專利名稱：變異型酶的設(shè)計法、制備方法和變異型酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對蛋白質(zhì)進(jìn)行脫酰胺化的變異型酶的設(shè)計法、制備方法和變異型酶等。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)脫酰胺酶是水解蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺、天冬酰胺的酰胺基，轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼帷?天冬氨酸，而游離氨的酶。蛋白質(zhì)脫酰胺酶可以適用于提高蛋白質(zhì)的功能性(溶解性、乳化特性、泡沫特性、凝膠化特性等)、提高小麥麩質(zhì)的生面團(tuán)()的伸展性、降低小麥變應(yīng)原誘發(fā)性、提高從農(nóng)產(chǎn)物中提取蛋白質(zhì)的提取效率、提高蛋白質(zhì)溶液中的鈣溶解性等各種用途，是一種產(chǎn)業(yè)上利用性很高的酶。蛋白質(zhì)脫酰胺酶廣泛存在自然界中。作為最為熟知的例子，可以列舉微生物來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(專利文獻(xiàn)1、幻。據(jù)報道，植物中，發(fā)芽中的小麥、菜豆、南瓜的種子中存在將蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基脫酰胺的酶(非專利文獻(xiàn)1)。而且，已知的是生物體內(nèi)也含有，而且在自然界中也廣泛存在，例如，近年來作為食品加工用酶被廣泛使用的放線菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基和賴氨酸殘基之間的交聯(lián)反應(yīng)，在反應(yīng)系中不存在賴氨酸等伯胺時，對蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基進(jìn)行脫酰胺化(非專利文獻(xiàn)2)。 而且，據(jù)報道，在其它微生物中，細(xì)菌(Bacillus circulans)的菌體內(nèi)存在對肽中的谷氨酰胺殘基進(jìn)行脫酰胺化的酶，即肽谷氨酰胺酶(非專利文獻(xiàn)3)。在利用蛋白質(zhì)脫酰胺酶時，與其它酶一樣，根據(jù)用途調(diào)節(jié)底物和酶的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等?？墒牵嬖谥煌ㄟ^調(diào)節(jié)這種酶反應(yīng)條件，無法制造出目的生成物的情況、 無法獲得所期待的收量的情況，對蛋白質(zhì)脫酰胺酶的性質(zhì)本身進(jìn)行改良的必要性就產(chǎn)生了。而且，作為產(chǎn)業(yè)用酶劑利用時，保存穩(wěn)定性十分重要，然而，由于一般來說，酶對氧的穩(wěn)定性低，因此為了維持充分的保存穩(wěn)定性，需要添加穩(wěn)定化劑或脫氣狀態(tài)下的包裝等，這關(guān)系到成本增加。為了改變蛋白質(zhì)脫酰胺酶的性質(zhì)，一般需要制備蛋白質(zhì)脫酰胺酶的變異體，評價其活性、底物特異性等，鑒定優(yōu)良的變異體，但這些工序需要很大的勞力。專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 特開2000-50887號公報專利文獻(xiàn)2 特開2001-218590號公報專利文獻(xiàn)3 特開2004-97099號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :V￡iintr￡iub， I. A. ， Kotova， L. V. &Shah￡i， R. (1996) Protein deamidases from germinating seeds. Physiol. Plantarum. 96,662-666.非專利文獻(xiàn)2:「産業(yè)用酵素」(1995)上島孝之、丸善、3. 2. 6食品功能的改良「谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的利用」pp. 40-42非專利文獻(xiàn)3 =Kikuchi, M.，Hayashida, H.，Nakano, E. &Sakaguchi K. (1971)Peptidoglutaminase. Enzymes for selectivedeamidation of y-amido of peptide-boundglutamine. Biochemistry 10,1222-1229.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供改良對蛋白質(zhì)進(jìn)行脫酰胺化的酶的新方法。此外，本發(fā)明的另外的目的是提供作用性和穩(wěn)定性得到改良的變異型酶。作用性的變化可以使得酶使用量降低、使反應(yīng)時間縮短、擴(kuò)大用途等。另一方面，穩(wěn)定性的改良可以提供保存穩(wěn)定性高的酶劑。鑒于以上課題進(jìn)行了積極研究，結(jié)果本發(fā)明人通過運用X射線結(jié)晶構(gòu)造分析技術(shù)，在解朊金黃桿菌(Chryseobacterium proteolyticum) 9670 株(FERM BP-7351)來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶中，獲得了與底物的識別相關(guān)的重要認(rèn)識，和與活性部位及其附近區(qū)域相關(guān)的重要認(rèn)識。即，在成功實現(xiàn)該蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體和前體的結(jié)晶化的同時，還成功獲得了其立體構(gòu)造信息，弄清楚了活性部位和底物口袋。由此確定被認(rèn)為與底物識別有關(guān)的氨基酸。而且，還弄清楚了活性部位的氨基酸，明確了其附近的被認(rèn)為影響活性中心的氨基酸的側(cè)鏈的電子狀態(tài)的氨基酸殘基。而且，還基于構(gòu)造分析的結(jié)果，嘗試改變酶的性質(zhì)，結(jié)果成功地改變了底物特異性，并提高了穩(wěn)定性。本發(fā)明主要是基于以上成果，提供以下的變異型酶的設(shè)計法等。[1]變異型酶的設(shè)計法，包含以下步驟(1)蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，確定從以下氨基酸組成的組中選擇的一個或兩個以上的氨基酸的步驟即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105 位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸；(2)構(gòu)建基于變異對象酶的氨基酸序列，將在步驟(1)確定的氨基酸取代為其它氨基酸或刪除而得到的氨基酸序列的步驟。[2]如[1]所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟⑴中，確定出選自于以下氨基酸中的一個或兩個以上的氨基酸即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。[3]如[1]所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟⑴中，確定相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的82位氨基酸的氨基酸。[4]如[1]所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中，確定選自以下氨基酸中的一個或兩個以上的氨基酸相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸。[5]如[1]所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中，確定相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的84位氨基酸的氨基酸。