn)Harlow和Lane,J"/Ao&w」Za6orato/jA/"ww"/，ColdSpringHarborPress(1988))、<吏用1-125才示i己的固相直接標(biāo)記RIA(參見(jiàn)Morel等人Mo/./畫(huà)畫(huà)/,25(1):7(1988))、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人Virology176:546(1990))和直接標(biāo)記RIA(Moldenhauer等人，Sc朋d//mww"o/.32:77(1990))。通常，這樣的測(cè)定涉及使用與固相表面或攜帶其中任一種的細(xì)胞相結(jié)合的純化的抗原、未標(biāo)記的測(cè)試免疫球蛋白和標(biāo)記的參考免疫球蛋白。通過(guò)確定在存在測(cè)試免疫球蛋白的情況下，與固相表面或細(xì)胞相結(jié)合的標(biāo)記的量來(lái)測(cè)定竟?fàn)幮砸种?。測(cè)試免疫球蛋白通常過(guò)量。通常，當(dāng)竟?fàn)幮钥贵w過(guò)量時(shí)，其會(huì)抑制參考抗體與共同抗原的特異性結(jié)合至少達(dá)50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"Kd，，是指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通常，當(dāng)使用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)、在BIACORE3000儀器中、使用重組人HCV作為分析物以及使用抗體作為配體進(jìn)行測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的人抗體與HCV相結(jié)合的解離平衡常數(shù)(Ko)小于大約l(T7M,例如小于大約10—SM、10—QM或10^M或甚至更小。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"Koff"是指抗體從抗體/抗原復(fù)合物上解離的解離速率常數(shù)。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"EC50"是指在體外或體內(nèi)分析中，能夠誘導(dǎo)為最大響應(yīng)的50%(即最大響應(yīng)與基線(xiàn)之間的中間值)的響應(yīng)的抗體或其抗原結(jié)合部分的濃度。此處所使用的"同種型"是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類(lèi)型(例如IgM或IgGl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體為IgGl同種型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體為IgG2同種型。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"中和HCV"、"抑制HCV"和"阻斷HCV"可互換使用，是指本發(fā)明的抗體防止HCV感染特定細(xì)胞的能力。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"非構(gòu)象表位"是指通常包含連續(xù)氨基酸序列的線(xiàn)性表位，該氨基酸序列足以結(jié)合能夠與這種表位相結(jié)合的抗體。這與構(gòu)象表位相反，構(gòu)象表位需要不連續(xù)的氨基酸序列形成三維結(jié)構(gòu)，以發(fā)生表位與抗體間的結(jié)合。線(xiàn)性表位與構(gòu)象表位的不同還在于，在變性條件下(例如在此處所描述的免疫印跡分析中)，線(xiàn)性表位仍然能夠被識(shí)別該表位的抗體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了線(xiàn)性的，例如非構(gòu)象的HCVE2表位，例如包含殘基412-423或由殘基412-423組成。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與這樣的線(xiàn)性表位特異性結(jié)合，而不與構(gòu)象表位特異性結(jié)合。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了這樣的線(xiàn)性表位，其適用于疫苗研發(fā)、針對(duì)該表位的抗體的產(chǎn)生和/或單獨(dú)用于主動(dòng)免疫治療中或與被動(dòng)免疫治療聯(lián)合使用。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"同種型轉(zhuǎn)換"是指抗體的類(lèi)型或同種型從一種Ig類(lèi)型變?yōu)榱硪环NIg類(lèi)型的現(xiàn)象。此處所使用的"非轉(zhuǎn)換型同種型"是指當(dāng)不發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時(shí)產(chǎn)生的重鏈同種型類(lèi)型；編碼非轉(zhuǎn)換型同種型的CH基因通常為緊接著功能性重排VDJ基因的下游的第一個(gè)CH基因。同種型轉(zhuǎn)換-故分為典型的或非典型的同種型轉(zhuǎn)換。典型的同種型轉(zhuǎn)換通過(guò)涉及轉(zhuǎn)基因中至少一個(gè)轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組事件發(fā)生。非典型的同種型轉(zhuǎn)換可以通過(guò)例如人(j,和人;之間的同源重組(5-相關(guān)的缺失)發(fā)生。另外的非典型轉(zhuǎn)換機(jī)制，例如轉(zhuǎn)基因間的和/或染色體間的重組，也可以發(fā)生并完成同種型轉(zhuǎn)換。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)換序列"是指引起轉(zhuǎn)換重組的那些DNA序列。"轉(zhuǎn)換供體"序列，典型地為ia轉(zhuǎn)換區(qū)，位于在轉(zhuǎn)換重組過(guò)程中將被刪除的構(gòu)建體區(qū)的5，側(cè)(即下游)。"轉(zhuǎn)換受體"區(qū)在將要?jiǎng)h除的構(gòu)建體區(qū)和替換恒定區(qū)(例如Y、s等)之間。由于沒(méi)有總是發(fā)生重組的特定的位點(diǎn)，因此最終的基因序列通常不能根據(jù)構(gòu)建體來(lái)預(yù)測(cè)。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"糖基化模式"被定義為與蛋白質(zhì)(更特別地與免疫球蛋白蛋白質(zhì))共價(jià)連接的碳水化合物單元的模式。異種抗體的糖基化模式可以表征為基本類(lèi)似于在由非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種產(chǎn)生的抗體上天然存在的糖基化模式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到與轉(zhuǎn)基因Ch基因所來(lái)源的物種相比，異種抗體的糖基化模式更加類(lèi)似于非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種中的所述糖基化模式。此處所使用的用于某一物體的術(shù)語(yǔ)"天然存在"是指某一物體可以在自然界中發(fā)現(xiàn)的事實(shí)。例如，可以從自然來(lái)源中分離出來(lái)并且沒(méi)有在實(shí)驗(yàn)室中人工有意修飾的存在于生物體(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"重排"是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中，在編碼基本完整的Vh或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型中，V區(qū)段分別緊挨著D-J或J區(qū)段。重排的免疫球蛋白基因座可以通過(guò)與種系DNA進(jìn)行比較而鑒定；重排的基因座將會(huì)具有至少一個(gè)重新組合的七聚體/九聚體同源元件。此處所使用的用于V區(qū)段的術(shù)語(yǔ)"未重排的"或"種系構(gòu)型"是指V區(qū)段未經(jīng)重新組合、因此直接挨著D或J區(qū)段的構(gòu)型。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"核酸分子"意于包括DNA分子和RNA分子。核苷酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選為雙鏈DNA。此處所使用的用于編碼能夠與HCV相結(jié)合的抗體或抗體部分(例如Vh、V。CDR3)的核酸的術(shù)語(yǔ)"分離的核酸分子"是指這樣一種核酸分子其中編碼該抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼能夠與HCV之外的抗原相結(jié)合的抗體的其它核苷酸序列，而在人基因組DNA中，其它序列可能天然位于該核酸的側(cè)翼。本發(fā)明還包括本發(fā)明的SEQIDNOs中所示的序列的"保守序列修飾"，即不會(huì)破壞由該核苷酸序列編碼的或包含該氨基酸序列的抗體與抗原的結(jié)合的核苷酸和氨基酸序列修飾。這樣的保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸的置換、添加和缺失。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)引入修飾，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。保守氨基酸置換包括將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)明確。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有p-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，人抗HCV抗體中預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地用來(lái)自同一側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基代替。確定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守置換的方法是本領(lǐng)域公知的(例如參見(jiàn)B讓mell等人飾W亂32:1180-1187(1993);Kobayashi等人"(10):879-884(1999);和Burks等人尸roc.A^/.爿cadSd.園94:412-417(1997))?；蛘?，在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以沿著整個(gè)或部分抗HCV抗體編碼序列隨機(jī)引入突變(例如通過(guò)飽和誘變)，得到的修飾的抗HCV抗體可以根據(jù)結(jié)合活性進(jìn)行篩選。"共有序列"是由相關(guān)序列家族中最常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)開(kāi)》成的序歹寸(例長(zhǎng)口參見(jiàn)Winnaker，F(xiàn)romGenestoClones(Verlagsgesellschaft,WeinheimGermany1987)。在蛋白質(zhì)家族中，共有序列中的每一個(gè)位置都被該家族中在該位置最常出現(xiàn)的氨基酸占據(jù)。如果兩種氨基酸出現(xiàn)的頻率相同，則每一種都可以包含在該共有序列中。免疫球蛋白的"共有構(gòu)架"是指在共有免疫球蛋白序列中的構(gòu)架區(qū)。如圖14所示，在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR的共有序列通過(guò)E2-660HCV糖蛋白表位412-423反應(yīng)性抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列的最佳比對(duì)得到。例如，來(lái)自克隆83-128(SEQIDN0:1)、95-2(SEQIDNO:3)、95-14(SEQIDNO:32)、95-38(SEQIDNO:33)、95-25(SEQIDNO:34)、95-42(SEQIDNO:35)、95-43(SEQIDNO:36)、95-49(SEQIDNO:37)、95-54(SEQIDNO:38)、95-58(SEQIDNO:39)和95-62(SEQIDNO:40)的抗體經(jīng)過(guò)最佳比對(duì)，獲得CDR1、CDR2和CDR3的共有序列。因此，發(fā)現(xiàn)重鏈可變區(qū)CDR1的共有序列為SEQIDNO:87所示的"1YGMH"，其中，"r代表小極性氨基酸殘基。發(fā)現(xiàn)重鏈可變區(qū)CDR2的共有序列為SEQIDNO:88所示的"VIWXDX7NXYYADS1516G"，其中，"X"可以為任意氨基酸殘基，"7"代表小極性氨基酸殘基，"15"代表疏水性氨基酸殘基以及"16"代表極性和帶正電荷的氨基酸殘基。發(fā)現(xiàn)重鏈可變區(qū)CDR3的共有序列為SEQIDNO:89所示的"ARDI567XR10X12IYFD17"，其中，"X"代表任意氨基酸殘基，"5"代表苯丙氨酸或無(wú)氨基酸，"6"代表絲氨酸或蘇氨酸，"7"和"12"代表疏水性氨基酸殘基，"10"代表小分子殘基以及"17"代表芳香族氨基酸殘基。同樣地，如圖15所示，輕鏈可變區(qū)CDR的共有序列可以通過(guò)E2-660HCV糖蛋白表位412-423反應(yīng)性抗體的氨基酸序列的最佳比對(duì)得到。例如，來(lái)自克隆83-128(SEQIDNO:2)、073-1(SEQIDNO:6)、95-2(SEQIDNO:4)、95-14(SEQIDNO:44)和95-38(SEQIDNO:53)的抗體的輕鏈可變區(qū)氨基S吏序列進(jìn)行最佳比對(duì)，獲得輕鏈可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的共有序列。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)CDR1的共有序列為SEQIDNO:90所示的"RASQSVXSYLA",其中，"X"可以是任意氨基酸殘基。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)CDR2的共有序列為SEQIDNO:91所示的"DASNRAT"。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)CDR3的共有序列為SEQIDNO:92所示的"QQRSNW7T",其中，"7"代表小疏水性氨基酸殘基。27對(duì)于核酸而言，術(shù)語(yǔ)"基本同源性"是指當(dāng)進(jìn)行最佳比對(duì)或進(jìn)行比較時(shí)，兩個(gè)核酸或其指定序列的至少大約80%的核普酸，通常至少大約90%至95%、更優(yōu)選至少大約98%至99.5%的核苷酸是相同的，具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔А；蛘?，?dāng)在選擇性雜交條件下區(qū)段能夠與該鏈的互補(bǔ)鏈雜交時(shí)，也存在基本同源性。兩個(gè)序列之間的百分同一性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％同源性-相同的位置數(shù)/總位置數(shù)x100),考慮為了最佳比對(duì)兩個(gè)序列而需要引入的空位的數(shù)目和每個(gè)空位的長(zhǎng)度。序列的比較和兩個(gè)序列間百分同一性的確定可以使用如以下非限定性實(shí)例中所述的數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。使用GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重，可以確定兩個(gè)核苷酸序列間的百分同一性。兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的和W.Miller(CABIOS，4:11-17(1989))的算法、使用PAM120殘基權(quán)重表、12的空位長(zhǎng)度罰分和4的空位罰分來(lái)確定。此外，兩個(gè)氨基酸序列之間的百分同一性也可以使用已經(jīng)引入到GCG軟件包中的GAP程序內(nèi)的Needleman和WunschMo/.說(shuō)W.(48):444-453(1970))的算法、使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣、16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重以及l(fā)、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來(lái)確定。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可以進(jìn)一步用作"查詢(xún)序列"，用來(lái)進(jìn)行公共數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，例如用于確定相關(guān)序列。這樣的檢索可以使用Altschul,等人(1990)/Mo/.歷o/.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)進(jìn)行。BLAST核苷酸檢索可以使用NBALST程序、得分=100、字長(zhǎng)=12進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以使用XBLAST程序、得分=50、字長(zhǎng)=3進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了比較的目的而獲得空位比對(duì)，可以使用如Altschul等人(1997)M/c/eZc25(17):3389-3402中描述的缺口BLAST。當(dāng)使用BLAST和缺口BLAST程序時(shí)，可以使用每個(gè)程序(例如XBLAST和NBLAST)的參數(shù)。核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱色譜法、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域公知的技術(shù))從其它細(xì)胞組分或其它污染物(例如其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))中純化出來(lái)時(shí)，核酸為"分離的"或"基本上純的，，。參見(jiàn)F.Ausubel,等人，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。盡管本發(fā)明的核酸組成通常為天然序列(除了修飾的限制性位點(diǎn)等)，但是來(lái)自cDNA、基因組或其混合物的本發(fā)明的核酸組成可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變以提供基因序列。對(duì)于編碼序列而言，這些突變可以根據(jù)需要影響氨基酸序列。特別地，可以想到與天然的V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換和其它此處所描迷的這樣的序列基本同源或源自它們的DNA序列(在此，"源自"表示一個(gè)序列與另一序列相同或由該另一序列修飾得到)。當(dāng)一個(gè)核酸^^殳置為與另一個(gè)核酸序列具有功能性的關(guān)系時(shí)，該核酸是"可操作地連接的"。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則與該序列可梯:作地連接。對(duì)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列而言，可操作地連接是指連接的DNA序列是相鄰的，并且當(dāng)需要連接兩個(gè)蛋/白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，它們是相鄰的并且在閱讀框中。對(duì)于轉(zhuǎn)換序列而言，可操作地連接是指該序列能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)換重組。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一個(gè)與其連接的核酸的核酸分子。載體的一種類(lèi)型為"質(zhì)粒"，是另外的DNA片段可以連接到其中的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。另一種載體類(lèi)型是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它的載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合入宿主細(xì)胞的基因組中，從而與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠引導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這些載體在此被稱(chēng)為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)稱(chēng)"表達(dá)載體")。一般而言，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明也包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們都行使等同的功能。