專利名稱：纖維素分解多肽及其在用于制備溶劑和燃料的微生物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和遺傳工程的領(lǐng)域，并且特別地關(guān)注借助于合適的酶試劑和表達(dá)所述酶試劑的微生物利用纖維素和木質(zhì)素纖維素材料的策略。更具體地，本發(fā)明涉及纖維素分解多肽的應(yīng)用和它們通過在產(chǎn)溶劑微生物(solventogenic micro-organisms)中直接或表達(dá)而制備溶劑的用途。
背景技術(shù)：
纖維素和木質(zhì)素纖維素材料是植物生物量的主要成分，并且其中存在的纖維素聚合物可以提供用于制備溶劑，諸如乙醇、丙酮或丁醇的葡萄糖或其他可發(fā)酵的單糖或寡糖的大量來源。纖維素聚合物可以被纖維素解聚酶水解，所述纖維素解聚酶通常被稱為纖維素水解酶(cellulolytic enzyme)或纖維素酶。例如，天然纖維素的水解主要涉及4種類型的纖維素酶纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase) (1，4_β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶， EC 3.2. 1.91)，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(內(nèi)切_1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC 3.2. 1.4)，內(nèi)切-加工性(processive)纖維素酶(EC 3.2. 1.4. /3. 2. 1.91)，和 β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)。纖維素酶和相關(guān)的酶已經(jīng)廣泛地用于生物技術(shù)的各個領(lǐng)域包括食品， 啤酒，葡萄酒，動物飼料，紡織品和洗滌品，紙漿和紙工業(yè)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和其他領(lǐng)域(關(guān)于綜述參見 Bhat 2000. Biotechnical Advances (生物技術(shù)進(jìn)展)18 :355-383)。纖維素酶的性質(zhì)可以不同，諸如尤其是，它們可以充當(dāng)內(nèi)切葡聚糖酶或加工性外切葡聚糖酶，它們可以產(chǎn)生多種長度的單體或低聚體，它們可以具有水解不同的纖維素形式諸如結(jié)晶纖維素、半結(jié)晶纖維素、無定形纖維素或半纖維素的不同能力，它們可以進(jìn)一步顯示結(jié)合纖維素物質(zhì)的不同的強(qiáng)度，不同的動力學(xué)參數(shù)等。因此，持續(xù)存在著對于進(jìn)一步表征其他的纖維素酶，從而鑒定有效的酶并優(yōu)化酶組合的需求。在產(chǎn)溶劑微生物中重組表達(dá)纖維素酶允許通過這些微生物直接從含纖維素材料中制備有用的溶劑包括，尤其是乙醇。至今，已經(jīng)主要將來自分解纖維素的梭菌屬 (Clostridium)物種的酶用于此目的。然而，仍然存在著對鑒定具有更強(qiáng)酶活性的酶的需求。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了一種在本文中稱為“ACLA”的纖維素分解酶作為特別適合用于工業(yè)制備溶劑、燃料和化學(xué)中間體的背景中的酶，因?yàn)榕c其他細(xì)菌纖維素酶諸如以前從解纖維素梭菌(Clostridium cellulolyticum)或熱纖梭菌(Clostridium thermocellum) 中鑒定的那些相比，其具有較高的活性。因此，ACLA有利于直接用于體外降解纖維素和用于在微生物(更特別地在產(chǎn)生溶劑的(產(chǎn)溶劑)微生物)中以產(chǎn)生可發(fā)酵的糖類為目標(biāo)的異源制備的背景中。在一個方面，本發(fā)明提供了 ACLA多肽、或其功能片段、同源物或變體在纖維素降解中，特別是在工業(yè)生產(chǎn)可發(fā)酵的糖類中，更特別地在溶劑制備中的用途。特別地，本發(fā)明提供了降解包含纖維素的物質(zhì)的方法，所述包含纖維素的物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量，所述方法包括使所述物質(zhì)與本文教導(dǎo)的ACLA多肽或其功能片段、同源物或變體或與表達(dá)ACLA或其功能片段、同源物或變體的重組微生物接觸。在具體實(shí)施方案中， 所述物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。因此，本發(fā)明提供了從包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法，包括應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的降解包含纖維素的物質(zhì)的方法，即，包括將所述物質(zhì)與表達(dá)ACLA或 ACLA多肽的功能片段、同源物、變體的重組微生物和/或與本文教導(dǎo)的ACLA或ACLA多肽的功能片段、同源物、變體接觸。在具體實(shí)施方案中，所述物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。本發(fā)明的具體實(shí)施方案提供了從包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法，該方法包括a)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)假單胞菌屬物種O^seudomonas sp. )ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，以及b)使所述物質(zhì)與所述ACLA多肽接觸。在更具體的實(shí)施方案中，所述方法還可以包括使所述ACLA酶或活性片段與所述重組宿主細(xì)胞分離的步驟。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ACLA特別適合于含纖維素材料(包括木質(zhì)素纖維素生物量) 的工業(yè)降解。因此，本發(fā)明提供了 ACLA在同步糖化發(fā)酵(SSF)或分步(單獨(dú))水解發(fā)酵 (SHF)中的用途。這些方法涉及在受控條件下分批降解含纖維素材料。因此，本發(fā)明的一個方面提供了表達(dá)ACLA多肽，ACLA多肽的功能片段、同源物、或變體的微生物，所述微生物能夠?qū)⒗w維素降解成為可發(fā)酵的糖類。這暗示該酶由該微生物分泌使得其可以降解與其接觸的含纖維素材料。如本文所述，這樣的微生物在制備溶劑、燃料和化學(xué)中間體的工業(yè)方法中是有用的。然而，還考慮其中所述多肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的實(shí)施方案。例如，本發(fā)明提供了表達(dá) ACLA多肽的微生物，使得其作用于被微生物內(nèi)化的纖維素聚合物。備選地，設(shè)想在表達(dá) ACLA多肽的微生物的至少一部分溶解時釋放所述ACLA多肽。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的從包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法包括使如本文所述的重組微生物在包含或富含結(jié)晶纖維素、半結(jié)晶纖維或無定形纖維素的纖維素物質(zhì)上生長，由此確保從含纖維素物質(zhì)直接制備可發(fā)酵的糖類，其可以用于制備化學(xué)品、化學(xué)中間體、燃料或溶劑諸如乙醇。本發(fā)明的另一個方面提供了假單胞菌屬ND137菌株的分離的ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和它們在纖維素的工業(yè)降解中的用途。更特別地，ACLA多肽由本文提供的序列表征。本發(fā)明的又一個方面提供了表達(dá)ACLA多肽，其功能片段、同源物或變體的重組微生物，其可以用于聯(lián)合(consolidated)生物加工中，即，能夠?qū)⒗w維素材料的降解產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)變成工業(yè)產(chǎn)品諸如溶劑、燃料或化學(xué)中間體。這樣的微生物除了編碼ACLA多肽、功能片段、同源物或變體的基因以外，可以還包含其他確保制備燃料、溶劑或其他化學(xué)品或化學(xué)中間體的轉(zhuǎn)基因。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，該重組微生物包含重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或其同源物的功能片段和/或變體，所述重組核酸分子可操作地連接至允許通過所述微生物的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列和/或允許通過所述微生物的分泌的分泌信號序列并且包含一種或多種參與從可發(fā)酵的糖制備目的產(chǎn)物的重組核酸分子。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)溶劑微生物，所述產(chǎn)溶劑微生物表達(dá)假單胞菌屬ND137的ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體。該重組產(chǎn)溶劑微生物可以包含編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在所述微生物中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。在具體實(shí)施方案中，該重組產(chǎn)溶劑微生物可以產(chǎn)生一種或多種溶劑，所述溶劑選自乙醇，丙酮，丁醇，丙酸，丁酸，醚和甘油。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該重組產(chǎn)溶劑微生物可以產(chǎn)生，或可以被改造以產(chǎn)生，至少或主要乙醇。乙醇的工業(yè)重要性在迅速地不斷增加，主要是由于其作為環(huán)境可接受的燃料的效用。因此，在一個實(shí)施方案中，所述重組產(chǎn)溶劑微生物可以是產(chǎn)乙醇微生物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，該重組產(chǎn)溶劑微生物是細(xì)菌。在更具體的實(shí)施方案中，該重組產(chǎn)溶劑細(xì)菌是產(chǎn)乙醇細(xì)菌。備選地，該重組產(chǎn)溶劑微生物是酵母，更具體地，產(chǎn)乙醇酵母。在更具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的背景中使用的產(chǎn)溶劑細(xì)菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，諸如例如發(fā)酵單胞菌屬物種(Zymomonas species)的細(xì)菌。在另一個實(shí)施方案中，該細(xì)菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，諸如例如梭菌屬物種(Clostridium species)的細(xì)菌。本發(fā)明由此還包括將來源于革蘭氏陰性細(xì)菌的纖維素酶引入至革蘭氏陽性細(xì)菌中，這在以前沒有被提過。在具體實(shí)施方案中，重組的產(chǎn)溶劑微生物和優(yōu)選產(chǎn)乙醇微生物是梭菌屬物種，更特別地丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。在其他實(shí)施方案中，重組的產(chǎn)溶劑微生物和特別地產(chǎn)乙醇微生物是發(fā)酵單孢菌屬物種，更特別地運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。這些細(xì)菌特別擅長地作為產(chǎn)生溶劑和特別地產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，該重組產(chǎn)溶劑微生物包含重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或其同源物的功能片段和/或變體，所述重組核酸分子可操作地連接至允許通過所述微生物的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列和/或允許通過所述微生物的分泌的分泌信號序列。因此，本發(fā)明提供了從包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法，所述包含纖維素的物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量，所述方法包括用一種或多種微生物，更特別地本文教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物處理所述物質(zhì)。在具體實(shí)施方案中，所述物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。在最具體的實(shí)施方案中，所述溶劑是乙醇并且所述微生物是產(chǎn)乙醇微生物。還應(yīng)該理解盡管在前述的方面和實(shí)施方案中已經(jīng)結(jié)合重組微生物基本地公開了本發(fā)明，但本發(fā)明還包括涉及有效用于獲得該重組微生物的重組手段和試劑，使用所述重組手段和試劑獲得該重組微生物的方法，用于在該重組微生物中表達(dá)所需多肽的方法，以及涉及表達(dá)的多肽及其組合本身和它們的制備方法的多個方面。
