專利名稱：增加樣本和/或靶通量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及用于檢測(cè)具體靶核酸的高通量測(cè)定領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于增加可在單個(gè)測(cè)定中分析的樣本和/或靶的數(shù)目的方法。
背景技術(shù)：
檢測(cè)樣本中的特異核酸序列的能力已在診斷和預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品和農(nóng)業(yè)監(jiān)控、 分子生物學(xué)研究和許多其他領(lǐng)域形成了新方法。其他方法，特別是使得能檢測(cè)樣本中的多種靶并且/或者同時(shí)分析寬濃度范圍的多個(gè)樣本的方法，將會(huì)是十分有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸(即，T個(gè)靶核酸，其中T是大于1的整數(shù))的第一測(cè)定方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法需要提供在測(cè)定前混合在一起的S個(gè)樣本，其中S是大于1的整數(shù)。使這些樣本的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括樣本特異的核苷酸標(biāo)簽和靶核苷酸序列。對(duì)于所述S個(gè)樣本的每一個(gè)(即，待合并的樣本的每一個(gè))， 可將帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列混合形成測(cè)定混合物。以該方式，可以成批地測(cè)定樣本，因此， 若例如48個(gè)樣本待分析，則S可以是例如3，這意味著制備16份測(cè)定混合物。參見(jiàn)實(shí)施例 1。可對(duì)所述測(cè)定混合物或其等分試樣用SXT對(duì)獨(dú)特的(unique)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與靶核苷酸序列退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與樣本特異性核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物。在具體實(shí)施方案中，對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物在擴(kuò)增混合物中或其等分試樣中的存在或量。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或量指示具體靶核酸在具體樣本中的存在或量。在所述第一種測(cè)定方法的示例性實(shí)施方案中，所述編碼反應(yīng)包括使用針對(duì)每個(gè)樣本的不同正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物系列分別預(yù)擴(kuò)增所述S個(gè)樣本的每一個(gè)來(lái)產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增的樣本，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物系列包括T對(duì)正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每對(duì)預(yù)擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增一個(gè)具體的靶核酸；并且在給定系列中的所有正向預(yù)擴(kuò)增引物或所有反向預(yù)擴(kuò)增引物都包括共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。
將所述S個(gè)樣本的每一個(gè)的預(yù)擴(kuò)增樣本混合來(lái)形成測(cè)定混合物(例如，待一起分析的每一系列樣本的一份測(cè)定混合物)。然后，可通過(guò)以下方式分析所述測(cè)定混合物將其分成最多SXT個(gè)擴(kuò)增混合物，并且用獨(dú)特?cái)U(kuò)增引物對(duì)來(lái)分別擴(kuò)增所述每個(gè)擴(kuò)增混合物，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與靶核酸序列退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與樣本特異性核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物。確定擴(kuò)增產(chǎn)物在所述擴(kuò)增混合物中的存在或量以確定具體靶核酸在具體樣本中的存在或量。本發(fā)明提供了檢測(cè)多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸(即，T個(gè)靶核酸，其中T是大于1的整數(shù))的第二測(cè)定方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法需要提供在測(cè)定前混合在一起的S個(gè)樣本，其中S是大于1的整數(shù)。對(duì)這些樣本的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括連接至靶核苷酸序列的第一核苷酸標(biāo)簽，所述靶核苷酸序列連接至第二核苷酸標(biāo)簽。對(duì)于這些S個(gè)樣本的每一個(gè)(即，所述待合并的樣本的每一個(gè))，將帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列混合形成測(cè)定混合物。用 SXT對(duì)獨(dú)特的擴(kuò)增引物擴(kuò)增所述測(cè)定混合物或其等分試樣，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與第一核苷酸標(biāo)簽退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與第二核苷酸標(biāo)簽退火的反向或正向擴(kuò)增引物。對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物在所述擴(kuò)增混合物或其等分試樣中的存在或量。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在具體樣本中的存在或量。在所述第二測(cè)定方法的示例性實(shí)施方案中，所述編碼反應(yīng)包括使用針對(duì)每個(gè)樣本的不同正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物系列分別對(duì)所述S個(gè)樣本的每一個(gè)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增樣本，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物系列包括T對(duì)正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每對(duì)預(yù)擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增一個(gè)具體的靶核酸；并且每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物包括正向核苷酸標(biāo)簽，每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物包括反向核苷酸標(biāo)簽；將所述S個(gè)樣本的每一個(gè)的預(yù)擴(kuò)增樣本混合形成測(cè)定混合物。然后，可通過(guò)以下方式分析所述測(cè)定混合物將每個(gè)測(cè)定混合物分為最多SXT個(gè)擴(kuò)增混合物，并且用獨(dú)特的擴(kuò)增弓I物對(duì)分別擴(kuò)增每個(gè)所述擴(kuò)增混合物，其中每對(duì)擴(kuò)增弓I物包括會(huì)與正向核苷酸標(biāo)簽退火的正向擴(kuò)增引物；和會(huì)與反向核苷酸標(biāo)簽退火的反向擴(kuò)增引物。確定擴(kuò)增產(chǎn)物在所述擴(kuò)增混合物中的存在或量。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在具體樣本中的存在或量。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣本中的多個(gè)靶核酸(即，T個(gè)靶核酸)的第三測(cè)定方法。 所述方法需要向樣本提供T個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物包括不同的靶特異性核苷酸序列和系列特異性核苷酸標(biāo)簽，其中使用X個(gè)不同的正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，X是大于1小于T的整數(shù)，因此T/X個(gè)引物包括相同的正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽。還向所述樣本提供T個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物包括不同的靶特異性核苷酸序列和反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，其中使用Y個(gè)不同的反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，Y是大于1小于T的整數(shù)，因此T/Y個(gè)引物包括相同的反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽。預(yù)擴(kuò)增所述樣本以產(chǎn)生測(cè)定混合物，其中針對(duì)具體靶生產(chǎn)的任何預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物參入正向和反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽的獨(dú)特組合。用擴(kuò)增引物擴(kuò)增所述測(cè)定混合物或其等分試樣，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與所述正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽退火的正向擴(kuò)增引物；和會(huì)與所述反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽退火的反向擴(kuò)增引物。對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物在所述擴(kuò)增混合物或其等分試樣中的存在或量。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在所述樣本中的存在。本發(fā)明的第四測(cè)定方法提供了一種檢測(cè)樣本中多個(gè)靶核酸的模塊化方法。該方法需要將樣本分為R個(gè)等分試樣，其中R是大于1的整數(shù)。對(duì)R個(gè)等分試樣的每一份分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的核苷酸序列，其中T是每個(gè)等分試樣中待檢測(cè)的靶核酸的數(shù)目，T是大于1的整數(shù)。每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括在靶核苷酸序列5’的第一核苷酸標(biāo)簽、靶核苷酸序列和在所述靶核苷酸序列3’的第二核苷酸標(biāo)簽。所述 T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的每一個(gè)中的核苷酸標(biāo)簽組合對(duì)每個(gè)等分試樣中的每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列來(lái)說(shuō)都是獨(dú)特的。然而，將相同系列的第一和第二核苷酸標(biāo)簽組合用于每個(gè)所述等分試樣的所述編碼反應(yīng)中。所述方法的該方面使得能夠使用針對(duì)每個(gè)等分試樣的相同系列T對(duì)不同的擴(kuò)增引物分別擴(kuò)增每個(gè)等分試樣。每對(duì)引物均包括會(huì)與每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列中的所述第一核苷酸標(biāo)簽退火的第一引物和會(huì)與其中的所述第二核苷酸標(biāo)簽退火的第二引物。對(duì)于每個(gè)等分試樣中的每對(duì)獨(dú)特的引物，所述方法需要確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于所述等分試樣中。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在所述樣本中的存在。在該方法的變化方法中，在所述編碼反應(yīng)后，將每個(gè)等分試樣分為T(mén)個(gè)亞等分試樣。將所述T對(duì)不同的擴(kuò)增引物的一對(duì)與每個(gè)亞等分試樣組合，并且將所述亞等分試樣分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在上述方法的具體實(shí)施方案中，所述樣本可以是基因組DNA樣本。在這些實(shí)施方案的變化方案中，可在存在一份量的阻斷劑的情況下進(jìn)行基因組DNA的預(yù)擴(kuò)增，其中所述阻斷劑的量足以提高所述靶核酸的特異性擴(kuò)增。


可通過(guò)與附圖結(jié)合參考以下說(shuō)明來(lái)理解本發(fā)明，所述附圖示出了本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案。圖1示出了一個(gè)示例性矩陣型微流體裝置的平面圖。圖2示出的曲線圖描繪了本發(fā)明的方法用于在基因分型研究中分析多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸的結(jié)果(實(shí)施例2)。以帶有3個(gè)不同標(biāo)簽序列的正向引物擴(kuò)增樣本。結(jié)果顯示在標(biāo)為T(mén)AG-1、2和3的單TAG對(duì)偶視圖(allelogram)(上排圖)中。所有的樣本都清楚地區(qū)分(圈出)為純合性XX、YY或雜合性XY基因型。來(lái)自這些對(duì)偶圖的合并基因型的數(shù)據(jù)顯示為“3合1合并圖(Merged 3) ”。圖3示出了來(lái)自實(shí)施例2的基因分型研究的數(shù)據(jù)。使用加標(biāo)簽和標(biāo)準(zhǔn)方法(為了比較)對(duì)16個(gè)SNP基因座進(jìn)行基因分型。不帶標(biāo)簽的樣本被描述為“原樣”。如實(shí)施例2 所描述，將示于“原樣”表格中的不帶標(biāo)簽的相同樣本與在正向引物上攜帶標(biāo)簽序列1、2或3的樣本(“測(cè)試”)進(jìn)行比較。帶標(biāo)簽的樣本顯示出1.4至2%的檢出率(call rate)增長(zhǎng)。標(biāo)簽3中的所有未檢出(no-called) SNP都來(lái)自于單個(gè)樣本。圖4示出了一種分析多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸的示例性方案，例如在實(shí)施例3的基因表達(dá)研究中。該研究使用了靶向16個(gè)基因座的3個(gè)標(biāo)簽組(1-3)。合成用于擴(kuò)增16 個(gè)cDNA的3個(gè)系列的16個(gè)正向引物。如果每組對(duì)48個(gè)個(gè)體加標(biāo)簽，并將來(lái)自每個(gè)標(biāo)簽組的1個(gè)樣本合并，那么可以同時(shí)分析144個(gè)樣本。在芯片外加標(biāo)簽反應(yīng)(off-chip tagging reaction)之前，將樣本分到所述3個(gè)標(biāo)簽系列的每個(gè)系列中。每組的48個(gè)樣本在正向引物的5’端帶有標(biāo)簽序列1、2或3。加標(biāo)簽反應(yīng)使用測(cè)定特異性加有標(biāo)簽的引物和外部反向引物。在芯片上，可使用嵌套反向引物。在基因表達(dá)的實(shí)例中，顯示了單個(gè)水解探針。圖5顯示一種分析多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸的示例性一般方案。例如，可使用等位基因特異性探針(基因分型)或單個(gè)探針(基因表達(dá))。將樣本合并后，在PCR步驟前使用ExoSAP-IT(USB)來(lái)除去殘余的引物。圖6顯示一種分析多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸的示例性一般方案，在該情形下，對(duì) 144個(gè)樣本進(jìn)行16項(xiàng)測(cè)定。合成用于擴(kuò)增16個(gè)基因座的3個(gè)系列的16個(gè)正向引物。每個(gè)標(biāo)簽系列在5’端還帶有標(biāo)簽序列1、2或3。在芯片外加標(biāo)簽反應(yīng)中，使用由帶有標(biāo)簽序列 1的16個(gè)正向測(cè)定引物和16個(gè)反向測(cè)定特異性反向引物組成的32個(gè)引物。使用帶有不同 5’標(biāo)簽序列(標(biāo)簽幻的測(cè)定特異性標(biāo)簽引物和相同序列的反向引物來(lái)對(duì)下一系列的樣本加標(biāo)簽。還以第3種標(biāo)簽和另一系列的樣本進(jìn)行該操作。在用標(biāo)簽系列1對(duì)48X樣本加標(biāo)簽、用標(biāo)簽系列2對(duì)48X樣本加標(biāo)簽，用標(biāo)簽系列3對(duì)48X樣本加標(biāo)簽后，將每個(gè)標(biāo)簽系列的一個(gè)樣本合并。這產(chǎn)生48個(gè)混合的樣本，并且當(dāng)將正確的標(biāo)簽引物和靶特異性反向引物加入到合并的樣本中時(shí)，只會(huì)出現(xiàn)來(lái)自于所述混合樣本之一(而不是另外兩個(gè))的特異性靶的有效PCR擴(kuò)增。圖7顯示了源自144個(gè)系列稀釋的通用參考cDNA的qPCR數(shù)據(jù)，所述通用參考cDNA 以靶向16個(gè)不同基因的3個(gè)不同標(biāo)簽(標(biāo)簽10、48和89)擴(kuò)增(實(shí)施例3)。數(shù)據(jù)來(lái)自單個(gè)96. 96陣列。由于所有cDNA樣本都是同一樣本的稀釋物，預(yù)期的Δ Δ CT為0。96. 5%的測(cè)定顯示出標(biāo)示出的靶區(qū)內(nèi)的-1至+1個(gè)循環(huán)的Δ ACT。144個(gè)樣本中的5個(gè)(約3.5%) 的Δ Δ CT為1. 0至1. 4。箭頭突出顯示兩個(gè)Δ Δ CT為1. 3和1. 4的最大離群值。對(duì)于每個(gè)標(biāo)簽/樣本稀釋物/測(cè)定合并物，使用通用參考cDNA從測(cè)試Δ CT中減去對(duì)照Δ CT基因 (Bax)來(lái)計(jì)算 Δ ACT。圖 8 顯示在購(gòu)自 Fluidigm Corp (South San Francisco, CA)的 12. 765 Digital Array上的數(shù)字化PCR的結(jié)果。如實(shí)施例4中所述，在多種量的tRNA存在下預(yù)擴(kuò)增人基因組DNA，然后用數(shù)字化PCR進(jìn)行分析。具體而言，使用Qin J. , Jones RC, Ramakrishnan R. (2008)Studying copy number variations using a nanofluidic platform Nucleic Acids Research, Vol. 36,No. 18 ell6 中所描述的方案，在 GeneAmp PCR 系統(tǒng) 9700 (Applied Biosystems，CA)上將人基因組DNA在25 μ 1反應(yīng)系(reaction)中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，所述25 μ 1 反應(yīng)系包含 IXPreAmp master mix (Applied Biosystems，CA)、900nM 引物、約 IOng 的 DNA 樣本和不同量的tRNA。如Qin等人所描述，將樣本稀釋并在所述數(shù)字化陣列上分析。在顯示的所有子圖中均使用等量的基因組DNA。