[6]如[1] [5]中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，步驟(1)中氨基酸的確定， 是通過比較所述變異對象酶的氨基酸序列與序列號2表示的氨基酸序列、以及/或者比較所述變異對象酶的立體構(gòu)造與由序列號2表示的氨基酸序列構(gòu)成的酶的立體構(gòu)造來進(jìn)行的。[7]如[1] [6]中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，將步驟⑴中確定的氨基酸取代為電荷狀態(tài)不同的氨基酸。[8]如[1] [7]中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是野生型酶。[9]如[1] [8]中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是微生物來源的蛋白質(zhì)脫酰胺酶。[10]如[9]所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是金黃桿菌屬來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。[11]如[9]所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是解朊金黃桿菌 (Chryseobacterium proteolyticum)來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。[12]如[1] [11]中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶的氨基酸序列與序列號2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性。[13]變異型酶的設(shè)計法，包括以下步驟(1)進(jìn)行蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的前體(pro-enzyme)的結(jié)構(gòu)分析，確定與底物特異性或氧化穩(wěn)定性相關(guān)的一個或兩個以上的氨基酸的步驟；(2)構(gòu)建基于變異對象酶的氨基酸序列，將步驟(1)中確定的氨基酸取代為其它氨基酸、或刪除而得到的氨基酸序列的步驟。[14]變異型酶的制備法，包括以下步驟(1)準(zhǔn)備編碼通過[1] [13]中任一項所述的設(shè)計法構(gòu)建的氨基酸序列的核酸的步驟；(2)使所述核酸表達(dá)的步驟；和(3)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。[15] 一種變異型酶，由在蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，將下組氨基酸取代為其它氨基酸或刪除而得到的氨基酸序列構(gòu)成即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸被取代為其它氨基酸或被刪除而得到的氨基酸序列。[16]如[15]所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是選自于下組中的一個或二個以上的氨基酸即相當(dāng)于由序列號2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。[17]如[15]所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的82位氨基酸的氨基酸。[18]如[15]所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是選自于下組中的一個或二個以上的氨基酸即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸和相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸。[19]如[15]所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的84位氨基酸的氨基酸。[20]如[15] [19]中任一項所述的變異型酶，所述變異對象酶是野生型酶。[21]如[15] [20]中任一項所述的變異型酶，所述變異對象酶是微生物來源的蛋白質(zhì)脫酰胺酶。[22]如[21]所述的變異型酶，所述變異對象酶是金黃桿菌屬來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。[23]如[21]所述的變異型酶，所述變異對象酶是解朊金黃桿菌 (Chryseobacterium proteolyticum)來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。[24]如[15] [23]中任一項所述的變異型酶，所述變異對象酶氨基酸序列與序列號2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性。
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[25]如[16]、[17]、[20] [23]中任一項所述的變異型酶，其對底物蛋白質(zhì)的作用性與所述變異對象酶相比發(fā)生變化。[26]如[18] [23]中任一項所述的變異型酶，其對過氧化氫的穩(wěn)定性高于所述變異對象酶。[27]編碼[15] [26]中任一項所述的變異型酶的基因。[28]含有[27]所述的基因的重組DNA。[29]具有[28]所述的重組DNA的微生物。


[圖1]將Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體(濃線)和前體(淡線)的α碳重合而成的圖。[圖2]以絲帶模型表示Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的高級結(jié)構(gòu)的圖。分別用螺旋狀和箭頭狀表示α-螺旋和β-折疊。[圖3]對Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體中活性中心Cys42附近和底物結(jié)合區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)大的圖。[圖4]對被認(rèn)為是對Chryseobacteriumproteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體中的活性中心有影響的氨基酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)大的圖。
具體實施例方式1.變異型酶的設(shè)計法本發(fā)明的第1方面提供基于對蛋白質(zhì)脫酰胺化的酶的變異型酶的設(shè)計法。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計法，可以得到在作用性和/或穩(wěn)定性這一點上，與變異前的酶不同的酶。換言之，本發(fā)明的設(shè)計法被用作用于使酶的作用性或穩(wěn)定性發(fā)生變化的方法。具體地說，例如， 為了使蛋白質(zhì)脫酰胺酶對于各個蛋白質(zhì)底物的活性和/或底物特異性發(fā)生變化，可以利用本發(fā)明的設(shè)計法。更具體的是，例如，為了提高蛋白質(zhì)脫酰胺酶的穩(wěn)定性，可以利用本發(fā)明的設(shè)計法。如果可以使對于各蛋白質(zhì)底物的特異性發(fā)生變化，就能夠期待即使對迄今為止反應(yīng)性低的蛋白質(zhì)也可以以更少量的酶進(jìn)行脫酰胺化，即使用量減少。此外，如果賦予不同的底物特異性，就可以應(yīng)用于新的用途。另一方面，如果能夠提高氧化穩(wěn)定性，就可以帶來在酶的使用時或輸送、保存的過程中，使用容易性提高等效果。蛋白質(zhì)脫酰胺酶之一的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶作用于蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基，轉(zhuǎn)化為谷氨酸。利用這種性質(zhì)，可以適用于提高蛋白質(zhì)功能性(溶解性、乳化特性、泡末特性、凝膠化特性等)、提高小麥麩質(zhì)的生面團(tuán)的伸展性、降低小麥變應(yīng)原誘發(fā)性，提高從農(nóng)產(chǎn)物中提取蛋白質(zhì)的提取效率、提高蛋白質(zhì)溶液中的鈣溶解性等各種用途，這是一種產(chǎn)業(yè)利用性高的酶。如果可以改變對于底物中的酰胺基的反應(yīng)性，例如，可以謀求通用性的提高、酶使用量(添加量)的降低等，與此同時還可以實現(xiàn)該酶在新領(lǐng)域的應(yīng)用。本說明書中“作用性”，在沒有特別說明時，作為包括如下特性的術(shù)語來使用與水解蛋白質(zhì)或肽中的谷氨酰胺或天冬酰胺的酰胺基，分別轉(zhuǎn)化成谷氨酸殘基、天冬氨酸殘基， 游離氨的作用相關(guān)的特性?！白饔眯浴笨梢园匆韵路绞?，在使用蛋白質(zhì)或肽作為底物的試驗系統(tǒng)中，測定底物濃度、反應(yīng)溫度等一定條件下的游離氨量，通過相對活性進(jìn)行評價。