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在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明教導(dǎo)了 ACLA的同源物和所述同源物的功能片段和/或變體，以及它們在酶降解纖維素和/或在重組微生物諸如在產(chǎn)溶劑微生物中表達(dá)的用途。更特別地，本文考慮的ACLA同源物包括與ACLA的DX結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的具體實(shí)施方案提供了本文教導(dǎo)的重組產(chǎn)溶劑微生物，其中ACLA多肽的同源物是 Saccharophagus degradans 2-40 株的 Cel5H 多肽。本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)一步鑒定了天然ACLA多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可概括為 GH5-DPR-CBM6-PSL-DZ，其中GH5代表其糖苷水解酶家族5結(jié)構(gòu)域，DPR代表富含-天冬氨酸-脯氨酸區(qū)，CBM6代表糖-結(jié)合組件(module)家族6結(jié)構(gòu)域，PSL代表聚絲氨酸接頭，以及不被這種解釋所限制，DZ表示被本發(fā)明人鑒定為推測的糖-結(jié)合組件的C-末端結(jié)構(gòu)域。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 ACLA多肽或其同源物或變體的分離片段，其具有結(jié)構(gòu)PSL-DZ，CBM6-PSL-DZ或DPR-CBM6-PSL-DZ，其中PSL代表聚絲氨酸接頭，且 DPR代表富含-天冬氨酸-脯氨酸區(qū)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了 ACLA酶的功能片段和它們在酶降解纖維素和/或微生物發(fā)酵中的用途。根據(jù)具體實(shí)施方案，提供了這樣的重組微生物，其表達(dá)包含一個或多個結(jié)構(gòu)域的ACLA酶的功能片段，所述結(jié)構(gòu)域選自或?qū)?yīng)于ACLA的GH5結(jié)構(gòu)域，CBM6結(jié)構(gòu)域和DZ結(jié)構(gòu)域。在該片段中一個或多個所述結(jié)構(gòu)域的存在可以賦予該片段以由各個結(jié)構(gòu)域引起的功能性。本發(fā)明的另一方面提供了 ACLA多肽、其同源物、功能片段和/或變體與一個或多個異源結(jié)構(gòu)域融合的改造形式，所述異源結(jié)構(gòu)域可以提供在糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝中有用的其他功能和活性，諸如解聚纖維素的活性，結(jié)合纖維素的活性，形成多纖維素酶體(cellulosome)的活性或其他活性。因此，具體實(shí)施方案提供了本文教導(dǎo)的重組微生物，其中所述ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，與一個或多個與所述ACLA多肽或其同源物異源的結(jié)構(gòu)域融合，所述結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白(cellulosomal scaffoldin protein)的糖苷水解酶(GH)催化結(jié)構(gòu)域，糖結(jié)合組件(CBM)結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白(cohesion)結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定(dockerin)結(jié)構(gòu)域，和親水(X組件)結(jié)構(gòu)域。另外地或備選地，該Cel5H多肽或其同源物，或所述Cel5H多肽或所述同源物的功能片段和/或變體與異源的或其天然信號肽融合。本發(fā)明的另一方面涉及ACLA酶和其他多肽或酶的聯(lián)合使用，所述其他多肽或酶有效用于糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝中，諸如解聚纖維素的酶，結(jié)合纖維素的酶或降解纖維素的酶。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 ACLA酶和其他酶的聯(lián)合使用，所述其他酶包括降解纖維素中的其他纖維素分解酶，諸如但不限于，在溶劑制備的背景中的那些。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于酶降解纖維素的纖維素酶的混合物(也稱為“雞尾酒”)。因此，根據(jù)具體實(shí)施方案，提供了分離的組合物，其包含ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，且還包含一種或多種參與糖聚合物代謝，和特別地參與纖維素代謝的多肽，優(yōu)選一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更優(yōu)選本文教導(dǎo)的一種或多種纖維素酶，其任選地與木聚糖酶組合。所述混合物特別地包含2 種以上，更特別地3種以上，最特別地4種以上，典型地5種或6種以上不同的酶。在所述組合物的具體實(shí)施方案中，所列舉的組分作為離散的或游離的多肽存在。在其他實(shí)施方案中，所列舉的多肽包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了共表達(dá)ACLA或相關(guān)多肽和其他多肽或酶的優(yōu)勢，所述其他多肽或酶優(yōu)選地為重組多肽或酶，其有效用于糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝中，諸如解聚纖維素的多肽，結(jié)合纖維素的多肽，形成多纖維素酶體的多肽(諸如，例如，支架蛋白(scaffoldin))或其他多肽。這樣的共表達(dá)，和任選地和特別地共分泌提供附加的或補(bǔ)充的活性和功能，導(dǎo)致在本發(fā)明的背景中設(shè)想的微生物更有效的解聚和利用纖維素。因此具體實(shí)施方案提供了重組微生物，包括但不限于本文教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物，其共表達(dá)和任選地共分泌ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/ 或變體，和一種或多種多肽(在本文中也稱為共表達(dá)的多肽)，最特別地參與糖聚合物代謝和特別地纖維素代謝的重組多肽，特別地和一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶， 更特別地和一種或多種糖苷水解酶，甚至更特別地和一種或多種纖維素酶。在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表達(dá)(a)假單胞菌屬物種O^seudomonas sp.)ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和(b) —種或多種另外的除所述ACLA多肽以外的外源纖維素降解酶的重組微生物。在具體實(shí)施方案中，所述酶在微生物中是有活性的或作為離散的或游離的多肽分泌。在其他實(shí)施方案中，所列舉的多肽包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。在具體實(shí)施方案中，所述一種或多種共表達(dá)的多肽諸如共表達(dá)的酶，更特別地共表達(dá)的纖維素酶的催化作用對于ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或其同源物的功能片段和/或變體的酶活性是附加的或補(bǔ)充的，優(yōu)選補(bǔ)充的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述一種或多種共表達(dá)的纖維素酶可以選自家族_5， 6，8，9和48纖維素酶。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，所述一種或多種共表達(dá)的纖維素酶可以選自解纖維素梭菌(Clostridium cellulolyticum)纖維素酶Cel48F，Cel9G, Cel9R, Cel9P, Cel9E, Cel9H, Cel9J, Cel9M, Cel8C, Cel5N 禾口 Cel5A,以及 Saccharophagus degradans 2-40 株纖維素酶 Cel5H，Cel9A, Cel9B, Cel5J, Cel5I, Cel5F, Cel5D, Cel5B, Cel9G, Cel5E, Cel5A, Cel5C和Cel6A，以及任一種所述纖維素酶的功能片段和/或變體。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了本文教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物，其中ACLA多肽或其同源物， 或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和任選地如上教導(dǎo)的一種或多種共表達(dá)的多肽，更特別地一種或多種共表達(dá)的纖維素酶，包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體或小型多纖維素酶體中(在此說明書全文中多纖維素酶體的總稱中始終包括兩者)。多纖維素酶體可以提供尤其是結(jié)合纖維素活性和解聚纖維素活性的超分子組織結(jié)構(gòu) (organisation)，從而實(shí)現(xiàn)糖聚合物代謝，特別地纖維素代謝的更高效率。另一個方面提供了編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸序列。本發(fā)明此方面的進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸序列，所述重組核酸序列可操作地連接至允許在目的宿主微生物中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。在具體實(shí)施方案中，ACLA多肽由宿主微生物分泌。在具體實(shí)施方案中，所述宿主為能夠?qū)⒗w維素的一種或多種降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槟康漠a(chǎn)物的微生物。在更具體的實(shí)施方案中，所述宿主是產(chǎn)溶劑微生物。在更具體的實(shí)施方案中，所述宿主為本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)乙醇微生物。在本文提供的重組核酸分子的具體實(shí)施方案中，編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核酸序列適應(yīng)宿主微生物的密碼子偏倚。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸序列，所述重組核酸序列可操作地連接至允許在目的宿主微生物，特別地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物和更優(yōu)選地產(chǎn)乙醇微生物中的分泌的分泌信號序列。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了編碼ACLA多肽或其同源物，或編碼所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的重組核酸分子，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中的分泌的分泌信號序列，且可操作地連接至允許在目的宿主微生物， 特別地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物和更特別地產(chǎn)乙醇微生物中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及載體，諸如例如克隆載體，穿梭載體和/或表達(dá)載體， 其包含上面公開的一種或多種重組核酸。一個進(jìn)一步的方面提供了用一種或多種所述重組核酸或用上述的載體轉(zhuǎn)化的目的宿主微生物。在一個實(shí)施方案中，該微生物可以是細(xì)菌，更特別地選自下列的細(xì)菌 大腸桿菌(Escherichia coli), Salmonella tymphimurium,粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens),鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)禾口枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。所述細(xì)菌特別適合于過量產(chǎn)生重組多肽，例如為了純化的目的。在具體實(shí)施方案中，該宿主微生物為本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物且優(yōu)選產(chǎn)乙醇微生物。一個進(jìn)一步的方面提供了由這樣轉(zhuǎn)化的微生物直接獲得或可由其獲得的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或細(xì)胞提取物。因此，還提供了用于獲得根據(jù)本發(fā)明的重組微生物，包括但不限于產(chǎn)溶劑微生物的方法。在具體實(shí)施方案中，提供了用于獲得本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)乙醇微生物的方法，該方法包括用本文教導(dǎo)的重組核酸或載體轉(zhuǎn)化宿主微生物。進(jìn)一步提供了用于產(chǎn)生，和任選地和最特別地分泌一種或多種ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的方法，所述方法包括用本文教導(dǎo)的各種重組核酸或載體中的一種或多種轉(zhuǎn)化宿主微生物，并且在有效引起所述各種多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)或保持這樣轉(zhuǎn)化的微生物。有利地，所述各種多肽以生物活性形式產(chǎn)生。任選地，該方法可以包括分離各種多肽的步驟。因此，還考慮本文公開的重組核酸、載體或宿主細(xì)胞在產(chǎn)生，和任選地和特別地分泌ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體中的應(yīng)用。 優(yōu)選所述各種多肽以生物活性形式產(chǎn)生。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了下述各項在從包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、 燃料或化學(xué)中間體中的用途(i)假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，(ii)編碼假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核苷酸序列，(iii)包含編碼假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核苷酸序列的表達(dá)載體，其中所述核酸序列可操作地連接至允許在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列；(iv)表達(dá)假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的宿主細(xì)胞，(ν)用編碼假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或(vi)根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的重組產(chǎn)溶劑微生物。