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"(或簡(jiǎn)稱(chēng)"宿主細(xì)胞")是指已引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語(yǔ)不僅指特定的所述細(xì)胞，還包括這些細(xì)胞的后代。由于突變或環(huán)境影響，在后代中可能會(huì)出現(xiàn)某些修飾，因而事實(shí)上，這些后代可能與母細(xì)胞不同，但是它們?nèi)匀话ㄔ诖颂幩褂玫男g(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"治療"是指此處所描述的治療性或預(yù)防性措施。"治療"方法包括給予需要這種治療的受試者(例如，患有HCV介導(dǎo)的疾病的受試者或最終可能患上這種疾病的受試者)本發(fā)明的人抗體，以預(yù)防、治療、延遲、降低嚴(yán)重程度或改善該疾病或復(fù)發(fā)疾病的一種或多種癥狀，或延長(zhǎng)受試者的存活時(shí)間至超出不接受這種治療時(shí)預(yù)期的存活時(shí)間。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"HCV介導(dǎo)的疾病"包括與HCV感染相關(guān)的疾病狀態(tài)和/或癥狀。一般而言，術(shù)語(yǔ)"HCV介導(dǎo)的疾病"是指其癥狀的發(fā)作、進(jìn)展或持續(xù)需要HCV參與的任何疾病。示例性的HCV介導(dǎo)的疾病包括^(旦不限于例如硬化和肝癌。術(shù)語(yǔ)"有效劑量"被定義為足以實(shí)現(xiàn)或至少部分實(shí)現(xiàn)所需效果的量。術(shù)語(yǔ)"治療有效劑量，，被定義為足以治愈或至少部分阻止已經(jīng)患有疾病的患者中的該疾病及其并發(fā)癥的量。此處使用的有效的量將取決于所治療的疾病的嚴(yán)重程度以及患者本身免疫系統(tǒng)的總體狀況。術(shù)語(yǔ)"患者"包括接受預(yù)防性或治療性處理的人和其它哺乳動(dòng)物受試者。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"受試者"包括任何人或非人類(lèi)動(dòng)物。例如，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療患有炎性疾病(例如關(guān)節(jié)炎，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的受試者。術(shù)語(yǔ)"非人類(lèi)動(dòng)物，，包括所有脊推動(dòng)物，例如30哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。除非另外定義，此處所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所通常理解的具有相同的含義。盡管與此處所描述的相似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，下文還是對(duì)合適的方法和材料進(jìn)行了描述。在出現(xiàn)沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例只是說(shuō)明性的而不是限制本發(fā)明。本發(fā)明的各個(gè)方面將會(huì)在下面的部分中進(jìn)一步詳細(xì)描述。概述HCV在人體中會(huì)導(dǎo)致致命性的肝細(xì)胞病變。此處提供了用于治療和預(yù)防HCV感染的動(dòng)物，特別是人受試者的方法和組合物。該組合物包含識(shí)別HCVE2蛋白質(zhì)的抗體或其部分。特別地，提供了重組完全人單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，這些人單克隆抗體是由表達(dá)人免疫球蛋白基因片段的小鼠產(chǎn)生的(以下描述)。還提供了抗HCV抗體的組合。新方法包括給予受試者能夠與HCV相結(jié)合的抗體(及其抗原結(jié)合部分)，以抑制受試者的HCV介導(dǎo)的疾病。例如，此處所描述的人單克隆抗HCV抗體可以中和HCV，并抑制HCV感染及其后遺癥，例如肝硬化和/或肝癌。在另一些例子中，可以給予抗HCV抗體(例如抗HCVE2蛋白質(zhì)單克隆抗體)的組合來(lái)抑制HCV介導(dǎo)的疾病。人單克隆抗體可以單獨(dú)給予，或與其它治療聯(lián)合給予。I.HCV人抗體的產(chǎn)生本發(fā)明包括能夠與HCV例如人HCV相結(jié)合的完全人抗體。示例性的能夠與HCV相結(jié)合的人單克隆抗體包括83-128、95-2、95-14、5-38和073-1。可以4吏用多種已知才支術(shù)(例如Kohler和Milstein，Atow"256:495(1975)中描述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù))來(lái)制備本發(fā)明的人單克隆抗體。盡管體細(xì)胞雜交方法是優(yōu)選的，但原則上還可以使用其它單克隆抗體制備技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致瘤轉(zhuǎn)化、使用人抗體基因庫(kù)的噬菌體展示技術(shù)。用于制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選動(dòng)物系統(tǒng)為鼠系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是本領(lǐng)域公知的，包括免疫方案以及用于分離和融合免疫的脾細(xì)胞的技術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用攜帶人免疫系統(tǒng)部分而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)產(chǎn)生針對(duì)HCV的人單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用轉(zhuǎn)基因小鼠，在此稱(chēng)為"HuMAb小鼠"，其包含編碼未重排的人重鏈(p和y)和k輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使內(nèi)源性p和k鏈基因座失活的靶突變(Lonberg,N.等人(1994)胸騰68(6474):856-859)。因此，小鼠顯示小鼠IgM或k的表達(dá)降低，并且響應(yīng)于免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類(lèi)別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變，以產(chǎn)生高親和力的人IgGK單克隆抗體(Lonberg,N,等人(1994),同上；綜述于Lonberg,N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93，和Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y,AcadSci764:536-546)。HuMAb小鼠的制備詳細(xì)描述于以下第II部分以及Taylor,L.等人(1992)M/由'c^c油W，"20:6287-6295;Chen，J.等人(1993)Mmza"ow"http://m畫(huà)wo/ogy5:647-656;Tuaillon等人(1993)尸roc.AW/.90:3720-3724;Choi等人(1993)iVa似re4:117-123;Chen,J.等人(1993)￡MS(9/12:821-830;Tuaillon等人(1994)/畫(huà)畫(huà)/.152:2912-2920;Lonberg等人，(1994)胸,368(6474):856-859;Lonberg,N.(1994)腸必ooAo/五x戶(hù)'me虛/尸/wr扁co/ogy113:49-101;Taylor,L.等人(1994)/"tema"o"a//wwzwwo/ogy6:579-591;Lonberg,N.和Huszar，D.(1995)/",，.iev./w羅wo/.Vol.13:65-93;Harding,F.和Lonberg，N.(1995)厄?yàn)閐764:536-546;Fishwild,D.等人(1996)A^w"歷ofec/mo/ogy14:845-851中。進(jìn)一步參見(jiàn)Lonberg、Kay和GenPharmInternational的美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5，874，299;和5,770,429;Surani等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,545,807;于1998年6月11日公布的國(guó)際公布Nos.WO98/24884;于1994年11月IO公布的WO94/25585;于1993年6月24日公布的WO93/1227;于1992年12月23日公布的WO92/22645;于1992年3月19日公布的WO92/03918。^瘦為了產(chǎn)生抗HCV的完全人單克隆抗體，包含人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(例如HCo12，HCo7)可以使用純化的或富集的HCV抗原制劑和/或表達(dá)HCV的細(xì)胞進(jìn)行免疫，例如，如Lonberg等人(1994)iVa/wre368(6474):856-859;Fishwild等人(1996)iVart^e說(shuō)'c^c/mo/ogy14:845-851和WO98/24884所述。如此處所述，使用重組HCV蛋白質(zhì)或表達(dá)HCV的細(xì)胞系作為免疫原來(lái)免疫HuMAb小鼠?；蛘?，可以使用編碼HCV的DNA來(lái)免疫小鼠。優(yōu)選地，小鼠在第一次輸注時(shí)為6-16周齡。例如，可以用純化的或富集的重組HCV抗原制劑(10-100(ig)經(jīng)腹膜內(nèi)免疫HuMAb小鼠。當(dāng)使用純化的或富集的HCV抗原制劑免疫不產(chǎn)生抗體時(shí)，小鼠還可以使用表達(dá)HCV蛋白質(zhì)的細(xì)胞(例如細(xì)胞系)進(jìn)行免疫，以促進(jìn)免疫應(yīng)答。示例性的細(xì)胞系包括過(guò)量表達(dá)HCV的穩(wěn)定的CHO和Raji細(xì)月包系。積累的使用不同抗原的經(jīng)驗(yàn)顯示，當(dāng)HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠最初用弗氏完全佐劑中的抗原經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)或皮下(SC)免疫、然后再每隔一周用弗氏不完全佐劑中的抗原IP/SC免疫(最多總共IO次)時(shí)，HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)答最佳?？梢允褂猛ㄟ^(guò)眶后取血獲得的血漿樣品在免疫方案過(guò)程中監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答?？梢允褂肊LISA篩選血漿(如下所述)，具有足夠的抗HCV人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠可用于融合?？梢杂每乖o脈內(nèi)加強(qiáng)免疫小鼠，三天后殺死小鼠，并取出脾臟。jf麥及^/厚聯(lián)務(wù)本發(fā)明還提供了HCVE2包膜糖蛋白的保守性非構(gòu)象表位，例如，HCVE2蛋白質(zhì)的氨基酸412-464、412-423或413-420,其用于對(duì)抗HCV33感染的主動(dòng)免疫。該表位可以單獨(dú)使用或可以經(jīng)過(guò)修飾，例如，以才是高對(duì)該表位的免疫應(yīng)答?？梢允褂枚喾N周知的并且容易獲得的交聯(lián)劑來(lái)制備化學(xué)構(gòu)建的抗原偶聯(lián)物。這些交聯(lián)劑可以是與選擇的抗原上不同的反應(yīng)性氨基酸或石友水化合物側(cè)鏈形成共價(jià)鍵的同源功能或異源功能化合物，例如SPDP、SATA、SMCC、DTNB。載體可以選自O(shè)MPC(腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisserianieningitidis)的外膜蛋白復(fù)合物)、BSA(牛血清白蛋白)、OVA(卵白蛋白)、THY(牛曱狀腺球蛋白)、KLH(匙孔賊血藍(lán)蛋白)和TT(破傷風(fēng)類(lèi)毒素蛋白)。其它具有自組裝成病毒樣顆粒(VLP)的能力的載體包括乙型肝炎病毒的HbSAg(表面抗原蛋白)和HBcAg(核心抗原蛋白)、4侖狀病毒衣殼蛋白、人乳頭瘤病毒Ll蛋白、戊型肝炎病毒顆粒、多瘤病毒蛋白和牛乳頭瘤病毒結(jié)構(gòu)蛋白(參見(jiàn)/o/P/wr.5We"c^95:70-79(2005))。偶聯(lián)可以通過(guò)遺傳或化學(xué)方法完成，例如^f吏用馬來(lái)酰亞胺/碌u醇偶合、溴乙酰胺/硫醇偶合和組氨酸選擇性交聯(lián)中的一種或多種。偶聯(lián)可以通過(guò)使用選自磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(sSMCC)、N-馬來(lái)酰亞胺苯?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、戊二醛、1-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)、雙-重氮聯(lián)苯胺(BDB)、N-乙酰基高半胱氨酸硫代內(nèi)酯(NAHT)以及N-[s-馬來(lái)酰亞胺己酰氧基]磺基琥珀酰亞胺酯(sEMCS)中的一種或多種的交聯(lián)劑完成。戎//CT乂卓乂發(fā)戎沐^染W(wǎng)浙務(wù)為了制備產(chǎn)生抗HCV人單克隆抗體的雜交瘤，可以分離來(lái)自免疫小鼠的脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞，并與適當(dāng)?shù)臒o(wú)限增殖化細(xì)胞系(例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系)相融合。然后，可以針對(duì)抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選產(chǎn)生的雜交瘤。例如，可以用50%PEG(w/v)使來(lái)自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液與SP2/0-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)融合?？梢詫⒓?xì)胞以大約1x105個(gè)細(xì)胞的密度接種在平底微量滴定板上，然后在除了普通試劑外還含有10%胎克隆血清和1XHAT(Sigma)的選擇性培養(yǎng)基中溫育2周。大約兩周之后，細(xì)胞在使用HT代替HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后可以通過(guò)ELISA針對(duì)人抗HCV單克隆IgM和IgG抗體，或者通過(guò)FLISA(熒光連接的免疫吸附測(cè)定)針對(duì)與表達(dá)HCV蛋白質(zhì)的細(xì)胞(例如表達(dá)HCV的CHO細(xì)胞系)表面的結(jié)合，篩選每個(gè)孔。一旦出現(xiàn)廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，通?？梢栽?0-14天后觀察培養(yǎng)基。可以再接種分泌抗體的雜交瘤，再度篩選，如果仍然為人IgG陽(yáng)性，抗HCV單克隆抗體可以通過(guò)有限稀釋亞克隆至少兩次。然后穩(wěn)定的亞克隆可以在體外培養(yǎng)，以在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗體用于表征。戎i7CT乂#義^戎雄翔務(wù)還可以使用例如本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(Morrison,S.(1985)6We"ce229:1202)，在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)基因(例如人抗體基因)可以連接到一個(gè)表達(dá)載體中，例如真核表達(dá)質(zhì)粒，例如WO87/04462、WO89/01036和EP338841中7>開(kāi)的GS基因表達(dá)系統(tǒng)或本領(lǐng)域爿^知的其它表達(dá)系統(tǒng)中使用的真核表達(dá)質(zhì)粒。包含克隆抗體基因的純化的質(zhì)?？梢砸氲秸婧怂拗骷?xì)胞中，例如CHO細(xì)胞或NSO細(xì)胞或其它真核細(xì)胞，例如植物來(lái)源的細(xì)胞、真菌或酵母細(xì)胞。用于引入這些基因的方法可以為本領(lǐng)域中描述的方法，例如電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(lipofectine)、lipofectamine或其它技術(shù)。向宿主細(xì)胞中引入這些抗體基因之后，可以鑒別并選擇表達(dá)該抗體的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表了隨后可為其表達(dá)水平而擴(kuò)增以及為生產(chǎn)抗體而放大規(guī)模的轉(zhuǎn)染瘤?？梢詮倪@些培養(yǎng)上清液和/細(xì)胞中分離和純化重組抗體。或者，這些克隆的抗體基因可以在其它表達(dá)系統(tǒng)(例如大腸桿菌或完整的生物體)中進(jìn)行表達(dá)，或者也可以合成表達(dá)。炎^舉為V/e雄,/i/^id:^:奎在雄抗體主要是通過(guò)位于6個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。因此，抗體個(gè)體間的CDR內(nèi)氨基酸序列比CDR之外的序列更加多樣化。由于CDR序列負(fù)責(zé)大部分的抗體-抗原相互作用，有可能通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體來(lái)表達(dá)模擬天然存在的特定抗體的性質(zhì)的重組抗體，該表達(dá)載體包含移植到來(lái)自具有不同性質(zhì)的不同抗體的構(gòu)架序列上的來(lái)自天然存在的特定抗體的CDR序歹ij(例如參見(jiàn)Riechmann,L.等人，1998,Mm^e332:323-327;Jones,P.等人，1986,7V^w"321:522-525;和Queen,C等人，1989,7V^/.爿owfC/.&A86:10029-10033)。這些構(gòu)架序列可以從包含種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。這些種系序列與成熟的抗體基因序列是不同的，因?yàn)樗鼈儾话ㄔ贐細(xì)胞成熟過(guò)程中通過(guò)V(D)J連接形成的完全裝配的可變基因。種系基因序列也不同于整個(gè)可變區(qū)均勻分布的高親和力第二全套抗體(repertoireantibody)的序列。例如，在構(gòu)架區(qū)1的氨基末端部分和構(gòu)架區(qū)4的羧基末端部分，體細(xì)胞突變的頻率相對(duì)較低。此外，許多體細(xì)胞突變并不會(huì)顯著改變抗體的結(jié)合性質(zhì)。因此，并不需要得到特定抗體的完整DNA序列，來(lái)重新產(chǎn)生具有與原抗體相似的結(jié)合性質(zhì)的完整重組抗體(參見(jiàn)1999年3月12日提交的PCT/US99/05535)?？缭紺DR區(qū)域的部分重鏈和輕鏈序列通常足以用于此目的。部分序列用于確定哪些種系可變和連接基因區(qū)段用于重組的抗體可變基因。然后，種系序列用于填補(bǔ)可變區(qū)的缺失部分。重鏈和輕鏈前導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)成熟過(guò)程中被切割，不會(huì)影響最終抗體的性質(zhì)。為了添加缺失的序列，可以通過(guò)連接或PCR擴(kuò)增將克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸組合?；蛘撸麄€(gè)可變區(qū)也可以合成為一組短的、重疊的寡核苷酸，并使PCR擴(kuò)增組合，以產(chǎn)生完全合成的可變區(qū)克隆。該方法具有某些優(yōu)勢(shì)，例如去除或包含特定的限制性位點(diǎn)，或者特定密碼子的優(yōu)化。利用來(lái)自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列設(shè)計(jì)一組重疊的合成寡核苷酸，以產(chǎn)生與天然序列具有相同的氨基酸編碼能力的合成V序列。合成重鏈和K鏈序列與天然序列具有三方面區(qū)別重復(fù)核苷酸堿基鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)的，這有利于寡核苷酸合成以及PCR擴(kuò)增；根據(jù)Kozak原貝'J(Kozak，1991,/CAem,266:19867-19870)引入了最佳翻譯起始位點(diǎn)；以及，HindIII位點(diǎn)構(gòu)建在翻譯起始位點(diǎn)的上游。對(duì)于重鏈和輕鏈可變區(qū)，優(yōu)化的編碼鏈序列和相應(yīng)的非編碼鏈序列被斷裂成30-50個(gè)核苷酸的寡核苷酸，起始于相應(yīng)的非編碼寡核苷酸的大約中點(diǎn)的位置。因此，對(duì)于每條鏈而言，寡核苷酸可以組裝為跨越150-400個(gè)核苷酸的區(qū)段的重疊的雙鏈組。然后使用這些庫(kù)作為模板來(lái)產(chǎn)生150-400個(gè)核苦酸的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通常，一個(gè)可變區(qū)寡核苷酸組將斷裂為兩個(gè)庫(kù)，將這個(gè)兩庫(kù)分別進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生兩個(gè)重疊的PCR產(chǎn)物。