上面兩子圖顯示陰性對(duì)照——不存在tRNA下進(jìn)行的預(yù)擴(kuò)增，而下面的兩對(duì)子圖顯示向預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)混合物中加入2 μ g/μ 1或3μ g/μ 1tRNA的效應(yīng)。很顯然，加入tRNA會(huì)增加特異性擴(kuò)增信號(hào)并壓抑背景。圖9顯示了向預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)混合物加入tRNA對(duì)特異性擴(kuò)增曲線質(zhì)量的影響。圖9中顯示的曲線來(lái)自實(shí)施例4中所描述的實(shí)驗(yàn)，并且反映了與圖8所顯示相同的芯片板圖的實(shí)時(shí)PCR曲線。第一子圖顯示了預(yù)擴(kuò)增混合物中不存在tRNA下的擴(kuò)增圖，第二和第三子圖顯示了當(dāng)2 μ g/ μ 1或3 μ g/ μ 1的tRNA分別包括在所述預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)混合物中時(shí)的影響。所述擴(kuò)增曲線確證了圖8的觀察結(jié)果，S卩加入tRNA會(huì)增加特異性擴(kuò)增信號(hào)的總量(增加采樣數(shù))，并且還顯示了加入tRNA會(huì)提高擴(kuò)增的質(zhì)量(可能是通過(guò)提高PCR的效率)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了用于增加可在單個(gè)測(cè)定中針對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶進(jìn)行分析的樣本數(shù)目的方法，還提供了用于增加樣本中可被分析的靶數(shù)目、同時(shí)使測(cè)定費(fèi)用的增加最小化的方法。所述方法特別適合用于增加在矩陣型微流體裝置上進(jìn)行的測(cè)定的效率。應(yīng)理解，本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、方案和試劑等，因?yàn)檫@些都可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員改變。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用來(lái)描述具體示例性實(shí)施方案的目的，不是意欲限制本發(fā)明的范圍。還應(yīng)注意，除非上下文另有說(shuō)明，否則本文和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式“a”、"an"和“所述”包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，提及“a cell ”是指一個(gè)或多個(gè)池及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其等同物。參考附圖所示出和/或以下說(shuō)明書(shū)所詳述的非限制性實(shí)施方案和實(shí)例可更完全地解釋本發(fā)明的實(shí)施方案及其多個(gè)特征和詳細(xì)優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)注意，在附圖中示出的特征不一定是按比例繪制的，并且即使未在本文明確說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，一個(gè)實(shí)施方案的特征可為其他實(shí)施方案使用?？梢允÷詫?duì)熟知的組件和處理技術(shù)的描述，從而不會(huì)不必要地使本發(fā)明的實(shí)施方案令人費(fèi)解。定義除非另有說(shuō)明，權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)按如下所述定義。為了清楚明確地定義這些術(shù)語(yǔ)，但是所有的定義都與本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)這些術(shù)語(yǔ)的理解一致。術(shù)語(yǔ)“鄰近的”當(dāng)在本文中用于指核酸中的兩個(gè)核苷酸序列時(shí)，可以指由0至約20 個(gè)核苷酸分隔的核苷酸序列，更具體而言，相隔約1至約10個(gè)核苷酸的核苷酸序列，或者是彼此直接毗連的序列。此外，若兩個(gè)引物部分重疊則可稱其為鄰近的，例如鄰近的引物可以重疊約1至約4個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否則包括可以以與天然存在的核苷酸相似的方式(例如雜交)發(fā)揮功能的天然核苷酸的已知類似物。術(shù)語(yǔ)核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如基因組DNA、互補(bǔ)DNA(cDNA，它是 mRNA的DNA代表物，通常通過(guò)信使RNA (mRNA)逆轉(zhuǎn)錄或者通過(guò)擴(kuò)增得到)、合成或通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA分子和mRNA。術(shù)語(yǔ)核酸除了包括單鏈分子外，還涵蓋雙鏈或三鏈核酸。在雙鏈或三鏈核酸中， 核酸鏈不需要是共延伸的(coextensive)(即，雙鏈核酸不需要在兩條鏈的全長(zhǎng)都是雙鏈的)。術(shù)語(yǔ)核酸還涵蓋它的任意化學(xué)修飾，例如通過(guò)甲基化和/或加帽。核酸修飾可包括將化學(xué)基團(tuán)添加至各個(gè)核酸堿基或者至核酸整體，所述化學(xué)基團(tuán)會(huì)引入額外的電荷、極性、氫鍵、靜電相互作用和功能性。這樣的修飾可包括堿基修飾，例如2位糖修飾、5位嘧啶修飾、8位嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外胺上的修飾和5溴尿嘧啶取代；主鏈修飾；異常堿基配對(duì)組合，例如異堿基(isobase)異胞嘧啶(isocytidine)和異鳥(niǎo)嘌呤(isoguanidine)等。更具體而言，在一些實(shí)施方案中，核酸可包括多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)和為嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的任何其他類型核酸，以及其他包含非核苷酸主鏈的聚合物，例如，聚酰胺(例如，肽核酸(PNA)和聚嗎啉(po 1 ymorpho 1 ino)(可市購(gòu)自 Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，作為 Neugene)) 聚合物，以及滿足以下條件的其他合成的序列特異性核酸聚合物，即所述聚合物含有構(gòu)型使得可進(jìn)行堿基配對(duì)和堿基堆積(例如DNA和RNA中出現(xiàn)的)的核堿基(nucleobase)。 術(shù)語(yǔ)核酸還涵蓋連接的核酸(linked nucleic acid，LNA)，連接的核酸記載于美國(guó)專利 No. 6，794，499、6，670，461、6，262，490和6，770，748中，這些專利就其對(duì)LNA的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式全文納入本說(shuō)明書(shū)。所述核酸可源自完全化學(xué)合成方法，例如固相介導(dǎo)的化學(xué)合成；可源自生物來(lái)源， 例如通過(guò)從產(chǎn)生核酸的任何物種中分離；或源自涉及通過(guò)分子生物學(xué)工具操作核酸的方法，例如DNA復(fù)制、PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄；或者來(lái)自以上方法的結(jié)合。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”是指在本發(fā)明的方法中要檢測(cè)的具體核酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶核苷酸序列”是指包括靶核酸的核苷酸序列的分子，例如通過(guò)擴(kuò)增靶核酸得到的擴(kuò)增產(chǎn)物或者在逆轉(zhuǎn)錄RNA靶核酸時(shí)產(chǎn)生的cDNA。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。即，若在核酸給定位置的核苷酸能夠與另一個(gè)核酸的核苷酸以氫鍵結(jié)合，則認(rèn)為這兩個(gè)核酸在該位置是相互互補(bǔ)的。兩個(gè)單鏈核酸分子之間的互補(bǔ)可以是“部分的”，其中僅一些核苷酸結(jié)合；或者所述互補(bǔ)可以是完全的，此時(shí)所述單鏈分子之間存在整體互補(bǔ)。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度對(duì)核酸鏈之間的雜交效率和強(qiáng)度具有顯著影響。“特異性雜交”是指在規(guī)定的嚴(yán)格條件下，核酸與靶核苷酸序列結(jié)合，但基本不與存在于雜交混合物中的其他核苷酸序列結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，放寬雜交條件的嚴(yán)格度使得會(huì)出現(xiàn)序列錯(cuò)配。在具體的實(shí)施例中，雜交在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行。短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”通常是指比具體序列在規(guī)定離子強(qiáng)度和PH下的解鏈溫度(Tm)低約5°C至約20°C或25°C的溫度。本文使用的Tm是一群雙鏈核酸分子開(kāi)始出現(xiàn)半解離成為單鏈的溫度。計(jì)算核酸Tm 的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如 Berger and Kimmel (1987)METHODS IN ENZYM0L0GY, VOL. 152=GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, San Diego =Academic Press, Inc. 和Sambrook et al. (198 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL,2NDED. ,VOLS. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory，兩篇參考文獻(xiàn)都以引用方式納入本文)。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所指出的，當(dāng)核酸在IM NaCl的水性溶液中時(shí)，Tm值的簡(jiǎn)單估計(jì)值可通過(guò)以下等式計(jì)算Tm = 81. 5+0. 41 (% G+C)(參見(jiàn)，例如 Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。雜交物的解鏈溫度(以及因此嚴(yán)格雜交的條件)受多種因素影響，例如引物或探針的長(zhǎng)度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶核酸的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中還是固定的等)，以及鹽和其他成分(例如存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)的濃度。這些因素的影響是已知的并且在本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)中有詳述。適于實(shí)現(xiàn)大部分序列特異性雜交的示例性嚴(yán)格條件是至少約60°C的溫度和pH7下約0. 2摩爾的鹽濃度。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”用于指相對(duì)較短的核酸，通常小于200個(gè)核苷酸，更特別小于100 個(gè)核苷酸，尤其特別小于50個(gè)核苷酸。一般而言，寡核苷酸是單鏈DNA分子。術(shù)語(yǔ)“引物”是指這樣的寡核苷酸，即其能夠與核酸雜交(也稱為“退火”)，并且在合適緩沖物和合適溫度并在合適條件(即，存在4種不同的核苷三磷酸和聚合試劑，例如 DNA或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)下作為核苷酸(DNA或RNA)聚合的起始位點(diǎn)。引物的適當(dāng)長(zhǎng)度取決于所述引物的目的用途，但引物的長(zhǎng)度一般為至少7個(gè)核苷酸，更一般為10至30 個(gè)核苷酸，甚至更一般為15至30個(gè)核苷酸。其他引物可以稍微更長(zhǎng)，例如長(zhǎng)30至50個(gè)核苷酸。在本文中，“引物長(zhǎng)度”是指與互補(bǔ)“靶”序列雜交并且引發(fā)核苷酸合成的寡核苷酸或核酸部分。短的引物分子通常需要較低的溫度來(lái)與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合體。引物不需要反映模板的精確序列，但是必須具有足夠互補(bǔ)性以與模板雜交。術(shù)語(yǔ)“引物位點(diǎn)”或 “引物結(jié)合位點(diǎn)”是指引物雜交的靶核酸的區(qū)段。若引物或其部分與另一個(gè)核酸內(nèi)的核苷酸序列雜交，則該引物被稱為與所述核酸退火。引物與具體核苷酸序列雜交，這一陳述不是意欲指所述引物完全地或者排他性地與所述核酸序列雜交。例如，在一些實(shí)施方案中，本文使用的擴(kuò)增引物被描述為“與樣本特異性核苷酸標(biāo)簽退火”。這種描述涵蓋與所述核苷酸標(biāo)簽完全退火的引物，以及部分地與所述核苷酸標(biāo)簽退火并且部分地與鄰近的核苷酸序列例如靶核苷酸序列退火的引物。這樣的雜合引物可增加擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。術(shù)語(yǔ)“引物對(duì)”是指一組引物，包括與待擴(kuò)增的DNA序列的5’端的互補(bǔ)區(qū)雜交的 5’ “上游引物”或“正向引物”和與所述待擴(kuò)增序列的3’端雜交的3’ “下游引物”或“反向引物”。如本領(lǐng)技術(shù)人員了解的，術(shù)語(yǔ)“上游”和“下游”或者“正向”和“反向”不意欲是進(jìn)行限制，而是在具體實(shí)施方案中提供示例性方向。如果引物對(duì)可用于特異性擴(kuò)增給定擴(kuò)增混合物中的具體靶核苷酸序列，則將其稱為“獨(dú)特的”。如果第一引物對(duì)被用于擴(kuò)增第一擴(kuò)增產(chǎn)物，然后第二引物對(duì)被用于擴(kuò)增位于所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物中的靶核苷酸序列，則第二引物對(duì)相對(duì)于第一引物對(duì)是“嵌套的”。嵌套可用于增加擴(kuò)增反應(yīng)的特異性?！疤结槨笔悄軌蛲ㄟ^(guò)一種或多種化學(xué)鍵(通常通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，一般通過(guò)形成氫鍵)與互補(bǔ)序列的靶核酸結(jié)合并因此形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸。所述探針可與“探針結(jié)合位點(diǎn)” 結(jié)合或雜交?？捎每蓹z測(cè)標(biāo)記標(biāo)記所述探針，以使探針的檢測(cè)容易進(jìn)行，特別是當(dāng)所述探針與其互補(bǔ)靶雜交后。然而，或者所述探針也可以不被標(biāo)記，而通過(guò)與標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合直接或間接地檢測(cè)。探針的大小可有很大變化。一般而言，探針長(zhǎng)度至少為7至15個(gè)核苷酸。其他探針長(zhǎng)可為至少20、30或40個(gè)核苷酸。又一些其他探針可略微更長(zhǎng)，長(zhǎng)為至少 50、60、70、80或90個(gè)核苷酸。再一些其他探針還可更長(zhǎng)，長(zhǎng)為至少100、150、200個(gè)或更多個(gè)核苷酸。探針還可以為上述任意數(shù)值界定的范圍內(nèi)的任意長(zhǎng)度(例如，長(zhǎng)15-20個(gè)核苷酸)。所述引物或探針可與靶核酸序列完全互補(bǔ)，或者可以低于完全互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述引物與靶核酸序列的互補(bǔ)區(qū)在至少7個(gè)核苷酸的一段序列上、更一般在10-30個(gè)核苷酸的一段序列上、并且經(jīng)常在至少14-25個(gè)核苷酸的一段序列上，具有至少65%的同一性，更經(jīng)常具有至少75%的同一性，至少85%的同一性，至少90%的同一性，或者至少 95%、96%、97%、98%或99%的同一性。應(yīng)理解，一些堿基(例如引物的3，堿基)通常最好是與靶核酸序列的相應(yīng)堿基完全互補(bǔ)。弓I物和探針一般在嚴(yán)格雜交條件下與所述靶序列退火。本文使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸標(biāo)簽”是指加至靶核苷酸序列的預(yù)定核苷酸序列。所述核苷酸標(biāo)簽可編碼關(guān)于所述靶核苷酸序列的信息項(xiàng)，例如所述靶核苷酸序列的標(biāo)識(shí)、所述序列所來(lái)源的染色體或者所述靶核苷酸序列所來(lái)源的樣本的標(biāo)識(shí)。在一些實(shí)施方案中，這樣的信息可在一個(gè)或多個(gè)核苷酸標(biāo)簽中編碼，例如，2個(gè)核苷酸標(biāo)簽的結(jié)合物——靴核苷酸序列一端一個(gè)——可編碼所述靶核苷酸序列的標(biāo)識(shí)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“編碼反應(yīng)”是指在其中至少一個(gè)核苷酸標(biāo)簽被加至靶核苷酸序列的反應(yīng)。例如，核苷酸標(biāo)簽可通過(guò)“編碼PCR”加入，在所述編碼PCR中至少一個(gè)引物包括靶特異性部分和位于所述靶特異性部分的5’端的核苷酸標(biāo)簽，并且第二引物包括僅靶特異性部分或者靶特異性部分和位于所述靶特異性部分5’端的核苷酸標(biāo)簽?？捎糜诰幋a PCR的示例性PCR方案的實(shí)例參見(jiàn)未決WO申請(qǐng)US03/37808以及美國(guó)專利No. 6，605, 451。 還可以通過(guò)可包括連接反應(yīng)的“編碼連接”反應(yīng)來(lái)加上核苷酸標(biāo)簽，在所述編碼連接反應(yīng)中至少一個(gè)引物包括靶特異性部分和位于所述靶特異性部分的5’端的核苷酸標(biāo)簽，并且第二引物包括僅靶特異性部分或者靶特異性部分和位于所述靶特異性部分5端的核苷酸標(biāo)簽。 示例性編碼連接反應(yīng)記載于例如美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 2005/0260640,該專利公開(kāi)文本以引用的方式全文特別就連接反應(yīng)納入本文。編碼反應(yīng)，例如編碼PCR，可進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，這足以加上單個(gè)核苷酸標(biāo)簽。或者，編碼反應(yīng)，例如編碼PCR，可進(jìn)行多個(gè)循環(huán)以預(yù)擴(kuò)增靶核酸 (例如以增加濃度)。本文使用的“編碼反應(yīng)”會(huì)產(chǎn)生“帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列”，它包括連接于靶核苷酸序列的核苷酸標(biāo)簽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“樣本特異性”核苷酸標(biāo)簽所指的核苷酸標(biāo)簽編碼在編碼反應(yīng)中與標(biāo)簽連接或者與之發(fā)生連接(becomes linked)的靶核苷酸序列的樣本標(biāo)識(shí)。提及引物的部分時(shí)本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶特異性核苷酸序列”是指在合適的退火條件下可與靶核酸或靶核苷酸序列特異性退火的序列?！肮餐?，，樣本特異性核苷酸標(biāo)簽是指具有特定核苷酸序列的標(biāo)簽，所述核苷酸序列與編碼反應(yīng)中產(chǎn)生的所有靶核苷酸序列連接或者與之發(fā)生連接，使得從給定樣本產(chǎn)生的所有帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列每一個(gè)均被具有相同序列的標(biāo)簽所識(shí)別?！跋盗刑禺愋院塑账針?biāo)簽”是與多個(gè)靶核苷酸序列連接或者與之發(fā)生連接的標(biāo)簽。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，測(cè)定混合物可包括多個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，所述序列在其兩端具有組合起來(lái)唯一地識(shí)別每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的不同的組特異性核苷酸標(biāo)簽。短語(yǔ)“不同的正向和反向引物系列”是指不同于在測(cè)定中使用的任何其他引物系列的引物系列。這樣的引物系列可用于引入樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。本發(fā)明的教導(dǎo)的擴(kuò)增涵蓋通過(guò)至少一個(gè)靶核酸的至少一部分被復(fù)制(一般地以模板依賴的方式)的任何方法，所述方法包括但不局限于用于線性地或指數(shù)地?cái)U(kuò)增核酸序