在上述多肽、重組核酸、載體、轉(zhuǎn)化的宿主微生物的具體實(shí)施方案中，方法和用途的特征在于下面特征中的一個或多個-所述ACLA同源物包含與ACLA的DZ結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域；和/或-所述ACLA 同源物為 Saccharophagus degradans 1-40 株的 Cel5H 多肽；和 / 或-所述功能片段包含一個或多個結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域選自或?qū)?yīng)于ACLA的GH5結(jié)構(gòu)域，CBM6結(jié)構(gòu)域和DZ結(jié)構(gòu)域；和/或-所述一種或多種ACLA多肽或其同源物，或所述一種或多種ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體與一個或多個與ACLA多肽或其同源物異源的結(jié)構(gòu)域融合，所述異源的結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白的GH催化結(jié)構(gòu)域，CBM結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定結(jié)構(gòu)域，和X組件結(jié)構(gòu)域；和/或-所述一種或多種ACLA多肽或其同源物，或所述一種或多種ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體可以與一種或多種參與糖聚合物代謝，特別地參與纖維素代謝的多肽，優(yōu)選重組多肽或酶，優(yōu)選地與一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更優(yōu)選地與一種或多種本文教導(dǎo)的異源纖維素酶共表達(dá)和任選地共分泌；和/或-所述一種或多種ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和任選地如上面所教導(dǎo)的一種或多種共表達(dá)的多肽，更特別地共表達(dá)的纖維素酶包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。本發(fā)明人對ACLA多肽的結(jié)構(gòu)和組織已經(jīng)進(jìn)一步進(jìn)行了全面的分析，并且已經(jīng)鑒定了在ACLA多肽的C-末端附近存在以前未曾同樣鑒定到的新結(jié)構(gòu)域(此后稱為結(jié)構(gòu)域 DZ)。不受限制地，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)提示了針對該DZ結(jié)構(gòu)域的推測的糖結(jié)合組件(和/或低聚組件功能)并且指示其存在可能至少部分地是ACLA解聚結(jié)晶纖維素的良好能力的原因。因此，本發(fā)明進(jìn)一步認(rèn)識到DZ結(jié)構(gòu)域或ACLA多肽的包含DZ結(jié)構(gòu)域的部分可以用于多種酶體系中以改善它們消化和降解結(jié)晶纖維素的能力。因此，進(jìn)一步的方面是假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽的分離的結(jié)構(gòu)域(DZ結(jié)構(gòu)域)，即所述ACLA多肽(諸如，例如，在圖IC中顯示的示例性的成熟ACLA多肽SEQ ID NO :3中)的氨基酸465-氨基酸558或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域，或所述DZ結(jié)構(gòu)域或所述同源結(jié)構(gòu)域的功能片段和/或變體。在具體實(shí)施方案中，與ACLA DZ同源的結(jié)構(gòu)域是&iccharophagus degradans 2-40 的Cel5H多肽(諸如，例如，在圖IE中顯示的示例性的成熟Cel5H多肽SEQ ID NO :5中) 的從氨基酸496延伸至氨基酸596的結(jié)構(gòu)域。具體實(shí)施方案提供了 ACLA多肽或其同源物或變體的分離片段，其具有結(jié)構(gòu) PSL-DZ，CBM6-PSL-DZ或DPR-CBM6-PSL-DZ，其中DPR, CBM6和PSL具有本說明書中他處所解釋的含義。這樣的片段包含DZ結(jié)構(gòu)域，所述DZ結(jié)構(gòu)域提供其有利的功能，和任選地，這樣的片段可以包括ACLA糖結(jié)合組件CBM6，所述CBM6可以進(jìn)一步促進(jìn)降解結(jié)晶纖維素或半纖維素物質(zhì)的能力。此外，內(nèi)源性接頭序列可以為將DZ和任選地CBM6結(jié)構(gòu)域與其他多肽融合同時保留它們的結(jié)構(gòu)和功能提供有利的手段。因此，具體實(shí)施方案提供了 Cel5H多肽的分離片段，其包含與ACLA的DZ結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域。此外考慮的是分離的DZ結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或如上教導(dǎo)的分離片段作為糖結(jié)合組件的應(yīng)用。這樣的應(yīng)用可以對多種酶體系賦予新的糖-或纖維素-結(jié)合特性。另一個方面涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽包含分離的DZ結(jié)構(gòu)域，最特別地ACLA的分離的DZ結(jié)構(gòu)域，或其功能片段和/或變體，或包含含有DZ結(jié)構(gòu)域的ACLA的分離片段，并且還包含與ACLA多肽或其同源物異源的一個或多個結(jié)構(gòu)域，所述一個或多個結(jié)構(gòu)域選自多纖維素酶體支架蛋白的GH催化結(jié)構(gòu)域，CBM結(jié)構(gòu)域，黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸如錨定結(jié)構(gòu)域，和X組件結(jié)構(gòu)域。這樣的組件組合允許生成新的纖維素降解酶，所述纖維素降解酶具有針對結(jié)晶纖維素或半纖維素物質(zhì)的有用活性。其他方面提供了嵌合多肽，所述嵌合多肽包含分離的DZ結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/ 或變體，或包含DZ結(jié)構(gòu)域的ACLA的分離片段，融合于與ACLA多肽或其同源物異源的一種或多種參與糖聚合物代謝，特別地參與纖維素代謝的多肽，優(yōu)選地融合于一種或多種能夠降解木質(zhì)素纖維素材料的酶，更優(yōu)選融合于一種或多種糖苷水解酶，甚至更優(yōu)選地融合于一種或多種纖維素酶。然而，也考慮另外的一個或多個DZ結(jié)構(gòu)域與如本文所述的ACLA多肽或其同源物，或其片段和/或變體的融合。一個進(jìn)一步的方面提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽。此方面的一個具體實(shí)施方案提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的 DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中，優(yōu)選地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物中和更優(yōu)選地在產(chǎn)乙醇微生物中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列?！獋€進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的DZ 結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中，優(yōu)選地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物中和更優(yōu)選地在產(chǎn)乙醇微生物中的分泌的分泌信號序列。此方面的另一個進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了重組核酸分子，所述重組核酸分子編碼分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或編碼包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或編碼如上所述的嵌合多肽，所述重組核酸分子可操作地連接至允許在目的宿主微生物中的分泌的分泌信號序列，和可操作地連接至允許在目的宿主微生物中，優(yōu)選地在本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物中和更優(yōu)選地在產(chǎn)乙醇微生物中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。
一個進(jìn)一步的方面提供了載體，諸如例如克隆載體，穿梭載體和/或表達(dá)載體，其包含任一種上述重組核酸分子。一個進(jìn)一步的方面提供了用上述重組核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的目的宿主微生物。 在具體實(shí)施方案中，該微生物是細(xì)菌，更優(yōu)選地選自下列的細(xì)菌大腸桿菌，Salmonella tymphimurium，粘質(zhì)沙雷氏菌，鼠傷寒沙門氏菌和枯草芽孢桿菌。在具體實(shí)施方案中，該微生物可以是本說明書中其他地方教導(dǎo)的產(chǎn)溶劑微生物且優(yōu)選產(chǎn)乙醇微生物。一個進(jìn)一步的方面提供了由這樣轉(zhuǎn)化的微生物直接獲得或可由其獲得的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或細(xì)胞提取物。在具體實(shí)施方案中，分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或如上所述的嵌合多肽，和任選地一種或多種共表達(dá)的參與糖聚合物代謝，特別地參與纖維素代謝的多肽可以包含在雜交的和/或共價的多纖維素酶體中。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了降解包含纖維素的物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量的方法，所述方法包括使所述物質(zhì)與分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或與包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或與如上所述的嵌合多肽，或與表達(dá)這些的重組微生物接觸。在一個實(shí)施方案中，所述物質(zhì)可以包含或富含結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素或無定形纖維素。相關(guān)的方面提供了從包含纖維素的物質(zhì)諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量中制備溶劑的方法，所述方法包括用分離的DZ結(jié)構(gòu)域或與其同源的分離的結(jié)構(gòu)域或其功能片段和/或變體，或用包含DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的ACLA的分離片段，或用如上所述的嵌合多肽，或用表達(dá)這些的重組的產(chǎn)溶劑微生物處理所述物質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，所述物質(zhì)可以包含或富含結(jié)晶纖維素。優(yōu)選地，溶劑可以是乙醇，并且該微生物可以是產(chǎn)乙醇微生物。一個進(jìn)一步的方面提供了通過本文所述的方法獲得的或可獲得的包含纖維素降解產(chǎn)物和/或溶劑，更特別地乙醇的組合物。所述組合物可以是粗制培養(yǎng)基或針對ACLA多肽(或其同源物或片段)的產(chǎn)物進(jìn)行了(至少)部分富集和/或純化或針對所述溶劑進(jìn)行了部分地富集和/或純化。在具體實(shí)施方案中，這樣的組合物的特征在于增加的葡萄糖、纖維二糖和纖維三糖含量。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，提供了這樣的組合物，其中葡萄糖、 纖維二糖和/或纖維三糖的含量大于IOwt %，大于20wt %，大于30wt %，大于40wt %，大于 50wt%，大于60wt%，大于70wt%，大于80wt%，大于90wt%以上。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，這樣的組合物的特征在于高溶劑含量。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，提供了這樣的組合物，其中溶劑的含量大于10襯％，大于20襯％，大于 30wt %，大于 40wt %，大于 50wt %，大于 60wt %，大于 70wt %，大于 80wt %，大于 90wt %，大于90wt%，或96% -99，9wt%。在具體實(shí)施方案中，該組合物的溶劑濃度大于約10g/L，和優(yōu)選大于約15g/L。本發(fā)明的這些和其他方面和實(shí)施方案在下面和在所附的權(quán)利要求中進(jìn)一步解釋， 并通過非限制性實(shí)施例說明。附圖簡述