(1)在176mM的磷酸緩沖液(pH6. 0)中以1 %濃度溶解或分散蛋白質(zhì)或肽，在37°C 下使蛋白質(zhì)脫酰胺酶反應(yīng)。(2) 一定時間后，用Ammonia Test Wako (和光社)定量反應(yīng)液中游離的氨的濃度， 測定單位時間、單位酶的氨增加量。而且，可以通過比較通過使用蛋白質(zhì)或肽作為底物的試驗系統(tǒng)求出的Km值、Kcat 值等，來評價“作用性”。本說明書中“氧化穩(wěn)定性”，沒有特別說明時，指的是，與氧化物存在下的上述作用性(即，水解蛋白質(zhì)或肽中的谷氨酰胺或天冬酰胺的酰胺基，分別轉(zhuǎn)化為谷氨酸殘基、天冬氨酸殘基，游離氨的活性)相關(guān)的穩(wěn)定性。氧化穩(wěn)定性可以用例如以下方法求出。(1)在含有0. 45 0. 9%的過氧化氫的176mM的磷酸緩沖液(pH6. 0)中溶解一定濃度的底物(例如IOmM Cbz-Gln-Gly)，37°C下使蛋白質(zhì)脫酰胺酶反應(yīng)。(2) —定時間后用Ammonia Test Wako定量反應(yīng)液中游離的氨濃度，測定氨增加量。以不存在過氧化氫下的氨增加量作為100%，來表達(dá)過氧化氫存在下的氨增加量。本發(fā)明的變異型酶的設(shè)計法大致包括二個步驟，即確定變異的氨基酸的步驟(步驟(1))，和構(gòu)建確定的氨基酸發(fā)生變異的氨基酸序列的步驟(步驟O))。以下，說明各步驟的詳細(xì)內(nèi)容。而且，本說明書中，在設(shè)計變異型酶時成為基礎(chǔ)的酶(要實施變異的酶)稱為“變異對象酶”。步驟(1)步驟(1)中，在蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，確定要實施變異的一個或二個以上氨基酸(以下，也稱為“變異對象氨基酸”)。本發(fā)明中的變異對象氨基酸，是在蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，選自以下組即相當(dāng)于序列號2 所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104 位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于 117位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。而且,這些變異對象氨基酸是,分析Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶相關(guān)的成熟體(由序列號2的氨基酸序列構(gòu)成)和前體(由序列號4的氨基酸序列構(gòu)成)的立體結(jié)構(gòu)，其結(jié)果提示與底物的識別有關(guān)的氨基酸、和/或已經(jīng)明確了對活性中心的氨基酸和位于其附近的活性中心的氨基酸有影響的氨基酸。如果使這些氨基酸發(fā)生變異，可以期待酶的作用性(尤其是底物特異性)和/或氧化穩(wěn)定性發(fā)生變化。這里，本說明書中使用氨基酸殘基時的用語“相當(dāng)于”，是指所比較的蛋白質(zhì)(酶) 之間對其功能發(fā)揮作出同等貢獻(xiàn)的情況，特別是指對底物特異性的貢獻(xiàn)是同等的。例如， 在考慮一級結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)的部分相同性的同時，排列比較對象的氨基酸序列和基準(zhǔn)的氨基酸序列(也就是序列號2的氨基酸序列)以便能夠進(jìn)行最適比較時(此時可以根據(jù)需要導(dǎo)入空位，將比對最優(yōu)化)、可以將對應(yīng)于基準(zhǔn)氨基酸序列中的特定氨基酸的位置的氨基酸確定為“相當(dāng)?shù)陌被帷?。代替一級結(jié)構(gòu)之間的比較，或者在此之上還進(jìn)行立體構(gòu)造(三維構(gòu)造)之間的比較，由此也可以確定“相當(dāng)?shù)陌被帷薄Ｍㄟ^利用立體構(gòu)造信息，獲得可靠性高的比較結(jié)果。這種情況下，可以采用一邊比較多個酶的立體構(gòu)造的原子坐標(biāo)一邊進(jìn)行比對的方法。變異對象酶的立體構(gòu)造信息可以從例如ftOtein Data Bank(http:// www. pdb j. org/index_j. html)獲得。以下示出采用X射線結(jié)晶構(gòu)造分析來確定蛋白質(zhì)立體構(gòu)造的方法的一例。(1)將蛋白質(zhì)結(jié)晶。結(jié)晶在確定立體構(gòu)造上不可或缺，但是除此之外，作為蛋白質(zhì)的高純度純化法、高密度且穩(wěn)定的保存法，也在產(chǎn)業(yè)上具有有用性。此外，可以使結(jié)合有作為配位體的底物或其類似化合物的蛋白質(zhì)結(jié)晶。(2)對所制作的結(jié)晶照射X射線，收集衍射數(shù)據(jù)。而且，蛋白質(zhì)結(jié)晶因X射線照射受損而衍射能劣化的情況有很多。此時，將結(jié)晶驟然冷卻到-173°C左右，在此狀態(tài)下收集衍射數(shù)據(jù)的低溫測定技術(shù)最近得到了普及。而且，最終為了收集用于確定構(gòu)造的高分解能數(shù)據(jù)，利用輝度高的同步加速器輻射。(3)進(jìn)行結(jié)晶構(gòu)造分析時，除了衍射數(shù)據(jù)之外，還需要相位信息。對于目標(biāo)蛋白質(zhì)，類似蛋白質(zhì)的結(jié)晶構(gòu)造為未知時，無法采用分子置換法進(jìn)行構(gòu)造確定，必須采用重原子同型置換法來解決相位問題。重原子同型置換法是將汞、鉬等原子序號大的金屬原子導(dǎo)入到結(jié)晶中、并利用金屬原子序號大的X射線散射能對X射線衍射數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)來獲得相位信息的方法。所確定的相位可以通過使結(jié)晶中的溶劑區(qū)域的電子密度平滑化來改善。溶劑區(qū)域的水分子變動大因而幾乎觀測不到電子密度，因此通過使該區(qū)域的電子密度近似為0，可以接近真實的電子密度，進(jìn)而相位得到改善。此外，非對稱單元中含有多個分子時，通過將這些分子的電子密度平均化可進(jìn)一步大幅改善相位。在使用如此改善后的相位計算得到的電子密度圖中擬合蛋白質(zhì)模型。該過程是在電腦三維圖形圖像上使用MSI公司(美國)的 QUANTA等程序進(jìn)行的。其后，使用MSI公司的X-PLOR等程序進(jìn)行構(gòu)造精密化，來完成構(gòu)造分析。對于目標(biāo)蛋白質(zhì)，類似蛋白質(zhì)的結(jié)晶構(gòu)造為已知時，可以使用已知蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)、采用分子置換法來確定。分子置換和構(gòu)造精密化可以使用程序CNS_S0LVE ver. 11等進(jìn)行。本發(fā)明人等嘗試從Chryseobacterium proteolyticum9670株的培養(yǎng)液中純化的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體的結(jié)晶化、和從重組大腸桿菌中純化的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的結(jié)晶化，成功得到兩者的立體構(gòu)造。而且，把蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的立體構(gòu)造的原子坐標(biāo)示于說明書的最后。此外，分別把該蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體的氨基酸序列示于序列表序列號2，將編碼其的基因的堿基序列示于序列號1，將蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的氨基酸序列示于序列表的序列號4，將編碼其的基因的堿基序列示于序列號3。如后述的實施例所示，明確了 Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋
白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體分子呈62.306x62.306xl85.532A的六方晶系的P6522
形，前體分子呈56.644χ103.290χ132.510λ的斜方晶系的品形(參照下文公開
的表ι和表幻。而且，圖ι是將蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體(濃線)和前體(淡線)的α碳重合而成的圖，圖2是以絲帶模型表示蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的高級結(jié)構(gòu)的圖。α-螺旋和折疊分別用螺旋狀和箭頭狀表示。圖3是將前體中活性中心Cys42附近和底物結(jié)合區(qū)域擴(kuò)大的圖，圖4是將被認(rèn)為對活性中心有影響的氨基酸區(qū)域擴(kuò)大的圖。以改變底物特異性作為目的時，優(yōu)選，變異對象氨基酸選自以下氨基酸構(gòu)成的組 相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、 相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、 相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、 相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。這些變異對象氨基酸是對Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，其結(jié)果提示與底物特異性相關(guān)的氨基酸，包括配置在裂隙(cleft)周邊的表面上的，和配置在活性中心的氨基酸附近的。我們預(yù)計上述氨基酸中82位的酪氨酸殘基配置在緊貼在活性中心的半胱氨酸 G2位)的前(pro)區(qū)域的氨基酸(Ala-(minus) 67位等)的附近，位于活性口袋入口，與底物形成氫鍵，因此我們認(rèn)為其在底物的識別中起重要的作用。于是，制作了將該氨基酸取代為其它氨基酸的變異體，研究其性質(zhì)，結(jié)果確認(rèn)了該氨基酸起著與底物特異性相關(guān)的重要作用(參照實施例的欄)。因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，相當(dāng)于該氨基酸(82位氨基酸)的氨基酸作為變異對象氨基酸。另一方面，在以提高氧化穩(wěn)定性作為目的時，優(yōu)選變異對象氨基酸選自由以下氨基酸組成的組相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105 位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸。這些變異對象氨基酸是對Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體和前體的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，分析結(jié)果提示與氧化穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸，包括與催化劑殘基(Cys42、HiS83、ASpl03)的相互作用或結(jié)構(gòu)保持相關(guān)的氨基酸。 由于上述氨基酸中的84位氨基酸,在與Chryseobacteriumproteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶相關(guān)的立體結(jié)構(gòu)分析中，配置于對活性中心的半胱氨酸(42位) 附近的半胱氨酸的硫醇基的解離狀態(tài)有影響的位置，由此預(yù)測其起到與活性中心半胱氨酸被氧化的容易度相關(guān)的重要作用。于是，制作將該氨基酸取代為其它的氨基酸的變異體，研究其性質(zhì)，結(jié)果確認(rèn)該氨基酸起著與氧化穩(wěn)定性相關(guān)的重要作用(參照實施例的欄)。因此，在本發(fā)明的更優(yōu)選方式中，相當(dāng)于該氨基酸(84位氨基酸)的氨基酸成為變異對象氨基酸。 本發(fā)明中變異對象酶的種類和來源等只要是水解蛋白質(zhì)中的酰胺基的酶即可，沒有特別限定。作為變異對象酶的例子，可以列舉小麥、菜豆、南瓜種子中已經(jīng)報告的對蛋白質(zhì)中的谷氨酰胺殘基進(jìn)行脫酰胺的酶、哺乳動物、魚或放線菌等微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)
12移酶、細(xì)菌(環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans))的肽谷氨酰胺酶等。優(yōu)選微生物來源的蛋白質(zhì)脫酰胺酶，更優(yōu)選Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶成為變異對象酶。優(yōu)選由對序列號2表示的氨基酸序列具有高同源性的氨基酸序列構(gòu)成的酶作為變異對象酶。作為其理由，可舉出能夠期待實現(xiàn)有效的改良，以及確定變異對象氨基酸變得容易。具體地說，優(yōu)選將與序列號2表示的氨基酸序列具有70%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的酶作為變異對象酶。其中，一般來說，同源性越高越好。例如將由具有80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)而更優(yōu)選95%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的酶作為變異對象酶。其中，兩個氨基酸序列的同源性(％ )例如可以按照以下方法確定。首先，以能夠進(jìn)行最佳比較地并列兩個序列(例如，可以在第一序列中導(dǎo)入空位后將與第二序列的比對最優(yōu)化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸殘基)，與第二序列的相應(yīng)位置的分子相同時，即稱該位置的分子是相同的。兩個序列的同源性是在這兩個序列中共同的同一位置的數(shù)目的函數(shù)(即、同源性(％)=同一位置的數(shù)目/位置的總數(shù)X100)，優(yōu)選也將比對的最優(yōu)化所需要的空位數(shù)目和大小考慮在內(nèi)。兩個序列的比較和同源性的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來實現(xiàn)。作為可以用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的具體例，有在 Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-68 中記載的、在 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-77 中改變的算法，但并不限于此。這樣的算法被整合到Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10中記載的NBLAST程序和XBLAST程序O. 0版本)中。為了得到與某氨基酸序列相同的氨基酸序列，例如，用XBLAST程序、設(shè)為score = 50、wordlength = 3來進(jìn)行BLAST多肽檢索即可。為了得到用于比較的空位比對，可以利用Altschul等人(1997)Amino Acids Research 25(17) :3389-3402 中記載的 Gapped BLAST。利用 BLAST 和 Gapped BLAST 時， 可以使用相應(yīng)的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。