14列的大量技術(shù)。進(jìn)行擴(kuò)增步驟的示例性方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接酶檢測(cè)反應(yīng) (ligase detection reaction, LDR)、Q-復(fù)制酶擴(kuò)增后的連接反應(yīng)、PCR、引物延伸、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、超分支連置換擴(kuò)增(hyperbranched strand displacement amplification) > 多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification, MDA)、基于核酸鏈的擴(kuò)增 (NASBA)、2 步多重?cái)U(kuò)增(two-step multiplexed amplification)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等， 包括其多重形式和結(jié)合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/ LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(還被稱作聯(lián)合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-CCR(combined chain reaction))、數(shù)字化擴(kuò)增等。這類技術(shù)的描述可見(jiàn)于Ausbel et al. ；PCR Primer :A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed. , Cold Spring Harbor Press (1995) ；The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience(2002) ；Msuih et al.，J. Clin.Micro. 34 :501-07(1996) ；The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed. , Humana Press, Totowa, NJ. (2002) ；Abramson et al. , Curr Opin Biotechnol. 1993 Feb. ；4(1) :41_7，美國(guó)專利 No. 6，027，998 ；美國(guó)專利 No. 6，605，451，Barany et al.，PCT 公開(kāi)文本 No. WO 97/31256 ；Wenz et al.，PCT 公開(kāi)文本 No. WO 01/92579 ；Day et al. , Genomics, 29 (1) :152-162(1995), Ehrlich et al.，Science 252 :1643-50(1991) ；Innis et al. , PCRProtocols :A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) ；Favis et al. , Nature Biotechnology 18: 561-64(2000)；禾口 Rabenau et al.，Infection 28 :97-102(2000) ；Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification,1995(available on the world wide web at :promega. com/geneticidproc/ussymp6proc/ blegrad.html-) ；LCR Kit Instruction Manual,Cat. #200520,Rev. #050002,Stratagene, 2002 ；Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :188-93(1991) ；Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25 :2924-2951(1997) ；Zirvi et al. , Nucl. Acid Res. 27 :e40i_viii(1999); Dean et al.，Proc Natl Acad Sci USA 99 :5261-66(2002) ； Barany and Ge If and, Gene 109 :1-11(1991) ；Walker et al., Nucl. Acid Res. 20 :1691—96(1992) ；Polstra et al.， BMC Inf. Dis. 2 :18-(2002) ；Lage et al. , Genome Res. 2003 Feb. ；13(2) :294-307, and Landegren et al. , Science 241 1077-80 (1988), Demidov, V. , Expert Rev MoI Diagn. 2002 Nov. ；2 (6) :542-8. ， Cook et al. ， J Mierobiol Methods. 2003 May ；53 (2) 165-74, Schweitzer et al. , Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb. ；12(1) :21_7，美國(guó)專利 No. 5，830，711，美國(guó)專禾Ij No. 6，027，889，美國(guó)專利 No. 5，686，243，PCT 公開(kāi)文本 No. W00056927A3 和 PCT 公開(kāi)文本 No. W09803673A1 等其他出處。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增包括以下連續(xù)過(guò)程的至少一個(gè)循環(huán)將至少一個(gè)引物與至少一個(gè)靶核酸中的互補(bǔ)或基本互補(bǔ)序列退火；用聚合酶以模板依賴的方式合成至少一條核苷酸鏈；并且使新形成的核酸雙鏈體變性以將鏈分開(kāi)?？芍貜?fù)也可不重復(fù)所述循環(huán)。擴(kuò)增可包括熱循環(huán)或者可以在等溫下進(jìn)行。本文使用的術(shù)語(yǔ)“qPCR”是指定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，也被稱作“實(shí)時(shí) PCR"或“動(dòng)力學(xué)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”。本文使用的術(shù)語(yǔ)“數(shù)字化擴(kuò)增”是指在其中對(duì)核酸樣本例如基因組DNA進(jìn)行相同的(或基本相似的)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增方法。一般而言，通常選擇進(jìn)行數(shù)字化擴(kuò)增的核酸的量，使得在將所述核酸分配至離散的反應(yīng)混合物時(shí)，每個(gè)單獨(dú)的擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)期包括一個(gè)或少于一個(gè)可擴(kuò)增核酸。任何靶擴(kuò)增子的濃度(拷貝/yL)與陽(yáng)性(即包含擴(kuò)增產(chǎn)物的) 昆白勺#^1110 “Method and Apparatus for Determining Copy Number Variation Using Digital PCR” 的共同未決美國(guó)申請(qǐng) No. 12/170，414，就其全部目的，特別是對(duì)數(shù)字化PCR結(jié)果的分析，將其以引用的方式納入。也可參見(jiàn)Dube等，2008， "Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device"PLoS ONE 3(8) :U876。PCR被用于擴(kuò)增時(shí)，數(shù)字化擴(kuò)增被命名為“數(shù)字化PCR”?！霸噭痹趶V義上是指在反應(yīng)中使用的除分析物(例如，被分析的核酸)之外的任何試劑。用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的示例性試劑包括但不局限于緩沖物、金屬離子、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、模板核酸、核苷酸、標(biāo)記、染料、核酸酶等。用于酶反應(yīng)的試劑包括例如底物、輔因子、緩沖物、金屬離子、抑制劑和激活劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)“通用檢測(cè)探針”是指可識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物存在的任何探針，無(wú)需考慮存在于產(chǎn)物中的靶核苷酸序列的標(biāo)識(shí)為何。本文使用的術(shù)語(yǔ)“通用qPCR探針”是指在qPCR過(guò)程中識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物存在的任何這類探針。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸標(biāo)簽可以包括檢測(cè)探針例如通用qPCR探針可結(jié)合的核苷酸序列。如果標(biāo)簽被加至靶核苷酸序列的兩端，則每個(gè)標(biāo)簽視所需均可包括被檢測(cè)探針識(shí)別的序列。此類序列的結(jié)合物可編碼有關(guān)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的標(biāo)識(shí)、染色體來(lái)源或者樣本來(lái)源的信息。在其他實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增弓I物可以包括檢測(cè)探針例如通用qPCR探針可結(jié)合的核苷酸序列。用這種方式，在本發(fā)明的方法的擴(kuò)增步驟中可將 1個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)探針結(jié)合位點(diǎn)加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，在預(yù)擴(kuò)增(若進(jìn)行)和擴(kuò)增中引入多個(gè)探針結(jié)合位點(diǎn)的可能性有利于多重檢測(cè)，其中可在給定的擴(kuò)增混合物或其等分試樣中檢測(cè)2個(gè)或更多個(gè)不同的擴(kuò)增產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“通用檢測(cè)探針”還意欲涵蓋被可檢測(cè)標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記)以及非序列特異性探針例如DNA結(jié)合染料(包括雙鏈DNA(dsDNA)染料例如STOR綠)標(biāo)記的引物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶特異性qPCR探針”是指可在qPCR過(guò)程中識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物存在的qPCR探針，所述識(shí)別基于所述qPCR探針與存在于所述產(chǎn)物中的靶核苷酸序列的雜交。“水解探針” 一般性地記載于美國(guó)專利No. 5，210，015中，該專利就其對(duì)水解探針的描述以引用的方式全文納入本文。水解探針利用了存在于一般用在PCR反應(yīng)中的熱穩(wěn)定 Taq M^·^ ( TAQMAN probetechnology, Applied Biosystems, Foster City CA)白勺
5’核酸酶活性。所述水解探針被熒光檢測(cè)染料如熒光素和受體染料或猝滅物標(biāo)記。一般而言，所述熒光染料共價(jià)連接至探針的5’端，所述猝滅物連接至探針的3’端，并且當(dāng)探針完整時(shí)，檢測(cè)染料的熒光由熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)猝滅。所述探針在PCR反應(yīng)中與界定所述靶核苷酸一端的引物之一的下游退火。使用Taq酶的聚合酶活性，所述靶核酸的擴(kuò)增由所述探針的上游的一個(gè)引物和在所述探針下游、但與所述靶核酸相對(duì)的鏈退火的第二引物指導(dǎo)。隨著上游引物延伸，所述Taq聚合酶到達(dá)所述帶標(biāo)簽的探針退火的區(qū)域，將所述探針-模板雜合體識(shí)別為底物，并且水解所述探針的磷酸二酯鍵。所述水解反應(yīng)不可逆地解除了猝滅物染料對(duì)報(bào)告染料的猝滅效應(yīng)，因此導(dǎo)致檢測(cè)物熒光隨著每個(gè)后續(xù)PCR循環(huán)而增加。具體而言，適用于本發(fā)明的水解探針能夠檢測(cè)8-mer或9-mer基序，所述8-mer或9-mer基序是人和其他的基因組和/或轉(zhuǎn)錄組中常見(jiàn)的，并且可以具有由使用連接的核酸(LNA) 類似物引起的約70°C的高Tm。本文使用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”是指可用于提供可檢測(cè)和/或可定量信號(hào)的任何原子或分子。具體而言，所述標(biāo)簽可直接或間接地連接至核酸或蛋白質(zhì)?？蛇B接至探針的合適標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)記(mass label)、電子致密顆粒 (electron dense particle)、磁性顆粒、自旋標(biāo)記、發(fā)出化學(xué)發(fā)光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子和酶底物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“染料”在廣義上是指吸收波長(zhǎng)大于或等于340nm的電磁輻射的任何有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“熒光染料”在廣義上是指在電磁輻射源——例如燈、光敏二極管或激光——福照時(shí)可通過(guò)熒光機(jī)制發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的電磁輻射的任何染料。術(shù)語(yǔ)“彈性體”具有本領(lǐng)中使用的廣義含義。因此，例如Allcock等人 (Contemporary Polymer Chemistry, 2nd Ed.)將彈性體在廣義上描述為處于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和液化溫度之間的溫度的聚合物。彈性材料表現(xiàn)出彈性特征，這是因?yàn)榫酆衔镦溔菀装l(fā)生扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，以使主鏈對(duì)力做出反應(yīng)而伸展，同時(shí)主鏈重新卷曲以在沒(méi)有力時(shí)恢復(fù)先前的形狀?？傊瑥椥泽w在施加力時(shí)變形，但是隨后在除去力時(shí)回到其初始形狀?！岸鄳B(tài)性標(biāo)記物”或“多態(tài)性位點(diǎn)”是出現(xiàn)核苷酸序列趨異的基因座。示例性標(biāo)記物有至少2個(gè)等位基因，每個(gè)出現(xiàn)的頻率均大于選擇群體的1%，并且更一般大于選擇群體的10%或20%。多態(tài)性位點(diǎn)可以小至1個(gè)堿基對(duì)。多態(tài)性標(biāo)記物包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、不定數(shù)串列重復(fù)(VNTR)、超變區(qū)、小衛(wèi)星、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)、缺失和插入元件例如Alu。首個(gè)鑒定出的等位基因形式被任意地指定為參考形式，其他等位基因形式被指定為可選的或變異的等位基因。在選擇群體中最經(jīng)常出現(xiàn)的等位基因形式有時(shí)被稱為野生型形式。對(duì)于等位基因形式，二倍體生物可以是純合的或雜合的。二等位基因多態(tài)性有兩種形式。三等位基因多態(tài)性有三種形式?！皢魏塑账岫鄳B(tài)性”(SNP)出現(xiàn)在由單個(gè)核苷酸占據(jù)的多態(tài)性位點(diǎn)，所述多態(tài)性位點(diǎn)是等位基因序列之間的差異位點(diǎn)。所述位點(diǎn)通常在其前面或后面有所述等位基因的高度保守序列(例如在少于1/100或1/1000群體成員中變化的序列)。SNP通常由于在多態(tài)性位點(diǎn)處一個(gè)核苷酸為另一個(gè)核苷酸所代替而產(chǎn)生。轉(zhuǎn)換是一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤代替，或者一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶代替。顛換是一個(gè)嘌呤被一個(gè)嘧啶代替，反之亦然。SNP還可發(fā)生自相對(duì)于參考等位基因缺失核苷酸或插入核苷酸。在多個(gè)樣本中檢測(cè)多個(gè)靶核酸總論在多個(gè)實(shí)施方案中提供了用于檢測(cè)多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸(即T個(gè)靶核酸，其中T是大于1的整數(shù))的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法需要提供在測(cè)定前混合在一起 (即合并)的S個(gè)樣本，其中S是大于1的整數(shù)。對(duì)這些樣本的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)， 所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，其中每個(gè)核苷酸標(biāo)簽編碼關(guān)于具體靶核酸的標(biāo)識(shí)和/或樣本來(lái)源的信息。對(duì)于這些S個(gè)樣本的每一個(gè)(即，待合并的樣本的每一個(gè))，將所述帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列混合形成測(cè)定混合物。以該方式，可成批地測(cè)定樣本，因此若例如48個(gè)樣本待分析，則S可以是例如3，這意味著可以制備16份測(cè)定混合物以檢測(cè)16個(gè)不同的靶。所述第一份測(cè)定混合物可包括例如來(lái)自樣本1-3的帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，第二份測(cè)定混合物可包括例如來(lái)自樣本4-6的帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，以此類推。 參見(jiàn)實(shí)施例1。然后進(jìn)行擴(kuò)增步驟，從而用會(huì)與所述至少一個(gè)核苷酸標(biāo)簽退火的至少一個(gè)引物擴(kuò)增所述帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列。