圖1圖示了假單胞菌屬物種ND137的天然ACLA蛋白的示例性氨基酸序列，所述氨基酸序列含有(A)或不含有(B) N-末端分泌信號序列；Saccharophagus degradans 2-40株的天然Cel5H多肽的示例性編碼核酸序列(C)和氨基酸序列(D-E)，所述氨基酸序列含有 (D)或不含有(E) N-末端分泌信號序列；和假單胞菌屬物種ND137的天然ACLA蛋白的示例性編碼核酸序列(F)。 圖2示意性圖示了 ACLA和Cel5H的結(jié)構(gòu)域的比較。 圖3比較了 ACLA與Cel5H的一般組織結(jié)構(gòu)。ACLA具有下列的組織結(jié)構(gòu)(從酶的N-末端至C-末端)信號序列/催化性組件(GH-家族幻/天冬氨酸-和脯氨酸接頭/屬于CBM-家族6的糖結(jié)合組件/富含絲氨酸的接頭，另一種命名為信號序列-GH5-DPR-CBM6-PSLo圖4比較了 ACLA和Cel5H在37°下對磷酸溶脹纖維素的活性。圖5比較了 ACLA和Cel5H在37°下對微晶纖維素(Avicel)PHlOl的活性。發(fā)明詳述當(dāng)用于本文時，單數(shù)形式“一個”、“一種”、和“所述”既包括單數(shù)也包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有清楚地說明。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“包含”(“comprising”、“comprises”和“comprisedof”)與 “包括”或“含有” (“including”、“includes” 或“containingWontains”)意思相同， 是包括的或開放式的，并且不排除另外的、未列舉的成員、要素或方法步驟。通過端值列舉的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)字和分?jǐn)?shù)，也包括所列舉的端值。術(shù)語“大約”用于本文時，當(dāng)指可測量的數(shù)值如參數(shù)、量、時間期間等時，是指包括標(biāo)示數(shù)值的和偏離標(biāo)示數(shù)值+/-10%或更少，優(yōu)選地+/-5%或更少，更優(yōu)選地+/-1%或更少，還更優(yōu)選地+/-0. 或更少的差異，只要此類差異在所公開的發(fā)明中適合于實(shí)施。要理解修飾語“大約”所指的值本身也被明確地和優(yōu)選地公開。除非另外指定，用于公開本發(fā)明的所有術(shù)語，包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所普遍理解的含義。借助于進(jìn)一步的指導(dǎo)，包括術(shù)語定義以更好地理解本發(fā)明的教導(dǎo)。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“ACLA”，“ACLA多肽”或“ACLA蛋白”指假單胞菌屬物種ND137 株的多肽或蛋白。上述命名特別地指具有天然序列的此類多肽，即，其基本序列與自然界中存在的或來源于自然界的假單胞菌屬物種ND137株的ACLA蛋白的基本序列相同的多肽。 專業(yè)技術(shù)人員理解ACLA的天然序列由于遺傳趨異或自發(fā)突變可能導(dǎo)致在假單胞菌屬物種 ND137株的不同次代菌株或傳代培養(yǎng)物之間發(fā)生差異。ACLA的天然序列可能由于轉(zhuǎn)錄后或翻譯后修飾而進(jìn)一步發(fā)生趨異。因此，自然界中存在或來源于自然界的所有ACLA序列均被認(rèn)為是“天然的”。上述命名包括存在于活生物體、微生物或細(xì)胞中的ACLA多肽，以及至少部分地分離自所述來源的ACLA多肽。這些術(shù)語也包括通過重組或合成方式生產(chǎn)時的ACLA多肽。ACLA多肽正常是分泌性的，并且可能以前體形式存在，所述前體形式包含可切割的N-末端分泌信號序列，或以缺少所述信號序列的成熟形式存在。取決于容易被專業(yè)技術(shù)人員理解的背景，本文提及的ACLA多肽可以包括所述成熟形式和/或所述前體形式。示例性的ACLA多肽包括但不限于由Uniprot/Swissprot登錄號Q8VUT3 (于2002 年3月1日輸入的序列版本1)所注釋的序列，該序列也重現(xiàn)在圖IA(SEQ ID N0!)中。此序列對應(yīng)于包含信號序列的ACLA前體。示例性的成熟ACLA多肽，即，信號序列被加工掉的多肽，由各個前體的氨基酸位置觀-585表示，其示例性地重現(xiàn)在圖IB(SEQ ID NO 2)中。取決于容易被專業(yè)技術(shù)人員理解的背景，本文提及的ACLA多肽可以包括所述成熟形式和/或所述前體形式。此外，除非明確地另外指明或通過上下文另外指明，每當(dāng)本文參考氨基酸位置鑒定ACLA的結(jié)構(gòu)域或其他基序時，這樣的參考針對ACLA的成熟形式，諸如特別地SEQ ID NO 5中顯示的那種。此外，除非明確地另外指明或通過上下文另外指明，每當(dāng)本文參考氨基酸位置鑒定ACLA的結(jié)構(gòu)域或其他基序時，這樣的參考針對ACLA的成熟形式，諸如特別地SEQ ID NO 2中顯示的那種。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“同源性”是指來自相同或不同分類單位的兩種大分子之間， 尤其是兩種多肽或多核苷酸之間的結(jié)構(gòu)相似性，其中所述相似性是由于共同祖先所產(chǎn)生的。因此，術(shù)語“同源物”是指具有所述結(jié)構(gòu)相似性的如此相關(guān)的大分子。優(yōu)選地，本文意指的ACLA多肽的同源物包括所述具有天然序列的同源物。ACLA多肽的多肽同源物可以優(yōu)選地顯示與ACLA多肽的如本說明書中其他地方定義的至少約30 %，更優(yōu)選至少40 %，甚至更優(yōu)選至少50 %，還更優(yōu)選至少60 %，仍更優(yōu)選至少70%，諸如非常優(yōu)選至少80%或至少90%或至少95%的序列同一性。備選地或優(yōu)選另外地，ACLA多肽的多肽同源物可以顯示與ACLA多肽的如本說明書中其他地方定義的至少約50 %，更優(yōu)選至少60 %，甚至更優(yōu)選至少70 %，還更優(yōu)選至少80 %，仍更優(yōu)選至少90 %， 諸如非常優(yōu)選至少95%的序列相似性。此外優(yōu)選地，ACLA多肽的多肽同源物可以包含與 ACLA多肽的結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的一個或多個功能結(jié)構(gòu)域，和優(yōu)選地包含GH家族5催化結(jié)構(gòu)域，CBM 家族6結(jié)構(gòu)域和DZ結(jié)構(gòu)域中的一個或多個。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)域可以具有與ACLA類似的組織結(jié)構(gòu)，尤其是GH5-CBM6-DZ，通常具有插入的接頭。需注意，ACLA多肽的優(yōu)選同源物為 &iccharophagus degradans 2-40 的 Cel5H 多肽。示例性Cel5H多肽包括但不限于由在下列各處注釋的核酸編碼序列編碼的多肽 NCBI Entrez 基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ？ db = gene) 基因座標(biāo)簽 Sde_3237 (GeneID :3965710),和 NCBI Genbank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/index. html)登錄號NC 007912(序列版本1，數(shù)據(jù)庫錄入更新時間2008年 7月20日)，該序列也重現(xiàn)在圖IC中(SEQ ID NO 3)；和在下列各處注釋的Cel5H多肽 NCBI Genbank登錄號YP 528706 (序列版本1，數(shù)據(jù)庫錄入更新時間:2008年7月20日)和 Uniprot/Swissprot (http //www. expasy.org/)登錄號 Q21FN5 (于 2006 年 4 月 18 日輸入的序列版本1)，該序列示例性地重現(xiàn)在圖ID (SEQ ID NO 4)中。此序列對應(yīng)于包含信號序列的Cel5H前體。示例性的成熟Cel5H多肽，S卩，信號序列被加工掉的多肽由所述前體序列的氨基酸位置35-630表示，其示例性地重現(xiàn)在圖 IE (SEQ ID NO 5)中。人們將理解信號肽酶的實(shí)際切割可以潛在地在前體Cel5H的氨基酸34和35之間的預(yù)測切割位點(diǎn)附近的肽鍵處發(fā)生，所述前體Cel5H諸如圖ID中所示。例如，實(shí)際的切割可能在前體Cel5H的位置30-40，優(yōu)選31-39，更優(yōu)選32-38，甚至更優(yōu)選32-37，還更優(yōu)選 33-36的氨基酸區(qū)內(nèi)的任一個肽鍵處發(fā)生，所述前體Cel5H如圖IB中所示。術(shù)語“片段”當(dāng)提及給定的多肽諸如ACLA或其同源物，或提及給定的結(jié)構(gòu)域諸如ACLA的DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物時，通常是指所述多肽的截短形式，其與所述多肽諸如所述 ACLA或同源物或所述結(jié)構(gòu)域相比具有一個或多個氨基酸殘基的N-末端和/或C-末端缺失，但該片段剩余的基本序列與所述多肽諸如所述ACLA或同源物或所述結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中的相應(yīng)位置相同。例如，給定多肽諸如ACLA或其同源物的片段可以包含所述多肽諸如所述ACLA或同源物的約> 5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選> 10個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選> 20個連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選> 30個連續(xù)氨基酸，例如，^ 40個連續(xù)氨基酸，和最優(yōu)選> 50個連續(xù)氨基酸，例如， 彡60，彡70，彡80，彡90，彡100，彡200或彡500個連續(xù)氨基酸的序列。例如，ACLA的DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的片段可以包含所述DZ結(jié)構(gòu)域或其同源物的約> 5個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選> 10個連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選> 20個連續(xù)氨基酸，甚至更優(yōu)選 ^ 30個連續(xù)氨基酸，例如，^ 40個連續(xù)氨基酸，和最優(yōu)選> 50個連續(xù)氨基酸，例如，^ 60， 彡70，彡80，或彡90個連續(xù)氨基酸的序列。此外，給定多肽諸如ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的片段可以代表所述多肽諸如所述ACLA或同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的至少約30%，例如，至少50%或至少70%， 優(yōu)選至少80 %，例如，至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，和仍更優(yōu)選至少95 %或甚至約99 %。術(shù)語給定多肽諸如ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的“變體(variant) ”是指這樣的多肽，其氨基酸序列與所述多肽諸如所述ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的天然序列基本上相同(即，大部分但非全部相同)?！盎旧舷嗤笔侵钢辽偌s85%相同，例如，優(yōu)選至少 90%相同，例如，至少91%相同，92%相同，更優(yōu)選至少93%相同，例如，94%相同，甚至更優(yōu)選至少95 %相同，例如，至少96 %相同，仍更優(yōu)選至少97 %相同，例如，至少98 %相同，和最優(yōu)選至少99%相同。兩個多肽之間的序列同一性可以通過多肽的氨基酸序列的最優(yōu)比對(兩個蛋白序列的最優(yōu)比對是使配對得分減去關(guān)于引入空位的任何罰分的總和最大化的比對；并且可以優(yōu)選地通過算法的計算機(jī)化執(zhí)行來進(jìn)行，諸如“Gap”，使用Needleman和^msch 1970 (J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)48 :443-453)的算法，或 “Bestfit”，使用 Smith 和 Waterman 1981 (J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)147 :195-197)的算法，它們可獲自，例如，來自 Accelrys的GCG v. 11. 1. 2包)，和一方面對該比對中多肽含有相同氨基酸殘基的位置數(shù)目和另一方面對該比對中兩個多肽的序列不同的位置數(shù)目評分來確定。當(dāng)兩個多肽在比對中的給定位置處含有不同的氨基酸殘基(氨基酸置換)時或當(dāng)多肽之一在比對中的給定處含有氨基酸殘基而另一個多肽不含氨基酸殘基或反之亦然(氨基酸插入或缺失)時，這兩個多肽在該位置處的序列不同。序列同一性計算為比對中多肽含有相同氨基酸殘基的位置數(shù)相對于比對中的位置總數(shù)目的比例(百分比)。用于執(zhí)行序列比對和確定序列同一性的更多合適的算法包括基于最初由Altschul等1990 (J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)215 403-10)所述的基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST)的那些，諸如由 Tatusova 和 Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett (FEMS 微生物學(xué)通訊)174 : 247-250)所述的〃 Blast 2序列"算法，諸如使用其缺省設(shè)置。給定多肽諸如ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的變體當(dāng)用于本文時也具體地包括與所述多肽諸如所述ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域具有一定程度的相似性的多肽。優(yōu)選地， 這樣的變體可以為至少約90 %相似，例如，優(yōu)選至少91 %相似，例如，至少92 %相似，93 %