然后通過(guò)PCR擴(kuò)增組合這些重疊的產(chǎn)物，形成完整的可變區(qū)。還可以希望在PCR擴(kuò)增中包括重^l或輕^l恒定區(qū)(包括k輕鏈的Bbsl位點(diǎn)或y重鏈的Agel位點(diǎn))的重疊片段，以產(chǎn)生可以容易地被克隆到表達(dá)載體構(gòu)建體中的片段。然后將重新構(gòu)建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、翻譯起始位點(diǎn)、前導(dǎo)序列、恒定區(qū)、3'非翻譯區(qū)、多腺苷酸化和翻譯終止區(qū)序列組合，形成表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體可以組合到一個(gè)載體中，共轉(zhuǎn)染、連續(xù)轉(zhuǎn)染或單獨(dú)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞內(nèi)，然后再進(jìn)行融合，形成表達(dá)兩條鏈的宿主細(xì)胞。可以構(gòu)建用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒，因而PCR擴(kuò)增的V重鏈和Vk輕鏈cDNA序列可用于重新構(gòu)建完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)?？捎糜诒磉_(dá)完全人IgG!k或IgG4k抗體。本發(fā)明的完全人抗體和嵌合抗體還包括IgG2、IgG3、IgE、IgA、IgM和IgD抗體?？梢詷?gòu)建類(lèi)似的質(zhì)粒，用于表達(dá)其它重鏈同種型或用于表達(dá)包含人輕鏈的抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的人抗HCV抗體的一種或多種結(jié)構(gòu)特征可用于產(chǎn)生保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性(例如，與HCV結(jié)合或中和HCV)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的人抗HCV抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)可以與已知的人構(gòu)架區(qū)和CDR重組組合，產(chǎn)生另外的、重組工程化的本發(fā)明的人抗HCV抗體。重鏈和是天然存在的人抗體的序列，或者可以是幾種人抗體的共有序列。參見(jiàn)37Kettleborough等人，/Voto'w4:773(1991);Kolbinger等人,尸ra^.w五"g/"^hwg6:971(1993)和Carter等人，WO92/22653。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備人抗HCV抗體的方法，包括制備一種抗體，其包含(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)和人重鏈CDR,其中，至少一個(gè)人重鏈CDR包含選自此處所描述的人重鏈CDR氨基酸序列的氨基酸序列；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)和人輕鏈CDR,其中，至少一個(gè)人輕鏈CDR包含選自此處所描述的人輕鏈CDR氨基酸序列的氨基酸序列，其中，該抗體保留與HCV相結(jié)合的能力?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)結(jié)合分析(例如實(shí)施例中所述的那些，例如ELISA或FLISA)來(lái)確定抗體與HCV結(jié)合的能力。本領(lǐng)域公知，抗體重鏈和輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體對(duì)抗原的結(jié)合特異性/親和力中起非常重要的作用(參見(jiàn)Hall等人，《//mtrno/，149:1605-1612(1992);Polymenis等人，/www"o/,152:5318-5329(1994);Jahn等人，/www"oZ/o/，193:400-419(1995);Klimka等人，乂Owcer,83:252-260(2000);Beiboer等人，Mo/.腸/，296:833-849(2000);Rader等人，尸rac.A^/.爿cac/5W.L/5^，95:8910-8915(1998);Barbas等人，/爿m.C&肌Soc，116:2161-2162(1994);Ditzel等人，/附mwm/,157:739-749(1996))。因此，按照上述方法制備的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選地包含抗體83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的重鏈和/或輕鏈CDR3?？贵w還可進(jìn)一步包含抗體83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的CDR2。抗體進(jìn)一步還可包含抗體83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的CDR1。抗體還可進(jìn)一步包含CDR的任何組合。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了抗HCV抗體，其包含(1)人重鏈構(gòu)架區(qū)、人重鏈CDR1區(qū)、人重鏈CDR2區(qū)和人重鏈CDR3區(qū)，其中，人重鏈CDR3區(qū)選自83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的CDR3，例如，如此處序列表中所顯示的95-2的人重鏈CDR3區(qū)；和(2)人輕鏈構(gòu)架區(qū)、人輕鏈CDR1區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中，人輕鏈CDR3區(qū)選自83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的CDR3,例如，如此處序列表中所顯示的95-2的人輕鏈CDR338區(qū)，其中該抗體能夠與HCV相結(jié)合。該抗體還可以進(jìn)一步包含抗體83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。該抗體還可以進(jìn)一步包含83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的重鏈CDR1和/或輕鏈CDRl。上述工程抗體的CDR1、2和/或3區(qū)可以包含如此處所公開(kāi)的抗體83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的確切的氨基酸序列。但是，普通技術(shù)人員知道，在仍然保留抗體與HCV有效結(jié)合的能力的情況下(例如保守序列修飾)，83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的確切的CDR序列允許存在一些不同。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，工程抗體可以包含一個(gè)或多個(gè)與抗體CDR83-128、95-2、95-14、95-38和073-1的一個(gè)或多個(gè)CDR例如90%、95%、98%或99.5%相同的CDR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以改變CDR的一個(gè)或多個(gè)殘基來(lái)改變其結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)更有利的結(jié)合速率、更有利的結(jié)合解離速率或這二者，從而獲得理想的結(jié)合常數(shù)。使用這種策略，可以得到例如Kd10"g或更低的超高結(jié)合親和力的抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的或此處所描述的親和力成熟技術(shù)來(lái)改變CDR區(qū)，然后再根據(jù)所需的結(jié)合改變篩選所得到的結(jié)合分子。因此，由于CDR改變，可以監(jiān)測(cè)結(jié)合親和力和免疫原性的改變，并對(duì)其打分，從而獲得對(duì)于結(jié)合和最低免疫原性的最佳組合優(yōu)化的抗體。除了在CDR之內(nèi)的修飾以外，或者代替在CDR內(nèi)的修飾，還可以在人抗體重鏈和/或輕《連可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)進(jìn)行修飾，只要這些修飾不消除人抗體的結(jié)合親和力即可。已知構(gòu)架內(nèi)幾個(gè)位置處的氨基酸對(duì)于確定許多抗體中CDR構(gòu)型(例如能夠與CDR相互作用的)是非常重要的(Chothia和Lesk,同上，Chothia等人，同上，和Tramontano等人，Mo/.所o/.215:175(1990),所有這些在此引入作為參考)。這些作者通過(guò)分析幾種已知抗體的結(jié)構(gòu)確定了對(duì)于CDR構(gòu)型重要的保守構(gòu)架殘基。基于CDR的構(gòu)型，所分析的抗體落入了有限數(shù)目的結(jié)構(gòu)或"規(guī)范"類(lèi)型。規(guī)范類(lèi)型成員中的保守構(gòu)架殘基被稱(chēng)為"規(guī)范"殘基。規(guī)范殘基包括輕鏈的殘基2、25、29、30、33、48、64、71、90、94和95,以及重鏈的殘基24、26、29、34、54、55、71和94?？梢圆鹏迵?jù)Martin和Thorton(1996)/Mo/.說(shuō)W.263:800的方法來(lái)確定其它的殘基(例如確定CDR結(jié)構(gòu)的殘基)。特別地，已知輕《連2、48、64和71位置上的氨基酸以及重鏈26-30、71和94位置上的氨基酸(根據(jù)Kabat編號(hào))能夠與許多抗體的CDR相互作用。輕鏈位置35上的氨基酸和重鏈93和103位置上的氨基酸同樣也可以與CDR相互作用。其它可能影響CDR構(gòu)型的殘基可以通過(guò)Foote和Winter(1992)Mo/,所o/.224:487的方法進(jìn)行確定。這些殘基被稱(chēng)為"游標(biāo)"殘基，它們是構(gòu)架區(qū)中緊接在CDR下面(即在CDR下形成一個(gè)"平臺(tái)")的殘基。"參與VL-Vh接觸面"的殘基或"包裝殘基"包括那些位于Vl和Vh沖妄觸面的殘基，如Novotny和Haber,尸rac.A^/.^cw/a5L4,82:4592-66(1985)或Chothia等人(同上)中定義的那樣。有時(shí)候，不太確定特定的氨基酸是否屬于一個(gè)或多個(gè)上述類(lèi)別。在這樣的情況下，可以產(chǎn)生替代變異抗體，其中一個(gè)包含該特定置換，而另一個(gè)不包含該置換?？梢允褂么颂幩枋龅娜魏卧囼?yàn)來(lái)測(cè)試這樣產(chǎn)生的替代變異抗體的所需活性，并選擇優(yōu)選的抗體。該構(gòu)架區(qū)內(nèi)取代的其它候選氨基酸為在人抗體該位置上不常見(jiàn)的或"稀有的，，氨基酸。這些氨基酸可被來(lái)自人種系序列的等同位置或來(lái)自更加典型的人抗體的等同位置的氨基酸所取代。例如，在人免疫球蛋白序列中，當(dāng)人抗體的人構(gòu)架區(qū)中該位置的氨基酸是罕見(jiàn)的、而種系序列中該位置的相應(yīng)氨基酸為常見(jiàn)的時(shí)；或者相對(duì)于其它人序列，當(dāng)人抗體中該位置的氨基酸是罕見(jiàn)的、種系序列中該位置的相應(yīng)氨基酸也是罕見(jiàn)的時(shí)，這種取代可能是理想的。還考慮到，通過(guò)使用來(lái)自恰巧是人抗體典型的種系序列的氨基酸替換罕見(jiàn)氨基酸，可以使人抗體具有更低的免疫原性。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"稀有的"是指在代表性的序列樣品中，氨基酸出現(xiàn)在那個(gè)位置上的序列少于大約20%,優(yōu)選少于大約10%，更優(yōu)選少于大約5%,再更優(yōu)選少于大約3%，再更優(yōu)選少于大約2%，再更優(yōu)選少于大約1%，此處所使用的術(shù)語(yǔ)"常見(jiàn)的"是指在代表性的樣品中，40氨基酸出現(xiàn)在多于大約25%、但是通常多于大約50%的序列中。例如，所有人輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別被分組到序列"亞組，，中，亞組中的序列彼此特別同源，并且在某些關(guān)鍵位置上具有相同的氨基酸(Kabat等人，同上)。當(dāng)確定人抗體序列中的氨基酸在人序列之間是"稀有的，，還是"常見(jiàn)的"時(shí)，通常優(yōu)選的是僅考慮那些與該人抗體序列在同一亞組中的人序列。一般而言，人抗體構(gòu)架區(qū)與作為其來(lái)源的人種系序列的構(gòu)架區(qū)通常是基本相同的，更通常情況下是相同的。當(dāng)然，構(gòu)架區(qū)中的許多氨基酸對(duì)抗體的特異性或親和力起的貢獻(xiàn)較小，或沒(méi)有直接貢獻(xiàn)。因此，構(gòu)架殘基的許多個(gè)別保守置換是可以忍受的，并不會(huì)引起所得到的人免疫球蛋白的特異性或親和力的明顯改變。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體可變構(gòu)架區(qū)與人種系可變構(gòu)架區(qū)序列或這些序列的共有序列至少有85%的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體的可變構(gòu)架區(qū)與人種系可變構(gòu)架區(qū)序列或這些序列的共有序列至少有90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。除了僅僅根據(jù)與HCVE2蛋白質(zhì)的線(xiàn)性表位相結(jié)合以外，還可以根據(jù)以下性質(zhì)選擇單克隆抗體保持本發(fā)明的抗體的其它功能性質(zhì)，例如，與HVCE2的多種基因型相結(jié)合，和/或超高親和力地結(jié)合，例如Ko為10—9M或更低。在//crW乂卓義發(fā)在#絲在可以使用多種已知的技術(shù)來(lái)表征本發(fā)明的人單克隆抗體與HCV的結(jié)合。通常最初使用ELISA來(lái)表征抗體。簡(jiǎn)而言之，可以使用在PBS中的純化的HCV包被微量滴定板，然后使用在PBS中稀釋的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白(BSA))來(lái)進(jìn)行封閉。將來(lái)自HCV免疫小鼠的血漿稀釋液添加到每個(gè)孔中，然后在37°C溫育1-2小時(shí)。使用PBS/Tween20洗板，然后在37。C下與偶聯(lián)到堿性磷酸酶上的山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑溫育1小時(shí)。洗滌之后，使用ABTS底物使該板顯色，并分析OD405。優(yōu)選地，使用產(chǎn)生最高效價(jià)的小鼠進(jìn)行融合。上述的ELISA分析可用于篩選抗體，因而可以篩選產(chǎn)生對(duì)HCV免疫原顯示出陽(yáng)性反應(yīng)性的抗體的雜交瘤。優(yōu)選地以高親和力與HCV結(jié)合的雜交瘤然后可以被亞克隆，并進(jìn)一步進(jìn)行表征。然后從每種雜交瘤中選擇一個(gè)保留母細(xì)胞的反應(yīng)性(通過(guò)ELISA)的克隆，用于制備細(xì)胞庫(kù)，并用于抗體純化。為了純化人抗HCV抗體，選擇的雜交瘤可以在搖瓶、兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶或其它培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)。過(guò)濾并濃縮上清液，之后使用蛋白A-Sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)進(jìn)4亍親和色"i普，以純化蛋白質(zhì)。將緩沖液更換為PBS后，使用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD28?；蛘邇?yōu)選地通過(guò)濁度分析來(lái)確定濃度。IgG可以通過(guò)凝膠電泳和抗原特異性的方法來(lái)證實(shí)。為了確定選擇的人抗HCV單克隆抗體是否與獨(dú)特的表位相結(jié)合，可以使用市售試劑(Pierce，Rockford,EL)將每種抗體生物素化?？梢允褂面溍箍股锼貥?biāo)記的探針來(lái)檢測(cè)生物素化MAb的結(jié)合。為了確定純化抗體的同種型，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行同種型ELISA。例如，可以使用10(ag/ml抗人Ig包被微量滴定板的孑L,4。C過(guò)夜。使用5。/。BSA封閉之后，在室溫下，該板與10昭/ml單克隆抗體或純化的同種型對(duì)照反應(yīng)2小時(shí)。然后各孔可以與人IgGl或其它人同種型特異性偶聯(lián)纟笨針?lè)磻?yīng)。如上所述顯色并分析該板。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法可以進(jìn)一步檢測(cè)抗HCV人IgG與HCV抗原的反應(yīng)性。簡(jiǎn)而言之，可以制備來(lái)自表達(dá)HCV的細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳之后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用20%小鼠血清封閉，并使用待測(cè)的單克隆抗體進(jìn)行探測(cè)?？梢允褂每谷薎gG堿性磷酸酶來(lái)檢測(cè)人IgG的結(jié)合，并使用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.,St.Louis,MO)進(jìn)行顯色。II.產(chǎn)生人單克隆抗HCV抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的產(chǎn)生在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了能夠表達(dá)特異性結(jié)合HCV的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠，因而當(dāng)使用HCV抗原和/或表達(dá)HCV的細(xì)胞免疫小鼠時(shí)，小鼠能夠產(chǎn)生人抗HCV抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合入小鼠的染色體DNA中，正如轉(zhuǎn)基因小鼠一樣，例如此處詳細(xì)描述的和列舉的HuMAb小鼠。這樣的轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)經(jīng)歷V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換，能夠產(chǎn)生針對(duì)HCV的人單克隆抗體的多種同種型(例如IgG)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過(guò)例如經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換發(fā)生。設(shè)計(jì)對(duì)外源抗原刺激有響應(yīng)、并具有異源抗體的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物需要轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包含的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在整個(gè)B細(xì)胞發(fā)育途徑中正確地發(fā)揮功能。這包括例如異源重鏈轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。因此，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因，從而能夠產(chǎn)生抗體的同種型轉(zhuǎn)換以及一種或多種下述性質(zhì)(1)高水平和細(xì)胞類(lèi)型特異性的表達(dá)，(2)功能性基因重排，(3)等位基因排斥的激活和對(duì)等位基因排斥的響應(yīng)，(4)充分的初級(jí)組成成分(repertoire)的表達(dá)，(5)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞高變和(7)在免疫應(yīng)答過(guò)程中對(duì)轉(zhuǎn)基因抗體基因座的控制。并不需要滿(mǎn)足上述所有標(biāo)準(zhǔn)。例如，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座受到功能性破壞的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因并不需要激活等位基因排斥。此外，在轉(zhuǎn)基因包括功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的實(shí)施方案中，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)功能性基因重排就不是必需的，至少對(duì)于已經(jīng)重排的轉(zhuǎn)基因而言。關(guān)于分子免疫學(xué)的背景，可以參見(jiàn)Fwm/awewto//wmwwo/ogv，2ndedition(1989),PaulWilliamE.,ed.RavenPress,N.Y。在某些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的種系中包含重排的、未重排的或重排和未重排組合的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因。