如果需要更高的特異性，一個(gè)或兩個(gè)擴(kuò)增引物可包括與所述與所述核苷酸標(biāo)簽鄰近的靶核苷酸互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，即可使用除了包括標(biāo)簽特異性序列還包括靶特異性序列的雜合擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，所述靶特異性序列在所述引物中標(biāo)簽特異性序列的3’端。基本上，本文描述的方法可用于檢測(cè)與需要數(shù)量的樣本中相同數(shù)量的靶。然而， 測(cè)定形式通常決定了檢測(cè)總數(shù)，所述檢測(cè)可以例如通過(guò)使用多于1種類型的標(biāo)記常規(guī)地而非多重地進(jìn)行。如下文所詳細(xì)討論的，可將測(cè)定混合物等分，用于在例如微量滴定板上或者更一般在矩陣型微流體裝置上分別擴(kuò)增。在具體的實(shí)施方案中，S(混合的樣本的數(shù)目)XT(靶的數(shù)目)限定了測(cè)定混合物等分試樣的數(shù)目，該數(shù)目對(duì)于在具有相應(yīng)數(shù)目的分離反應(yīng)室的矩陣型微流體裝置上的分析可以是例如30、48、96、120或192。在示例性實(shí)施方案中，在單個(gè)測(cè)定中測(cè)定的樣本總數(shù)XT的積至少是選自2304、3600、4608和9216的數(shù)值。如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，通過(guò)多重化，例如通過(guò)使用多個(gè)標(biāo)記在給出等分試樣中進(jìn)行多重檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)額外的通量增加。ffl —鼎浦耐示頻革歹丨在具體的實(shí)施方案中，每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列均包括樣本特異性核苷酸標(biāo)簽和靶核苷酸序列。在這類實(shí)施方案中，使用SXT對(duì)獨(dú)特的擴(kuò)增引物擴(kuò)增所述測(cè)定混合物或其等分試樣，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與靶核苷酸序列退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與樣本特異性核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物。擴(kuò)增因此取決于具有具體靶核苷酸序列和具體樣本特異性標(biāo)簽的帶標(biāo)簽靶核苷酸序列的存在。因此，包括這些核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生指示具體樣本中的具體靶核酸的存在和量(若使用定量檢測(cè))。使用能夠檢測(cè)與具體樣本特異性標(biāo)簽結(jié)合的靶核苷酸序列存在的任何方法，可以檢測(cè)獨(dú)特的引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或量。為了易于檢測(cè)，通過(guò)將測(cè)定混合物分為最多達(dá) SXT個(gè)擴(kuò)增混合物并用獨(dú)特的擴(kuò)增引物對(duì)分別擴(kuò)增每個(gè)擴(kuò)增混合物，可以對(duì)其進(jìn)行分析。 在該情形下，擴(kuò)增產(chǎn)物在具體等分試樣中的存在或量指示與所述樣本特異性核苷酸標(biāo)簽相對(duì)應(yīng)的樣本中所述靶特異性引物相對(duì)應(yīng)的靶核酸的存在或量。所述樣本特異性核苷酸標(biāo)簽的核苷酸序列編碼樣本標(biāo)識(shí)。從給定樣本中產(chǎn)生的全部帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列可用共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽——即具有相同核苷酸序列的標(biāo)簽——加標(biāo)簽。或者，可用不同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽對(duì)測(cè)定混合物中的每個(gè)靶核苷酸序列加標(biāo)簽，即，使得在所述測(cè)定混合物中的每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列攜帶具有不同核苷酸序列的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。因此，如果在一個(gè)測(cè)定混合物中有三個(gè)將被合并用于分析16個(gè)靶的樣本，那么可使用標(biāo)簽1-16識(shí)別來(lái)自樣本1的靶核酸序列，可使用標(biāo)簽 17-32來(lái)識(shí)別來(lái)自樣本2的靶核酸序列，可使用標(biāo)簽32-48來(lái)識(shí)別來(lái)自樣本3的靶核酸序列。如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，可使用標(biāo)簽系列，使得來(lái)自給定樣本的一些但不是全部靶核苷酸序列共用共同的標(biāo)簽。因此，例如可使用標(biāo)簽1來(lái)識(shí)別來(lái)自樣本1的靶核酸序列1-4， 可使用標(biāo)簽2來(lái)識(shí)別來(lái)自樣本1的靶核酸序列5-8，可使用標(biāo)簽3來(lái)識(shí)別來(lái)自樣本1的靶核酸序列9-12，可以使用標(biāo)簽4來(lái)識(shí)別來(lái)自樣本1的靶核酸序列13-16。在這種情況下，標(biāo)簽1-4可識(shí)別樣本1的靶核酸序列，類似的標(biāo)簽系列(例如標(biāo)簽5-8和標(biāo)簽9-12)可識(shí)別樣本2和3的靶核酸序列。在該方法的示例性實(shí)施方案中，所述編碼反應(yīng)需要使用針對(duì)每個(gè)樣本的不同正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物系列分別預(yù)擴(kuò)增所述S個(gè)樣本的每一個(gè)來(lái)產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增的樣本，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物系列包括T對(duì)正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每對(duì)預(yù)擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增具體的靶核酸。此外，在給定系列中的所有正向預(yù)擴(kuò)增引物或所有反向預(yù)擴(kuò)增引物均包括樣本特異性核酸標(biāo)簽，所述標(biāo)簽可以是、但不必是共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。所述樣本特異性核苷酸標(biāo)簽通常在所述引物中所述靶特異性核苷酸序列的5’端。將所述S個(gè)樣本的每一個(gè)的預(yù)擴(kuò)增樣本混合形成測(cè)定混合物(例如，待一起分析的每個(gè)樣本系列一個(gè)測(cè)定混合物)。然后，可以如上文所述分析所述測(cè)定混合物。系列中的每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物除包括靶特異性核苷酸序列外還可以包括樣本特異性核苷酸標(biāo)簽，所述系列中每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物可包括靶特異性核苷酸序列?；蛘?，系列中的每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物可包括靶特異性核苷酸序列，每個(gè)系列中的每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物除包括靶特異性核苷酸序列外還可包括樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。用2個(gè)核苷酸標(biāo)簽對(duì)靶核苷酸序列加標(biāo)簽在具體的實(shí)施方案中，每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括與靶核苷酸序列連接的第一核苷酸標(biāo)簽，所述靶核苷酸序列與第二核苷酸標(biāo)簽連接。在這類實(shí)施方案中，用SXT對(duì)獨(dú)特的擴(kuò)增引物對(duì)所述測(cè)定混合物或其等分試樣進(jìn)行擴(kuò)增，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與第一核苷酸標(biāo)簽退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與第二核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物。擴(kuò)增因此取決于具有合適標(biāo)簽組合的帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的存在。所述核苷酸標(biāo)簽的核苷酸序列可以用上文對(duì)于使用單樣本特異性標(biāo)簽的實(shí)施方案所描述的多種方式編碼樣本標(biāo)識(shí)。換句話說(shuō)，可以用共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽對(duì)從給定樣本中產(chǎn)生的所有帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列加標(biāo)簽?；蛘撸梢杂貌煌臉颖咎禺愋院塑账針?biāo)簽對(duì)測(cè)定混合物中的每個(gè)靶核苷酸序列加標(biāo)簽，或者可以使用標(biāo)簽系列，使得來(lái)自給定樣本的一部分但非全部靶核苷酸序列共用共同的標(biāo)簽。由于使用了兩個(gè)標(biāo)簽，可組合使用任意這些策略。例如，一個(gè)標(biāo)簽可以是給定樣本產(chǎn)生的所有帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列共同的樣本特異性標(biāo)簽，而另一個(gè)標(biāo)簽對(duì)于測(cè)定混合物中的每個(gè)帶標(biāo)簽的核苷酸序列可以是不同的。在一些高特異性的實(shí)施方案中，測(cè)定混合物中的每個(gè)標(biāo)簽與所述混合物中的每個(gè)其他標(biāo)簽均是不同的(核苷酸序列不同)。在該加雙重標(biāo)簽方法的示例性實(shí)施方案中，所述編碼反應(yīng)需要使用針對(duì)每個(gè)樣本的不同正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物序列分別預(yù)擴(kuò)增所述S個(gè)樣本的每一個(gè)來(lái)產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增的樣本，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物系列包括T對(duì)正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物(S卩，每個(gè)靶一對(duì))，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物對(duì)能夠擴(kuò)增具體的靶核酸。此外，每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物包括正向核苷酸標(biāo)簽，并且每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物包括反向核苷酸標(biāo)簽。這些標(biāo)簽通常在引物中靶特異性核苷酸序列的5’端。
將所述S個(gè)樣本的每一個(gè)的預(yù)擴(kuò)增樣本混合形成測(cè)定混合物(例如，待一起分析的每個(gè)樣本系列一個(gè)測(cè)定混合物)。然后，通過(guò)如上文總體所述的擴(kuò)增分析所述測(cè)定混合物。每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與正向核苷酸標(biāo)簽退火的正向擴(kuò)增引物；和會(huì)與反向核苷酸標(biāo)簽退火的反向擴(kuò)增引物。通過(guò)組合加標(biāo)簽檢測(cè)多個(gè)靶核酸本發(fā)明還提供了可用于檢測(cè)樣本中的多個(gè)靶核酸的雙重加標(biāo)簽方法。該方法需要向樣本提供T個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物，其中T是待檢測(cè)靶的數(shù)目。每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物均包括不同的靶特異性核苷酸序列和系列特異性核苷酸標(biāo)簽。所述系列特異性核苷酸標(biāo)簽通常在所述靶特異性核苷酸標(biāo)簽的5’端。使用X個(gè)不同的正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，X是大于 1小于T的整數(shù)。因此，T/X個(gè)引物包括相同的正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽。還向所述樣本提供了 T個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物。每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物均包括不同的靶特異性核苷酸序列和反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽。所述系列特異性核苷酸標(biāo)簽通常在所述靶特異性核苷酸標(biāo)簽的5’端。使用Y個(gè)不同的反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，Y是大于1小于T的整數(shù)。因此，T/X個(gè)引物包括相同的反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽。對(duì)所述樣本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，以生產(chǎn)測(cè)定混合物，其中針對(duì)具體靶產(chǎn)生的任何預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物引入了獨(dú)特的正向和反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽的組合。然后進(jìn)行擴(kuò)增步驟，由此通過(guò)擴(kuò)增引物——即可與存在于具體帶標(biāo)簽的核苷酸序列中的核苷酸標(biāo)簽退火的擴(kuò)增引物——的合適組合擴(kuò)增所述帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列。因此，當(dāng)制備了 X+Y個(gè)引物時(shí)，可在單個(gè)測(cè)定中分析XXY個(gè)靶。例如，如果X和Y 均是100，則僅需要合成200個(gè)引物來(lái)檢測(cè)10，000個(gè)靶核酸。在該方法的示例性實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增通過(guò)如下方式進(jìn)行將所述測(cè)定混合物分為T(mén)個(gè)擴(kuò)增混合物，并使用獨(dú)特的擴(kuò)增引物對(duì)分別擴(kuò)增所述擴(kuò)增混合物的每一個(gè)。每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與所述正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽退火的正向擴(kuò)增引物；和會(huì)與所述反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽退火的反向擴(kuò)增引物。對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物在所述擴(kuò)增混合物或其等分試樣中的存在或量。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在樣本中的存在?；旧希景l(fā)明的方法可用于檢測(cè)與需要數(shù)量的樣本中相同數(shù)量的靶。然而，測(cè)定形式通常決定了檢測(cè)總數(shù)，所述檢測(cè)可以例如通過(guò)使用多于1種類型的標(biāo)記常規(guī)地而非多重地進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，可將測(cè)定混合物等分，用于在例如微量滴定板上或者更一般在矩陣型微流體裝置上分別擴(kuò)增。目前的微流體裝置設(shè)計(jì)為使其成為這樣的測(cè)定，即在所述測(cè)定中X或Y至少是選自12、24、48和96的數(shù)值，其中T (檢測(cè)的靶的數(shù)目)至少是選自384、576、768、1152、2304、3600、4608和9216的數(shù)值。如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，通過(guò)多重化，例如通過(guò)使用多個(gè)標(biāo)記在給出等分試樣中進(jìn)行多重檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)額外的通量增加。本發(fā)明還考慮上述加標(biāo)簽方法的組合。檢測(cè)多個(gè)靶核酸——模塊化方法本發(fā)明還提供用于檢測(cè)樣本中的多個(gè)靶核酸的方法，其中所述待檢測(cè)的靶核酸被分為多個(gè)系列或“模塊”，每個(gè)模塊的靶核酸用相同系列的核苷酸標(biāo)簽對(duì)加標(biāo)簽。在每個(gè)模塊內(nèi)，標(biāo)簽對(duì)系列彼此不同，但對(duì)于每個(gè)模塊使用相同的標(biāo)簽對(duì)系列。然后，可通過(guò)用與所述標(biāo)簽對(duì)系列退火的引物對(duì)系列擴(kuò)增每個(gè)模塊進(jìn)行檢測(cè)。更具體而言，在一些實(shí)施方案中，所述方法需要將樣本分為R個(gè)等分試樣，其中R 是大于1的整數(shù)(例如96)?？蓪?duì)所述R個(gè)等分試樣的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，其中T是每等分試樣中待檢測(cè)的靶核酸的數(shù)目，T是大于1的整數(shù)(例如96)。每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括在靶核苷酸序列5’ 端的第一核苷酸標(biāo)簽、靶核苷酸序列和在所述靶核苷酸序列3’端的第二核苷酸標(biāo)簽。所述 T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的每一個(gè)中的核苷酸標(biāo)簽的組合對(duì)于每個(gè)等分試樣中的每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列是獨(dú)特的。然而，相同系列的第一和第二核苷酸標(biāo)簽組合被用于所述等分試樣的每一個(gè)的編碼反應(yīng)中。因此，在一些實(shí)施方案中，所述T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的每一個(gè)中的核苷酸標(biāo)簽組合存在于其他等分試樣的每一個(gè)中的帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列中，但每個(gè)標(biāo)簽組合可連接于不同的靶核苷酸序列。因此，在具體的實(shí)施方案中，所述編碼反應(yīng)可產(chǎn)生最多達(dá)RXT (例如96X96 = 9216)個(gè)不同的帶標(biāo)簽的核苷酸序列，因此允許進(jìn)行RXT(如9216)個(gè)測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)以下方式對(duì)所述帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列進(jìn)行檢測(cè)對(duì)每個(gè)等分試樣使用針對(duì)每個(gè)等分試樣的相同系列的T對(duì)不同擴(kuò)增引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，每對(duì)引物均包括會(huì)與每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列中的所述第一核苷酸標(biāo)簽退火的第一引物和會(huì)與其中的所述第二核苷酸標(biāo)簽退火的第二引物。