詳細(xì)地說，請參照http// www. ncbi. nlm. nih. gov。作為能夠用于序列比較的其他數(shù)學(xué)算法的例子，有Myers和 Miller (1988)Comput Appl Biosci. 4 :11-17中記載的算法。這樣的算法被整合到例如可以在GENESTREAM網(wǎng)站服務(wù)器(IGH Montpellier、法國)或ISREC服務(wù)器中利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比較中使用ALIGN程序時，例如，可以使用PAM120殘基質(zhì)量表，設(shè)為空位長度罰分=12、空位罰分=4?？梢允褂肎CG軟件包的GAP程序、使用Blossom 62基質(zhì)或PAM250基質(zhì)，設(shè)為空位權(quán)重=12、10、8、6、或4、空位長度權(quán)重=2、3、或4來確定兩個氨基酸序列的同源性。此外， 可以使用GCG軟件包(可以利用http://www. gcg. com)的GAP程序，設(shè)為空位權(quán)重=50、空位長度權(quán)重=3來確定兩個核酸序列的相同度。變異對象酶是典型的野生型酶(在自然中發(fā)現(xiàn)的酶)。然而，也可以將已經(jīng)發(fā)生某種變異或施以改變后的酶作為變異對象酶。如此本發(fā)明可以用于進(jìn)一步提高酶的特性。步驟O)步驟⑵中，構(gòu)建以變異對象酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)、將在步驟⑴中確定的氨基酸取代成其他氨基酸或刪除而得的氨基酸序列。取代后的氨基酸的種類沒有特別限定。因此，可以是保守性氨基酸取代，也可以是非保守性氨基酸取代。其中，所謂“保守性氨基酸取代”是指將某氨基酸殘基取代成具有同樣性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈被分類為堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、 非電荷極性側(cè)鏈(例如門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、 β分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)這樣的幾個家族。保守性氨基酸取代優(yōu)選是在同一家族內(nèi)的氨基酸殘基之間的取代。 在一個優(yōu)選方式中，將確定的氨基酸取代為電荷狀態(tài)不同的氨基酸。如果通過這種取代，可以期待性質(zhì)有大幅改變。2.變異型酶的制備法本發(fā)明的第2方面涉及變異型酶的制備法。本發(fā)明的制備法包括以下步驟。(1)準(zhǔn)備編碼通過本發(fā)明的設(shè)計法構(gòu)建的氨基酸序列的核酸的步驟；(2) 使所述核酸表達(dá)的步驟，和(3)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。在步驟(1)中，基于采用本發(fā)明的設(shè)計法構(gòu)建的氨基酸序列，對編碼變異對象酶的基因施加必要的變異(即、取代或刪除作為表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的在特定位置的氨基酸)， 得到編碼變異型酶的核酸(基因)。用于取代特異位置的堿基序列的方法在該技術(shù)領(lǐng)域中已知有很多(例如、參照分子克隆，第3版，冷泉港實驗室出版，紐約)，可以從中選擇適當(dāng)?shù)姆椒▉硎褂?。作為特異位置的變異?dǎo)入法，可以采用特異位置的氨基酸飽和變異法。特異位置的氨基酸飽和變異法是以蛋白的立體構(gòu)造為基礎(chǔ)，推定與所需功能相關(guān)的位置，導(dǎo)入氨基酸飽和變異的"kmi-rational，semi-random"方法(J. Mol. Biol. 331, 585-592 (2003)) 例如，可以使用 Quick change (Stratagene 公司)等的試劑盒、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988))來導(dǎo)入特異位置的氨基酸飽和變異。在PCR 中使用的DNA聚合酶可以使用Taq聚合酶等。但是優(yōu)選使用K0D_PLUS_(東洋紡社)、Pfu turbo (Stratagene公司)等的精度高的DNA聚合酶。另一方面，通過在酶基因中插入隨機(jī)的變異，選擇與各變異體(改變體)的表達(dá)產(chǎn)物的底物特異性相比具有較好底物特異性的基因，也可以制作編碼變異型酶的基因。導(dǎo)入這樣的隨機(jī)變異時，首先利用例如易錯PCR在標(biāo)的基因區(qū)域中隨機(jī)地導(dǎo)入變異，構(gòu)建變異型酶基因文庫。接著，從所得的文庫以酶活性或底物特異性為指標(biāo)選出克隆。在步驟⑵中，使步驟⑴中準(zhǔn)備的基因表達(dá)。接著在后續(xù)的步驟(3)中回收作為表達(dá)產(chǎn)物的變異型酶。通常利用適當(dāng)?shù)乃拗?載體系進(jìn)行基因表達(dá) 回收表達(dá)產(chǎn)物(變異型酶)，也可以利用無細(xì)胞合成系來進(jìn)行。并且，關(guān)于利用宿主-載體系的變異型酶的制備法的詳細(xì)情況，引用后述(4.編碼變異型酶的核酸等欄)相應(yīng)的記載。其中，所謂“無細(xì)胞合成系(無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系、無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系)”是指，不使用活細(xì)胞，而是使用源于活細(xì)胞的(或者采用基因工程方法得到的)核糖體、轉(zhuǎn)錄-翻譯因子等，在體外從作為模板的核酸(DNA、mRNA)來合成其所編碼的mRNA、蛋白質(zhì)。在無細(xì)胞合成系中一般使用根據(jù)需要將細(xì)胞粉碎液純化而得到的細(xì)胞提取液。細(xì)胞提取液一般含有蛋白質(zhì)合成所必需的核糖體、啟動因子等各種因子、tRNA等各種酶。進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成時，在該細(xì)胞提取液中添加各種氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白質(zhì)合成所必需的其他物質(zhì)。自然，蛋白質(zhì)合成時也可以根據(jù)需要補(bǔ)充另外準(zhǔn)備的核糖體、各種因子、以及/或者各種酶等。還報道了再構(gòu)成蛋白質(zhì)合成所必需的各分子(因子)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系的開發(fā)(Shimizu, Y. et al. =Nature Biotech.，19，751-755，2001)。在該合成系中，由大腸桿菌基因組將由構(gòu)成細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成系的3種啟動因子、3種伸長因子、與終結(jié)相關(guān)的4種因子、使各氨基酸與tRNA結(jié)合的20種氨酰tRNA合成酶、以及甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)甲?；附M成的31種因子的基因擴(kuò)增，使用它們在體外再構(gòu)成蛋白質(zhì)合成系。在本發(fā)明中可以利用這樣的再構(gòu)成的合成系。用語“無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系”能夠與無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系、體外翻譯系或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系交換使用。在體外翻譯系中，使用RNA作為模板來合成蛋白質(zhì)。作為模板RNA使用全RNA、mRNA、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等。在另一方的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系中，使用DNA作為模板。模板DNA優(yōu)選應(yīng)包含核糖體結(jié)合區(qū)域，且含有適當(dāng)?shù)慕K止序列。