每個(gè)重鏈轉(zhuǎn)基因包含至少一個(gè)CH基因。此外，重鏈轉(zhuǎn)基因還可以包含功能性同種型轉(zhuǎn)換序列，該同種型轉(zhuǎn)換序列能夠支持轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞中編碼多種CH基因的異源轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。這些轉(zhuǎn)換序列可以是在來(lái)自作為轉(zhuǎn)基因Ch基因來(lái)源的物種的種系免疫球蛋白基基因座中天然存在的序列，或者這些轉(zhuǎn)換序列可以來(lái)自于在接受轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)中存在的序列。例如，如果人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體引入的轉(zhuǎn)換序列與在小鼠重鏈基因座中天然存在的序列相似，由于推測(cè)小鼠轉(zhuǎn)換序列為了與小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)共同作用而被優(yōu)化，而人轉(zhuǎn)換序列并未優(yōu)化，因而用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可以產(chǎn)生更高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件。轉(zhuǎn)換序列可以使用傳統(tǒng)的克隆方法來(lái)分離和克隆，或者也可以從重疊的合成寡核苷酸從頭合成，該寡核苷酸是基于有關(guān)免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列的公開(kāi)的序列信息而設(shè)計(jì)的(Mills等人，M/c"c油L15:7305-7316(1991);Sideras等人,/mmimo/.1:631-642(1989))。對(duì)于上述每種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的相當(dāng)一部分B細(xì)胞中(至少10%)發(fā)現(xiàn)了功能性重排的異源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。用于產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因包括包含編碼至少一個(gè)可變基因區(qū)段、一個(gè)多樣性基因區(qū)段、一個(gè)連接基因區(qū)段和至少一個(gè)恒定區(qū)基因區(qū)段的DNA的重鏈轉(zhuǎn)基因。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因包含編碼至少一個(gè)可變基因區(qū)段、一個(gè)連接基因區(qū)段和至少一個(gè)恒定區(qū)基因區(qū)段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因區(qū)段的基因區(qū)段與轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物是異源性的，因?yàn)樗鼈儊?lái)自于或者對(duì)應(yīng)于編碼來(lái)自不是轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的物種的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因區(qū)段的DNA。在本發(fā)明的一個(gè)方面，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，使得各個(gè)基因區(qū)段是未經(jīng)重排的，即沒(méi)有重排，因而編碼功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。當(dāng)與HCV抗原接觸時(shí)，這些未重排的轉(zhuǎn)基因支持V、D和J基因區(qū)段的重組(功能性重排)，優(yōu)選地支持在轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物內(nèi)得到的重排免疫球蛋白重鏈中引入全部或部分D區(qū)基因區(qū)段。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因包含未重排的"小基因座"。這樣的轉(zhuǎn)基因通常包含相當(dāng)一部分C、D和J區(qū)段以及V基因區(qū)段的亞群。在這樣的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中，各種調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、類(lèi)別轉(zhuǎn)換區(qū)、用于RNA加工的剪接供體和剪接受體序列、重組信號(hào)等)包含來(lái)自異源DNA的相應(yīng)序列。這些調(diào)節(jié)序列可被加入到來(lái)自本發(fā)明使用的相同或相關(guān)非人動(dòng)物物種的轉(zhuǎn)基因中。例如，人免疫球蛋白基因區(qū)段可以與轉(zhuǎn)基因小鼠中使用的嚙齒動(dòng)物免疫球蛋白增強(qiáng)子序列在轉(zhuǎn)基44因中組合?；蛘?，也可以將合成調(diào)節(jié)序列加入到轉(zhuǎn)基因中，其中，這些合成調(diào)節(jié)序列與已知在哺乳動(dòng)物基因組中天然存在的功能性DNA序列不同源。根據(jù)共有原則(例如確定剪接受體位點(diǎn)或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子基序的允許序列的原則)來(lái)設(shè)計(jì)合成調(diào)節(jié)序列。例如，小基因座包含基因組免疫球蛋白基因座的一部分，與天然存在的種系Ig基因座相比，具有至少一個(gè)非必需DNA部分(例如間插序列；內(nèi)含子或其部分)的內(nèi)部(即并非在該部分的末端)缺失。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生針對(duì)HCV的人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包含至少一個(gè)、通常2-10個(gè)、有時(shí)候20-25個(gè)或更多個(gè)拷貝的在WO98/24884實(shí)施例12中描述的轉(zhuǎn)基因(例如pHCl或pHC2)，該動(dòng)物與WO98/24884實(shí)施例5、6、8或14中描述的包含單拷貝輕鏈轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物繁殖，并且其后代與WO98/24884實(shí)施例10中描述的JH缺失的動(dòng)物繁殖。動(dòng)物繁育為這三種性狀的每一種都是純合性的。這些動(dòng)物具有下述基因型單拷貝(每個(gè)染色體單倍體組)的人重鏈未重排小基因座(在WO98/24884的實(shí)施例12中有描述)、單拷貝(每個(gè)染色體單倍體組)的未重排人k輕鏈構(gòu)建體(在WO98/24884的實(shí)施例14中有描述)以及去除所有功能性Jh區(qū)段的、在每個(gè)內(nèi)源小鼠重鏈基因座處的缺失(在WO98/24884的實(shí)施例10中有描述)。這些動(dòng)物與對(duì)于Jh缺失而言是純合的小鼠繁殖(WO98/24884的實(shí)施例10)，以產(chǎn)生對(duì)于JH缺失而言是純合的以及對(duì)于人重鏈和輕鏈構(gòu)建體而言是半合子的后代。給所得到的動(dòng)物注射抗原，并用于產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的人單克隆抗體。從這種動(dòng)物中分離出來(lái)的B細(xì)胞對(duì)于人重鏈和輕鏈而言是單特異性的，因?yàn)樗鼈冎话饕粋€(gè)拷貝的每種基因。此外，對(duì)于人或小鼠重鏈而言，它們也是單特異性的，因?yàn)橛捎谌鏦O98/24884實(shí)施例9和12所述引入了跨越Jh區(qū)的缺失，兩個(gè)內(nèi)源性小鼠重鏈基因拷貝是非功能性的。此外，對(duì)于人或小鼠輕鏈而言，大部分的B細(xì)胞也是單特異性的，因?yàn)樵诖蟛糠諦細(xì)胞中，單拷貝的重排人k輕鏈基因的表達(dá)將會(huì)等位基因地以及同種型地排除內(nèi)源性小鼠k和、鏈基因的重排。本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示能夠產(chǎn)生具有大部分組成成分的免疫球蛋白，理想地基本上類(lèi)似于天然小鼠。因此，例如，在內(nèi)源Ig基因已被滅活的實(shí)施方案中，總免疫球蛋白水平的范圍為大約0.1至10mg/ml血清，優(yōu)選為0.5至5mg/ml，理想地為至少大約0.1mg/ml。當(dāng)將能夠?qū)崿F(xiàn)從IgG到IgM的轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)基因引入到轉(zhuǎn)基因小鼠中時(shí)，成年小鼠的血清IgG與IgM的比例優(yōu)選為大約10:1。IgG與IgM的比例在未成熟小鼠中要低很多。一般而言，大于大約10%、優(yōu)選40%至80%的脾和淋巴結(jié)B細(xì)胞僅表達(dá)人IgG蛋白質(zhì)。理想狀況下，所有組成成分接近于天然小鼠中所顯示的，通常至少為大約10%、優(yōu)選為25%至50%或更多。一般而言，主要取決于引入小鼠基因組中的不同V、J和D區(qū)的數(shù)量，將會(huì)產(chǎn)生至少大約一千種、優(yōu)選104至106或更多不同的免疫球蛋白(理想地為IgG)。這些免疫球蛋白通常將會(huì)識(shí)別大約一半或更多的高抗原性蛋白質(zhì)，例如葡萄球菌蛋白A。通常，免疫球蛋白對(duì)預(yù)先選擇的抗原顯示出的親和力(KD)小于10-7M，例如小于10-8M、10_9或10—1()或更小。優(yōu)選地可以產(chǎn)生具有預(yù)先確定的所有組成成分的小鼠，以限制對(duì)預(yù)所有組成成分的重鏈轉(zhuǎn)基因可以包含，例如，在人體中對(duì)預(yù)先確定的抗原類(lèi)型的抗體應(yīng)答中優(yōu)先使用的人Vh基因。或者，由于各種原因(例如，編碼對(duì)預(yù)先確定的抗原具有高親和力的V區(qū)的可能性低；發(fā)生體細(xì)胞突變和親和力增強(qiáng)的傾向變低；或者對(duì)某些人是免疫原性的)，可以從確定的所有組成成分中排除一些Vh基因。因此，在包含不同重鏈或輕鏈基因區(qū)段的轉(zhuǎn)基因重排之前，例如通過(guò)雜交或DNA測(cè)序，可以很容易地確定這些基因區(qū)段為來(lái)自該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以外的生物體物種。上述轉(zhuǎn)基因小鼠可以使用例如純化的或富集的HCV抗原制劑和/或表達(dá)HCV蛋白質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行免疫?；蛘?，也可以使用編碼HCV蛋白質(zhì)的DNA來(lái)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。然后，這些小鼠將會(huì)產(chǎn)生B細(xì)胞，B細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)發(fā)生類(lèi)別轉(zhuǎn)換，并表達(dá)HCV反應(yīng)性免疫球蛋白。該免疫球蛋白可以是人抗體(也被稱(chēng)為"人序列抗體")，其中，重鏈和輕鏈多肽由人轉(zhuǎn)基因序列編碼，該序列中可以包含通過(guò)體細(xì)胞突變產(chǎn)生的序列和V區(qū)重組接點(diǎn)，以及種系編碼的序列；這些人抗體可以被稱(chēng)為與人V^或VH基因區(qū)段和人JL或DH和JH區(qū)段編碼的多肽序列基本相同，盡管由于體細(xì)胞突變和差異V-J和V-D-J的重組接點(diǎn)，可能會(huì)存在其它的非種系序列。每個(gè)抗體鏈的可變區(qū)通常至少80%由人種系V、J和(對(duì)于重鏈)D基因區(qū)段編碼；通常至少85%的可變區(qū)是由存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼；通常90%或95%或更多的可變區(qū)序列是由存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列編碼。但是，由于非種系序列是通過(guò)體細(xì)胞突變和VJ和VDJ連接而引入的，人序列抗體經(jīng)常會(huì)具有一些并非由在小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因中發(fā)現(xiàn)的人V、D或J基因區(qū)段編碼的可變區(qū)序列(和出現(xiàn)頻率較低的恒定區(qū)序列)。通常，這樣的非種系序列(或個(gè)別核苷酸位置)會(huì)聚集在CDR內(nèi)或CDR附近，或者聚集在已知體細(xì)胞突變聚集的區(qū)域內(nèi)。生包含人序列y鏈(例如、y2a、y2B或)和人序列輕鏈(例如x)的人抗體。由于親和力成熟和抗原對(duì)B細(xì)胞的選擇，特別是在二次(或隨后的)抗原攻擊之后，這些同種型轉(zhuǎn)換的人抗體通常在可變區(qū)中，通常在CDR內(nèi)或在CDR的大約10個(gè)殘基內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)體細(xì)胞突變。這些高親和力人抗體可以具有小于1(T7M，例如小于10"M、10-9或10,或更小的結(jié)合親和力(KD)。本發(fā)明的另一方面包括來(lái)自此處所描述的轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞。B細(xì)胞可用于產(chǎn)生表達(dá)能夠與人HCV高親和力結(jié)合(例如KD小于10-7M)的人單克隆抗體的雜交瘤。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生親和力(KD)小于l(T7M,例如小于10—8M、10—9或10—1()或更小的人抗體的雜交瘤，該親和力是使用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)、在BIACORE3000儀器中、使用重組人HCV作為分析物并且使用抗體作為結(jié)合人HCV的配體而確定的，其中，該抗體包含人序列輕鏈，其包含(1)具有與人Vl基因區(qū)段和人jl區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，以及(2)具有與人Cl基因區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列的輕鏈恒定區(qū)；人序列重鏈，其包含(1)具有與人Vh基因區(qū)段、任選的D區(qū)和人JH區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列的重鏈可變區(qū)，以及(2)具有與人CH基因區(qū)段編碼的多肽序列基本相同的多肽序列的恒定區(qū)。用于在具有包含整合人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠的高親和力人單克隆抗體，所述方法包括向基因組內(nèi)引入包含不存在于所述整合人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因中的V區(qū)基因區(qū)段的V基因轉(zhuǎn)基因。通常，V區(qū)轉(zhuǎn)基因?yàn)榘薞H或VL(VK)基因區(qū)段陣列的一部分的酵母人工染色體，可能天然存在于人基因組中，或者可以分別通過(guò)重組方法剪接在一起，可能包括無(wú)序的或可忽略的V基因區(qū)段。YAC上通常包含至少5個(gè)或更多個(gè)功能性V基因區(qū)段。在這種變形中，可以通過(guò)V區(qū)所有組成成分的擴(kuò)增方法來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，該小鼠表達(dá)包含由V區(qū)轉(zhuǎn)基因上存在的V區(qū)基因區(qū)段編碼的可變區(qū)序列以及在人Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)的免疫球蛋白鏈。通過(guò)V區(qū)所有組成成分?jǐn)U增方法，可以產(chǎn)生具有至少5種不同的V基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；還可以產(chǎn)生包含至少大約24種或更多V基因的小鼠。一些V基因區(qū)段可以是非功能性的(例如假基因等)；根據(jù)需要，這些區(qū)段可以保留，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用的重組方法選擇性刪除。一旦小鼠種系已被改造為包含具有擴(kuò)增的V區(qū)段所有組成成分、基本上不存在于包含J和C基因區(qū)段的人Ig轉(zhuǎn)基因中的功能性YAC,該性狀就可以遺傳和培育到其它遺傳背景中，包括其中具有擴(kuò)增的V區(qū)段所有組成成分的功能性YAC被培育到具有不同人Ig轉(zhuǎn)基因的小鼠種系中的背景。具有擴(kuò)增的V區(qū)段所有組成成分的多功能YAC可以被溫育到種系中，與一種人Ig轉(zhuǎn)基因(或多種人Ig轉(zhuǎn)基因)一起作用。盡管此處稱(chēng)為YAC轉(zhuǎn)基因，但是當(dāng)整合到基因組中時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因基本上不含酵母序列，例如在酵母中自主復(fù)制所需的序列；當(dāng)不再需要在酵母中復(fù)制之后(即在引入小鼠ES細(xì)胞或小鼠原合子(prozygote)中之前)，這些序列任選地可通過(guò)基因工程(例如限制性酶消化和脈沖場(chǎng)凝膠電泳法或其它合適的方法)刪除。遺傳人序列免疫球蛋白表達(dá)性狀的方法包括培育具有人Ig轉(zhuǎn)基因的、并且任選地還具有包含擴(kuò)增的V區(qū)段所有組成成分的功能性YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠。Vh和Vl基因區(qū)段可以存在與YAC上。轉(zhuǎn)基因小鼠可以培育到實(shí)驗(yàn)者希望的任何背景中，包括攜帶其它人轉(zhuǎn)基因(包括人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其它人淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因)的背景。本發(fā)明還提供了由具有擴(kuò)增的V區(qū)所有組成成分YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的高親和力人序列免疫球蛋白。盡管上面描述了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，還涉及已被分為4類(lèi)的其它實(shí)施方案I.包含未重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；II.包含未重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；III.包含重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；和IV.包含重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物類(lèi)別中，當(dāng)內(nèi)源輕鏈基因(或至少k基因)已經(jīng)通過(guò)同源重組(或其它方法)敲除時(shí)，優(yōu)選順序?yàn)閕i〉i〉in〉iv，而當(dāng)內(nèi)源輕鏈基因尚未敲除并且必須通過(guò)等位基因排斥控制時(shí)，為i>n>m>iv。in.抗體偶聯(lián)物/免疫毒素在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了與治療部分(例如細(xì)胞毒素)、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性同位素偶聯(lián)的人抗HCV單克隆抗體。當(dāng)與細(xì)胞毒素偶聯(lián)時(shí)，這些抗體偶聯(lián)物被稱(chēng)為"免疫毒素，，。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性藥劑包括任何對(duì)細(xì)胞有害的(例如殺死細(xì)胞)的藥劑。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、長(zhǎng)春新石威、長(zhǎng)春堿、秋水仙石咸、多柔比星、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線(xiàn)菌素D、1-去氫睪甾酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和噪呤霉素及其類(lèi)似物或同系物。治療劑包括但不限于抗代謝49物(例如甲氨喋呤、6-巰。票呤、6-硫?yàn)踉脒?、阿糖胞苷?-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴。桊)、烷化劑(例如氮芥、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和羅莫司丁(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐星、絲裂霉素C和順二氯二氨鉑(II)(DDP)順柏)、蒽環(huán)類(lèi)(例如柔紅霉素(以前稱(chēng)為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素類(lèi)(例如放線(xiàn)菌素D(以前稱(chēng)為放線(xiàn)菌素)、博來(lái)霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))和抗有絲分裂劑(例如長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素(例如反射性碘)偶聯(lián)，以產(chǎn)生用于治療HCV相關(guān)疾病(例如癌癥)的細(xì)胞毒性放射性藥物。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物可以用于改變特定的生物反應(yīng)。治療部分不應(yīng)解釋為只限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)可以包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如肺瘤壞死因子或干擾素-Y;或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，例如淋巴因子、白介素-1("IL-1")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒細(xì)胞集落刺激因子("G-CSF")或其它細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。用于將這樣的治療部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是公知的，例如參見(jiàn)Arnon等人，"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(eds.)，pp,243-56(AlanR.Liss,Inc.1985);Hellstrom等人，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等人(eds.)，pp.623-53(MarcelDekker,Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(eds.),pp.303-16(AcademicPress1985),和Thorpe等人，"ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.，62:119-58(1982)。IV,藥物組合物在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，例如藥物組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的一種或組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含多種(例如兩種或更多種)本發(fā)明的分離的人抗體的組合。優(yōu)選地，該組合物的每種抗體與獨(dú)特的、預(yù)先選擇的HCV表位相結(jié)合。本發(fā)明的藥物組合物還可以在聯(lián)合治療中給藥，即與其它制劑共同給藥。例如，聯(lián)合治療可以包括本發(fā)明的組合物以及至少一種或多種另外的治療劑，例如抗炎劑、DMARD(疾病改善抗風(fēng)濕藥)、免疫抑制劑、化學(xué)治療劑和抗牛皮癬劑。本發(fā)明的藥物組合物的給藥還可以與放射性治療一起進(jìn)行。本發(fā)明還包括與其它抗體(例如CD4特異性抗體和IL-2特異性抗體)共同給藥。與CD4特異性抗體或IL-2特異性抗體的聯(lián)合給藥對(duì)于治療自身免疫性疾病和移植排斥是非常有用的。此處所使用的"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有生理相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮給藥(例如通過(guò)注射或輸注)。根據(jù)不同的給藥途徑，可以將活性化合物(即抗體、雙特異性和多特異性分子)包被在某種材料中，以保護(hù)該活性化合物免受酸作用和其它可能滅活該化合物的自然條件的影響。"藥學(xué)上可接受的鹽"是指保留母體化合物所需的生理活性、且不會(huì)引起任何不希望的毒性效應(yīng)的鹽(參見(jiàn)，例如Berge,S.M.等人1977)乂尸/wr肌66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自非毒性的無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等)和衍生自非毒性有機(jī)酸(如，脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂族和芳香磺酸等)的鹽。堿加成鹽包括衍生自堿土金屬(例如鈉、鉀、錳、鈣等)的鹽以及衍生自非毒性的有機(jī)胺(如，N，N'-二節(jié)基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的鹽。本發(fā)明的組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多方法給藥。本領(lǐng)域的4支術(shù)人員知道給藥的途徑和/或模式根據(jù)所希望的結(jié)果而改變?；钚曰衔锟膳c保護(hù)化合物以防止其快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼片和微包封的遞送系統(tǒng)。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合體，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。許多用于制備這類(lèi)制劑的方法已經(jīng)獲得了專(zhuān)利或是本領(lǐng)域才支術(shù)人員普遍知道的。參見(jiàn),例如5kstoZ"^/Co",ra〃ed7e/eas^i>wgZ)e/Zve^y加fe慰，J.R.Robinson，ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978。為通過(guò)特定給藥途徑來(lái)施用本發(fā)明的化合物，可能需要用某種材料以將該化合物在適當(dāng)?shù)妮d體(例如脂質(zhì)體)或稀釋劑中給予受試者。藥學(xué)上可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖液。脂質(zhì)體包括水包油包水型CGF乳液以及普通的脂質(zhì)體(Strejan等人(1984)/A^wraZm/mmo/.7:27)。藥學(xué)上可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散液以及用于即時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。這樣的介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域已知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑外，其它常規(guī)介質(zhì)或試劑都可用于本發(fā)明的藥物組合物中。輔助活性物質(zhì)也可以引入組合物中。治療組合物通常必須是無(wú)菌的，并且在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。組合物可被配制成為溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適用于高藥物濃度的其它有序的結(jié)構(gòu)。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其合適的混合物?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用包衣(例如卵磷脂)，在分散劑的情況中通過(guò)維持需要的顆粒大小，和通過(guò)使用表面活性劑，來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)使組合物中包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來(lái)延長(zhǎng)可注射的組合物的吸收。無(wú)菌的注射溶液的制備過(guò)程可以是將所需量的活性化合物和根據(jù)需要的上述所列成分的一種或組合加入到適當(dāng)?shù)娜軇┲?，然后再進(jìn)行微過(guò)濾除菌。一般而言，分散液是通過(guò)將活性化合物添加到包含基本分散介質(zhì)和選自上述列舉的成分的其它所需成分的無(wú)菌載體中制備的。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末的情況，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其產(chǎn)生來(lái)自之前無(wú)菌過(guò)濾溶液的活性成分加上任何需要的附加成分的粉末。調(diào)節(jié)給藥方案以提供所需的最佳反應(yīng)(例如治療反應(yīng))。例如，可以單次給予大丸劑(bolus),可以分幾次劑量在不同的時(shí)間進(jìn)行給藥，或者給藥劑量可以根據(jù)治療狀況的緊急程度成比例地降低或增加。例如，本發(fā)明的人抗體可以經(jīng)皮下注射每周給藥一次或兩次，或者經(jīng)皮下注射每月給藥一次或兩次。將腸胃外給藥組合物配制成單位劑量形式以便于給藥和劑量的均勻性是非常有利的。此處所使用的單位劑量形式是指適于作為單一劑量給予治療的受試者的物理上分散的單元；每個(gè)單元包含經(jīng)計(jì)算與所需藥物載體結(jié)合能夠產(chǎn)生所需的治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的單位劑量形式的規(guī)格受限于并且直接取決于(a)活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和需要達(dá)到的特定治療效果，和(b)配制這種活性化合物用于治療個(gè)體中的敏感性的
技術(shù)領(lǐng)域：
中固有的局限。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、碌u酸氫鈉、偏亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯曱醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、丙基沒(méi)食子酸酯、a-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。對(duì)于治療性組合物而言，本發(fā)明的制劑包括那些適于口服、經(jīng)鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的制劑。制劑可以方便地以單位劑量形式存在，且可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行制備。可以與載體材料組合以制成單一劑量形式的活性成分的量將會(huì)^4居治療的受試者和特定的給藥模式而變化?？梢耘c載體材料組合以制備單一劑量形式的活性成分的量通常為產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一^:而言，在100%中，該量為大約0.001%至大約90%的活性成分，優(yōu)選為大約0.005%至大約70%，最優(yōu)選為大約0.01%至大約30%。適于陰道給藥的本發(fā)明的制劑還包括包含本領(lǐng)域已知合適的載體的陰道栓劑、棉塞、乳劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑。用于局部或經(jīng)皮給藥的本發(fā)明的組合物的劑型包括粉末、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。活性化合物可以在無(wú)菌條件下與藥學(xué)上可接受的載體、與可能需要的任何防腐劑、緩沖液或拋射劑混合。此處所使用的術(shù)語(yǔ)"非腸道給藥"和"腸胃外給藥"是指除腸內(nèi)和局部給藥方式之外的其它給藥方式，通常是經(jīng)注射給藥，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、0艮窩內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、嚢下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明的藥物組合物中可以使用的合適的水性和非水性載體的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油(例如橄欖油)和可注射有機(jī)酯(例如油酸乙酯)?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散劑的情況中通過(guò)維持所需的顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑，來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可以包含輔劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^(guò)上面的滅菌過(guò)程和加入不同的抗細(xì)菌劑和抗真菌劑(例如對(duì)羥基苯曱酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)來(lái)防止微生物的存在。還可能希望在組合物中包含等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可以通過(guò)包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來(lái)延長(zhǎng)可注射的藥物形式的吸收。當(dāng)本發(fā)明的化合物作為藥品給予人和動(dòng)物時(shí)，它們可以單獨(dú)給予，或者作為包含與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合的例如0.001-90%(更優(yōu)選0.005-70%,例如0.01-30%)的活性成分的藥物組合物給予。與選擇的給藥途徑無(wú)關(guān)，本發(fā)明的化合物(其可以合適的水合形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法配制成為藥學(xué)上可接受的劑型。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變以獲得對(duì)于特定的患者、組合物和給藥模式有效地實(shí)現(xiàn)希望的治療反應(yīng)而不會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生毒性效應(yīng)的活性成分的量。所選的劑量水平取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括本發(fā)明采用的特定的組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、給藥途徑、給藥時(shí)間、所使用的特定化合物的排泄率、治療持續(xù)時(shí)間、與使用的特定組合物聯(lián)合使用的其它的藥物、化合物和/或材料、接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀態(tài)、總體健康水平和之前的病史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已知的類(lèi)似因素。具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或獸醫(yī)能夠很容易地確定和開(kāi)具所需的藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于達(dá)到希望的治療效果所需的水平開(kāi)始藥物組合物中使用的本發(fā)明的化合物的劑量，然后再逐漸增加劑量直到實(shí)現(xiàn)希望的效果為止。一4殳而言，本發(fā)明的組合物的合適日劑量為有效地產(chǎn)生治療效果的最低劑量的化合物量。這樣的有效劑量一般取決于上述因素。優(yōu)選的給藥方式為靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥，優(yōu)選為接近目標(biāo)位置給藥。如果需要的話(huà)，治療性組合物的有效的日劑量可以在整日時(shí)間內(nèi)以適當(dāng)?shù)拈g隔以?xún)蓚€(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)亞劑量獨(dú)立地給藥，任選地以單位劑量形式給藥。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)給藥，但是優(yōu)選作為藥物制劑(組合物)來(lái)給予該化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置來(lái)給予治療性組合物。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療性組合物可以使用無(wú)針的皮下注射裝置進(jìn)行給藥，例如美國(guó)專(zhuān)利No.5,399,163、5，383，851、5,312,335、5,064,413、4，941，880、4，790，824或4,596,556中公開(kāi)的裝置。可用于本發(fā)明的公知植入物和模塊的例子包括美國(guó)專(zhuān)利No.4,487,603,其公開(kāi)了用于以可控的速率分配藥物的可植入式微輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利No.4.,486，194,其公開(kāi)了用于經(jīng)皮給藥的治療裝置；美國(guó)專(zhuān)利No.4，447，233，其公開(kāi)了以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利No.4,447,224，其公開(kāi)了用于連續(xù)藥物輸送的可變流量可植入式輸注裝置；美國(guó)專(zhuān)利No.4，439,196,其公開(kāi)了具有多腔隔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國(guó)專(zhuān)利No.4,475,196，其公開(kāi)了滲透藥物遞送系統(tǒng)。許多其它這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可被配制用于確保適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)分布。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物能夠通過(guò)BBB(如果需要的話(huà))，它們可以被配制到例如脂質(zhì)體中。制備脂質(zhì)體的方法可以參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利4,522,811;5,374,548和5,399,331。脂質(zhì)體可以包含一個(gè)或多個(gè)被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)至特定細(xì)胞或器官中的部分，因此能夠提高靶向藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)(參見(jiàn)，例如V.V.Ranade(1989)C"w.尸/wrmaco/.29:685)。示例性的革巴向部分包括葉酸或生物素(參見(jiàn)，例如Low等人的美國(guó)專(zhuān)利5,416,016);甘露糖香(Umezawa等人，(1988)所oc/zem.所op—.C簡(jiǎn)m亂153:1038);抗體(P.G.Bloeman等(1995)F愿Z^",357:140;M.Owais等人(1995;U""m^To6.爿ge"&C/^woAer.39:180);表面活性蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134),其不同種類(lèi)可以包含于本發(fā)明的制劑中，以及本發(fā)明分子的成分；pl20(Schreier等人(1994)/5/o/.C/ew.269:9090);還參見(jiàn)K.Keinanen;M丄.Laukkanen(1994)Ffi^S丄故346:123;J丄Killion;I丄Fidler(1994)/麵畫(huà)/^4:273。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療化合物被配制在脂質(zhì)中，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包含靶向部分。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)快速推注將脂質(zhì)體中的治療化合物遞送到靠近腫瘤或感染的部位。該組合物必須具有一定的流動(dòng)性以i"更于注射。該組合物還必須在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，并且防止微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的"有效治療劑量"優(yōu)選地會(huì)造成患者中ACR20初步定義的改善(PreliminaryDefinitionofImprovement),更優(yōu)選地造成ACR50初步定義的改善，再更優(yōu)選地造成ARCD70初步定義的改善。