15相似，更優(yōu)選至少94%相似，例如，95%相似，甚至更優(yōu)選至少96%相似，例如，至少97%相似，仍更優(yōu)選至少98%相似，例如，至少99%相似。兩個多肽之間的序列相似性可以通過多肽的氨基酸序列的最優(yōu)比對(見上)，并且一方面對該比對中多肽含有相同或相似(即，保守置換的)氨基酸殘基的位置數(shù)目和另一方面對該比對中兩個多肽的序列另外不同的位置數(shù)目評分來確定。當(dāng)兩個多肽在比對中的給定位置處含有非保守氨基酸殘基時或當(dāng)多肽之一在比對中的給定位置處含有氨基酸殘基而另一個多肽不含氨基酸殘基或反之亦然(氨基酸插入或缺失)時，這兩個多肽在該位置處的序列另外地不同。序列相似性計算為比對中多肽含有相同或相似氨基酸殘基的位置數(shù)相對于比對中的位置總數(shù)目的比例(百分比)。應(yīng)該理解提及片段和/或變體時，說明書也廣泛地考慮給定多肽諸如ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的變體的片段，以及所述多肽的片段的變體。術(shù)語“功能”當(dāng)提及給定多肽諸如ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的片段和/或變體時是指這樣的片段和變體，其至少部分地保留了相應(yīng)多肽諸如所述ACLA或其同源物或結(jié)構(gòu)域諸如DZ結(jié)構(gòu)域的生物活性或功能性。優(yōu)選，這樣的功能片段和/或變體可以保留至少約20%，例如，至少30%，或至少40%，或至少50%，例如，至少60%，更優(yōu)選至少70%， 例如，至少80%，仍更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少90%，和最優(yōu)選至少95%或甚至100% 的相應(yīng)多肽諸如所述ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的活性。有可能，這樣的功能片段和/ 或變體可以甚至具有比相應(yīng)多肽諸如所述ACLA或同源物或DZ結(jié)構(gòu)域更高的活性。給定多肽諸如ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的功能片段和/或變體可以在其生物活性或功能的至少一個方面和優(yōu)選更多或所有方面上與所述多肽的功能等同。所述ACLA 或其同源物的生物學(xué)功能的相關(guān)方面包括特別地但不限于解聚纖維素活性或纖維素酶活性，關(guān)于不同纖維素物質(zhì)(例如，結(jié)晶、半結(jié)晶或無定形纖維素或半纖維素)的活性譜，降解結(jié)晶纖維素物質(zhì)的能力或偏好，和與纖維素物質(zhì)相互作用或結(jié)合的能力。ACLA或其同源物的所述DZ結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能的相關(guān)方面包括特別地但不限于結(jié)合纖維素和特別地結(jié)合結(jié)晶纖維素，和/或低聚作用活性。ACLA或其同源物或DZ結(jié)構(gòu)域的給定片段和/或變體的生物活性，包括所述活性的上述方面，可以通過標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，諸如例如實(shí)施例章節(jié)中給出的酶活性試驗(yàn)來確定。術(shù)語“產(chǎn)溶劑的(solventogenic)” 或“產(chǎn)生溶劑的(solvent-producing) ” 具有其本領(lǐng)域已確定的含義并且特別地指微生物諸如細(xì)菌(即，產(chǎn)溶劑細(xì)菌)從糖來源諸如例如己糖、戊糖或寡糖中產(chǎn)生一種或多種非氣態(tài)有機(jī)液體或溶劑，諸如，尤其是乙醇，丙酮，丁醇，丙酸，丁酸，醚或甘油的能力。特別地，該術(shù)語包含天然存在的產(chǎn)溶劑生物體，帶有天然存在的或誘導(dǎo)的突變的產(chǎn)溶劑生物體，和已經(jīng)被遺傳修飾的產(chǎn)溶劑生物體。因此，在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“非產(chǎn)溶劑的”是指不能夠從糖來源制備溶劑的微生物諸如細(xì)菌。作為天然的非產(chǎn)溶劑微生物的微生物實(shí)例包括用于重組生產(chǎn)的大多數(shù)微生物，諸如，但不限于，大腸桿菌(E. coll)，巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。術(shù)語“產(chǎn)乙醇的(ethanologenic) ”或“產(chǎn)生乙醇的(ethanol-producing) ”意在表示微生物諸如細(xì)菌(即，產(chǎn)乙醇細(xì)菌)從糖來源諸如例如己糖、戊糖或寡糖中產(chǎn)生至少或優(yōu)選地主要乙醇的能力，更優(yōu)選地從糖類產(chǎn)生乙醇作為最豐富的非氣態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的能力。特別地，該術(shù)語包括天然存在的產(chǎn)乙醇生物體，帶有天然存在的或誘導(dǎo)的突變的產(chǎn)乙醇生物體，和已經(jīng)被遺傳修飾的產(chǎn)乙醇生物體。合適的產(chǎn)溶劑微生物的實(shí)例包括但不限于梭菌屬和發(fā)酵單胞菌屬的菌株，諸如，但不限于本文例證的那些。術(shù)語“分離(isolating)，，當(dāng)提及具體組分時通常表示將該組分與組合物的至少一種其他組分分開，由此前一組分從該組合物中被“分離”。特別地，術(shù)語“分離”和“分離的(isolated)”在本文中可以指樣品中增加量的所需的一種或多種蛋白或一種或多種多肽。相對量可以表示為待分離的所需一種或多種蛋白或一種或多種多肽的濃度或量和樣品中總蛋白的濃度或量之間的比率。另外，該術(shù)語可以包括將所需的一種或多種蛋白或一種或多種多肽與非蛋白細(xì)胞組分(例如，細(xì)胞壁，液體，核酸，等)分開。術(shù)語“重組核酸”或“重組核酸分子”當(dāng)用于本文時通常是指包含使用重組DNA技術(shù)(諸如例如分子克隆和核酸擴(kuò)增)產(chǎn)生和/或連接在一起的區(qū)段的核酸分子(諸如，例如，DNA, cDNA或RNA分子)。通常，重組核酸分子可以包含一個或多個非天然存在的序列， 和/或可以包含與天然存在的序列對應(yīng)的區(qū)段，所述區(qū)段不象它們在未被修飾的來源基因組中定位的那樣被定位。當(dāng)重組核酸分子在已經(jīng)引入其的宿主生物體中復(fù)制時，子代核酸分子也包括在術(shù)語“重組核酸分子”的范圍內(nèi)。在具體實(shí)施方案中，重組核酸分子可以穩(wěn)定地整合至宿主生物體的基因組中，諸如例如在一個或多個隨機(jī)位置處整合或以靶向的方式，諸如，例如，借助于同源重組整合， 或重組核酸分子可以作為染色體外元件存在或包含在染色體外元件內(nèi)，其中后者可以是自復(fù)制的。提出重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)，第二版，第1_3卷，Sambrook等編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989 ；Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))，Ausubel 等編輯，Greene Publishing and ffiley-Interscience,New York (紐約)，1992 (定期更新)Jnnis 等，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR 實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和應(yīng)用指南)，Academic Press =San Diego (圣地亞哥)，1990。微生物學(xué)的一般原理見，例如，Davis，B. D.等， Microbiology (微生物學(xué))，第三版，Harper & Row, publishers, Philadelphia (費(fèi)城)， Pa. (1980)。術(shù)語“重組多肽”當(dāng)用于本文中時是指通過重組核酸分子的表達(dá)由宿主生物體產(chǎn)生的多肽或蛋白，所述重組核酸分子已經(jīng)引入至所述宿主生物體或其祖先中，并且其包含編碼所述多肽或蛋白的序列。此外，術(shù)語“重組的”或“轉(zhuǎn)化的”當(dāng)在本文中用于提及宿主生物體、微生物或細(xì)胞時，包括其中已經(jīng)引入了重組核酸分子的宿主生物體、微生物或細(xì)胞，以及所述宿主生物體、微生物或細(xì)胞的重組子代。在此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將外來核酸諸如重組核酸引入或轉(zhuǎn)移至宿主生物體、微生物或細(xì)胞中。這樣引入的核酸可以優(yōu)選地在所述宿主生物體、微生物或細(xì)胞的進(jìn)一步生長和細(xì)胞分裂全程中得以保持?？梢允褂萌魏纬Ｒ?guī)的基因轉(zhuǎn)移方法來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，諸如而不限于電穿孔，電滲透，化學(xué)轉(zhuǎn)化，脂轉(zhuǎn)染(lipofection)，病毒-或噬菌體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，等。“編碼”的意思是核酸序列或其部分依靠被研究的生物體的遺傳密碼對應(yīng)于特定的氨基酸序列，例如，所需多肽或蛋白的氨基酸序列。借助于舉例，“編碼”特定多肽或蛋白的核酸可以包括基因組，hnRNA,前-mRNA，mRNA, cDNA,重組或合成的核酸。優(yōu)選，編碼特定多肽或蛋白的核酸可以包含編碼所述多肽或蛋白的可讀框(ORF)。 “可讀框”或“0RF”是指一連串編碼核苷酸三聯(lián)體(密碼子)，其以本身已知的翻譯起始密碼子開始并以本身已知的翻譯終止密碼子結(jié)束，并且不包含任何內(nèi)部的框內(nèi)翻譯終止密碼子，和潛在地能夠編碼多肽。因此，該術(shù)語可以與本領(lǐng)域中使用的“編碼序列”同義。在一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的一種或多種多肽的核酸序列或ORF可以是以本身已知的方式為了在特定生物體例如，微生物，更特別地目的細(xì)菌中表達(dá)而最優(yōu)化的密碼子?？色@得多種生物體的密碼子使用偏好和密碼子頻率，例如，經(jīng)由Nakamura等，2000 (Nucl Acids Res(核酸研究)28 : 所述的密碼子使用數(shù)據(jù)庫(Codon Usage Database) (http://www. kazusa. or. jp/codon/)。如本文教導(dǎo)的重組微生物中目的多肽的表達(dá)可以通過可操作地連接編碼所述多肽的核酸序列或ORF與允許在所述微生物中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列來實(shí)現(xiàn)。就此而言，術(shù)語“表達(dá)”多肽當(dāng)指重組生物體時包括能夠，例如，在合適的培養(yǎng)條件下或在添加誘導(dǎo)物時(例如， 在使用可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列時)表達(dá)該多肽的重組生物體?！翱刹僮鞯倪B接”是其中調(diào)節(jié)性核酸序列和要表達(dá)的序列以允許所述表達(dá)的方式連接的連接。例如，序列，諸如，例如，啟動子和0RF，可以被稱為可操作地連接，條件是所述序列之間的連接的性質(zhì)不會(1)導(dǎo)致引入移碼突變(frame-shift mutation), (2)干擾啟動子指導(dǎo)ORF轉(zhuǎn)錄的能力，(3)干擾ORF從啟動子序列轉(zhuǎn)錄的能力。表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列或元件的準(zhǔn)確性質(zhì)可以在生物體之間發(fā)生變化，但典型地包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子，和任選地增強(qiáng)子。提及“啟動子”或“增強(qiáng)子”要在其最寬泛的背景中理解并且包括準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄起始所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和當(dāng)可適用時對基因表達(dá)的準(zhǔn)確的空間和/或時間的控制或其對例如，內(nèi)部或外部(例如，外源性)刺激物的反應(yīng)。更特別地，“啟動子”可以描述核酸分子，優(yōu)選DNA分子上的一個區(qū)域，RNA聚合酶與所述區(qū)域結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄。啟動子優(yōu)選地，但非必需地，位于轉(zhuǎn)錄受其控制的序列的上游，即5’。典型性，在原核生物中，啟動子區(qū)可以包含啟動子本身和當(dāng)轉(zhuǎn)錄為RNA時將發(fā)出蛋白質(zhì)合成起始信號的序列(例如，Shine-Dalgarno序列)兩者。在實(shí)施方案中，本文考慮的啟動子可以是組成型的或可誘導(dǎo)型的。借助于舉例，適合于在發(fā)酵單孢菌屬物種，諸如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)中的表達(dá)的組成型啟動子包括而不限于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)的丙酮酸脫羧酶基因的啟動子(Ppd。啟動子)和來源于trp和Iac啟動子的人工Pta。啟動子。借助于舉例，適合于在梭菌屬物種諸如丙酮丁醇梭菌中的表達(dá)的組成型啟動子包括而不限于丙酮丁醇梭菌的硫解酶基因的啟動子(Pthl啟動子)，乙酰乙酸脫羧酶基因的啟動子(Pad。啟動子)，磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶(phosphotransbutyrylase)基因的啟動子(Pptb啟動子)，木糖葡萄球菌Staphylococcus xylosus)木糖操縱子的木糖可誘導(dǎo)型啟動子(Pxyl啟動子)。因此，在具體實(shí)施方案中，提供了這樣的啟動子，其是受操縱基因控制的啟動子。 當(dāng)用于本文中時，術(shù)語“操縱基因”是指一種核苷酸序列，優(yōu)選DNA序列，其控制序列從啟動子轉(zhuǎn)錄的起始和/或維持。典型地，操縱基因通?？梢晕挥趩幼雍推滢D(zhuǎn)錄被啟動子控制的下游序列之間。通常，操縱基因能夠結(jié)合阻遏物多肽，由此其減少從所述啟動子的轉(zhuǎn)錄。 有用的阻遏物可以在其結(jié)合操縱基因的狀態(tài)和其不結(jié)合操縱基因的狀態(tài)之間交替，并且這樣的交替可以有利地受外部條件，例如，外部物質(zhì)或特定的代謝物的控制。因此，在包含相容性阻遏物的宿主細(xì)胞中，在本發(fā)明的核酸中包含操縱基因可以允許控制啟動子的活性和由所述啟動子的表達(dá)。操縱基因序列通?？梢詠碓从诩?xì)菌染色體。還應(yīng)該理解本發(fā)明的核酸可以編碼一種或多于一種的目的多肽。此外，在預(yù)期表達(dá)兩種或多種多肽時，所述表達(dá)可以來自多個獨(dú)立的表達(dá)單元，或可以來自單個表達(dá)單元 (即，多順反子表達(dá)(multi-cistronic expression))，所述單個表達(dá)單元包含兩個或多個連續(xù)的受常見的調(diào)節(jié)元件控制的0RF。借助于舉例，編碼兩種或多種多肽的表達(dá)單元可以通過將各個ORF的翻譯起始密碼子與控制翻譯起始的序列(例如，核糖體進(jìn)入序列)締合來產(chǎn)生。術(shù)語“終止子”或“轉(zhuǎn)錄終止子”通常是指在轉(zhuǎn)錄單元末端處的序列元件，其發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止的信號。例如，終止子通常位于編碼目的多肽的一個或多個ORF的下游，即3’。