而且，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系中，設(shè)定添加有各反應(yīng)所必需的因子的條件，使得轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及翻譯反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。3.變異型酶根據(jù)以上的制備法，可以得到對蛋白質(zhì)、肽的作用性發(fā)生變化的變異型酶、或氧化穩(wěn)定性發(fā)生了變化的變異型酶。因此，本發(fā)明提供作為另一個方面的變異型酶。優(yōu)選的一個方式的變異型酶，提高了對變異對象酶難以作用的蛋白質(zhì)的作用性。而且，優(yōu)選的其它方式的變異型酶與變異對象酶相比，其在過氧化氫存在下的穩(wěn)定性也提高了。本發(fā)明的變異型酶由水解蛋白質(zhì)的酰胺基的酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，選自以下氨基酸中的一或二個以上的氨基酸被取代為其它氨基酸或被刪除的氨基酸構(gòu)成即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。優(yōu)選的是，在以改變底物特異性作為目的時，取代或刪除的氨基酸選自下組中的一或二個氨基酸即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。另一方面，在以提高氧化穩(wěn)定性作為目的時，取代或刪除的氨基酸選自下組中的一或二個氨基酸即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸。更優(yōu)選的是，取代或刪除的氨基酸是相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的82位和/或84位氨基酸的氨基酸。變異對象酶的種類或來源等，也與上述第一方面的情況一樣，省略重復(fù)的說明。而且，變異對象酶的具體例子是由序列號2所示的氨基酸序列構(gòu)成的酶(ChryseobacteriumproteolytiCum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶)、專利文獻(xiàn)1中示出氨基酸序列的酶(粘金黃桿菌(Chryseobacterium gleum) JCMMlO株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶)、專利文獻(xiàn)3中示出氨基酸序列的酶(茂原鏈輪絲菌(Str印tomycesmobaraensis)S-8112株來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)等。本發(fā)明的變異型酶的特征在于，在變異前的酶(即變異對象酶)的氨基酸序列中在特定位置具有變異(取代或刪除氨基酸)的氨基酸序列，但也可以在該變異的位置以外進(jìn)行部分氨基酸變異或改變。這樣，本發(fā)明也可提供如下的蛋白質(zhì)，即，雖然與具有施以上述變異的氨基酸序列的變異型酶相比時其功能同等，但是氨基酸序列在局部不同的蛋白質(zhì)(以下、也稱為“同源蛋白質(zhì)”)。所謂“氨基酸序列在局部不同”是指，典型地說，通過構(gòu)成氨基酸序列的1個 數(shù)個氨基酸缺失、取代、或1 數(shù)個氨基酸添加、插入、或它們的組合，氨基酸序列產(chǎn)生變異(變化)。其中，氨基酸序列的不同在與蛋白質(zhì)的酰胺基的水解相關(guān)特性不大幅降低的限度下(優(yōu)選基本上保持的限度)是容許的。只要滿足該條件，氨基酸序列不同的位置就沒有特別限定，還可以在多個位置產(chǎn)生不同。其中，所謂“多個”是指例如相當(dāng)于小于全部氨基酸約30%的數(shù)目，優(yōu)選相當(dāng)于小于約20%的數(shù)目，更優(yōu)選相當(dāng)于小于約10%的數(shù)目，進(jìn)一步優(yōu)選相當(dāng)于小于約5%的數(shù)目，最優(yōu)選相當(dāng)于小于約1 %的數(shù)目。即同源蛋白質(zhì)與上述變異型酶的氨基酸序列中的任一個具有例如約70%以上、優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選約90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選約95%以上、最優(yōu)選約99%以上的同源性。變異型酶可以用于需要蛋白質(zhì)的酰胺基的水解的任意的用途。例如，在蛋白質(zhì)的功能性(溶解性、乳化特性、泡沫特性、凝膠化特性等)的提高、小麥麩質(zhì)的生面團(tuán)的伸展性的提高、小麥變應(yīng)原誘發(fā)性的降低、從農(nóng)產(chǎn)物中提取蛋白質(zhì)的提取效率的提高、蛋白質(zhì)溶液中的鈣溶解性的提高等方面可以利用變異型酶。變異型酶的使用量可以適當(dāng)設(shè)定成目的效果能夠得到發(fā)揮。而且，如果用保存穩(wěn)定性提高了的變異型酶，在酶使用時或輸送、保存過程中，能帶來使用容易性提高等效果。4.編碼變異型酶的核酸等本發(fā)明進(jìn)一步提供與本發(fā)明的變異型酶相關(guān)的核酸。即，提供可以作為用于鑒定編碼變異型酶的基因、編碼變異型酶的核酸的探針而使用的核酸，可以作為用于將編碼變異型酶的核酸擴(kuò)增或使其突變等的引物而使用的核酸。編碼變異型酶的基因，典型地說，用于制備變異型酶。根據(jù)使用編碼變異型酶的基因的基因工程調(diào)制法，可以得到更均質(zhì)狀態(tài)的變異型酶。此外，該方法可以說是適于制備大量變異型酶的方法。而且，編碼變異型酶的基因的用途并不限于制備變異型酶。例如，也可以利用該核酸作為用于闡明變異型酶作用機(jī)理等的實驗用工具、或者作為用于設(shè)計或制作酶的進(jìn)一步變異體的工具。在本說明書中，所謂“編碼變異型酶的基因”是指使之表達(dá)時得到該變異型酶的核酸，具有對應(yīng)于該變異型酶的氨基酸序列的堿基序列的核酸自不必說，還包括在這樣的核酸中添加有不編碼氨基酸序列的序列而成的核酸。此外，還考慮密碼的簡并。
本發(fā)明的核酸通過參考本說明書或附上的序列表所公開的序列信息，使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程方法、分子生物學(xué)方法、生化學(xué)方法等，可以制成分離的狀態(tài)。在本發(fā)明的其他方式中，提供如下的核酸，S卩，雖然與編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列比較時其所編碼的蛋白質(zhì)功能同等，但是堿基序列在局部不同的核酸(以下、也稱為“同源核酸”。此外，將規(guī)定同源核酸的堿基序列也稱為“同源堿基序列”)。作為阿源核酸的例子，可以列舉以編碼本發(fā)明的變異型酶的核酸的堿基序列為基準(zhǔn)，由包含1個或多個堿基取代、缺失、插入、添加、或倒位的堿基序列構(gòu)成，而且編碼具有水解蛋白質(zhì)的酰胺基的活性的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的取代、缺失等可以在多個部位發(fā)生。其中，“多個”是指根據(jù)該核酸所編碼的蛋白質(zhì)的立體構(gòu)造中的氨基酸殘基的位置、種類的不同而不同，例如是2 40堿基、優(yōu)選2 20堿基、更優(yōu)選2 10堿基。如以上那樣的同源核酸可以通過例如限制性內(nèi)切酶處理、采用核酸外切酶或DNA連接酶等的處理、定點突變導(dǎo)入法(分子克隆，第3版，13章，冷泉港實驗室出版，紐約)或隨機(jī)突變導(dǎo)入法(分子克隆，第3版，13章，冷泉港實驗室出版，紐約)來導(dǎo)入變異等而得到。此外，通過紫外線照射等其他方法也可以得到同源核酸。本發(fā)明的另外的方式涉及具有與編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸。本發(fā)明的的另外的方式是提供對于編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列、或者對于與之互補(bǔ)的堿基序列具有至少約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99. 