每個(gè)等分試樣中與每對(duì)獨(dú)特的引物相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在所述樣本中的存在。在一些實(shí)施方案中，在擴(kuò)增前，可將每個(gè)等分試樣分為T(mén)個(gè)亞等分試樣。然后，將一系列T對(duì)不同的擴(kuò)增引物中的一個(gè)可與每個(gè)亞等分試樣結(jié)合，并且可對(duì)所述亞等分試樣分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在示例性實(shí)施方案中，所述編碼反應(yīng)可以是預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，所述預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)可在微流體裝置上進(jìn)行。為了在編碼前增加靶核酸濃度，可在編碼預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)前進(jìn)行可選的前預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。所述前預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)可以多重化進(jìn)行。例如，在一個(gè)混合物中可以使用針對(duì)9216 個(gè)不同的靶核酸的靶特異性引物。然后，可將該混合物分為R = 96個(gè)等分試樣，并且使用 T = 96對(duì)不同的引物將每個(gè)等分試樣在微流體裝置上進(jìn)行編碼預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，所述引物對(duì)可將96對(duì)不同的核苷酸標(biāo)簽加至所述96個(gè)等分試樣的每一個(gè)的靶核苷酸序列。為了增加特異性，用于預(yù)擴(kuò)增的引物相對(duì)于用于前預(yù)擴(kuò)增的引物可以是嵌套的。在編碼預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)后，可在微流體裝置的分開(kāi)的室中進(jìn)行擴(kuò)增。例如，可將編碼預(yù)擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的96個(gè)等分試樣的每一個(gè)加樣至矩陣型微流體裝置的各個(gè)樣本管線中，并且可將96個(gè)不同的標(biāo)簽特異性引物組合的每一個(gè)加樣至各個(gè)測(cè)定柱中。所述96個(gè)引物組合的每個(gè)不同組合均可擴(kuò)增所述96個(gè)等分試樣的每一個(gè)中的不同靶核苷酸。然后，可以將得到的9216個(gè)反應(yīng)室(亞等分試樣)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，這可通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行，所述方法包括STOR綠、通用探針庫(kù)、每個(gè)標(biāo)簽組合使用一個(gè)探針(例如，其中探針序列被引入至核苷酸標(biāo)簽中)以及使用熒光引物來(lái)添加核苷酸標(biāo)簽。在具體的實(shí)施方案中，該模塊化方法是高度靈活的，并且可以很容易地由另外的靶(例如，另外96個(gè)靶)擴(kuò)展。因此它適用于測(cè)定板。樣本核酸
核酸(“樣本”)制品可獲自生物來(lái)源，并且用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備。具體而言，本文所述的方法中可用的DNA或RNA可從任何來(lái)源提取和/或擴(kuò)增，所述來(lái)源包括細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、病毒、細(xì)胞器以及高等生物，所述高等生物如植物或動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物，更尤其是人。合適的核酸還可獲自環(huán)境來(lái)源(例如池塘水)、人造產(chǎn)物(例如食物)、 法醫(yī)樣本等。核酸可通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的任一種從細(xì)胞、體液(例如血液、血液級(jí)分、尿液等)或組織樣本中提取或擴(kuò)增。示例性的樣本包括血漿、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、腦膜液、口腔液和皮膚外部切片的樣本；來(lái)自呼吸系統(tǒng)、腸道、生殖道和尿道的樣本；淚水、唾液、血細(xì)胞、干細(xì)胞或腫瘤的樣本。例如，胎兒DNA樣本可從胚胎(例如從一個(gè)或多個(gè)胚胎細(xì)胞或胎兒細(xì)胞)或從母親血液中得到。樣本可以從活的或死亡的生物體或者從體外培養(yǎng)物中得到。示例性的樣本可包括單細(xì)胞、石蠟包埋的組織樣本和針吸活檢物?？捎糜诒景l(fā)明的核酸還可以來(lái)自于一個(gè)或多個(gè)核酸庫(kù)，包括cDNA、黏粒、YAC、BAC、Pl、PAC庫(kù)等?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法分離需要的核酸，具體方法的選擇根據(jù)核酸的來(lái)源、 性質(zhì)以及類似因素。所述樣本核酸可不需要是純化形式，但是一般應(yīng)足夠純以使本發(fā)明方法的擴(kuò)增步驟能夠進(jìn)行。當(dāng)靶核酸是RNA時(shí)，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法和如例如 Sambrook, J. , Fritsch, E.F. , and Maniatis, Τ. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2,3(1989)所述將所述 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后，可通過(guò)本發(fā)明的方法分析所述cDNA。靶核酸可在本發(fā)明(本文所述)的編碼反應(yīng)中加標(biāo)簽的任何靶核酸均可使用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)。在一般的實(shí)施方案中，對(duì)于靶核酸至少知道一些核苷酸序列信息。例如，如果使用的編碼反應(yīng)是PCR，那么對(duì)于給定靶核酸的每個(gè)末端通常應(yīng)獲得足夠的序列信息，以使得能夠設(shè)計(jì)合適的擴(kuò)增引物。所述靶可包括例如與病原體相關(guān)的核酸，所述病原體如病毒、細(xì)菌或真菌；RNA，例如過(guò)表達(dá)或表達(dá)不足指示疾病的RNA、以組織特異性或發(fā)育特異性方式表達(dá)的RNA或由具體刺激物誘導(dǎo)的RNA ；基因組DNA，可在例如基因分型中對(duì)其分析具體的多態(tài)性(如SNP)、 等位基因或單倍型的基因組DNA。特別關(guān)注的是在遺傳疾病或其他病理學(xué)中改變(例如擴(kuò)增、缺失和/或突變)的基因組DNA ；與希望或不希望性狀相關(guān)的序列；以及/或者可唯一地識(shí)別個(gè)體的序列(例如在法醫(yī)或親子關(guān)系測(cè)定中)。引物設(shè)計(jì)適用于核酸擴(kuò)增的弓I物應(yīng)足夠長(zhǎng)以在聚合試劑存在下弓I發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。所述引物的確切長(zhǎng)度和組成將取決于很多因素，包括例如退火反應(yīng)的溫度、引物的來(lái)源和組成以及在何處使用探針、探針退火位點(diǎn)與引物退火位點(diǎn)的鄰近情況和引物探針濃度的比例。 例如，依賴于所述靶核酸序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物一般包含約15至約30個(gè)核苷酸，但它可包含更多或更少的核苷酸。所述引物應(yīng)是足夠互補(bǔ)的，以選擇性地與其各自的鏈退火并形成穩(wěn)定的雙鏈體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適的引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增需要的靶核酸。例如，通過(guò)使用任意市售的軟件或開(kāi)源軟件，如I^rimerf (參見(jiàn)，例如Rozen and Skaletsky (2000)Meth. Mol. Biol.，132 :365-386 ；www.broad.mit. edu/node/1060,等)或者通過(guò)登錄Roche UPL網(wǎng)站，可以設(shè)計(jì)PCR引物。將所述擴(kuò)增子序列輸入I^rimerf程序，同時(shí)將UPL探針序列加括號(hào)以確保ft~imer3程序會(huì)在括號(hào)內(nèi)的探針序列任一邊設(shè)計(jì)引物。
引物可通過(guò)任何合適的方法制備，所述方法包括例如對(duì)合適序列克隆和限制性酶切或是通過(guò)例如如下的直接化學(xué)合成Narang et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 :90_99的磷酸三酯法、Brown et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 :109-151 的磷酸二酯法、Beaucage et al. (1981)Tetra. Lett. ,22 :1859-1862 的二乙基亞磷酰胺法和美國(guó)專利 No. 4，458，066 的
固體支持法等；或者可由市售來(lái)源提供?？赏ㄟ^(guò)使用 Sephadex 柱(Amersham Biosciences, Inc. , Piscataway, NJ)或本令頁(yè)域技術(shù)人員已知的其他方法純化引物。引物純化可提高本發(fā)明方法的敏感性。微流體裝置在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的任一方法可使用微流體裝置進(jìn)行。在示例性實(shí)施方案中，矩陣型微流體裝置使得能將多個(gè)底物溶液和試劑溶液在分開(kāi)的分離反應(yīng)室中同時(shí)結(jié)合。應(yīng)了解，底物溶液可包括一個(gè)或多個(gè)底物，并且試劑溶液可包括一個(gè)或多個(gè)試劑。例如，所述微流體裝置可使得多個(gè)不同的擴(kuò)增引物和樣本同時(shí)成對(duì)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中， 所述裝置被配置為在所述不同室的每一個(gè)中包括不同組合的引物和樣本。在多個(gè)實(shí)施方案中，分開(kāi)的反應(yīng)室的數(shù)目可以超過(guò)50個(gè)，通常超過(guò)100個(gè)，更經(jīng)常超過(guò)500個(gè)，甚至更經(jīng)常超過(guò)1000個(gè)，有時(shí)超過(guò)5000個(gè)，或超過(guò)10000個(gè)。在具體的實(shí)施方案中，所述矩陣型微流體裝置是動(dòng)態(tài)陣列(“DA”)微流體裝置。 DA微流體裝置是這樣的矩陣型微流體裝置，即該裝置被設(shè)計(jì)來(lái)分離成對(duì)組合的樣本和試劑 (例如擴(kuò)增引物、檢測(cè)探針等)并且適用于進(jìn)行定性和定量PCR反應(yīng)，包括實(shí)時(shí)定量PCR分析。在一些實(shí)施方案中，所述DA微流體裝置至少部分由彈性體制造。DA記載于PCT公開(kāi)文本W(wǎng)005107938A2 (Thermal Reaction Device and Method For Using The Same)禾口美國(guó)專利公開(kāi)文本US20050252773A1中，兩篇文獻(xiàn)就其對(duì)DA的描述以引用的方式全文納入本文。 DA可整合高密度矩陣設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)利用所述微流體裝置的層間流體連通過(guò)孔(via)來(lái)使控制管線和流體管線穿行通過(guò)所述裝置和在層間穿行。由于彈性體塊多層中的流體管線， 因此能夠進(jìn)行高密度反應(yīng)池排布?；蛘撸珼A可被設(shè)計(jì)，使得所有的試劑和樣本通道在相同彈性體層中，而對(duì)照通道在不同的層中。美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 2008/0223721和PCT公開(kāi)文本No. W005/107938 A2描述了可用于實(shí)施本文描述的方法的示例性矩陣型裝置。PCT公開(kāi)文本No. W005/107938 A2中的圖21被翻印為圖1，示出了示例性矩陣設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)具有第一彈性體層2110 (第一層)和第二彈性體層2120 (第二層)，每層均具有在其中形成的流體通道。例如，第一層2110中的試劑流體通道與第二層2120中的試劑流體通道通過(guò)過(guò)孔2130連接，而第二層2120還在其中有樣本通道，所述樣本通道和所述試劑通道分別終止于樣本和試劑室2180。所述樣本和試劑室2180通過(guò)接口通道2150彼此流體連通，所述接口通道2150具有與其相連的接口閥 2140來(lái)控制每個(gè)反應(yīng)池2160的室2180之間的流體連通。在使用中，所述接口首先關(guān)閉， 然后將試劑從所述試劑入口弓I入所述試劑通道，并且將樣本通過(guò)所述樣本入口弓I入樣本通道；然后關(guān)閉控制閥2170將每個(gè)反應(yīng)池2160與其他反應(yīng)池2160隔離。一旦反應(yīng)池2160 被隔離，就打開(kāi)接口閥2140以使樣本室和試劑室可相互流體連通，使得所需的反應(yīng)可以發(fā)生。由此(以及WO 05/107938 A2中的描述)可見(jiàn)，DA可用于使M數(shù)目的不同樣本和N數(shù)目的不同試劑反應(yīng)。盡管上文描述的WO 05/107938中的DA非常適于進(jìn)行本文描述的方法，但是本發(fā)明并不限于任何具體的裝置或設(shè)計(jì)。可以使用任何隔開(kāi)樣本并且/或者可使試劑和樣本獨(dú)立地成對(duì)組合的裝置。美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 20080108063(其以引用的方式全文納入本文)包括顯示48. 48動(dòng)態(tài)陣列的圖，該48. 48動(dòng)態(tài)陣列是可獲自Fluidigm Corp (South San Francisco Calif.)的市售裝置。應(yīng)理解，其他構(gòu)造是可能的且被考慮，例如48X96、96X96 和 30X120 等。在具體的實(shí)施方案中，所述微流體裝置可以是數(shù)字化陣列微流體裝置，該裝置被改造以進(jìn)行數(shù)字化擴(kuò)增。這類裝置可具有將樣本和試劑的混合物分隔至納升體積的反應(yīng)室的連成一體的通道和閥門(mén)。在一些實(shí)施方案中，所述數(shù)字化陣列微流體裝置至少部分地由彈性體制成。示例性數(shù)字化陣列微流體裝置記載于Fluidigm，Inc擁有的共同未決美國(guó)申請(qǐng)中。一個(gè)示例性實(shí)施方案具有與通往所述裝置的12個(gè)分離的樣本輸入對(duì)應(yīng)的12個(gè)輸入端口。所述裝置可以有12個(gè)板，并且所述12個(gè)板中的每一個(gè)板可以包含765個(gè)6nL反應(yīng)室，每板總體積為4. 59 μ L0微流體通道可將所述板上的多個(gè)反應(yīng)室與流體源連接起來(lái)。可以向存儲(chǔ)器(accumulator)施加壓力，以開(kāi)放和關(guān)閉連接反應(yīng)室與流體源的閥。在示例性實(shí)施方案中，可提供12個(gè)入口，用于所述樣本試劑混合物的上樣?？墒褂?8個(gè)入口來(lái)提供試劑源，在向存儲(chǔ)器施加壓力時(shí)所述試劑被提供給所述微流體裝置。此外，可提供2個(gè)或更多入口來(lái)向所述微流體裝置提供水合作用。水合入口與所述裝置流體連通，以有利于控制與反應(yīng)室相關(guān)的濕度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可用于制造所述裝置的一些彈性體材料是透氣的，使得從反應(yīng)室中蒸發(fā)的氣體或蒸氣可穿過(guò)彈性體材料進(jìn)入周圍大氣中。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，位于所述裝置周邊部分的流體管線在圍繞反應(yīng)室板的微流體裝置周邊部分處提供了水合液體例如緩沖液或預(yù)混合物的保護(hù)物，從而減少或防止存在于所述反應(yīng)室中的液體蒸發(fā)。因此，可通過(guò)向水合入口加入揮發(fā)性液體例如水來(lái)增加所述裝置周邊的濕度。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一入口與圍繞所述裝置第一側(cè)的板的水合流體管線流體連通，并且第二入口與圍繞所述裝置另一側(cè)的板的所述水合流體管線流體連通。盡管所述數(shù)字化陣列微流體裝置十分適用于進(jìn)行本文所述的數(shù)字化擴(kuò)增方法，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解這些裝置的許多變體和替代物。可從Fluidigm Corp. (South San Francisco, CA)購(gòu)買的12. 765數(shù)字化陣列的微流體裝置包括12個(gè)板，每個(gè)板有765個(gè)反應(yīng)室，每個(gè)反應(yīng)室體積為6nL。然而，該幾何形狀對(duì)于數(shù)字化擴(kuò)增方法不是所要求的。給定的數(shù)字化陣列微流體裝置的幾何形狀將取決于具體的應(yīng)用。與適用于本文描述的方法有關(guān)的裝置的其他描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No. 2005/0252773中提供，所述專利申請(qǐng)就其數(shù)字化陣列微流體裝置的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式納入本文。在一些實(shí)施方案中，本文描述的方法可使用提供反應(yīng)產(chǎn)物回收的微流體裝置進(jìn)行。這樣的裝置詳細(xì)記載于2009年4月2日提交的共同未決美國(guó)申請(qǐng)No. 61/166，105中， 所述申請(qǐng)以引用的方式全文納入本文，特別是就其對(duì)可使反應(yīng)產(chǎn)物回收的微流體裝置和相關(guān)方法的描述。例如，可在這樣的裝置上在測(cè)序前進(jìn)行校準(zhǔn)DNA樣本的數(shù)字化PCR方法，使得可以回收擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物然后可作為DNA測(cè)序的模板。使用彈性體材料的制造方法以及用于設(shè)計(jì)裝置及其組件的方法已詳細(xì)記載于科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中。參見(jiàn)，例如Unger et al. ,2000, Science 288 :113-16 ；美國(guó)專利No. US 6，960，437 (利用微流體裝置擴(kuò)增核酸)、6，899，137 (微制造的彈性體閥和泵系統(tǒng))、6，767，706 ( 一體化的活性焊劑(active flux)微流體裝置和方法)、6，752，922 (微流體層析)、6，408，878 (微制造的彈性體閥和泵系統(tǒng))、6，645，432 (包含三維排列的通道網(wǎng)的微流體系統(tǒng))；美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No. 2004/0115838,20050072946,20050000900, 20020127736、20020109114、20040115838、20030138829、20020164816、20020127736 和 20020109114 ；PCT 公開(kāi)文本 No. WO 2005/084191、W005030822A2 和 W001/01025 ；Quake & Scherer,2000, “ From micro to nanofabrication with soft materials" Science 290 :1536-40 ；Unger et al.,2000, " Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography " Science 288 :113-116 ；Thorsen et al.