例如，在重組核酸包含兩個或多個0RF，例如，連續(xù)排列并一起形成多順反子轉(zhuǎn)錄單元的ORF 的情況下，轉(zhuǎn)錄終止子可以有利地位于最下游的ORF的3’。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以有利地針對要用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的微生物的重組核酸提供控制本文教導(dǎo)的一種或多種多肽的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。然而，還考慮這樣的實(shí)施方案，其中重組核酸提供缺少一個或多個調(diào)節(jié)序列的一個或多個編碼序列，而需要的調(diào)節(jié)序列由被轉(zhuǎn)化的微生物提供(諸如，例如，其中該重組核酸插入至包含合適的調(diào)節(jié)序列的染色體或附加體(印isomal)區(qū)域中)。梭菌屬和丙酮丁醇梭菌當(dāng)用于本文中時是指如本領(lǐng)域中已知的細(xì)菌分類單位，并且特別地包括屬于所述分類單位的細(xì)菌、細(xì)菌菌種、菌株、亞種和培養(yǎng)物，以及天然存在的或野生型標(biāo)本的修飾的或改造的，諸如例如突變的或遺傳改造的衍生物。通過指導(dǎo)而非限制，可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的梭菌屬的分離菌株可以，尤其以關(guān)于丙酮丁醇梭菌的登錄號ATCC 824,ATCC 4259,ATCC 39236或ATCC 43084來訂購。例如，拜氏梭菌 (Clostridium bei jerinckii)的分離菌株可以，尤其以登錄號ATCC 858和ATCC 25752來訂購。發(fā)酵單孢菌屬和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌當(dāng)用于本文中時是指如本領(lǐng)域中已知的細(xì)菌分類單位，并且特別地包括屬于所述分類單位的細(xì)菌、細(xì)菌菌種、菌株、亞種和培養(yǎng)物，以及天然存在的或野生型標(biāo)本的修飾的或改造的，諸如例如突變的或遺傳改造的衍生物。通過指導(dǎo)而非限制，可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的分離菌株可以， 尤其以登錄號 ATCC 29191, ATCC 10988，ATCC 39676 或 ATCC 31821 來訂購。需注意，由本發(fā)明的產(chǎn)溶劑微生物表達(dá)的多肽可以被靶定以用于分泌。為了實(shí)現(xiàn)分泌，編碼多肽的核酸序列可以與編碼分泌信號序列的序列可操作地連接。就此而言，“可操作地連接”表示編碼信號序列的序列和編碼待分泌的多肽的序列在框內(nèi)(in frame)或同相(in phase)連接，從而在表達(dá)時，信號肽促進(jìn)如此與其連接的多肽的分泌。應(yīng)當(dāng)理解，適當(dāng)?shù)男盘栃蛄锌扇Q于期望在其中進(jìn)行分泌的微生物的類型。例如， 相對于革蘭氏陰性菌，在革蘭氏陽性菌中可能需要不同信號序列。
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借助于實(shí)例而非限制，革蘭氏陽性菌中的分泌，特別是梭菌屬如丙酮丁醇梭菌中的分泌，可使用如下信號序列完成，所述信號序列為解纖維素梭菌的Cel5A前體多肽的信號序列(示例序列Aenbank登錄號AAA51444,1994年10月31日修改的序列版本1)，或解纖維素梭菌的CipC前體支架蛋白的信號序列(示例序列=Genbank登錄號AAC28899, 2005 年12月5日修改的序列版本2)，或丙酮丁醇梭菌的CipA前體支架蛋白的信號序列(示例序列Genbank登錄號AAK78886, 2006年1月19日修改的序列版本1)。此外非限制地，在革蘭氏陰性菌中，和特別地在發(fā)酵單胞菌屬諸如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中的分泌，可以經(jīng)由Sec途徑，例如，使用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的葡糖酸內(nèi)酯酶前體多肽的信號序列(示例序列=Genbank登錄號CAA47637, 2006年10月19日修改的序列版本1)或糖類選擇性孔蛋白(Porine)OprB的信號序列(示例序列Genbank登錄號AAV88688, 2005 年1月25日修改的序列版本1)來實(shí)現(xiàn)，或經(jīng)由雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(Tat)途徑，例如，使用運(yùn)動發(fā)酵單胞菌的葡萄糖果糖氧化還原酶前體多肽的信號序列(示例序列=Genbank登錄號 CAB02496,2006年10月19日修改的序列版本1)來實(shí)現(xiàn)。還應(yīng)當(dāng)理解可以使用將要通過本文教導(dǎo)的微生物表達(dá)的多肽的天然(或同源的、 內(nèi)源性)信號肽，只要它們在所述微生物中是有功能的。因此，借助于舉例，可以使用ACLA 前體多肽的內(nèi)源的或同源的分泌信號序列來實(shí)現(xiàn)ACLA或相關(guān)多肽的分泌。特別地，由于假單胞菌屬物種ND137株是一種革蘭氏陰性菌，因此ACLA的內(nèi)源的或同源的信號序列可以特別適合于其在其他革蘭氏陰性菌，諸如例如在發(fā)酵單胞菌屬，更特別地在運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中的分泌。在其他實(shí)施方案中，多肽諸如ACLA和相關(guān)多肽可以使用異源的信號序列進(jìn)行分泌。天然ACLA多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)可概括為GH5-DPR-CBM6-PSL-DZ，成熟ACLA中的結(jié)構(gòu)域邊界的示意性指示顯示在圖2中。ACLA或其同源物的功能片段優(yōu)選地含有GH5，CBM6和 DZ結(jié)構(gòu)域中的一個或多個，或與其對應(yīng)的結(jié)構(gòu)域(例如，ACLA的同源物和/或變體內(nèi)的類似結(jié)構(gòu)域)。優(yōu)選地，包含在這些片段內(nèi)的結(jié)構(gòu)域可以如本文預(yù)期的那樣是功能性的。因此， 在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了一些片段，諸如與下列結(jié)構(gòu)域組織結(jié)構(gòu)對應(yīng)的那些GH5， GH5-DPR, GH5-DPR-CBM6, GH5-DPR-CBM6-PSL，DPR-CBM6, DPR-CBM6-PSL，DPR-CBM6-PSL-DZ， CBM6, CBM6-PSL, CBM6-PSL-DZ，和PSL-DZ，DZ0本發(fā)明還設(shè)想了與成熟ACLA的結(jié)構(gòu)域的組合對應(yīng)的片段，諸如，但不限于PSL-DZ-PSL-DZ。需注意，本發(fā)明還涉及ACLA和具有有用的異源結(jié)構(gòu)域的相關(guān)多肽的多種融合。在此背景中，術(shù)語“異源的”表示所述一個或多個結(jié)構(gòu)域來源于除ACLA多肽或其同源物以外的多肽。因此，“異源的”當(dāng)指結(jié)構(gòu)域的組合時是指這樣的事實(shí)，即不同的結(jié)構(gòu)域不源自(或不是天然地存在于)同一蛋白。然而，也可以考慮另外的ACLA來源的結(jié)構(gòu)域與ACLA多肽或其同源物、或其片段和/或變體的融合。術(shù)語“融合”在本文中被寬泛地預(yù)期為包括尤其是遺傳融合(即，將不同的部分融合至單個可讀框中)以及通過化學(xué)和/或物理手段(例如，化學(xué)交聯(lián)或光電耦合)誘導(dǎo)的融合。此外，融合包括直接融合或經(jīng)由接頭的融合。合適的接頭可以包括而不限于至少3， 優(yōu)選至少4或5，更優(yōu)選至少7和仍更優(yōu)選至少12個氨基酸，諸如3-15個氨基酸，且優(yōu)選包含非帶電氨基酸，富含非帶電氨基酸或由非帶電氨基酸組成的肽序列，所述非帶電氨基酸優(yōu)選選自甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸，并且更優(yōu)選甘氨酸或絲氨酸。示例性的糖苷水解酶(GH)催化結(jié)構(gòu)域可以來源于本身已知的糖苷水解酶(糖苷酶)或尤其是使用已確定的程序鑒定和分離的未來糖苷水解酶。示例性的糖苷酶包括分組在NC-IUBMB的EC 3.2.1. “糖苷酶”分類中的那些，更優(yōu)選能夠解聚纖維素和木質(zhì)纖維素(lingo-cellulosic)底物的糖苷酶，諸如，例如，纖維素酶(EC 3. 2.1. 4.)，纖維素 1，4-β-cellobiosidases(EC 3.2.1.91)和加工性(processive)內(nèi)切纖維素酶(EC 3. 2. 1. 4. /EC 3. 2. 1. 91.)。術(shù)語糖結(jié)合組件(CBM)在本領(lǐng)域中是已知的，并且普遍地廣義地覆蓋存在于糖苷水解酶中或來源于糖苷水解酶的所有非催化性糖(sugar)-或糖(carbohydrate)-結(jié)合組件。本文優(yōu)選的CBM組件可以包括特異性結(jié)合纖維素或纖維素物質(zhì)的那些并且備選地是指纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。CMB和它們的結(jié)構(gòu)和功能特性的綜述參見尤其是 Tomme 等·1995 ( "Cellulose-binding domains-classification and properties (纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類和特性)”，于Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (不溶性多糖的酶降解)，Saddler JN & Penner M，編輯，142-163 頁， American Chemical Society (美國化學(xué)協(xié)、會)，Washington (華盛頓))禾口 Boraston 等， 2004( "Carbohydrate-binding modules :fine tuning polysaccharide recognition ( H 結(jié)合組件精細(xì)調(diào)節(jié)的多糖識別)".Biochem J(生物化學(xué)雜志)382 :769-81)。黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域當(dāng)用于本文中時通常是指能夠特異性結(jié)合多纖維素酶體支架蛋白亞基的一個或多個受體(黏結(jié)蛋白)結(jié)構(gòu)域的所有多肽結(jié)構(gòu)域。示例性的黏結(jié)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括存在于組裝成多纖維素酶體的糖苷水解酶中或來源于所述糖苷水解酶的錨定結(jié)構(gòu)域。本文考慮I型和II型錨定結(jié)構(gòu)域兩者。對錨定結(jié)構(gòu)域的解釋參見尤其是 Lytle 等，2001 ( “Solution structure of a type I dockerin domain， a novel prokaryotic, extracellular calcium-binding domain (I 型錨定結(jié)構(gòu)域，一禾中新的原核生物細(xì)胞外鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu))”.J Mol Biol (分子生物學(xué)雜志)307: 745-753) ,Adams 等，2005 ("Structural characterization of type II dockerin module from the cellulosome of Clostridium thermocellum calcium-induced effects on conformation and target recognition(來自熱纖梭菌的多纖維素酶體的II型錨定組件的結(jié)構(gòu)表征鈣誘導(dǎo)的對構(gòu)象和靶標(biāo)識別的作用)” .Biochemistry (生物化學(xué))44 2173-82)禾口參見 Bayer 等，1998( "cellulosomes-structure and ultrastructure (多纖維素酶體-結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu))”.J Struct Biol (結(jié)構(gòu)生物學(xué)雜志)124 :221-234)。用于測定錨定蛋白-黏結(jié)蛋白相互作用的合適的測定法，諸如用于指導(dǎo)選擇本文中合適的錨定結(jié)構(gòu)域，描述于尤其是 Haimovitz 等，2008 ( "Cohesin-dockerin microarray Diverse specificities between two complementary families of interacting protein modules (黏結(jié)蛋白-錨定蛋白微陣列兩個互補(bǔ)家族的相互作用蛋白組件之間不同的特異性)，，.Proteomics (蛋白組學(xué))8 :968-979)。另外考慮的是本文教導(dǎo)的多肽與有效用于糖聚合物代謝，特別地有效用于纖維素代謝中的其他多肽或酶，優(yōu)選重組多肽或酶的共表達(dá)和任選地共分泌。術(shù)語“共表達(dá)”通常涉及由相同的微生物，特別地由所述微生物的相同細(xì)胞表達(dá)兩種或多種蛋白或多肽(稱為被“共表達(dá)的”)。合適的用于實(shí)現(xiàn)兩種或多種多肽的共表達(dá)的系統(tǒng)本身是已知的。非限制地，共表達(dá)的多肽可以由受相同或不同的調(diào)節(jié)元件控制的單獨(dú)的順反子編碼，或可以由單個多順反子元件編碼；這樣的順反子可以在染色體上或在相同或不同的外遺傳元件 (epigenetic element),或其組合等上。還考慮用于纖維素降解的包含ACLA多肽，其片段、變體或同源物的酶的混合物。 更特別地，所述混合物除了 ACLA多肽以外還可以包含其他纖維素酶。在根據(jù)本發(fā)明的混合物中，所述纖維素酶可以具有補(bǔ)充的活性或附加的活性。根據(jù)本發(fā)明的混合物可以包含不同量的ACLA多肽，其片段、變體或同源物。在具體實(shí)施方案中，所述ACLA多肽，其片段、變體或同源物以相對于所有酶約15-約99%的量存在于酶混合物中。更特別地，ACLA多肽，其片段、變體或同源物在酶混合物中的量為約 50-約99%。更特別地，ACLA多肽，其片段、變體或同源物在酶混合物中的量為約80-約 99%。