9 %的相同堿基序列的核酸。本發(fā)明的另外的方式涉及具有與編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列或與該同源堿基序列互補(bǔ)的堿基序列在嚴(yán)緊條件下雜交的堿基序列的核酸。其中，所謂“嚴(yán)緊條件”是指形成所謂的特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件。這樣的嚴(yán)緊條件可以參照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的例如分子克隆(第3版，冷泉港實驗室出版，紐約)或Currentprotocols in molecular biology (由 Frederick Μ· Ausubel 等人編輯·，1987)進(jìn)行設(shè)定。作為嚴(yán)緊條件，可以列舉例如使用雜交液(50%甲酰胺、10XSSC(0. 15M NaCl,15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7· 0)、5XDenhardt溶液、SDS、10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))在約42°C 約50°C下溫育，然后使用0. IX SSC,0. 1% SDS在約65°C 約70°C下進(jìn)行清洗的條件。作為更優(yōu)選的嚴(yán)緊條件，可以列舉例如使用 50% 甲酰胺、5XSSC(0. 15MNaCl, 15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7. 0)、1 XDenhardt 溶液、1 % SDS、10%硫酸葡聚糖、10μ g/ml變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))作為雜交液的條件。本發(fā)明的另外的方式是提供具有編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列、或者與之互補(bǔ)的堿基序列的一部分的核酸(核酸片段)。這樣的核酸片段可以用于對具有編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列的核酸等進(jìn)行檢測、鑒定、以及/或者擴(kuò)增等。核酸片段設(shè)計為例如至少含有與在編碼本發(fā)明的變異型酶的基因的堿基序列中連續(xù)的核苷酸部分(例如約10 約100堿基長、優(yōu)選約20 約100堿基長、更優(yōu)選約30 約100堿基長)雜交的部分。用作探針時可以對核酸片段進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記可以使用例如熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素。本發(fā)明的另外的方面涉及含有本發(fā)明的基因(編碼變異型酶的基因)的重組DNA。本發(fā)明的重組DNA例如以載體的形態(tài)提供。在本說明書中用語“載體”是指可以將插入其中的核酸輸送到細(xì)胞等靶內(nèi)的核酸性分子。根據(jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達(dá))，還考慮宿主細(xì)胞的種類來選擇適當(dāng)?shù)妮d體。作為以大腸桿菌為宿主的載體，可以例示M13噬菌體或其變異體、λ噬菌體或其變異體、PBR322或其變異體(pB325、pAT153、pUC8等)等，作為以酵母為宿主的載體，可以例示pYepSecUpMFa, pYES2等，作為以昆蟲細(xì)胞為宿主的載體，可以例示pAc、pVL等，作為以哺乳類細(xì)胞為宿主的載體，可以例示pCDM8、pMT2PC等。本發(fā)明的載體優(yōu)選為表達(dá)載體。所謂“表達(dá)載體”是指可以將插入于其中的核酸導(dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)、且在該細(xì)胞內(nèi)能夠使之表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常含有所插入的核酸表達(dá)所必需的啟動子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。還可以使用含有選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。在使用所述表達(dá)載體時，可以利用選擇標(biāo)記確認(rèn)表達(dá)載體是否導(dǎo)入(及其程度)。本發(fā)明的核酸向載體插入、選擇標(biāo)記基因的插入(必要時)、啟動子的插入(必要時)等，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(例如，可參照分子克隆，第3版，1.84，冷泉港實驗室出版，紐約，使用限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶的公知方法)進(jìn)行。作為宿主細(xì)胞，從操作容易度的觀點出發(fā)，優(yōu)選使用大腸桿菌(大腸埃希菌)等細(xì)菌細(xì)胞，但只要是能夠復(fù)制重組DNA且變異型酶的基因能夠表達(dá)的宿主細(xì)胞，就可以利用。作為優(yōu)選的宿主的代表例，利用T7系啟動子時可以列舉大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS，不是這種情況時可以列舉大腸埃希菌JM109。本發(fā)明的另外的方面涉及具有本發(fā)明的重組DNA的微生物(即轉(zhuǎn)化體)。本發(fā)明的微生物可以通過使用了上述本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化來得到。例如，可以通過氯化鈣法(J. Mol. Biol.、第 53 卷、第 159 頁(1970)) ,Hanahan 法((J. Mol. Biol.、第 166 卷、第 557頁(1983))、SEM 法(Gene、第 96 卷、第 23 頁(1990))、Chung 等人的方法(Proc. Natl. Acad.Sci. USA、第 86 卷、第 2172 頁(1989))、磷酸鈣共沉淀法、電穿孔(Potter, H. et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81, 7161-7165 (1984)) > Lipofection (Feigner, P. L. et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84，7413-7417 (1984))等來實施。本發(fā)明的微生物可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的變異型酶。即，本發(fā)明的另外的方面是提供通過使用上述微生物來生產(chǎn)本發(fā)明的變異型酶的方法。本發(fā)明的生產(chǎn)方法至少包括在產(chǎn)生本發(fā)明的變異型酶的條件下培養(yǎng)上述微生物的步驟。通常除了該步驟之外，還實施將所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)回收(分離及純化)的步驟。本發(fā)明所述微生物(轉(zhuǎn)化體)的培養(yǎng)根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行即可。作為培養(yǎng)基中使用的碳源，只要是能夠同化的碳化合物即可，可使用例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糖蜜、丙酮酸等。此外，作為氮源只要是能夠利用的氮化合物即可，例如可使用胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕堿提取物等。除此之外，根據(jù)需要使用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等的鹽類、特定的氨基酸、特定的維生素等。另一方面，培養(yǎng)溫度可以設(shè)定在30°C 40°C的范圍內(nèi)(優(yōu)選37°C附近)。