， 2002," Microfluidic large-scale integration" Science 298 :580-584 ；Chou et al., 2000," Microfabricated Rotary Pump" Biomedical Microdevices 3:323-330 ；Liu et al.,2003," Solving the" world-to-chip" interface problem with a microfluidic matrix" Analytical Chemistry 75,4718-23, Hong et al,2004, " A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture" Nature Biotechnology 22 435-39。美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 20080223721和PCT公開(kāi)文本No. W005107938A2描述了可用于實(shí)施本發(fā)明的示例性矩陣型裝置。W005107938A2的圖21被翻印為圖1。圖1描述了示例性矩陣設(shè)計(jì)，所述設(shè)計(jì)具有第一彈性體層2110(第一層)和第二彈性體層2120(第二層)，每層均具有在其中形成的流體通道。例如，第一層2110中的試劑流體通道與第二層 2120中的試劑流體通道通過(guò)過(guò)孔2130連接，而第二層2120還在其中有樣本通道，所述樣本通道和所述試劑通道分別終止于樣本和試劑室2180。所述樣本和試劑室2180通過(guò)接口通道2150彼此流體連通，所述接口通道2150具有與其相連的接口閥2140來(lái)控制每個(gè)反應(yīng)池2160的室2180之間的流體連通。在使用中，所述接口首先關(guān)閉，然后將試劑從所述試劑入口引入所述試劑通道，并且將樣本通過(guò)所述樣本入口弓丨入樣本通道；然后關(guān)閉控制閥 2170將每個(gè)反應(yīng)池2160與其他反應(yīng)池2160隔離。一旦反應(yīng)池2160被隔離，就打開(kāi)接口閥2140以使樣本室和試劑室可相互流體連通，使得所需的反應(yīng)可以發(fā)生。由此(以及WO 05/107938 A2中的描述)可見(jiàn)，DA可用于使M數(shù)目的不同樣本和N數(shù)目的不同試劑反應(yīng)。盡管上文描述的WO 05/107938中的DA非常適于進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)定，但是本發(fā)明并不限于任何具體的裝置或設(shè)計(jì)。可以使用任何隔開(kāi)樣本并且可使試劑和樣本獨(dú)立地成對(duì)組合的裝置。美國(guó)專利公開(kāi)文本No. 20080108063(其以引用的方式全文納入本文)包括顯示48. 48動(dòng)態(tài)陣列的圖，該48. 48動(dòng)態(tài)陣列是可獲自Fluidigm Corp (South San Francisco Calif.)的市售裝置。應(yīng)理解，其他構(gòu)造是可能的且被考慮，例如48X96、96X96和 30X120 等。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，從一個(gè)或多個(gè)樣本檢測(cè)并且/或者定量一個(gè)或多個(gè)靶核酸通常可在微流體裝置上通過(guò)以下方式進(jìn)行獲取樣本；可選預(yù)擴(kuò)增所述樣本；并將所述預(yù)擴(kuò)增的樣本的等分試樣分到微流體裝置的反應(yīng)室中，其中包含合適的緩沖物、引物、 可選的探針和酶；擴(kuò)增這些混合物；并且檢查所述等分試樣中是否存在擴(kuò)增的靶核酸。所述樣本等分試樣的體積可為約1皮升至約500納升，約100皮升至約20納升，約1納升至約20納升，或者為約5納升至約15納升。在一些實(shí)施方案中，在單獨(dú)的擴(kuò)增混合物中——例如在矩陣型微流體裝置的單獨(dú)的反應(yīng)室中——進(jìn)行多重檢測(cè)，所述多重檢測(cè)可被用于進(jìn)一步增加可在單個(gè)測(cè)定中分析的樣本和/或靶的數(shù)目，或者用于進(jìn)行比較方法例如多位點(diǎn)的比較基因組雜交(CGH)樣分析。在具體的實(shí)施方案中，所述測(cè)定通常具有至少3個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍，更經(jīng)常是至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)或至少8個(gè)數(shù)量級(jí)。定量實(shí)時(shí)PCR以及其他檢測(cè)和定量方法任何檢測(cè)和/或定量核酸的方法均可在本發(fā)明中來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))被用于擴(kuò)增和/或定量靶核酸。在該實(shí)施方案的變化方案中， 可使用數(shù)字化PCR。在另一些實(shí)施方案中，可使用其他擴(kuò)增系統(tǒng)或檢測(cè)系統(tǒng)，包括例如記載于美國(guó)專利No. 7，118，910 (就其對(duì)擴(kuò)增/檢測(cè)系統(tǒng)的描述以引用的方式全文納入本文)的系統(tǒng)和侵入測(cè)定(Invader assay) ；PE BioSystems0在具體的實(shí)施方案中，使用了實(shí)時(shí)定量方法。例如，可使用“定量實(shí)時(shí)PCR”方法來(lái)通過(guò)測(cè)量在擴(kuò)增過(guò)程本身期間形成的擴(kuò)增產(chǎn)物的量來(lái)確定存在于樣本中的靶核酸的量。熒光核酸酶測(cè)定是可成功地用于本文描述的方法的實(shí)時(shí)定量方法的一個(gè)具體實(shí)例。這種監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物形成的方法包括使用雙重標(biāo)記的熒光寡核苷酸探針連續(xù)測(cè)量PCR產(chǎn)物積聚一在文獻(xiàn)中經(jīng)常被稱作“TaqMan 法”。參見(jiàn)美國(guó)專利No. 5，723，591 ;Heid et al.，1996，Real-time quantitative PCR Genome Res. 6 :986_94，每篇文獻(xiàn)均就其對(duì)熒光核酸酶測(cè)定的描述通過(guò)引用的方式全文納入本文。應(yīng)理解，雖然“TaqMan 探針”廣泛用于 qPCR，但本發(fā)明并不限于使用這些探針；任何合適的探針均可使用?？捎糜诒景l(fā)明的其他檢測(cè)/定量方法包括FRET和模板延伸反應(yīng)、分子信標(biāo)檢測(cè)、 蝎檢測(cè)(Scorpion detection)、侵入檢測(cè)(Invader detection)和扣鎖探針檢測(cè)(padlock probe detection)。FRET和模板延伸反應(yīng)利用了供體/受體對(duì)的一個(gè)成員標(biāo)記的引物和所述受體/ 供體對(duì)的另一個(gè)成員標(biāo)記的核苷酸。在模板依賴的延伸反應(yīng)期間在所述標(biāo)記的核苷酸被參入所述引物之前，所述供體和受體之間相距足夠遠(yuǎn)以使能量傳遞不能發(fā)生。然而，如果所述標(biāo)記的核苷酸被參入所述引物中且所述距離足夠近，那么能量轉(zhuǎn)移發(fā)生并且可被檢測(cè)。 這些方法尤其可在單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中用于進(jìn)行單堿基對(duì)延伸反應(yīng)，記載于美國(guó)專利 No. 5，945，283 和 PCT 公開(kāi)文本 WO 97/22719 中。利用分子信標(biāo)，所述探針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物的互補(bǔ)區(qū)雜交時(shí)的構(gòu)象變化導(dǎo)致可檢測(cè)信號(hào)的形成。所述探針本身包括兩個(gè)部分一個(gè)部分在5’末端，另一個(gè)部分在3’末端。這些部分位于與所述探針結(jié)合位點(diǎn)退火的探針部分的側(cè)翼，并且是彼此互補(bǔ)的。一個(gè)末端部分一般連接于報(bào)告染料，另一個(gè)末端部分通常連接于猝滅染料。在溶液中，所述兩個(gè)末端部分可相互雜交以形成發(fā)夾環(huán)。在這種構(gòu)象中，所述報(bào)告物和猝滅染料相距足夠近以至來(lái)自報(bào)告染料的熒光被猝滅染料有效地猝滅。相反，雜交探針產(chǎn)生了線性化的構(gòu)象，在該構(gòu)象中猝滅的程度降低。因此，通過(guò)對(duì)所述兩個(gè)染料監(jiān)測(cè)發(fā)光射光變化，有可能間接地監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。該類型的探針和它們的使用方法進(jìn)一步記載于例如Piatek et al. , 1998,Nat. Biotechnol. 16 :359-63 ；Tyagi, and Kramer,1996, Nat. Biotechnology 14:303-308 ；禾口 Tyagi,et al.，1998，Nat.Biotechnol. 16 :49-53(1998)。蝎型檢測(cè)方法記載于例如Thelwell et al. 2000，Nucleic Acids Research, 28 3752-3761 禾口 Solinas et al. ,2001, "Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications”Nucleic Acids Research 29 :20o 蝎引物是熒光 PCR 引物，所述引物帶有經(jīng)PCR終止物連接在5’-末端的探針元件。它們用于均質(zhì)溶液中的PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)擴(kuò)增子特異性檢測(cè)。兩種不同的形式是可能的“莖-環(huán)”形式和“雙螺旋”形式。在兩種情況下，探測(cè)機(jī)制都是分子內(nèi)的。所有樣式中的蝎型的基本元件是(i)PCR引物；(ii)防止PCR 通讀所述探針元件的PCR終止物；(iii)特異性探針序列；以及(iv)包含至少一個(gè)熒光團(tuán)和猝滅物的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。在所述蝎型引物的PCR延伸后，得到的擴(kuò)增子包含與所述探針互補(bǔ)的序列，所述序列在每個(gè)PCR循環(huán)的變性階段成為單鏈。冷卻時(shí)，所述探針自由結(jié)合至該互補(bǔ)序列，使熒光增強(qiáng)，這是因?yàn)殁缥锊辉僭谒鰺晒鈭F(tuán)附近。所述PCR終止物會(huì)防不需要的Taq DNA聚合酶通讀所述探針。侵入測(cè)定(ThirdWave Technologies，Madison，WI)特別可用于 SNP 基因分型， 利用了被命名為信號(hào)探針的寡核苷酸，所述寡核苷酸與所述靶核酸(DNA或RNA)或多態(tài)性位點(diǎn)互補(bǔ)。被命名為侵入寡核苷酸(Invader Oligo)的第二寡核苷酸包含相同的5’核苷酸序列，但所述3’核苷酸序列包含核苷酸多態(tài)性。所述侵入寡核苷酸會(huì)干擾所述信號(hào)探針與所述靶核酸的結(jié)合，使得所述信號(hào)探針的5’末端在包含所述多態(tài)性的核苷酸處形成“翼 (flap)”。該復(fù)合物由被稱為切割酶(Cleavase)的結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶識(shí)別。切割酶切割所述核苷酸的5’翼。釋放的翼與帶有FRET標(biāo)簽的第三探針結(jié)合，從而形成被切割酶識(shí)別的另一雙螺旋結(jié)構(gòu)。這次，所述切割酶切開(kāi)熒光團(tuán)和猝滅物，并產(chǎn)生熒光信號(hào)。對(duì)于SNP 基因分型，所述信號(hào)探針將被設(shè)計(jì)為與所述參考(野生型)等位基因或變體(突變體)等位基因雜交。與PCR不同，在沒(méi)有核酸擴(kuò)增的情況下有信號(hào)的線性擴(kuò)增。足夠指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的更進(jìn)一步的詳細(xì)資料由例如Neri，B. P.，et al.，Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis 3826 :117-125, 2000)和美國(guó)專利 No. 6，706，471 提供?？坻i探針(PLP)是長(zhǎng)的(例如約100個(gè)堿基)線性寡核苷酸。所述探針3’和5’ 末端的序列與所述靶核酸中的鄰近序列互補(bǔ)。在所述PLP的中部非互補(bǔ)區(qū)域有可用于識(shí)別所述具體PLP的“標(biāo)簽”序列。所述標(biāo)簽序列的側(cè)翼有通用啟動(dòng)位點(diǎn)，所述通用啟動(dòng)位點(diǎn)使得能夠進(jìn)行所述標(biāo)簽的PCR擴(kuò)增。當(dāng)與所述靶雜交時(shí)，就使所述PLP寡核苷酸的兩末端接近，并且可由酶連接反應(yīng)連接。生成的產(chǎn)物是與所述靶DNA鏈串聯(lián)的環(huán)狀探針?lè)肿印Ｈ魏挝催B接的探針(即，未與靶雜交的探針)都通過(guò)核酸外切酶的作用除去。PLP的雜交和連接需要兩個(gè)末端片段識(shí)別所述靶序列。以該方式，PLP提供非常特異的靶識(shí)別。然后，可以將環(huán)化PLP的標(biāo)簽區(qū)域擴(kuò)增，并且檢測(cè)生成的擴(kuò)增子。例如，可進(jìn)行TaqMau 實(shí)時(shí)PCR來(lái)對(duì)擴(kuò)增子檢測(cè)并定量。可將擴(kuò)增子的存在和量與所述樣本中的靶序列的存在和量關(guān)聯(lián)起來(lái)。對(duì)于PLP的描述，參見(jiàn)例如Landegren et al., 2003, Padlock and proximity probes for in situ and array-based analyses tools for the post—genomic era, Comparative and Functional Genomics 4 :525-30 ； Nilsson et al.,2006, Analyzing genes using closing and replicating circles Trends Biotechnol. 24:83-8 ；Nilsson et al. ,1994, Padlock probes !circularizing oligonucleotides for localized DNA detection, Science 265 :2085_8o在具體的實(shí)施方案中，可用作探針的可探測(cè)標(biāo)記的熒光團(tuán)包括但不限于羅丹明、花菁 3(Cy 3)、花菁 5(Cy 5)、熒光素、Vic 、Liz .、TamraTM、5-FamTM、6-FamTM 和得克薩斯紅(Molecular Probes)。(Vic 、Liz 、Tamra ,5-Fam 和 6-Fam 都可獲自 Applied Biosystems, Foster City, Calif)0
已經(jīng)開(kāi)發(fā)的裝置能夠以包含熒光指示劑的組合物進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，發(fā)出所述波長(zhǎng)的光束，讀出熒光染料的強(qiáng)度，并且顯示每個(gè)循環(huán)后的熒光強(qiáng)度。包括熱循環(huán)件、光束發(fā)射器和熒光信號(hào)檢測(cè)器的裝置已經(jīng)記載于例如美國(guó)專利No. 5，928，907,6, 015，674和 6，174，670 中。在一些實(shí)施方案中，這些功能的每一種均可由分開(kāi)的裝置進(jìn)行。例如，如果將Q-β 復(fù)制酶反應(yīng)用于擴(kuò)增，那么所述反應(yīng)可以不在循環(huán)件中進(jìn)行，但可以包括在特定波長(zhǎng)下發(fā)射的光束、熒光信號(hào)的檢測(cè)和擴(kuò)增產(chǎn)物量的計(jì)算和顯示。在具體實(shí)施方案中，聯(lián)合熱循環(huán)和熒光檢測(cè)的裝置可用于精確定量靶核酸。在一些實(shí)施方案中，熒光信號(hào)可在一個(gè)或多個(gè)熱循環(huán)期間和/或之后檢測(cè)，因此使得可在反應(yīng)發(fā)生時(shí)“實(shí)時(shí)”監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，可以使用擴(kuò)增產(chǎn)物的量和擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目來(lái)計(jì)算擴(kuò)增前所述樣品中有多少所述靶核酸序列。根據(jù)一些實(shí)施方案，可以在足以指示所述靶核酸序列存在于樣本中的預(yù)定數(shù)目的循環(huán)后簡(jiǎn)單地監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。對(duì)于任何給定樣本類型、引物序列和反應(yīng)條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定多少循環(huán)就足以確定給定靶核酸的存在。根據(jù)一些實(shí)施方案，可使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定量由熒光信號(hào)指示的擴(kuò)增產(chǎn)物。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No. 5，736，333。通過(guò)獲取不同溫度下的熒光，可能跟蹤雜交的程度。此外，PCR產(chǎn)物雜交的溫度依賴性可用于鑒定和/或定量PCR產(chǎn)物。因此，本文描述的方法涵蓋在檢測(cè)和/或定量擴(kuò)增子時(shí)使用解鏈曲線分析。解鏈曲線分析是公知的，記載于例如美國(guó)專利No. 6，174，670、 6472156和6，569，627中，所述每篇專利通過(guò)引用的方式全文納入本文，特別是就其對(duì)使用解鏈曲線分析來(lái)檢測(cè)和/或定量擴(kuò)增產(chǎn)物的描述。在示例性實(shí)施方案中，解鏈曲線分析使
用雙鏈 DNA 染料-例如 SYBR 綠、Pico 綠(Molecular Probes, Inc.，Eugene, OR)、溴化乙