ACR20初步定義的改善定義如下在壓痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(TenderJointCount)(TCJ)和胂脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(SwollenJointCount)(SWJ)中大于等于20%的改善以及在下述5項(xiàng)評(píng)估中的3項(xiàng)中大于等于20%的改善患者疼痛評(píng)估(VAS)、患者總體評(píng)估(VAS)、醫(yī)生總體評(píng)估(VAS)、患者自評(píng)估不能(HAQ)、急性期反應(yīng)物(CRP或ESR)。ACR50和ACR70是依據(jù)相同的方式定義的，分別為大于50%和70%的改善。對(duì)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見(jiàn)Felson等人inAmericanCollegeofRheumatologyPreliminaryDefinitionofImprovementinRheumatoidArthritis;ArthritisRheumatism(1995)38:727-735?？梢栽陬A(yù)測(cè)對(duì)于人胂瘤的有效性的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)估化合物抑制癌癥的能力。或者，可以通過(guò)研究該化合物的抑制能力來(lái)評(píng)估組合物的這一性質(zhì)，這種體外抑制通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的試驗(yàn)進(jìn)行。治療有效量的治療化合物可以減小腫瘤大小，或者改善受試者的癥狀。基于受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重程度以及特定的組合物或所選給藥途徑等因素，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定這樣的量。還可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)評(píng)估抗體治療或預(yù)防硬化的能力。該組合物必須是無(wú)菌的并且具有一定程度的流動(dòng)性以使該組合物可以通過(guò)注射給藥。除了水以外，載體還可以是等滲緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)及其合適的混合物?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散劑的情況中通過(guò)維持所需的顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑，來(lái)維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)和氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)使組合物包含延緩吸收的試劑(例如單硬^脂酸鋁或明膠)來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射組合物的長(zhǎng)期吸收。如上所述，當(dāng)活性化合物被適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)時(shí)，該化合物可經(jīng)口服給藥，例如與惰性稀釋劑或可吸收的可食用載體一起給藥。V.本發(fā)明的應(yīng)用及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的4十對(duì)HCV的人物)以及含有該抗體的組合物可用于多種體外和體內(nèi)診斷和治療應(yīng)用中。例如，本發(fā)明的人單克隆抗體可用于治療HCV介導(dǎo)的疾病，包括但不限于肝臟疾病，例如硬化、肝細(xì)胞癌和肝癌形成。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防HCV介導(dǎo)的疾病(例如肝臟疾病)的方法，包括給予受試者有效治療或預(yù)防該疾病的量的本發(fā)明的人抗體。該抗體可以單獨(dú)給藥，或者與另一種治療劑聯(lián)合給藥，該治療劑例如是a-IFN或細(xì)胞毒素，與該抗體一起或協(xié)同作用，以治療或預(yù)防HCV介導(dǎo)的疾病。適于使用本發(fā)明的抗體治療的其它疾病包括HCV介導(dǎo)的肝細(xì)胞病變、HCV介導(dǎo)的肝硬化和/或HCV介導(dǎo)的肝癌。此外，本發(fā)明的抗體可用于體外或體內(nèi)診斷多種由HCV介導(dǎo)的疾病。具體而言，該抗體可用于檢測(cè)HCV水平或包含HCV的纟田月包的水平?；蛘?，該抗體可用于抑制或中和HCV功能，進(jìn)而可以預(yù)防或改善由HCV功能引起的疾病癥狀。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括包含本發(fā)明的人抗HCV抗體和任選的使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒。該試劑盒可以進(jìn)一步包含一種或多種另外的試劑(例如a-IFN)或一種或多種另外的本發(fā)明的抗體(例如具有互補(bǔ)活性的、與不同于第一人抗體的HCV抗原表位相結(jié)合的人抗體)。因此，使用本發(fā)明的抗體治療的患者還可以另外給予(在給予本發(fā)明的人抗體之前、同時(shí)或之后)另一種能夠提高或擴(kuò)大人抗體的治療效果的治療劑。下述實(shí)施例描述了本發(fā)明的其它實(shí)施方案。下述實(shí)施例將會(huì)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但是不應(yīng)該理解為限定本發(fā)明。序列表、附圖和所有本申請(qǐng)所引用的參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利和公布的專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容都在此清楚地通過(guò)引用方式結(jié)合于本文中。200880010301.5實(shí)施例本發(fā)明進(jìn)一步描述于下述實(shí)施例中，這些實(shí)施例不限制權(quán)利要求書(shū)中描述的本發(fā)明的范圍。材泮+和方法在整個(gè)實(shí)施例部分中，除非特別說(shuō)明，使用下述材料和方法。一般而言，除非特別說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施使用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、免疫學(xué)(特別是例如抗體技術(shù))技術(shù)和多肽制備的才示準(zhǔn)沖支術(shù)。例^口參見(jiàn)Sambrook,Fritsch禾口Maniatis,A/o/ecw/arCYom'"g:Co/d//ar辦orZ^orato/j尸r咖(1989);」w幼o(hù)辦五喂'"eer/wgProtocolfMeAo^yAfo/ecw/ar5w/ogy乂510，Paul,S.,HumanaPr(1996);爿w船oc(y^Vigiwem力g..」尸ra"/ca/^4//roac/(PracticalApproachSeries,169),McCafferty,Ed"IrlPr(1996);^w"6o^e&'爿丄a/joratof7Afawwa/，Harlow等人，C.S.H丄.Press,Pub.(1999);和CWre"fPratoco/sMo/ecw/"r說(shuō)o/ogy,eds.Ausubel等人，JohnWiley&Sons(1992)。用于分析HCV生物學(xué)的體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)在例如Ce〃cw//w"m^fe/sam'ma/o/v/ra/Zie/a".to.77:/lepa"fcC'丄a6.爿m'm.(NY);34(2):39-47(2005)和77^c//附;朋zeemode/o//^pG"toCv/my^/^c"o"51,ILARJ.;42(2):117-26(2001)中有描述。密碼子優(yōu)化的HCV基因型laEl/E2表達(dá)構(gòu)建體的裝配簡(jiǎn)而言之，構(gòu)建編碼E2基因型la菌抹H77(原型la序列)蛋白質(zhì)栽體中。為了提高哺乳動(dòng)物的表達(dá)，以?xún)?yōu)化的密碼子使用改變核苷酸序列。使用重疊PCR和購(gòu)自IDT的寡核苷酸來(lái)裝配序列，并克隆到pCDNA3.1-myc，his表達(dá)載體中，該載體中HindIII和Xbal與C末端myc和六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。El/E2密碼子優(yōu)化的laH77序列具有添加的末端，該末端包含限制性酶切位點(diǎn)(用粗體小寫(xiě)表示)、確保限制性?xún)?nèi)切酶切割的附加的突出端(用下劃線(xiàn)小寫(xiě)表示)、共有Kozak序列(由粗體下劃線(xiàn)小寫(xiě)表示)和ATG起始密碼子(由粗體下劃線(xiàn)大寫(xiě)表示)(參見(jiàn)SEQIDNO:27和圖13)。用于表達(dá)可溶性E2蛋白質(zhì)的密碼子優(yōu)化的HCV基因型laE2-661表達(dá)構(gòu)建體(pCDNA-la-CO-E2-661)的裝配使用pCDNA-la-CO-El/E2作為模板，PCR擴(kuò)增編碼蛋白質(zhì)364至661的E2蛋白質(zhì)部分，并將其克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體中，該載體中HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。密碼子優(yōu)化的HCV基因型laE2-661的表達(dá)和純化使用Lipofectamine2000(Invitrogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T人組織培養(yǎng)細(xì)胞。收集來(lái)自細(xì)胞的包含分泌蛋白質(zhì)的上清液，使用鎳親和色譜從上清液中純化出laE2-661?；贠D280nm確定蛋白質(zhì)濃度，并進(jìn)一步通過(guò)考馬斯染色的SDS-PAGE和使用來(lái)自BiodesignInternational的市售E2'J、鼠抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行評(píng)估。野生型HCV基因型laEl/E2表達(dá)載體(pCDNA-la-El/E2)的裝配使用引物PCR擴(kuò)增HCVlaH77的El/E2的編碼序列(氨基酸165-746)以引入HindIII和Xbal克隆位點(diǎn)、共有Kozak序列和起始密碼子，然后將其克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體中，該載體內(nèi)HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。野生型HCV基因型laE2-660表達(dá)載體(pCDNA-la-E2-660)的裝墜使用pCDNA-la-El/E2作為模板PCR擴(kuò)增編碼氨基酸364-660的E2蛋白質(zhì)部分，將其克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體中，該載體內(nèi)HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。HCV基因型lb、2b、3a和4aEl/E2表達(dá)載體(oCDNA-El/E2)的裝配獲得高效價(jià)基因型lb、2b、3a和4aHCV陽(yáng)性患者血清，并從血清中分離RNA。對(duì)分離的RNA進(jìn)行RT-PCR，其中使用與核心基因末端互補(bǔ)的基因型特異性引物，并且針對(duì)在El/E2基因側(cè)面的p7基因。利用PCR使用引物擴(kuò)增El/E2編碼序列(氨基酸165-746),以引入HindIII和Xbal克隆位點(diǎn)、共有Kozak序列和起始密碼子。將該序列克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體中，該載體內(nèi)HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框，然后進(jìn)行測(cè)序。Blast搜索證實(shí)了這些序列為預(yù)期的基因型，但是這些序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中并沒(méi)有完全匹配。HCV基因型lbE2-661表達(dá)載體(pCDNA-lb-E2-661)的裝配使用pCDNA-lb-El/E2作為模板，使用PCR擴(kuò)增編碼氨基酸364至661的E2蛋白質(zhì)部分。然后將該序列克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體內(nèi)，該載體內(nèi)HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。表達(dá)和純化與以上對(duì)于laE2-661所述基本相同地進(jìn)行。HCV基因型laE2HVRl缺失表達(dá)載體的裝配為了產(chǎn)生缺失了編碼E2高變區(qū)1(HVR1)的核苦酸的E1/E2編碼構(gòu)建體，使用pCDNA-la-El/E2作為模板，使用3，引物PCR擴(kuò)增El，該3'引物包含對(duì)于開(kāi)始于氨基酸411的E2區(qū)的突出端(略過(guò)氨基酸384-410-HVR1)。在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，使用pCDNA-la-El/E2作為模板，使用包含對(duì)于E13，末端的突出端的5，引物PCR擴(kuò)增編碼氨基酸411-746的E2區(qū)?；旌显贓l-E2連接處包含互補(bǔ)突出端、不含編碼E2HVR1的區(qū)域的El和E2PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中使用具有HindIII位點(diǎn)的對(duì)El的5'末端特異性的引物，和具有Xbal位點(diǎn)的對(duì)E2的3'末端特異性的引物。將該序列克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體中，該載體內(nèi)HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。密碼子優(yōu)化的HCV基因型laE2截短表達(dá)載體的裝配工程化用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的截短形式，其中除去了E2的C末端氨基酸。使用pCDNA-la-CO-El/E2作為模板，PCR擴(kuò)增編碼所需氨基酸的E2蛋白質(zhì)部分，并克隆到pCDNA3.1-his表達(dá)載體中，該載體內(nèi)HindIII和Xbal與C末端六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。產(chǎn)生了下述構(gòu)建體opCDNA-la-CO-E2-624(E2氨基酸384-624)opCDNA-la-CO-E2畫(huà)584(E2氨基酸384-584)opCDNA-la-CO-E2-544(E2氨基酸384-544)opCDNA誦la畫(huà)CO-E2-504(E2氨基酸384-504)opCDNA-la-CO-E2-464(E2氨基酸384-464)每種構(gòu)建體的表達(dá)和純化基本如以上對(duì)于laE2-661所述進(jìn)行。凝集素ELISA使用E2截短形式進(jìn)行凝集素捕獲ELISA來(lái)確定抗體反應(yīng)性。簡(jiǎn)而言之，使用普通雪花蓮(Ga/a"A^m'vafc)(GNA)凝集素包被96孔板。將來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清液的E2截短形式添加到用GNA凝集素包被的96孔板上，以捕獲蛋白質(zhì)。然后將雜交瘤上清液添加到96孔板中，以確定蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。使用抗人i咸性磷酸酶第二抗體和PNPP底物來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體?？缭紿CV基因型laE2糖蛋白氨基酸384-464的細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建體的裝配下一步，構(gòu)建具有用于細(xì)菌表達(dá)的N末端硫氧還蛋白融合的融合蛋白，以允許產(chǎn)生E2的小部分。對(duì)于第一組蛋白質(zhì)而言，使用pCDNA-la-El/E2作為模板，PCR擴(kuò)增編碼所需氨基酸的E2蛋白質(zhì)部分，將其克隆到pET32表達(dá)載體中，該載體內(nèi)EcoRI和HindIII與C末端myc和六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。產(chǎn)生了下述構(gòu)建體opET32-E2-A(氨基酸384-463)opET32-E2-B(氨基酸411-463)opET32-E2-C(氨基酸432-463)opET32-E2-D(氨基酸436-463)opET32-E2-E(氨基酸384-431)將載體轉(zhuǎn)化到BL21-DE3大腸桿菌細(xì)菌(Invitrogen)中，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。裂解細(xì)菌，并使用鎳親和色譜純化目標(biāo)蛋白質(zhì)?；贠D280nm確定蛋白質(zhì)的濃度，并進(jìn)一步通過(guò)考馬斯染色的SDS-PAGE和使用myc和組氨酸標(biāo)簽特異性小鼠抗體的蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于第二組蛋白質(zhì)而言，制備互補(bǔ)的磷酸化寡核香酸，當(dāng)退火時(shí)，它們將具有EcoRI和HindIII突出端，并編碼所需氨基酸。將DNA克隆到pET32表達(dá)載體中，該載體內(nèi)EcoRI和HindIII與C末端myc和六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。產(chǎn)生了下述構(gòu)建體opET32-E2-G(氨基酸412-423)opET32-E2-H(氨基酸432-443)opET32-E2-I(氨基酸436-447)表達(dá)和純化按照以上對(duì)于第一組蛋白質(zhì)所述進(jìn)行。HCVE2-412-423表位的丙氨酸掃描突變體的產(chǎn)生在細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建體中，將412-423表位中的每個(gè)氨基酸分別突變?yōu)楸彼?，以確定對(duì)抗體接觸重要的氨基酸。制備互補(bǔ)磷酸化寡核苷酸，當(dāng)退火時(shí)，它們將具有EcoRI和HindIII突出端，并編碼具有所需改變的E2412-423區(qū)域。將DNA克隆到pET32表達(dá)載體中，該載體內(nèi)EcoRI和HindIII與C末端myc和六組氨酸標(biāo)簽符合讀框。然后對(duì)載體測(cè)序，以證實(shí)該構(gòu)建體是正確的。產(chǎn)生了下述構(gòu)建體opET32-E2-G-Q412A(氨基酸412從Q突變?yōu)锳)opET32-E2畫(huà)G畫(huà)L413AopET32-E2-G-I414AopET32畫(huà)E2-G-N415AopET32-E2畫(huà)G畫(huà)T416AopET32畫(huà)E2-G-N417AopET32-E2畫(huà)G畫(huà)G418AopET32-E2-G-S419AopET32-E2-G畫(huà)W420AopET32-E2畫(huà)G畫(huà)H421AopET32-E2-G-I422AopET32畫(huà)E2曙G-N423A表達(dá)和純化按照以上對(duì)于其它細(xì)菌蛋白質(zhì)所述進(jìn)行。4叚病毒的產(chǎn)生和中和試馬全產(chǎn)生了具有HIV骨架的假病毒，該骨架包含防止HIV包膜糖蛋白表達(dá)的突變和引導(dǎo)螢光素酶在靶細(xì)胞中表達(dá)的螢光素酶基因(pNL4陽(yáng)3丄uc.R畫(huà)E-)。通過(guò)用來(lái)自不同基因型(la、lb、2b、3a和4a))的pcDNAEl/E2和pNL4-3丄uc.R-E-共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，提供了HCVEl/E2糖蛋白。在轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，從細(xì)胞收集包含分泌病毒顆粒的上清液，使用Centricon70濃縮器和/或超速離心進(jìn)行濃縮。然后在存在抗體或不存在抗體的情況下，使用假病毒感染Hep3B細(xì)胞(ATCC)。在室溫下，假病毒與抗體預(yù)溫育1小時(shí)，然后添加到Hep3B細(xì)胞中。溫育72小時(shí)之后，通過(guò)螢光素酶檢測(cè)，使用BrightGlo螢光素酶分析(Promega)來(lái)定量感染，在Victor3讀板器(PerkinElmer)上進(jìn)行讀數(shù)。Biacore親和力確定在流動(dòng)室1和2中，山羊抗人IgG(Fc)與來(lái)自Biacore的CM5傳感器芯片通過(guò)酰胺偶聯(lián)。僅使用HBS-P緩沖液(Biacore),在流動(dòng)室2中捕獲人抗體(95-2或83-128)。E2-G流過(guò)流動(dòng)室1(用于背景)和流動(dòng)室2(用于與人抗體的特異性相互作用)200秒，其在HBS-P緩沖液中的濃度為125、62.5、31.3和15.6nM,流速為50pl/min。當(dāng)注射停止后，緩沖液流過(guò)兩個(gè)流動(dòng)室，以采集解離數(shù)據(jù)。評(píng)估這些數(shù)據(jù)，擬合曲線(xiàn)，以使用BIAevaluation軟件確定親和常數(shù)。