術(shù)語“糖苷水解酶”或“糖苷酶”通常包括能夠水解糖苷鍵，更特別地0-，N-或S-糖苷鍵，甚至更優(yōu)選在寡糖和/或多糖底物中的這樣的鍵的酶和酶復(fù)合物。該術(shù)語包括外切糖苷酶以及內(nèi)切糖苷酶。該術(shù)語特別地包括分組在NC-IUBMB的EC 3.2.1. “糖苷酶”分類中的糖苷酶。術(shù)語“纖維素酶”通常包括能夠水解纖維素和含纖維素物質(zhì)的酶和酶復(fù)合物。該術(shù)語包括而不限于下列的纖維素酶類型纖維二糖水解酶(l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶，EC 3.2. 1.91)，內(nèi)切-0-1，4-葡聚糖酶(內(nèi)切_1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶， EC 3. 2. 1. 4)，加工性內(nèi)切纖維素酶(EC 3. 2. 1. 4. /EC 3. 2. 1. 91.)和β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)。纖維素酶進(jìn)一步包括內(nèi)切葡聚糖酶以及(加工性)外切葡聚糖酶，并且涵蓋產(chǎn)生各種長度的單體和/或低聚體的酶。該術(shù)語還包括纖維二糖酶，氧化纖維素酶，葡萄糖苷酶，纖維素磷酸化酶，和通常由此表示的其他酶。該術(shù)語包括能夠降解各種形式的纖維素的酶，所述纖維素諸如而不限于結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素，無定形纖維素，半纖維素和/或化學(xué)或生物改性的纖維素形式。借助于舉例而非限制，如果第一和第二纖維素酶優(yōu)先作用于不同的底物(諸如， 例如，結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素，無定形纖維素或半纖維素)，或如果第一和第二纖維素酶產(chǎn)生不同的產(chǎn)物(例如，糖單體和/或低聚體的不同群體)，或如果第一纖維素酶優(yōu)先地作用于第二纖維素酶的反應(yīng)產(chǎn)物或反之亦然等，則第一纖維素酶可以被認(rèn)為具有對第二纖維素酶補(bǔ)充的活性。借助于舉例且非限制地，解纖維素梭菌的纖維素分解系統(tǒng)已由B6laich等， 1997( "The cellulolytic system of Clostridium cellulolyticum(角軍纖維素梭菌的纖維素分解系統(tǒng))”.J Biotechnol(生物技術(shù)雜志)57 :3-14)綜述；且&iccharophagus degradans的纖維素分解系統(tǒng)由Taylor等，2006 (見上)綜述。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了改造的多纖維素酶體，其包含本文教導(dǎo)的多肽，特別地ACLA 和相關(guān)多肽(例如，DZ-結(jié)構(gòu)域和包含該結(jié)構(gòu)域的多肽)。如本領(lǐng)域中所已知的，天然的多纖維素酶體代表某些細(xì)菌分類單位，諸如尤其是梭菌屬和擬桿菌屬(Bacteroides)的細(xì)胞外的、多酶纖維素分解復(fù)合物。天然多纖維素酶體的基本組織結(jié)構(gòu)包括組織化多肽(支架蛋白)，通常包含一個或多個相同或不同的糖結(jié)合組件(CBM)和一個或多個相同或不同的受體(黏結(jié)蛋白)結(jié)構(gòu)域，它們促進(jìn)糖苷酶或纖維素分解酶通過與所述酶中的關(guān)聯(lián)錨定結(jié)構(gòu)域的相互作用而結(jié)合至多纖維素酶體復(fù)合物中。天然多纖維素酶體的這些結(jié)構(gòu)特征也可以用于改造的多纖維素酶體中，由此所需的糖結(jié)合和糖解聚活性可以結(jié)合至改造的多纖維素酶體中。用于產(chǎn)生改造的多纖維素酶體的技術(shù)在本領(lǐng)域中已確定(參見，例如，F(xiàn)ierobe等，2002( "Degradation of cellulose substrates by cellulosome chimeras. Substrate targeting versus proximity of enzyme components (多纖維素酶體嵌合體降解纖維素底物。酶組分的底物靶向性與接近性的比較)”· J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)277 =49621-30) ；Fierobe等， 2005("Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complex substrates controlled incorporation of three distinct enzymes into a defined trifunctional scaffoldin (設(shè)計的多纖維素酶體對均質(zhì)底物與復(fù)雜底物的作用比較三種不同的酶可控地結(jié)合至確定的三功能支架蛋白中)” .J Biol Chem(生物化學(xué)雜志)280 :16325-34)； 以及 Perret 等，2004 ( "Production of heterologous and chimeric scaffoldins by Clostridium acetobutylicum ATCC 8 ”(丙酮丁醇梭菌ATCC8M產(chǎn)生異源和嵌合的支架蛋白)· J Bacteriol (細(xì)菌學(xué)雜志)186 :253-7))。通常，改造的多纖維素酶體可以含有雜交的或嵌合的支架蛋白多肽，其包含相同或不同的糖類底物特異性的一個或多個CBM組件，和一個或多個能夠結(jié)合相同或不同的關(guān)聯(lián)錨定結(jié)構(gòu)域的黏結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域。酶，諸如特別地糖苷酶或纖維素分解酶，可以借助于用于支架蛋白多肽中存在的黏結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域的關(guān)聯(lián)錨定組件(正常存在于所述酶中和/或被改造至所述酶中)結(jié)合至多纖維素酶體中。所述酶也可以包含CBM或其他非催化性結(jié)構(gòu)域。 這樣的改造的多纖維素酶體在本領(lǐng)域中通常被稱為“嵌合的”或“雜交的”多纖維素酶體或 “小型多纖維素酶體”。備選地或另外地，所述一種或多種酶，諸如糖苷酶或纖維素分解酶可以與支架蛋白主鏈，諸如，例如，通過作為同一多肽鏈的一部分表達(dá)(即，遺傳融合)來共價連接。 這樣多纖維素酶體通常被稱為“共價的”(Mingardon等，2007，“Exploration of new geometriesin cellulosome-like chimeras (在多纖維素酶體樣嵌合體中研究新的幾何學(xué))” Appl. Environ. Microbiol.(應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué))73 :7138-7149)。因此，改造的多纖維素酶體，諸如雜交的，嵌合的，小型_，或共價的多纖維素酶體， 或這些形態(tài)的任意組合，或任意的其他改造的多纖維素酶體形式，被考慮與本文教導(dǎo)的多肽一起使用。術(shù)語“纖維素”本身在本領(lǐng)域中是已知的。借助于進(jìn)一步的解釋而非限制，該術(shù)語可以包括所有形式的纖維素，諸如而不限于天然存在和非天然存在的纖維素形式，諸如，例如，結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶纖維素，微晶纖維素，無定形纖維素，半纖維素，再生纖維素，和/或化學(xué)或生物學(xué)改性或衍生的纖維素形式，諸如，例如，其醚或酯，等。富含結(jié)晶纖維素的物質(zhì)可以包含而不限于，至少約(w/w)，例如，彡5% (w/w)， 優(yōu)選至少約10% (w/w)，例如，彡20%，彡30%或彡40% (w/w)，更優(yōu)選至少約50% (w/w)， 例如，彡60%或彡70% (w/w)，仍更優(yōu)選至少約80% (w/w)，例如，彡90% (w/w)的本領(lǐng)域中所理解的結(jié)晶纖維素，半結(jié)晶和/或微晶纖維素，更優(yōu)選結(jié)晶纖維素。用本文所述的ACLA 酶，其片段、變體和同源物或重組微生物諸如本文教導(dǎo)的重組微生物處理或接觸含纖維素物質(zhì)的方法和過程在本領(lǐng)域中是普遍已知的，并且可以無限制地包括各種規(guī)模的工業(yè)酶降解或發(fā)酵過程。要如此降解和/或發(fā)酵的物質(zhì)可以例如，以固體，半固體，液體或可溶形式提供，或作為勻漿物或提取物提供，或作為(水性)分散體或混懸液提供，或作為(部分) 分離的或純化的和/或預(yù)處理的(例如，通過稀酸預(yù)處理，氫氧化鈉預(yù)處理，石灰(lime)預(yù)處理，用有機(jī)溶劑與水預(yù)處理，熱液過程，或AFEX)木質(zhì)素纖維素物質(zhì)或纖維素物質(zhì)或纖維素提供，或以其他合適的本身用于纖維素材料和生物量的解聚和/或發(fā)酵的形式提供。因此，本發(fā)明還考慮起始培養(yǎng)物，其包含本發(fā)明的多肽或微生物，任選地分別與一種或多種其他酶或微生物組合。纖維素的預(yù)處理通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行，并且包括熱、機(jī)械、 化學(xué)或這些方法的組合從而破壞纖維素物質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)，并且增強(qiáng)隨后對纖維素物質(zhì)的酶水解。任何預(yù)處理過程可以與本發(fā)明的方法組合采用，包括但不限于，制漿，諸如硫酸鹽制漿(kraft)，亞硫酸鹽制漿(sulfite)，機(jī)械制漿，熱制漿和化學(xué)-熱-機(jī)械制漿。備選地， 預(yù)處理過程也可以包括添加有機(jī)溶劑以輔助從木質(zhì)素纖維素原料中分餾木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。用于纖維素利用的生物技術(shù)方法的綜述參見尤其是Lynd等，2002( "Microbial cellulose utilization !fundamentals and biotechnology (微生物纖維素禾[|用原理和生物技術(shù))”.Microbiol Mol Biol Rev(微生物學(xué)和分子生物學(xué)評論)66 :506-77)， 禾口 Himmel 等，2007( "Biomass recalcitrance !engineering plants and enzymes for biofuels production (生物量頑抗性改造用于生物燃料制備的植物和酶)”kienCe (科學(xué))315 :804-807)。術(shù)語“化學(xué)中間體”當(dāng)用于本文中時是指在一些反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物過程中產(chǎn)生的任何化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明的背景中，加工包括生物量的降解產(chǎn)物(諸如葡萄糖或另一種可發(fā)酵的糖類)通過一系列步驟轉(zhuǎn)化為一些所需的產(chǎn)物。因此，由根據(jù)本發(fā)明的ACLA多肽通過生物量的降解生成的并且可以用于生物加工的后續(xù)步驟中的所有物質(zhì)被認(rèn)為是中間體。制備化學(xué)中間體的方法可以包括兩種方法，一種是其中大批生成化學(xué)中間體的方法(用于進(jìn)一步物理分離的生物加工法)，另一種是其中不分離中間體但其立即轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物的聯(lián)合生物加工方法。根據(jù)本發(fā)明的制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法包括通過將含纖維素物質(zhì)與根據(jù)本發(fā)明的ACLA酶，其片段、變體和同源物或與(非產(chǎn)溶劑)微生物接觸來降解纖維素，該方法典型地進(jìn)一步包括這樣的步驟，所述步驟包括將纖維素或含纖維素材料的降解產(chǎn)物， 更特別地葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿軇⑷剂匣蚧瘜W(xué)中間體。在具體實(shí)施方案中，這通過將由根據(jù)本發(fā)明的纖維素降解方法獲得的降解產(chǎn)物與產(chǎn)溶劑微生物接觸來確保，所述產(chǎn)溶劑微生物能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)變?yōu)樗璧娜軇?。這樣的產(chǎn)溶劑微生物包括天然產(chǎn)溶劑的微生物和已經(jīng)被遺傳改造從而增加其從糖來源產(chǎn)生溶劑的能力的生物體。產(chǎn)溶劑微生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于本文所述的那些。在更特別的實(shí)施方案中，降解產(chǎn)物通過微生物或通過化學(xué)處理轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌a(chǎn)物。如本文所述，本發(fā)明進(jìn)一步提供了 ACLA多肽，或其功能片段、同源物或變體在工業(yè)纖維素降解，更特別地在制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體中的用途。實(shí)際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)分離的ACLA酶與其他細(xì)菌性纖維素降解酶相比具有特別高的纖維素分解活性。因此，此酶特別適合于在纖維素的大批降解(bulk degradation)，諸如含纖維素生物量在生物反應(yīng)器中的
24大規(guī)模降解中的應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明提供了降解包含纖維素的物質(zhì)(諸如木質(zhì)素纖維素或纖維素材料或生物量)的方法，該方法包括使所述物質(zhì)與本文教導(dǎo)的ACLA多肽或其功能片段、同源物或變體或與本文教導(dǎo)的表達(dá)ACLA或其功能片段、同源物或變體的重組微生物接觸。已經(jīng)觀察到ACLA具有內(nèi)切-加工性活性，這使其特別感興趣地用于生物量的工業(yè)降解中。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ACLA酶具有的另一個優(yōu)勢是能夠直接降解處于其晶體形式，S卩，處于其天然存在的形式的纖維素。因此，在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降解包含結(jié)晶纖維素的物質(zhì)的方法，該方法包括使所述物質(zhì)與本文教導(dǎo)的ACLA多肽或其功能片段、同源物或變體或與本文教導(dǎo)的表達(dá)ACLA或其功能片段、同源物或變體的重組微生物接觸。通過下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步支持上面的各個方面和實(shí)施方案。