啶等進(jìn)行(參見(jiàn) Zhu et al.，1994, Anal. Chem. 66 :1941-48)。在使用預(yù)擴(kuò)增的多個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目足以將一個(gè)或多個(gè)核苷酸標(biāo)簽加至所述靶核苷酸序列，使得所述帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的相對(duì)拷貝數(shù)目可基本上代表樣本中所述靶核酸的相對(duì)拷貝數(shù)目。例如，預(yù)擴(kuò)增可進(jìn)行2-20個(gè)循環(huán)以引入所述樣本特異性或系列特異性核苷酸標(biāo)簽。在另一些實(shí)施方案中，檢測(cè)在指數(shù)擴(kuò)增結(jié)束時(shí)進(jìn)行，即在“平臺(tái)，，期進(jìn)行，或者進(jìn)行終點(diǎn)PCR。在這種情況下，預(yù)擴(kuò)增將使擴(kuò)增子拷貝數(shù)對(duì)靶和對(duì)樣本正態(tài)化。在多個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)擴(kuò)增和/或擴(kuò)增可進(jìn)行約2、4、10、15、20、25、30、35或40個(gè)循環(huán)，或者落在由任意這些數(shù)值限制的范圍內(nèi)的循環(huán)數(shù)。若需要，如本文所述生成的帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列可通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行分析。很多現(xiàn)行的DNA測(cè)序技術(shù)依賴于“合成測(cè)序”。這些技術(shù)需要文庫(kù)創(chuàng)建、文庫(kù)分子的大規(guī)模平行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。文庫(kù)創(chuàng)建開(kāi)始于樣本核酸轉(zhuǎn)變?yōu)檫m當(dāng)大小的片段、銜接體序列連接在所述片段的末端，并且選擇正確地附加有所述銜接體的分子。銜接體序列存在于所述文庫(kù)分子末端使得能夠擴(kuò)增隨機(jī)序列插入物。上述對(duì)核苷酸序列加標(biāo)簽的方法可用連接代替以引入銜接體序列。在具體實(shí)施方案中，在大規(guī)模平行PCR步驟中產(chǎn)生的文庫(kù)DNA分子的數(shù)目低至足夠以使兩個(gè)分子與相同底物例如相同的珠子(在454 DNA測(cè)序中)或相同的表面片(在 Solexa DNA測(cè)序中)結(jié)合的機(jī)會(huì)很低，但高至足夠以使擴(kuò)增序列的產(chǎn)量足夠在自動(dòng)測(cè)序中提供高通量。在如上文所述引入合適的銜接體序列后，可在合成測(cè)序前使用數(shù)字化PCR來(lái)校準(zhǔn)文庫(kù)DNA分子的數(shù)目。標(biāo)記策略任何合適的標(biāo)記策略都可用于本發(fā)明的方法。如果將所述測(cè)定混合物等分，并且對(duì)每個(gè)等分試樣分析單一擴(kuò)增產(chǎn)物的存在，那么可在所述擴(kuò)增混合物中使用通用檢測(cè)探針。在具體的實(shí)施方案中，可使用通用qPCR探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。合適的通用qPCR探針包括雙鏈 DNA 染料，如 SYBR 綠、Pico 綠(Molecular Probes, Inc.，Eugene, OR)、溴化乙啶等(參見(jiàn)Zhu et al.，1994，Anal. Chem. 66 :1941-48)。合適的通用qPCR探針還包括可與存在于所有擴(kuò)增產(chǎn)物中的核苷酸序列結(jié)合的序列特異性探針?？蓪⑦@類探針的結(jié)合位點(diǎn)在預(yù)擴(kuò)增(在使用預(yù)擴(kuò)增的實(shí)施方案中)過(guò)程中常規(guī)地引入至所述帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列中并且/或或者在擴(kuò)增過(guò)程中弓丨入至擴(kuò)增產(chǎn)物中?；蛘?，將一個(gè)或多個(gè)靶特異性qPCR探針(即，對(duì)待檢測(cè)的靶核苷酸序列特異) 應(yīng)用于所述擴(kuò)增混合物中來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。靶特異性探針可能是有用的，例如當(dāng)在大量樣本中僅欲檢測(cè)少數(shù)靶核酸時(shí)。例如，如果僅欲檢測(cè)3個(gè)靶，可使用具有對(duì)每個(gè)靶不同的熒光標(biāo)記物的靶特異性探針。通過(guò)合適的標(biāo)記選擇，可進(jìn)行這樣的分析，即其中在單個(gè)反應(yīng)中不同的標(biāo)記在不同的波長(zhǎng)下被激發(fā)并且/或者被檢測(cè)。參見(jiàn)，例如Fluorescence Spectroscopy (Pesce et al. , Eds. )Marcel Dekker, New York, (1971) ；White et al., Fluorescence Analysis :A Practical Approach, Marcel Dekker, New York, (1970)； Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd ed. ,Academic Press,New York, (1971) ；Griffiths,Colour and Constitution of Organic Molecules, Academic Press, New York, (1976) ；Indicators(Bishop, Ed.).Pergamon Press, Oxford, 19723 ； 禾口 Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Eugene(1992)。不需要的反應(yīng)組分的除去應(yīng)了解，涉及核酸復(fù)合混合物的反應(yīng)(其中使用許多反應(yīng)步驟)可得到大量未參入的反應(yīng)組分，通過(guò)多種清除方法的任一種除去這類未參入的反應(yīng)組分或降低它們的濃度可提高隨后發(fā)生的反應(yīng)的效率和特異性。例如，在一些實(shí)施方案中，可能需要在進(jìn)行本文所述的擴(kuò)增步驟前除去預(yù)擴(kuò)增引物或降低預(yù)擴(kuò)增引物的濃度。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)簡(jiǎn)單稀釋來(lái)減少不需要的組分的濃度。例如，可在擴(kuò)增前將預(yù)擴(kuò)增樣本稀釋約2、5、10、50、100、500、1000、5000或10，000倍來(lái)提高隨后的擴(kuò)增步驟的特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，稀釋度也可落在由任何上述數(shù)值限定的范圍內(nèi)(例如， 約100倍至約1000倍)。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)多種酶方法除去不需要的組分。合適的酶方法的實(shí)例包括消化單鏈核酸的酶，如大腸桿菌(E. coli)外切核酸酶I。擴(kuò)增反應(yīng)剩下的多余dNTP可通過(guò)用蝦堿性磷酸酶(SAP)處理“除去”，蝦堿性磷酸酶可除去dNTP的磷酸基團(tuán)。尿嘧啶 N-糖基化酶(UNG) ( AmpErase from Applied Biosystems,Inc. ,Foster City, CA)可用于防止不需要的遺留(carry-over)引物參與初始擴(kuò)增反應(yīng)，所述初始擴(kuò)增反應(yīng)中所述引物包括dUTP而不是dTTP。UNG降解含有U的引物?；蛘撸赏ㄟ^(guò)柱色譜除去未反應(yīng)的引物和dNTP。例如，為了該目的可以使用在葡聚糖凝膠(S^hadex)上進(jìn)行的凝膠過(guò)濾。在具體的實(shí)施方案中，清除包括核酸的選擇性固定。例如，可將需要的核酸優(yōu)先固定在固體支持物上。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將光生物素連接于需要的核酸上，并且將生成的生物素標(biāo)記的核酸固定在包含親和部分結(jié)合物例如鏈親和素的固體支持物上?；蛘撸?可將不想要的核酸固定在固體支持物上，通過(guò)洗滌收獲需要的核酸。在擴(kuò)增過(guò)稈中使用阻斷劑在一些實(shí)施方案中，可在存在阻斷劑的情況下進(jìn)行擴(kuò)增以增加靶核酸的特異性擴(kuò)增。這類試劑可抑制擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的背景噪聲，增加一個(gè)或多個(gè)靶核酸的特異性擴(kuò)增，并且/或者提高擴(kuò)增的質(zhì)量(例如，可能通過(guò)提高擴(kuò)增的效率)。在任何擴(kuò)增反應(yīng)中都可以使用阻斷劑，例如當(dāng)基因組DNA樣本被預(yù)擴(kuò)增或擴(kuò)增時(shí)?；蚪MDNA包含引物可以非特異性雜交的重復(fù)核苷酸序列，這樣可增加背景噪聲并且與靶核酸競(jìng)爭(zhēng)引物。在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中加入阻斷劑會(huì)增加所述靶核酸的特異性擴(kuò)增。 在多個(gè)實(shí)施方案中，特異性擴(kuò)增的提高可以是不存在阻斷劑下觀察到的擴(kuò)增的約10%、約 25%、約 50%、約 75%、約 100%、約 150%、約 200%、約 250%、約 300%、約 350%、約 400%、 約450%或約500%。不拘囿于具體的理論，本發(fā)明人認(rèn)為所述阻斷可通過(guò)與基因組DNA樣本中的重復(fù)序列雜交起作用。阻斷劑還特別可用于使用基因組DNA或其他類型的核酸樣本的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)。在多重?cái)U(kuò)增中，在擴(kuò)增反應(yīng)混合物中存在多個(gè)引物可增加由所述多個(gè)引物的非特異性雜交造成的信號(hào)。加入阻斷劑可抑制該信號(hào)。 在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將核酸阻斷劑例如tRNA用作擴(kuò)增反應(yīng)例如PCR中的阻斷劑。其他阻斷劑可包括降解寡核苷酸引物、重復(fù)DNA、BSA或糖原。所述阻斷劑應(yīng)以可增加所述靶核酸特異性擴(kuò)增的量存在。在一些實(shí)施方案中，所述阻斷劑以約0. 1 μ g/μ 1至約40μ g/μ 1的濃度存在。在具體實(shí)施方案中，所述阻斷劑濃度可以是約0. 1、約0. 2、約0. 3、約0. 4、約0. 5、約0. 6、約0. 7、約1、約2、約3、約4、約5、約 6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35或約40 μ g/μ 1的預(yù)擴(kuò)增或擴(kuò)增反應(yīng)混合物，或者可以是任何以這些數(shù)值的任一個(gè)作為端點(diǎn)的范圍(例如，約1 μ g/μ 1至約 5 μ g/ μ 1)。還可憑經(jīng)驗(yàn)確定合適的量，如實(shí)施例4中所示。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將tRNA以約1 μ g/ μ 1至約5 μ g/ μ 1例如約2或3 μ g/ μ 1的濃度用作阻斷劑。^M本發(fā)明的方法可用于任何以檢測(cè)核酸樣本中一個(gè)或多個(gè)靶核酸的存在或量為目標(biāo)的技術(shù)中。因此，例如，這些方法可用于鑒定具體多態(tài)性(如SNP)、等位基因、單倍型或染色體異常(如擴(kuò)增、缺失或非整倍性)的存在。所述方法可用于基因分型，所述基因分型可在多種情況下進(jìn)行，包括診斷遺傳疾病或病癥、藥物基因組學(xué)(個(gè)性化醫(yī)學(xué))、農(nóng)業(yè)質(zhì)量控制(例如，用于種子或牲畜)、植物或動(dòng)物種群的研究和管理(例如，在水產(chǎn)業(yè)或漁業(yè)管理中或者在確定種群多樣性中)或者親子鑒定或法醫(yī)鑒定。本發(fā)明的方法可用于鑒定在生物或環(huán)境樣本中指示具體條件或生物體的序列。例如，所述方法可用于鑒定病原體，例如病毒、 細(xì)菌和真菌。所述方法還可用于表征環(huán)境或微環(huán)境，例如用于表征人腸道中的微生物種。這些方法還可用于確定DNA或RNA (例如mRNA、miRNA)拷貝數(shù)。確定基因組DNA中的異常DNA拷貝數(shù)目可用于例如診斷和/或預(yù)后遺傳缺陷和疾病例如癌癥。確定RNA “拷貝數(shù)”(即表達(dá)水平)可用于表達(dá)監(jiān)測(cè)所關(guān)注的基因，例如在不同條件(例如不同的外部刺激或疾病狀態(tài))和/或在不同發(fā)育階段下的不同個(gè)體、組織或細(xì)胞中。引物還可發(fā)揮探針的功能。此外，所述方法還可用于制備用于進(jìn)一步分析例如DNA測(cè)序的核酸樣本。最后，在隨后的分析之前，作為第一步可對(duì)核酸樣本加標(biāo)簽，以降低樣本的錯(cuò)誤標(biāo)記或交叉污染損害結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。例如，任何醫(yī)生診所、實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)院可以在收集之后立即對(duì)樣本加標(biāo)簽，所述標(biāo)簽可在分析時(shí)確認(rèn)。類似地，對(duì)在犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集到的含有核酸的樣本可盡可能快地加標(biāo)簽，以確保所述樣本不會(huì)被誤標(biāo)記或者被篡改。在樣本每次從一方當(dāng)事人轉(zhuǎn)移給另一方時(shí)對(duì)所述標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè)可用于建立樣本保管鏈。試劑盒本發(fā)明的試劑盒包括可用于實(shí)施本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)測(cè)定方法的一種或多種試劑。試劑盒通常包括帶有一個(gè)或多個(gè)容納試劑(例如引物和/或探針)的容器的包裝物， 所述試劑作為一個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的組合物，或者任選地，作為其中所述試劑的相容性所允許的混合物。所述試劑盒還可以包括從使用者的角度來(lái)看需要的其他材料，例如緩沖物、稀釋物、標(biāo)準(zhǔn)物以及/或者可用于樣本處理、洗滌或進(jìn)行所述測(cè)定的任何其他步驟的任何其他材料。本發(fā)明的試劑盒通常包括進(jìn)行本發(fā)明的一種或多種方法的說(shuō)明書(shū)。包含在本發(fā)明試劑盒中的說(shuō)明書(shū)可貼在包裝材料之上或可作為包裝插頁(yè)包括在其中。盡管說(shuō)明書(shū)一般是書(shū)寫(xiě)或印刷材料，但它們并不限于此。本發(fā)明考慮任何能夠儲(chǔ)存這類說(shuō)明并將其傳遞給終端用戶的介質(zhì)。這類介質(zhì)包括但不限于電子儲(chǔ)存介質(zhì)(例如磁盤(pán)、磁帶、錄音盒帶、芯片)、 光學(xué)介質(zhì)(例如CD R0M)、RF標(biāo)簽等。本文使用的術(shù)語(yǔ)“說(shuō)明書(shū)”可包括提供所述說(shuō)明書(shū)的互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)的地址。應(yīng)理解，本文描述的實(shí)例和實(shí)施方案僅用于示例性目的，根據(jù)它們作出的多種修飾或修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是暗示性的，并且包括在本申請(qǐng)的主旨和考慮內(nèi)以及所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。此外，本文引用的所有其他出版物、專利和專利申請(qǐng)就其全部目的通過(guò)引用的方式全文納入本文。實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)每個(gè)引物使用獨(dú)特標(biāo)簽的“更多樣本”化學(xué)法該實(shí)施例提供了一種用于進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)定方法的示例性方案，以使用獲自 Fluidigm Corporation, South San Francisco，CA 的 48. 48 動(dòng)態(tài)陣列測(cè)量最多達(dá) 144 個(gè)樣本中的16個(gè)靶的基因表達(dá)。為了在不改變芯片設(shè)計(jì)的的情況下使用動(dòng)態(tài)陣列增加用于基因表達(dá)的樣本通量， 發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種新方案來(lái)使用一個(gè)M48芯片測(cè)量在超過(guò)48個(gè)樣本中少于48 (即16)個(gè)靶的基因表達(dá)。該方案包括加標(biāo)簽、合并和實(shí)時(shí)PCR步驟。為了證明觀點(diǎn)，僅編碼并分析了 3個(gè)靶基因。在加標(biāo)簽步驟過(guò)程中，將cDNA樣本分為3個(gè)不同的組。對(duì)于所述3個(gè)組，分別合成3個(gè)靶(GAPDH、LDH1、HPRT)的正向和反向引物，獨(dú)特的標(biāo)簽序列添加在所述引物的5’末端(共18個(gè)不同的標(biāo)簽)。以該方式，每對(duì)標(biāo)簽界定了以具體組的試劑擴(kuò)增并加標(biāo)簽的具體靶。將每個(gè)系列的組特異性帶標(biāo)簽的引物與33個(gè)其他未加標(biāo)簽的基因表達(dá)混合物合并在一起，以模擬預(yù)擴(kuò)增中的高復(fù)雜性。在加標(biāo)簽步驟(用所述帶標(biāo)簽的引物預(yù)擴(kuò)增靶)中，在5μ 1反應(yīng)系中擴(kuò)增所述3 組不同的cDNA樣本(標(biāo)準(zhǔn)cDNA，4X稀釋的8個(gè)滴度，從5ng至0. 3pg)，所述反應(yīng)系包含 2. 5 μ 1 2 XPreaAmp Master Mix (Applied Biosystems)、1 μ 1 多重力口標(biāo)簽弓I物混合物(每組樣本1份不同的混合物)、1 μ 1 cDNA和0. 5 μ 1無(wú)DNA水。PCR按如下進(jìn)行初始95°C 15 分鐘，之后是14個(gè)循環(huán)2步擴(kuò)增譜95°C 15秒變性、60°C 4分鐘退火和延伸。用DNA懸浮緩沖液(來(lái)自TEKnova的低EDTA TE)將所述PCR產(chǎn)物稀釋100倍。然后，將來(lái)自所述3組的PCR產(chǎn)物合并，每個(gè)合并的樣本具有來(lái)自所述帶標(biāo)簽的3組的每一組的一個(gè)樣本。作為對(duì)比，通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR分別地分析來(lái)自不同標(biāo)簽組的樣本。同樣，以未加標(biāo)簽的引物和未混合的樣本平行地進(jìn)行所述分析。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR在動(dòng)態(tài)陣列芯片上分析所述合并的樣本。在5μ1反應(yīng)系中以相應(yīng)的TaqMan探針為每對(duì)標(biāo)簽制備10 X測(cè)定混合物，所述反應(yīng)系包含2 μ M Taqman探針、 9μ M的兩種標(biāo)簽特異性引物和IX測(cè)定上樣試劑(Fluidigm)。為每個(gè)2. 5 μ L(合并的或獨(dú)立的)樣本制備5 μ L樣本混合物，所述樣本混合物包含1 X TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)、1 XDA樣本上樣試劑。如上文所述在動(dòng)態(tài)陣列芯片上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)TaqMan基因表達(dá)。相對(duì)于參考樣本(在相對(duì)濃度0. 063的ABC，灰背景)確定HPRT cDNA和GAPDH cDNA的不同樣本的Δ ACT。來(lái)自A、B和C 3組的樣本不混合(“單獨(dú)的”)，與相同濃度的樣本混合(“ABC”)或者與不同濃度的樣本混合(“A固定”)。相對(duì)濃度是指加入所述加標(biāo)簽反應(yīng)系的cDNA量(“1.000”= 5納克)。對(duì)于分別以組A、B和C特異性標(biāo)簽引物以及以未加標(biāo)簽的引物(即帶有所述預(yù)擴(kuò)增引物的靶特異性部分的序列的引物)分析的樣本， 列出了 Δ ACt值。結(jié)果顯示于表1中。表1樣本混合物