小鼠的免疫使用可溶性E2蛋白質(zhì)免疫來(lái)自Medarex的人IgG基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(HuMab小鼠)，以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。使用弗氏佐劑(l次注射)以及MPL+TDM佐劑(Sigma)(14次注射)用laE2-661免疫小鼠85083。使用MPL+TDM+CWS佐劑(Sigma)(1次注射)以及MPL+TDM佐劑(5次注射)用laE2-661免疫小鼠97895。脾細(xì)胞融合和雜交瘤篩選取出小鼠的脾臟，并分離脾細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)PEG融合方案將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤。然后通過(guò)ELISA針對(duì)laE2-661反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生篩選雜交瘤，陽(yáng)性細(xì)胞用于進(jìn)一步表征。雜交瘤抗體基因的分離和測(cè)序使用QiagenRNeasy試劑盒從雜交瘤細(xì)胞中分離出RNA。使用包含限制性位點(diǎn)的基因特異性引物對(duì)重鏈可變區(qū)進(jìn)行RT-PCR,克隆所得到的序列，并對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序。使用基因特異性引物對(duì)輕鏈可變區(qū)進(jìn)行RACE。將序列克隆到TOPO載體中，對(duì)栽體進(jìn)行測(cè)序。設(shè)計(jì)基因特異性引物，并用于PCR擴(kuò)增和添加限制性位點(diǎn)。實(shí)施例l:抗HCV單克隆抗體的產(chǎn)生小鼠免疫、雜交瘤產(chǎn)生和選擇使用可溶性HCV基因型1aE2包膜糖蛋白免疫包含人免疫球蛋白基因(如以上題目為"在HuMab小鼠中產(chǎn)生人單克隆抗體"的部分所述產(chǎn)生，并由Medarex，Milpitas，CA提供)的轉(zhuǎn)基因小鼠?？乖c弗氏完全佐劑或RIBI佐劑共同給藥。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)監(jiān)測(cè)小鼠血清對(duì)可溶性E2蛋白質(zhì)(laE2-661)的應(yīng)答。從免疫動(dòng)物中分離脾臟B細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)的脾細(xì)胞融合方法與小鼠骨髓瘤(P3X-AG8.653)細(xì)胞融合。產(chǎn)生了克隆雜交瘤，使用ELISA針對(duì)E2-661反應(yīng)性抗體的產(chǎn)生進(jìn)行篩選。使用量減少的雜交瘤上清液，通過(guò)ELISA檢測(cè)陽(yáng)性雜交瘤對(duì)HCV基因型la和基因型lbE2-661的等同的反應(yīng)性。對(duì)基因型laE2-661和基因型lbE2-661顯示等同的反應(yīng)性的雜交瘤，被測(cè)試其中和Hep3B細(xì)胞的HCV假病毒感染性的能力。通過(guò)ELISA得知，這一選擇過(guò)程產(chǎn)生了20種能夠中和HCV假病毒并對(duì)la和lbE2可溶性蛋白質(zhì)具有等同的反應(yīng)性的雜交瘤。具體而言，19種雜交瘤來(lái)自小鼠#97895，產(chǎn)生的IgGl抗體如下95-2;95-14;95-15;95-18;95-20;95-21;95-25;95-26;95-30;95-38;95-39;95-42;95-43;95-48;95-49;95-52;95-54;95-58;和95-6。通過(guò)ELISA得知，一種雜交瘤，即83-128,能夠中和HCV假病毒并對(duì)la和lbE2可溶性蛋白質(zhì)具有等同的反應(yīng)性，確定其來(lái)自小鼠#85083,并產(chǎn)生IgG3抗體。通過(guò)ELISA得知，一種雜交瘤，即073-1,能夠中和HCV假病毒并對(duì)la和lbE2可溶性蛋白質(zhì)具有等同的反應(yīng)性，確定其來(lái)自小鼠#113073，并產(chǎn)生IgG3抗體。進(jìn)一步表征這21種雜交瘤?？贵w測(cè)序和克隆對(duì)人抗體83-128(來(lái)自小鼠#85083的雜交瘤)和073-1(來(lái)自小鼠#113073的雜交瘤)的重鏈和輕鏈可變序列進(jìn)行測(cè)序，并克隆到包含人IgGl/K抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)的載體中。這將人抗體83-128和073-1從IgG3抗體改變?yōu)镮gGl抗體。對(duì)來(lái)自小鼠#97895的19種雜交瘤產(chǎn)生的人抗體的重鏈可變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行對(duì)比。發(fā)現(xiàn)全部19種抗體共有顯著的序列同一性(即大于96%相同)。基于中和分析數(shù)據(jù)選擇3種雜交瘤95-2、95-14和95-38,并確定它們的輕鏈可變區(qū)序列。將人抗體95-2、95-14和95-38的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列克隆到包含人IgG1/k抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)的載體中?？贵w通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)、純化，并使用HCV假病毒中和分析進(jìn)行直接對(duì)比。選擇來(lái)自小鼠#97895的人抗體95-2進(jìn)一步表征?？寺?5-14、95-49、95-62、95-42、95-58、95-25、95-43、95-54、95-2、95-38、83-128、073-1產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列分別示于SEQIDNOs:32、37、40、35、39、34、36、38、3、33、l和5中?？寺?5-2、95-14、95-38、073-1和83-128產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別示于SEQIDNOs:4、44、53、6和2中。編碼克隆95-2、95-14、95-38、073-1和83-128產(chǎn)生的抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別示于SEQIDNOs:27、48、57、29和25中；編碼克隆95-2、95-14、95-38、073-1和83-128產(chǎn)生的抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別示于SEQIDNOs:28、49、58、30和26中。實(shí)施例2:抗體的表征HCV基因型la和lb-可溶性E2ELISA對(duì)比了人抗體95-2(圖1A)和人抗體83-128(圖1B)與可溶性HCV基因型E2-660(三角形)和可溶性HCV基因型lbE2-660(正方形)的反應(yīng)性。使用2|Jg/ml的抗原包被ELISA板，并使用2倍稀釋的抗體進(jìn)行探測(cè)。使用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗人第二抗體和PNPP底物檢測(cè)結(jié)合的抗體。發(fā)現(xiàn)人抗體95-2和83-128對(duì)兩種基因型具有相等的反應(yīng)性(參見(jiàn)圖1)。還用95-14、95-38和073-1抗體進(jìn)行了這些實(shí)驗(yàn)，所有這三種抗體等同地識(shí)別基因型la和lb(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自多種基因型的HCV假病毒的中和使用Hep3B細(xì)胞來(lái)確定人抗體95-2和83-128中和HCV假病毒的多種基因型的能力。5倍稀釋的抗體與HCV假病毒在室溫下溫育1小時(shí)。將病毒-抗體混合物添加到Hep3B細(xì)胞，然后在37°C溫育72小時(shí)。使67用Brightglo螢光素酶分析來(lái)定量感染，并在Victor3讀板器上讀取光輸出量。使用同種型匹配的無(wú)關(guān)人抗體作為陰性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)兩種人抗體95-2和83-128都能夠中和HCV基因型la、lb、2b、3a和4a假病毒(分別參見(jiàn)圖2A、2B、2C、2D和2E)?？贵w073-1也顯示能夠中和所有上述列出的假病毒(數(shù)據(jù)未顯示)?；蛐蚻a和lbE2可溶性蛋白質(zhì)的還原和非還原蛋白質(zhì)印跡分析分析了人抗體95-2和83-128與進(jìn)行了還原或非還原SDS-PAGE的來(lái)自HCV基因型la和lb的可溶性E2蛋白質(zhì)(E2-661)的反應(yīng)性。使用抗his標(biāo)簽單克隆抗體(his)、83-128和95-2，使用與HRP相偶聯(lián)的抗小鼠IgG(his)或抗人IgG(95-2和83-128)，以及增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。發(fā)現(xiàn)人抗體95-2和83-128都能夠識(shí)別經(jīng)歷了變性、還原凝膠、然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的E2-661(參見(jiàn)圖3)。人抗體95-2和83-128對(duì)表達(dá)為細(xì)菌融合蛋白的E2412-423表位的結(jié)合親和力確定了人抗體95-2和83-128對(duì)表達(dá)為細(xì)菌融合蛋白的E2412-423表位的結(jié)合親和力，總結(jié)在圖4中。山羊抗人IgGFc與Biacore芯片通過(guò)酰胺偶聯(lián)。人抗體95-2和83-128在芯片上分別被捕獲，含E2412-423氨基酸的E2-G細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)以不同的濃度流過(guò)芯片。利用BIAevaluationTM軟件擬合曲線(xiàn)，并計(jì)算親和常數(shù)。實(shí)施例3:表位的確定確定人抗體83-128和95-2識(shí)別E2蛋白質(zhì)的哪個(gè)區(qū)域?yàn)榱舜_定人抗體83-128和95-2識(shí)別E2蛋白質(zhì)的哪個(gè)區(qū)域，哺乳動(dòng)物表達(dá)的E2蛋白質(zhì)的羰基末端截短形式通過(guò)凝集素ELISA被捕獲，并使用83-128和95-2進(jìn)行探測(cè)(構(gòu)建體圖見(jiàn)圖5，ELISA數(shù)據(jù)見(jiàn)圖6)?；谶@些數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，這些抗體識(shí)別的表位在E2的氨基酸412-464內(nèi)。正如所料，所有的抗體(95-14、95-49、95-62、95-42、95-58、95-25、95-43、95-54、95-2、95-38和073-1)都在E2蛋白質(zhì)的這個(gè)區(qū)域內(nèi)識(shí)別。為了進(jìn)一步確定表位，使用細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白，因?yàn)镋2的較小片段在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中不能很好地表達(dá)。使用純化的蛋白質(zhì)包被ELISA板，并使用人抗體83-128和95-2進(jìn)行探測(cè)(構(gòu)建體圖見(jiàn)圖7，ELISA數(shù)據(jù)見(jiàn)圖8)。人抗體83-128和95-2都能夠識(shí)別所有包含E2氨基酸412-423的構(gòu)建體，因此，確定氨基酸412-423為表位。還使用073-1抗體進(jìn)行了此項(xiàng)試驗(yàn)，其同樣也能識(shí)別412-423表位(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定在412-423表位內(nèi)重要的接觸，在E2-G細(xì)菌融合蛋白中，使用丙氨酸掃描誘變將412-423表位中的每個(gè)氨基酸分別突變?yōu)楸彼?。純化的蛋白質(zhì)包被ELISA板，并使用兩種人抗體(83-128和95-2)進(jìn)行探測(cè)。使用對(duì)融合蛋白上的(His)6表位特異性的抗his單克隆抗體作為板包被的對(duì)照(參見(jiàn)圖9)?；谶@些數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)殘基413和420對(duì)人抗體95-2的結(jié)合是非常關(guān)鍵的；殘基413、418和420對(duì)人抗體83-128的結(jié)合是非常關(guān)鍵的。為了確定412-423表位內(nèi)天然發(fā)生的改變的頻率，分析這個(gè)E2區(qū)域在LosAlamosHCV數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)告的序列，這些序列通過(guò)人工優(yōu)化精簡(jiǎn)，只有完整的序列和減少為一個(gè)序列的相似的序列。基于比對(duì)(圖10),精簡(jiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中77%的序列與本實(shí)施例中使用的la和lb表達(dá)的E2蛋白質(zhì)的這個(gè)區(qū)域中的序列相同。因此，人抗體95-2和83-128應(yīng)該能夠識(shí)別這些蛋白質(zhì)。為了確定這個(gè)區(qū)域內(nèi)報(bào)告的一些序列差異是否會(huì)影響人抗體95-2和83-128的識(shí)別，將序列改變工程化到包含412-423表位的E2-G細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白中(圖11)。包括不在數(shù)據(jù)庫(kù)中的Tarr等人(2006)Hepatology中報(bào)告的來(lái)自基因型5菌抹的序列(Genbank登錄號(hào)AY785283)。純化的蛋白質(zhì)包被ELISA板，使用兩種抗體(83-128和95-2)進(jìn)行探測(cè)。使用對(duì)融合蛋白上的his標(biāo)簽特異性的抗his單克隆抗體作為板包被的對(duì)照(圖12)。人抗體95-2能夠識(shí)別所有的構(gòu)建體，除了基因型6a,它比這個(gè)特異性的基因型5序列降低了10倍。人抗體83-128能夠識(shí)別所有的構(gòu)建體，除了那些來(lái)自于特異性基因型5和6a序列的構(gòu)建體，對(duì)5a的識(shí)別較弱。實(shí)施例4:體外模型在體外模型中測(cè)試本發(fā)明的人抗體的抗病毒活性以及抑制HCV感染的能力。多種HCV感染的體外模型在本領(lǐng)域是已知的，并用于測(cè)試本發(fā)明的人抗體，包括例如(i)原代肝細(xì)胞的HCV感染；(ii)肝細(xì)胞系的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染；和(iii)使用全長(zhǎng)或亞基因組復(fù)制子進(jìn)行轉(zhuǎn)染，如C.Guha等人("Ce〃cw/fwremotMyawt/am'畫(huà)/wot/e/so/Wra//^/a"'to.尸"W/^;a"toC"LabAnimal(NY)2005,34(2):39-47)中所述。在這些體外模型中培養(yǎng)的細(xì)胞與本發(fā)明的人抗體相接觸，或者與適當(dāng)?shù)膶?duì)照抗體相接觸，并使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如通過(guò)一全測(cè)HCV病毒RNA，例如使用定量、實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)(RT/PCR)，來(lái)監(jiān)測(cè)抗體對(duì)HCV感染和病毒活性的效果。實(shí)施例5:體內(nèi)動(dòng)物模型在體內(nèi)動(dòng)物模型中測(cè)試本發(fā)明的人抗體抑制已知丙型肝炎病毒感染的能力。特別地，本發(fā)明的人抗體在黑猩猩動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試，如R.E.Lanford等人(ILARJ.2001;42(2):117-26)中所述。根據(jù)Lanford等人的描述，黑猩猩(Pantroglodytes)是唯一對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)感染敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在最初對(duì)非甲非乙型肝炎的研究中使用，包括觀察感染的臨床過(guò)程、確定病毒的物理性質(zhì)和最終HCV核苷酸的克隆。黑猩猩模型對(duì)HCV感染的早期事件的分析至關(guān)重要，因?yàn)樗菑慕佑|開(kāi)始可獲得樣品并且所有接觸動(dòng)物都可以研究的種群。因此，黑猩猩代表了真正的非選擇的種群。相反，人群通常根據(jù)疾病的狀態(tài)或抗體反應(yīng)性來(lái)選擇，并且通常包括已經(jīng)感染數(shù)十年的個(gè)體。黑猩猩模型對(duì)于提高對(duì)病毒清除相關(guān)因素的理解、分析感染的免疫應(yīng)答以及開(kāi)發(fā)疫苗是非常重要的。HCV的感染性cDNA克隆的開(kāi)發(fā)依賴(lài)于黑猩猩的使用，在使用反向遺傳學(xué)評(píng)價(jià)病毒復(fù)制的關(guān)鍵序列時(shí)也仍然需要黑猩猩模型。此外，黑猩猩已經(jīng)與DNA微陣列技術(shù)結(jié)合使用，來(lái)探測(cè)在HCV感染過(guò)程中肝臟基因表達(dá)的完整改變譜。針對(duì)HCV疾病的理解和治療方案的發(fā)展，黑猩猩還將繼續(xù)提供重要的作用。因此，給黑猩猩接種HCV，并額外給予本發(fā)明的人抗體。對(duì)照動(dòng)物接種HCV,并且或者不給予本發(fā)明的人抗體，或者給予適當(dāng)?shù)膶?duì)照抗體。在HCV接種之前、HCV接種時(shí)或者HCV接種之后，給予黑猩猩本發(fā)明的人抗體。然后使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的分析來(lái)監(jiān)測(cè)人抗體對(duì)HCV感染、發(fā)展和清除的效果。例如，HCV感染和/或清除可以通過(guò)下述進(jìn)行監(jiān)測(cè)(i)測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平的升高，指示肝損傷；(ii)通過(guò)使用例如定量、實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈反應(yīng)(RT/PCR)來(lái)檢測(cè)血清中的HCV病毒RNA;和(iii)例如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附和重組免疫印跡分析評(píng)估抗HCV抗體應(yīng)答。這些分析是本領(lǐng)域普通^支術(shù)人員已知的，并可以按照例如Lanford等人所述進(jìn)行。此外，在與上述實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)中，評(píng)估本發(fā)明的抗體對(duì)HCVEl和/或E2蛋白質(zhì)應(yīng)答的效果，例如，如Lanford等人所述。與對(duì)照動(dòng)物相比，在接觸本發(fā)明的人抗體的動(dòng)物中，HCV感染的減量調(diào)節(jié)、HCV進(jìn)展的降低或HCV清除的增加都指示了抗體預(yù)防或治療HCV感染的有效性。此外，通過(guò)在急性感染期到病毒清除的過(guò)程中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)感染動(dòng)物肝臟中基因表達(dá)的改變，利用DNA微陣列監(jiān)測(cè)本發(fā)明的人抗體對(duì)黑猩猩中HCV感染的進(jìn)行性改變的效果。對(duì)從接觸抗體的動(dòng)物和未接觸抗體的對(duì)照動(dòng)物獲得的肝組織進(jìn)行DNA孩O車(chē)列分析，所述肝組織分別采自感染之前以及整個(gè)感染和清除期間的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，例如，可到感染之后的第16周。這些研究可以使用例如Affymetrix人FLDNA微陣列進(jìn)行，該微陣列包含代表大約6800種基因的寡核苷酸，基本如Lanford等人所述。實(shí)施例6:用于人體給藥的抗HCV抗體的產(chǎn)生可以使用已知的技術(shù)來(lái)克隆和重組表達(dá)本發(fā)明的人抗體，以利于和提高它們的產(chǎn)量。使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，可將編碼本發(fā)明抗體克隆的重鏈和輕71鏈可變區(qū)的核酸序列克隆到pIE-UgammalF載體中。該載體在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，純化，并轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔4x105個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔皿上，使用G418對(duì)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)行篩選。然后將通過(guò)G418抗性選擇的抗性克隆與其它轉(zhuǎn)染瘤一起進(jìn)行檢測(cè)，分析IgG的產(chǎn)生。在存在濃度增加的曱氨喋呤的情況下生長(zhǎng)可以增加抗體的表達(dá)。