實(shí)施例實(shí)施例1 :ACLA的DZ結(jié)構(gòu)域的鑒定ACLA由來自假單胞菌屬物種ND137的基因aclA編碼。圖3比較了 ACLA與Gel5H 的一般組織結(jié)構(gòu)。ACLA具有下列的組織結(jié)構(gòu)(從酶的N-末端至C-末端)信號序列/催化性組件(GH-家族幻/天冬氨酸-和脯氨酸接頭/屬于CBM-家族6的糖結(jié)合組件/富含絲氨酸的接頭，另一種命名為信號序列-GH5-DPR-CBM6-PSL。編碼ACLA的基因已經(jīng)在大腸桿菌中克隆和過表達(dá)，但相應(yīng)的酶沒有被完全表征 (Aoki & KEimei 2006. European Journal of Phycology ( 十 1 ^!^^ ; ) 41 :321_328)。 ACLA的編碼序列在圖IF(SEQ ID NO 6)中提供。ACLA顯示與來自S. degradans的Cel5H具有顯著的整體同源性，并且也具有DZ結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例2 =ACLA在大腸桿菌中的制備和純化使用分子生物學(xué)技術(shù)，編碼ACLA的成熟形式(無信號序列)的合成DNA在大腸桿菌(E.coli)表達(dá)載體(pET22b(+)，NOVagen)中克隆。得到的載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 株(DE3) (Novagen)。同樣，編碼ACLA的截短形式或改造形式的修飾基因通過PCR獲得并在 pET22b (+)中克隆，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株(DE3)。為了促進(jìn)純化，在重組蛋白的C-末端終端處移植4個Hi s密碼子以促進(jìn)在鎳樹脂 (Nickel resin) (Ni-NTA, Qiagen)上的純化。重組菌株在LB培養(yǎng)基(Luria Bertani medium)中生長并且使用IPTG作為誘導(dǎo)物觸發(fā)被克隆的基因的表達(dá)。將培養(yǎng)物離心并在弗氏壓碎器(French press)中破壞收獲的細(xì)胞。為了獲得可以在鎳樹脂上純化的已產(chǎn)生的可溶形式的ACLA蛋白，必須采用變性 (使用尿素)和隨后的復(fù)性步驟。重組ACLA的合成通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來驗(yàn)證。觀察到在鎳樹脂上的純化和陰離子交換FPLC產(chǎn)生70%純的蛋白批料(也觀察到一些降解物質(zhì))。 實(shí)施例3 評價ACLA對多種底物包括對-硝基苯基-β -D-纖維二糖糖苷(pNPC)， 羧甲基纖維素(CMC)，磷酸溶脹纖維素(PASC)，微晶纖維素(Avicel)和原料物質(zhì)孵化稻草
25(hatched straw)的活性使用標(biāo)準(zhǔn)條件(37°C )測試純化的ACLA酶對多種底物的活性，并與純化的重組 Cel5H對相同底物的活性進(jìn)行比較。測試ACLA對可溶性發(fā)色底物對-硝基苯基- β -D-纖維二糖糖苷(pNPC)的酶活性，并與Cel5H(以95%純度)的酶活性相比較。在對硝基苯基和纖維二糖之間的連接被該酶裂解后，對硝基酚和纖維二糖被釋放，并且其濃度可以通過分光光度分析直接測定。ACLA 對于對-硝基苯基-β -D-纖維二糖糖苷的酶活性為17，9ui/μ mol，而Cel5H對相同底物的酶活性為18，2ui/ymoL·因此，與Cel5H對于對-硝基苯基-β-D-纖維二糖糖苷底物的酶活性相比，ACLA顯示98 %的酶活性。對于針對PASC(無定形纖維素)的活性的測試，使用的酶濃度為5ηΜ且底物濃度為3. 5g/L(pH 6. 0)。ACLA對PASC的酶活性為780ui/μ mol，而Cel5H對相同底物的酶活性為1600ui/ymol。因此，與Cel5H對PASC的酶活性相比，ACLA顯示49%的酶活性。對于 ACLA和Cel5H兩者，使用PASC作為底物，糖類釋放作為時間的函數(shù)顯示在圖4中。對于針對Avicel (結(jié)晶纖維素)的活性的測試，酶濃度為IOOnM且底物濃度為 3. 5g/L(pH 6. 0)。ACLA對Avicel的酶活性為56 μ M/Mh，而Cel5H對相同底物的酶活性為 140yM/24ho因此，與Cel5H對Avicel的酶活性相比，ACLA顯示40%的酶活性。對于ACLA 和Cel5H兩者，使用微晶纖維素(Avicel)作為底物，糖類釋放作為時間的函數(shù)顯示在圖5 中。對于針對CMC的活性的測試，酶濃度為InM且底物濃度為8g/L CMC (pH 6. 0)。實(shí)施例4 =ACLA微晶纖維素酶活性與來自解纖維素梭菌的野生型和改造的纖維素酶的比較使用如實(shí)施例3中所述的測定設(shè)計，ACLA微晶纖維素酶活性與來自解纖維素梭菌的野生型和改造的纖維素酶進(jìn)行比較。酶濃度為IOOnM且底物濃度為3. 5g/L (pH 6. 0)。也測試ACLA(ACLAwt)對孵化稻草的活性(酶濃度和底物濃度分別為IOOnM和 3. 5g/L)。上述的所有動力學(xué)實(shí)驗(yàn)在37°C下在20mM Tris-馬來酸酯pH 6. 0, ImM CaCl2 (疊氮化物0.01% w/v)緩沖液中進(jìn)行。ACLA的微晶纖維素酶活性也在相同緩沖液中在存在
氯化鈉(171mM NaCl)的條件下測量。觀察到ACLA酶的活性明顯高于來自解纖維素梭菌的野生型和改造的纖維素酶。實(shí)施例5 =ACLA活性與其他纖維素酶對結(jié)晶纖維素的活性的組合進(jìn)行動力學(xué)試驗(yàn)以研究ACLA活性是否補(bǔ)充或增加其他纖維素酶在降解純結(jié)晶纖維素中的活性。在這些試驗(yàn)中，測試下列的酶-來自解纖維素梭菌的野生型酶Cel5A(內(nèi)切)，Cel9G(內(nèi)切)，Cel9M(內(nèi)切)， Cel9P(內(nèi)切)，Cel48F(加工性)和Cel9E(加工性)。-來自解纖維素梭菌的修飾的酶CipO_G(內(nèi)切)-從除解纖維素梭菌以外的生物體分離的酶Neocallimastixpatriciarum(真菌(fungus))的 Cel6A (外切)。觀察到ACLA與其他纖維素酶的組合活性至少是增加的(additive)。這表明ACLA與其他酶的組合在降解纖維素中的潛在用途。實(shí)施例6 由丙酮丁醇梭菌產(chǎn)生和分泌ACLA編碼ACLA的野生型基因通過PCR從假單胞菌屬物種菌株擴(kuò)增，并克隆在大腸桿菌-丙酮丁醇梭菌PS0S952穿梭載體中。此質(zhì)粒是丙酮丁醇梭菌的表達(dá)載體(Perret等， 2004. J Bacteriol (細(xì)菌學(xué)雜志)186 :253-7)。目的基因的表達(dá)處于編碼硫解酶的基因的強(qiáng)力和組成型啟動子(Pthl)的控制下。兩個Iac操縱基因引入至pthl的上游和下游以防止大腸桿菌中該基因的任何表達(dá)。隨后載體被甲基化(體內(nèi)使用菌株ER2275[pANl]，體外使用甲基化酶CpG)并且如以前所述用來電轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌菌株。獲得重組克隆并且對菌落的PCR試驗(yàn)指示該載體在產(chǎn)溶劑梭菌中仍然是完整的。幾個克隆在2YTC培養(yǎng)基中生長，但與對照菌株相比在培養(yǎng)上清中沒有檢測到針對對-硝基苯基-纖維二糖糖苷的附加活性，所述對照菌株帶有“空”的PS0S952 (在平板上的CMC酶試驗(yàn))。用此新載體(甲基化后)轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌生成重組菌落。假單胞菌屬物種是一種革蘭氏陰性菌，其顯示兩層膜(外膜和胞質(zhì)膜)，而丙酮丁醇梭菌(革蘭氏陽性菌)僅擁有胞質(zhì)膜。在一個構(gòu)建體中，ACLA的天然信號序列替換為來自解纖維素梭菌的Cel5A的天然信號序列，因?yàn)楹笳弑槐〈妓缶浞值胤置?至多達(dá)5mg/L)。用包含雜交基因的載體轉(zhuǎn)化丙酮丁醇梭菌。研究使用Cel5A信號序列時ACLA的分泌產(chǎn)量。在發(fā)酵罐中在3g/L 2YT-PASC，pH固定在5，5的環(huán)境中生長重組細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物。測量到PASC的降解，剩余纖維二糖的消耗(consummation)和細(xì)菌生長。該重組細(xì)菌菌株的第二個培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中在2YT (然而不含有任何PASC)，pH固定在5，5的環(huán)境中生長。此試驗(yàn)的目標(biāo)是檢查細(xì)菌生長和PASC的消耗之間的相關(guān)性。此外，建立第三個培養(yǎng)物，以檢查觀察到的細(xì)菌生長是否是由于ACLA的活性而非丙酮丁醇梭菌的內(nèi)源酶系統(tǒng)的活性引起的。因此，含有空載體(PS0Q的菌株的培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中在 3g/L2YT-PASC，pH固定在5，5的環(huán)境中生長。最后，第四個培養(yǎng)物在發(fā)酵罐中在5g/L 2￥1^^5(，？!1固定在5，5的環(huán)境中生長以檢查PASC濃度是否是細(xì)菌生長的限制因素。因此，較高濃度的PASC可以潛在地導(dǎo)致較高的OD值(即，高于在前面試驗(yàn)中觀察到的0. 45的最大OD值)。
權(quán)利要求
1.一種從包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的方法，所述方法包括a)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)假單胞菌屬O^seudomonas)物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，以及b)使所述物質(zhì)與所述ACLA多肽接觸。
2.權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述ACLA酶或活性片段與所述重組宿主細(xì)胞分離的步驟。
3.一種重組微生物，所述重組微生物表達(dá)假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物，或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，其中所述微生物能夠降解纖維素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組微生物，所述重組微生物是產(chǎn)溶劑微生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組產(chǎn)溶劑微生物，所述重組產(chǎn)溶劑微生物是產(chǎn)乙醇微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組產(chǎn)溶劑微生物，所述重組產(chǎn)溶劑微生物是產(chǎn)溶劑細(xì)菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組產(chǎn)溶劑細(xì)菌，所述重組產(chǎn)溶劑細(xì)菌是丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述方法包括使所述物質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項所述的重組微生物接觸。
9.一種降解包含纖維素的物質(zhì)的方法，所述方法包括使所述物質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求3-7 中任一項所述的重組微生物接觸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2、8或9中任一項所述的方法，其中所述物質(zhì)包含或富含結(jié)晶纖維素。
11.一種重組微生物，所述重組微生物表達(dá)(a)假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，和(b)一種或多種除所述ACLA多肽以外的另外的外源纖維素降解酶。
12.—種酶混合物，所述酶混合物包含假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、 或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體和一種或多種除所述ACLA多肽以外的纖維素降解酶。
13.下述各項用于由包含纖維素的物質(zhì)制備溶劑、燃料或化學(xué)中間體的用途(i)假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體，(ii)編碼假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核苷酸序列，(iii)包含編碼假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核苷酸序列的表達(dá)載體，其中所述核酸序列可操作地連接至允許在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列；(iv)表達(dá)假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的宿主細(xì)胞，(ν)用編碼假單胞菌屬物種ND137的ACLA多肽或其同源物、或所述ACLA多肽或所述同源物的功能片段和/或變體的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或 (vi)根據(jù)權(quán)利要求3-7和11中任一項所述的重組微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)ND137的纖維素酶、其功能片段和/或變體及其改造形式在工業(yè)生物加工，更特別地溶劑制備的背景中的應(yīng)用。
文檔編號C12P7/06GK102227499SQ200980147738
公開日2011年10月26日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者亨利-皮埃爾·菲耶羅布, 安熱莉克·沙納爾-維亞爾 申請人:國家科學(xué)研究中心, 國立應(yīng)用科學(xué)學(xué)院, 地中海大學(xué), 普羅旺斯大學(xué), 道達(dá)爾公司