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸的測(cè)定方法，所述方法包括 提供在測(cè)定前混合在一起的S個(gè)樣本，其中S是大于1的整數(shù)；使所述S個(gè)樣本的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括樣本特異的核苷酸標(biāo)簽和靶核苷酸序列； 其中T是待檢測(cè)的靶核酸的數(shù)目，T是大于1的整數(shù)；對(duì)于所述S個(gè)樣本的每一個(gè)，將帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列混合形成測(cè)定混合物； 對(duì)所述測(cè)定混合物或其等分試樣用SXT對(duì)獨(dú)特的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與靶核苷酸序列退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與樣本特異性核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物；并且對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于擴(kuò)增混合物或其等分試樣中，從而擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在具體樣本中的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述編碼反應(yīng)包括使用針對(duì)每個(gè)樣本的不同正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物系列分別預(yù)擴(kuò)增所述S個(gè)樣本的每一個(gè)來(lái)產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增樣本，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物系列包括T對(duì)正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每對(duì)預(yù)擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增一個(gè)具體的靶核酸；并且在給定系列中的所有正向預(yù)擴(kuò)增引物或所有反向預(yù)擴(kuò)增引物包括共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽；所述混合包括將所述S個(gè)樣本的每一個(gè)的預(yù)擴(kuò)增樣本混合來(lái)形成測(cè)定混合物； 所述擴(kuò)增包括將所述測(cè)定混合物分成最多SXT個(gè)擴(kuò)增混合物，并且用獨(dú)特的擴(kuò)增引物對(duì)來(lái)分別擴(kuò)增所述每個(gè)擴(kuò)增混合物，其中所述每對(duì)擴(kuò)增引物包括 會(huì)與靶核苷酸序列退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與樣本特異性核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物；并且所述確定包括確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于所述擴(kuò)增混合物中，從而擴(kuò)增產(chǎn)物在擴(kuò)增混合物中的存在指示具體靶核酸在具體樣本中的存在。
3.權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中一個(gè)系列中的每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物除包括靶特異性核苷酸序列外還包括共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽，并且每個(gè)系列中的每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物均包括靶特異性核苷酸序列。
4.權(quán)利要求2的測(cè)定方法，其中一個(gè)系列中的每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物包括靶特異性核苷酸序列，并且每個(gè)系列中的每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物除包括靶特異性核苷酸序列外還包括共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。
5.一種檢測(cè)多個(gè)樣本中的多個(gè)靶核酸的測(cè)定方法，所述方法包括 提供在測(cè)定前混合在一起的S個(gè)樣本，其中S是大于1的整數(shù)；對(duì)所述S個(gè)樣本的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括連接至靶核苷酸序列的第一核苷酸標(biāo)簽， 所述靶核苷酸序列連接至第二核苷酸標(biāo)簽；其中T是待檢測(cè)的靶核酸的數(shù)目，T是大于1的整數(shù)；對(duì)于所述S個(gè)樣本的每一個(gè)，將帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列混合形成測(cè)定混合物；使用SXT對(duì)獨(dú)特的擴(kuò)增引物擴(kuò)增所述測(cè)定混合物或其等分試樣，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括會(huì)與第一核苷酸標(biāo)簽退火的正向或反向擴(kuò)增引物；和會(huì)與第二核苷酸標(biāo)簽退火的各自的反向或正向擴(kuò)增引物；并且對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于擴(kuò)增混合物或其等分試樣中，從而擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在具體樣本中的存在。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述編碼反應(yīng)包括使用針對(duì)每個(gè)樣本的不同正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物系列分別對(duì)所述S 個(gè)樣本的每一個(gè)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生預(yù)擴(kuò)增樣本，其中每個(gè)預(yù)擴(kuò)增引物系列包括T對(duì)正向和反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每對(duì)預(yù)擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增一個(gè)具體的靶核酸；并且每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物包括正向核苷酸標(biāo)簽，每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物包括反向核苷酸標(biāo)簽；所述混合包括將所述S個(gè)樣本的每一個(gè)的預(yù)擴(kuò)增樣本混合形成測(cè)定混合物； 所述擴(kuò)增包括將每個(gè)測(cè)定混合物分為最多SXT個(gè)擴(kuò)增混合物，并且用獨(dú)特的擴(kuò)增引物對(duì)分別擴(kuò)增每個(gè)所述擴(kuò)增混合物，其中每對(duì)擴(kuò)增弓I物包括 會(huì)與正向核苷酸標(biāo)簽退火的正向擴(kuò)增引物；和會(huì)與反向核苷酸標(biāo)簽退火的反向擴(kuò)增引物；并且所述確定包括確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于所述擴(kuò)增混合物中，從而擴(kuò)增產(chǎn)物在擴(kuò)增混合物中的存在指示具體靶核酸在具體樣本中的存在。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述核苷酸標(biāo)簽的至少一個(gè)包括從給定樣本產(chǎn)生的所有帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列共同的樣本特異性核苷酸標(biāo)簽。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述另一個(gè)核苷酸標(biāo)簽對(duì)于所述測(cè)定混合物中的每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列是不同的。
9.權(quán)利要求1、2、5或6的測(cè)定方法，其中所述擴(kuò)增引物的至少一個(gè)包括與所述核苷酸標(biāo)簽的至少一個(gè)鄰近的靶核苷酸互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸。
10.權(quán)利要求1、2、5或6的測(cè)定方法，其中通過(guò)制備多個(gè)不同的測(cè)定混合物測(cè)定一系列樣本，其中每個(gè)測(cè)定混合物包括S個(gè)不同樣本的混合物。
11.權(quán)利要求10的測(cè)定方法，其中3\1~是選自30、48、96、120和192的至少一個(gè)數(shù)值。
12.權(quán)利要求10的測(cè)定方法，其中在單個(gè)測(cè)定中測(cè)定的樣本總數(shù)XT的積是選自 2304,3600,4608和9216的至少一個(gè)數(shù)值。
13.一種用于檢測(cè)樣本中多個(gè)靶核酸的測(cè)定方法，所述方法包括向樣本提供T個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每個(gè)正向預(yù)擴(kuò)增引物包括不同的靶特異性核苷酸序列和系列特異性核苷酸標(biāo)簽，其中使用X個(gè)不同的正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，其中T 是待檢測(cè)靶的數(shù)目，X是大于1小于T的整數(shù)，因此T/X個(gè)引物包括相同的正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽；向所述樣本提供T個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物，其中每個(gè)反向預(yù)擴(kuò)增引物包括不同的靶特異性核苷酸序列和反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，其中使用Y個(gè)不同的反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽，Y是大于1小于T的整數(shù)，因此T/Y個(gè)引物包括相同的反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽；預(yù)擴(kuò)增所述樣本以產(chǎn)生測(cè)定混合物，其中針對(duì)具體靶生產(chǎn)的任何預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物參入正向和反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽的獨(dú)特組合；用擴(kuò)增引物擴(kuò)增所述測(cè)定混合物或其等分試樣，其中每對(duì)擴(kuò)增引物包括 會(huì)與所述正向系列特異性核苷酸標(biāo)簽退火的正向擴(kuò)增引物；和會(huì)與所述反向系列特異性核苷酸標(biāo)簽退火的反向擴(kuò)增引物；并且對(duì)于每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于所述擴(kuò)增混合物或其等分試樣中，從而擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在所述樣本中的存在。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述擴(kuò)增包括將所述測(cè)定混合物分成T個(gè)擴(kuò)增混合物，并且使用獨(dú)特的擴(kuò)增弓I物對(duì)分別擴(kuò)增所述擴(kuò)增混合物的每一個(gè)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中X至少是選自12、24、48和96的數(shù)值。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述T至少是選自384、576、768、1152、2304、3600、4608 和9216的數(shù)值。
17.一種用于檢測(cè)樣本中的多個(gè)靶核酸的測(cè)定方法，所述方法包括 將樣本分為R個(gè)等分試樣，其中R是大于1的整數(shù)；對(duì)所述R個(gè)等分試樣的每一個(gè)分別進(jìn)行編碼反應(yīng)，所述編碼反應(yīng)產(chǎn)生一系列T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列，其中T是每個(gè)等分試樣中待檢測(cè)的靶核酸的數(shù)目，T是大于1的整數(shù)， 并且其中每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列包括在靶核苷酸序列5’的第一核苷酸標(biāo)簽、靶核苷酸序列和在所述靶核苷酸序列3'的第二核苷酸標(biāo)簽；所述T個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列的每一個(gè)中的核苷酸標(biāo)簽組合對(duì)每個(gè)等分試樣中的每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列來(lái)說(shuō)都是獨(dú)特的；并且將相同系列的第一和第二核苷酸標(biāo)簽組合用于每個(gè)所述等分試樣的所述編碼反應(yīng)中；使用針對(duì)每個(gè)等分試樣的相同系列T對(duì)不同的擴(kuò)增引物分別擴(kuò)增每個(gè)等分試樣，每對(duì)引物均包括會(huì)與每個(gè)帶標(biāo)簽的靶核苷酸序列中的所述第一核苷酸標(biāo)簽退火的第一引物和會(huì)與其中的所述第二核苷酸標(biāo)簽退火的第二引物；并且對(duì)于每個(gè)等分試樣中的每對(duì)獨(dú)特的引物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在于所述等分試樣中， 從而擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示具體靶核酸在所述樣本中的存在。
18.權(quán)利要求17的測(cè)定方法，其中在擴(kuò)增前 將每個(gè)等分試樣分為T(mén)個(gè)亞等分試樣；將所述T對(duì)不同的擴(kuò)增引物的一對(duì)與每個(gè)亞等分試樣組合；并且對(duì)所述亞等分試樣分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
19.權(quán)利要求17的測(cè)定方法，其中所述編碼反應(yīng)包括預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)。
20.權(quán)利要求19的測(cè)定方法，其中對(duì)所述樣本進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，其中預(yù)擴(kuò)增TXR個(gè)靶核酸的每一個(gè)。
21.權(quán)利要求20的測(cè)定方法，其中用于預(yù)擴(kuò)增的引物相對(duì)于用于前預(yù)擴(kuò)增的引物是嵌套的。
22.權(quán)利要求17的測(cè)定方法，其中R和/或T至少是選自12、24、48和96的數(shù)值。
23.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中擴(kuò)增混合物在擴(kuò)增前形成于或者被分配至微流體裝置的不同隔間。
24.權(quán)利要求23的測(cè)定方法，其中所述微流體裝置至少部分是由彈性體材料制造。
25.權(quán)利要求23的測(cè)定方法，其中所述測(cè)定具有至少4個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。
26.權(quán)利要求2、6、13或19的測(cè)定方法，其中所述預(yù)擴(kuò)增和/或所述擴(kuò)增通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行。
27.權(quán)利要求2、6、13或19的測(cè)定方法，其中所述預(yù)擴(kuò)增進(jìn)行2_20個(gè)循環(huán)以引入所述核苷酸標(biāo)簽。
28.權(quán)利要求2、6、13或19的測(cè)定方法，其中所述預(yù)擴(kuò)增進(jìn)行足夠數(shù)目的循環(huán)以使擴(kuò)增子拷貝數(shù)對(duì)靶和對(duì)樣本正態(tài)化。
29.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
30.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中在所述擴(kuò)增混合物中使用通用qPCR探針來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
31.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中在所述擴(kuò)增混合物中使用一個(gè)或多個(gè)靶特異性qPCR探針來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
32.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中在所述擴(kuò)增混合物中使用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽特異性qPCR探針來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
33.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中使用熒光核酸酶測(cè)定檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
34.權(quán)利要求33的測(cè)定方法，其中使用雙重標(biāo)記的熒光寡核苷酸探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
35.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，還包括對(duì)所述擴(kuò)增混合物中的擴(kuò)增產(chǎn)物的量進(jìn)行定量。
36.權(quán)利要求35的測(cè)定方法，還包括確定在每個(gè)樣本中存在的每個(gè)靶核酸的量。
37.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中進(jìn)行所述測(cè)定以確定所述靶核酸的拷貝數(shù)。
38.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中進(jìn)行所述測(cè)定以確定對(duì)應(yīng)于所述靶核酸的基因座的基因型。
39.權(quán)利要求2、6、13或17的測(cè)定方法，其中進(jìn)行所述測(cè)定以確定所述靶核酸的表達(dá)水平。
40.權(quán)利要求2、6、13或19的測(cè)定方法，還包括在進(jìn)行所述擴(kuò)增前降低預(yù)擴(kuò)增引物的濃度。
41.權(quán)利要求2、6、13或19的方法，其中所述樣本包括基因組DNA樣本。
42.權(quán)利要求41的方法，其中在存在足以提高所述靶核酸的特異性擴(kuò)增的量的阻斷劑的情況下進(jìn)行所述預(yù)擴(kuò)增。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述阻斷劑包括會(huì)與所述基因組DNA樣本中的重復(fù)序列雜交的核酸阻斷劑。
44.權(quán)利要求42的方法，其中所述阻斷劑選自tRNA、降解寡核苷酸引物、重復(fù)DNA、牛血清白蛋白(BSA)和糖原。
45.權(quán)利要求42的方法，其中所述阻斷劑以約0.1 μ g/μ 1至約40 μ g/μ 1的濃度存在。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述阻斷劑包含約1μ g/ μ 1至約5 μ g/ μ 1的濃度的 tRNAo
全文摘要
本發(fā)明提供增加可在單個(gè)測(cè)定中分析的樣本和/或靶核酸的數(shù)量的測(cè)定方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102203287SQ200980142505
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者A·摩爾, B·G·茲莫曼, M·恩格爾, R·拉馬克里山 申請(qǐng)人:弗盧迪格姆公司