選擇能夠在175nM甲氨喋呤中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物克隆單細(xì)胞用于進(jìn)一步發(fā)展。將培養(yǎng)物以低密度接種在96孔板上允許產(chǎn)生來(lái)自單細(xì)胞或克隆的培養(yǎng)物。針對(duì)人IgG的產(chǎn)生篩選培養(yǎng)物，通常選擇產(chǎn)生最高水平IgG的細(xì)胞用于進(jìn)一步應(yīng)用。將曱氨喋呤擴(kuò)增的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以產(chǎn)生包含多個(gè)冷凍小瓶細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)?；蛘撸劝滨０泛铣擅?GS)載體可以與例如使用硫代曱硫氨酸(methioninesulphoximine)實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞篩選一起使用(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,827,739;5,122,464;5,879,936;和5,891,693)。為了從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備抗體，培養(yǎng)來(lái)自上述步驟中分離的克隆的細(xì)胞，并作為生物反應(yīng)器的接種物進(jìn)行擴(kuò)增。生物反應(yīng)器通常能夠容納500升體積的培養(yǎng)基。細(xì)胞在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，直到細(xì)胞的生存能力降低為止，這表明培養(yǎng)物中產(chǎn)生了最大的抗體濃度。通過(guò)過(guò)濾去除細(xì)胞。將濾液加至蛋白A柱上?？贵w與柱相結(jié)合，并用低pH值的洗液洗脫。下一步，將抗體加至Q-Sepharose柱上，以去除殘余的污染物，例如CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和其它污染物(例如可能存在的病毒污染物)。將抗體從Q-Sepharose柱上洗脫下來(lái)、納米過(guò)濾、濃縮并使用例如PBS的緩沖液進(jìn)行洗滌。然后將制劑無(wú)菌等分到小瓶中，用于之后的給藥。等同方案本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道或能夠確定，無(wú)需使用常規(guī)試驗(yàn)之外的試驗(yàn)，還存在此處所描述的本發(fā)明的特定的實(shí)施方案的多種等同方式。這樣的等同方式也意于包含在下述的權(quán)利要求中。獨(dú)立權(quán)利要求中公開(kāi)的實(shí)施方案的任意組合都包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。參者文獻(xiàn)的引入此處所涉及的所有的出版物、專(zhuān)利以及未決的專(zhuān)利申請(qǐng)都通過(guò)《1用方式結(jié)合于本文中。序列表摘要<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>權(quán)利要求1.一種能夠與丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白質(zhì)上的非構(gòu)象(線(xiàn)性)表位相結(jié)合并且抑制病毒感染細(xì)胞的能力的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分在HCV假病毒中和試驗(yàn)中中和HCV。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體抑制受試者體內(nèi)的HCV感染。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制受試者的HCV介導(dǎo)的肝細(xì)胞病變。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體能夠與HCVE2蛋白質(zhì)或其片段的兩種或更多種HCV基因型相結(jié)合。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，該分子能夠與來(lái)自具有選自la、lb、2b、3a、4a、5、5a、6a、6g、6k及其組合的基因型的HCV病毒的HCVE2蛋白質(zhì)相結(jié)合。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述表位位于E2蛋白質(zhì)的氨基酸殘基412-464、412-423或413-420之間。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與HCVE2蛋白質(zhì)或其片段特異性結(jié)合，KD至少為大約1x10-7M、1x10_8M、1x1(T9M、1x10'10M、1xl(T11M、1x10"2jVI或更好。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含與重《連可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:1(83-128)、SEQIDNO:3(95-2)或SEQIDNO:5(073-1)至少80%相同的氨基酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含與輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:2(83-128)、SEQIDNO:4(95隱2)或SEQIDNO:6(073-1)至少80%相同的氨基酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含與重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:1(83-128)、SEQIDNO:3(95-2)或SEQIDNO:5(073-1)至少95%相同的氨基酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含與輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:2(83-128)、SEQIDNO:4(95畫(huà)2)或SEQIDNO:6(073-1)至少95%相同的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分進(jìn)一步包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含與輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQIDNO:2(83-128)、SEQIDNO:4(95-2)或SEQIDNO:6(073-1)至少95%相同的氨基酸序列。14.一種能夠與HCVE2蛋白質(zhì)上的表位特異性結(jié)合的分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，該表位與克隆83-128、073-1、95-2、95-14、95-15、95-18、95-20、95-21、95-25、95-26、95-30、95-38、95-39、95-42、95-4、95-48、95-49、95-52、95-54、95-58、95-62及其組合產(chǎn)生的抗體所結(jié)合的表位相重疊。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與SEQIDNOs:7-9(83-128)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:10-12(95-2)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:13-15(073-1)中的一個(gè)或多個(gè)至少80%相同。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),該互補(bǔ)決定區(qū)與SEQIDNOs:16-18(83-128)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:19-21(95-2)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:22-24中的一個(gè)或多個(gè)至少80%相同。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與SEQIDNOs:7-9(83-128)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:10-12(95-2)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:13-15(073-1)中的一個(gè)或多個(gè)至少95%相同。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分的輕鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該互補(bǔ)決定區(qū)與SEQIDNOs:16-18(83-128)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:19-21(95-2)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:22-24中的一個(gè)或多個(gè)至少95%相同。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR,這三個(gè)CDR與SEQIDNOs:7-9(83-128)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:10-12(95-2)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:13-15(073-1)中的一個(gè)或多個(gè)的重鏈可變區(qū)CDR至少80%相同。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，這三個(gè)CDR與SEQIDNOs:16-18(83-128)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:19-21(95-2)中的一個(gè)或多個(gè)或SEQIDNOs:22-24中的一個(gè)或多個(gè)的輕《連可變區(qū)CDR至少80%相同。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，非構(gòu)象表位包含HCVE2殘基412-423。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體不與HCVE2的構(gòu)象表位相結(jié)合。23.—種能夠與HCV相結(jié)合的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)具有共有序列CDR1(SEQIDNO:87)、CDR2(SEQIDNO:88)、CDR3(SEQIDNO:89)或其組合的重鏈可變區(qū)，和任選的一個(gè)具有共有序列CDR1(SEQIDNO:90)、CDR2(SEQIDNO:91)、CDR3(SEQIDNO:92)或其組合的輕鏈可變區(qū)。24.—種能夠特異性結(jié)合HCV的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)具有分別如SEQIDNOs:87-89所示的共有序列CDR1、CDR2和CDR3的重鏈可變區(qū)，和一個(gè)具有分別如SEQIDNOs:90-92所示的共有序列CDR1、CDR2和CDR3的輕鏈可變區(qū)。25.—種能夠與HCV相結(jié)合的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含一個(gè)由基因VH3-33編碼的重鏈可變區(qū)，和任選的一個(gè)由VkL6編碼的輕《連可變區(qū)。26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制HCV與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)合。27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分抑制HCVE2蛋白質(zhì)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)合。28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，所述抗體為全長(zhǎng)抗體。29.—種包含前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體的抗原結(jié)合部分的分離的多肽。30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域。31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分為單鏈抗體。33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分為Fab片段。34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，進(jìn)一步包含才示"i己或4素。35.—種在藥學(xué)上可接受的載體中包含前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體或其抗原結(jié)合部分的組合物。36.—種包含兩種或更多種前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體的組合物，其中，所述抗體能夠與一種或多種HCVE2蛋白質(zhì)的不同表位相結(jié)合。37.—種編碼人抗體可變區(qū)的分離的核酸，該抗體能夠結(jié)合包含與重鏈可變區(qū)83-128(SEQIDNO:25)、輕鏈可變區(qū)83-128(SEQIDNO:26)、重鏈可變區(qū)95-2(SEQIDNO:27)、輕鏈可變區(qū)95-2(SEQIDNO:28)、重鏈可變區(qū)073-1(SEQIDNO:29)、輕鏈可變區(qū)073-1(SEQIDNO:30)或其組合至少90%相同的序列的HCV。38.—種編碼人抗體可變區(qū)的分離的核酸，該抗體能夠結(jié)合包含與重鏈可變區(qū)83-128(SEQIDNO:25)、輕鏈可變區(qū)83-128(SEQIDNO:26)、重鏈可變區(qū)95-2(SEQIDNO:27)、輕鏈可變區(qū)95-2(SEQIDNO:28)、重鏈可變區(qū)073-1(SEQIDNO:29)、輕鏈可變區(qū)073-1(SEQIDNO:30)的核酸在高嚴(yán)格性條件下雜交的序列的HCV。39.—種包含權(quán)利要求37或38所述的核酸的表達(dá)載體。40.—種包含^l利要求37或38所述的核酸的宿主細(xì)^^。41.一種包含分離的蛋白質(zhì)或其片段、或編碼HCVE2包膜糖蛋白的非構(gòu)象表位的核酸的HCV疫苗。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的疫苗，其中，所述疫苗包含分離的HCVE2蛋白質(zhì)的殘基412-423。43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的疫苗，其中，所述疫苗由偶聯(lián)到載體上的分離的HCVE2蛋白質(zhì)的殘基412-423組成，以提高對(duì)肽抗原的免疫應(yīng)答。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的疫苗，其中，所述載體選自蛋白質(zhì)載體、小分子載體或病毒樣顆粒(VLP)載體。45.—種試劑盒，包含一種或多種權(quán)利要求1所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，和用于治療HCV介導(dǎo)的疾病的說(shuō)明書(shū)。46.—種治療受試者中HCV感染的方法，該方法包括給予受試者有效抑制HCV感染癥狀的量的前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述受試者為人。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分經(jīng)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下對(duì)受試者給藥。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合部分與第二治療劑聯(lián)合給藥。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述第二治療劑為第二人抗體或其抗原結(jié)合部分。51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述第二治療劑為抗病毒劑。52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述第二治療劑為HCV疫苗。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述HCV疫苗為HCVE2蛋白質(zhì)或其片段。54.—種在藥學(xué)上可接受的載體中包含權(quán)利要求1所述的人抗體或其抗原結(jié)合部分的適于治療哺乳動(dòng)物中HCV介導(dǎo)的疾病或障礙的組合物。55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的組合物，其中，所述組合物進(jìn)一步包含能夠與HCV相結(jié)合的第二人抗體。56.—種治療哺乳動(dòng)物中HCV感染的方法，包含給予哺乳動(dòng)物能夠與HCV或其片段相結(jié)合的權(quán)利要求1所述的抗體或其片段，從而使HCV對(duì)細(xì)胞的感染性受到抑制。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述抗體或其片段能夠與HCVE2蛋白質(zhì)或其片段的兩種或更多種HCVE2基因型相結(jié)合。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中，給予兩種或更多種抗體或其片段。59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述能夠與HCV相結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分為選自83-128、073-1、95-2、95-14、95-15、95-18、95-20、95-21、95-25、95-26、95-30、95-38、95-39、95-42、95-4、95-48、95-49、95-52、95-54、95-58、95-62及其組合的人單克隆抗體。60.—種一全測(cè)哺乳動(dòng)物中的HCV感染的方法，包括將哺乳動(dòng)物的體液與權(quán)利要求1所述的抗體或其片段相接觸，并確定是否發(fā)生結(jié)合，所述結(jié)合指示存在HCV感染。61.—種鑒定能夠與HCVE2蛋白質(zhì)的兩種或更多種基因型交叉反應(yīng)的抗體或其片段的方法，包括將候選抗體與HCVE2蛋白質(zhì)的非構(gòu)象表位接觸，并確定是否發(fā)生結(jié)合，其中，所述與非構(gòu)象表位的結(jié)合指示能夠與HCVE2蛋白質(zhì)的兩種或更多種基因型交叉反應(yīng)的抗體。62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述抗體為人抗體血清、多克隆抗體或單克隆抗體。63.—種根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法鑒定出的抗體或其片段。64.—種重組HCVE2蛋白質(zhì)，包含為非構(gòu)象的并且當(dāng)引入哺乳動(dòng)物中時(shí)能夠誘導(dǎo)中和抗體的表位。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的HCVE2蛋白質(zhì)，其中，所述哺乳動(dòng)物為人、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或小鼠。66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的E2蛋白質(zhì)，其中，所述小鼠為包含人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了能夠與丙型肝炎病毒(HCV)相結(jié)合的分離的人單克隆抗體，以及相關(guān)的基于抗體的組合物和分子。人抗體可以在能夠通過(guò)進(jìn)行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生人單克隆抗體多種同種型的轉(zhuǎn)染瘤或非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)中產(chǎn)生。本發(fā)明還公開(kāi)了包含人抗體的藥物組合物、能夠產(chǎn)生人抗體的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和雜交瘤，以及使用人抗體的治療和診斷方法。文檔編號(hào)C07K16/10GK101679512SQ200880010301公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年2月13日優(yōu)先權(quán)日2007年2月21日發(fā)明者D·阿姆布羅西諾,G·J·巴布科克,S·索羅安,T·布羅埃林,W·D·小托馬斯申請(qǐng)人:馬薩諸塞州大學(xué)