培養(yǎng)時間可以考慮培養(yǎng)對象的轉(zhuǎn)化體的生育特性、變異型酶的產(chǎn)生特性等來進(jìn)行設(shè)定。培養(yǎng)基的PH在轉(zhuǎn)化體生育且產(chǎn)生酶的范圍內(nèi)調(diào)整。優(yōu)選將培養(yǎng)基的pH設(shè)為6. O 9. O左右(優(yōu)選ρΗ7· O 附近)。盡管還可以將含有生產(chǎn)變異型酶的菌體的培養(yǎng)液直接、或經(jīng)濃縮、除去雜質(zhì)等后作為酶溶液使用，但一般姑且從培養(yǎng)液或菌體中回收變異型酶。所產(chǎn)生的變異型酶只要是分泌型蛋白質(zhì)就可以從培養(yǎng)液回收，如果是此外的情況可以從菌體內(nèi)回收。從培養(yǎng)液回收時，例如可以通過將培養(yǎng)上清液過濾、進(jìn)行離心處理除去不溶物后，進(jìn)行減壓濃縮、膜濃縮，利用硫酸銨或硫酸鈉的鹽析，利用甲醇、乙醇或丙酮等的分級沉淀法、透析、加熱處理、等電點處理、凝膠過濾或吸附色譜法、離子交換色譜法、親和性色譜法等各種色譜法(例如、S印hadex凝膠(Pha rmacia Biotech)等的凝膠過濾、DEAE SepharoseCL-6B (Pharmacia Biotech)> Octyl SepharoseCL-6B(Pharmacia Biotech)> CM SepharoseCL-6B(PharmaciaBiotech))等組合，進(jìn)行分離、純化來得到變異型酶的純化品。另一方面，從菌體內(nèi)回收時，通過將培養(yǎng)液過濾、進(jìn)行離心處理等來獲取菌體，接著通過加壓處理、超聲波處理等機(jī)械方法或采用溶菌酶等的酶的方法將菌體破壞后，與上述同樣地進(jìn)行分離、純化，可以得到變異型酶的純化品。還可以將如上所述得到的純化酶通過例如凍干、真空干燥或噴干等形成粉末后提供。此時，可以將純化酶預(yù)先溶解于磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液或GOOD緩沖液中?？梢詢?yōu)選使用磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液。應(yīng)說明的是，作為其中的GOOD緩沖液，可以列舉PIPES、MES或MOPS。以下通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。實施例1.蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體的X線結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析(1)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體的制備Chryseobacterium proteolyticum9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶成熟體是按已經(jīng) 艮道的(Yamaguchi, S.，Jeens D. J. Mrcher, D. B. (2001) Protein-glutaminase fromChryseobacteriumproteoIyticum, an enzyme that deamidates glutaminyl residuesinproteins. Purification，c haracterization and gene cloning. Eur. J. Biochem. ,268,1410-1421)方法制備的。(2)結(jié)晶化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體的結(jié)晶化按以下程序進(jìn)行。首先，使用HamptonResearch公司的M孔板，通過沉滴(sitting drop)蒸氣擴(kuò)散法進(jìn)行篩選。20°C下靜置，數(shù)日后，觀察到三個孔中的結(jié)晶。這其中，采用最好的條件，使用懸滴(hanging drop)蒸氣擴(kuò)散法，用由5 μ 1的酶液(40mg/ml)和5 μ 1的貯存溶液(1. OM磷酸銨0. IM檸檬酸鈉ρΗ5. 6)構(gòu)成的10μ 1的懸滴，得到良好的結(jié)晶。在X線分析之前用含有30%甘油的貯存溶液處理后，用液氮(_173°C )驟冷。(3) X 線分析X射線衍射數(shù)據(jù)在液氮溫度下使用Sft~ing-8(兵庫縣)的同步加速器-放射線BL-38B1收集，使用HKI2000程序加工。收集1.15 A分解能的X射線衍射數(shù)據(jù)，確定結(jié)晶學(xué)
參數(shù)。空間組為 P6522、晶格常數(shù)為 a=62.306A、b=62.306A、c=185.582A。(4)三維構(gòu)造的確定三維構(gòu)造通過如下確定在2mM Na[AuCl4]中浸漬5分鐘，導(dǎo)入金原子，通過利用該反常散射確定位相的重原子同型置換法，在分解能進(jìn)行確定。位相確定中使用SEHLXD，SHELXC程序，使用WinCoot建模，結(jié)構(gòu)精密化使用Refmac5，SHELXL。數(shù)據(jù)收集和精密化的統(tǒng)計值數(shù)據(jù)示于表1。[表1]
結(jié)晶蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的成熟體 (Au重原子置換)蛋白質(zhì)谷氨醜胺酶的成熟體〈數(shù)椐測定>空間組P65 2 2P6s 2 2晶格常數(shù)(A，°)62.455, 62.455, 185.84162.306，62.306, 185.532α=90β=90γ=120α=90 β=90 γ= 120波長(Λ)1.000.90分解能(A)50-2.32(2.36-2,32)50-1.15 (1.19-1.15)測定反射1303801008233獨特反射1753676489Rmerge0.043 (0.058)0.058 (0.385)數(shù)據(jù)完整度(％)99.5 (95.6)99.8 (99.8)裝置SPring-8 BL38B1SPring-8 BL38B1檢測器JUPITER 210 CCDR-Axis V結(jié)構(gòu)確定重原子同型置換法〈結(jié)構(gòu)精密化〉分解能(A)10-1.15使用反射72390Rcryst / Rfree0.0979/0.1359r. m. s. d 鍵0.030Ar. m. s. d 角0.032A殘渣/水/ Na+/_甘油185/448/1/12.蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的X線結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析(1)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體在大腸桿菌中的表達(dá)質(zhì)粒的制備按以下方式通過PCR擴(kuò)增編碼Chryseobacteriumproteolytic· 9670株來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的基因(GenBank AccesionNo. AB046594) ο 以通過Sambrook等人的方法(Molecular Cloning :a laboratory manual,第二版，冷泉港實驗室出版，1989)分離的Chryseobacterium proteolyticum9670株的染色體DNA作為PCR的模板，合成序列號5和序列號6的寡核苷酸，作為引物。PCR反應(yīng)使用KOD 7 ^ ν ^ r Λ (東洋紡)，進(jìn)行 94°C /2 分鐘、94°C /15 秒 _70°C /30 秒 _68°C /70 秒的循環(huán)30次。將所得到的PCR片段用限制性內(nèi)切酶NdeI及B10I處理后，連接用相同的兩種酶切斷而得到的質(zhì)粒PET20 (b) (Novagen公司)，得到表達(dá)質(zhì)粒pETPGl。通過確定堿基序列確認(rèn)所得到的PCR片段正確地編碼蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體。序列號55，-CGTGCCATATGGATTCCAACGGGAATCAGG-3，(下劃線為限制性內(nèi)切酶NdeI識別位點)序列號65，-CTCGCTCGAGAAATCCACAGCTGGATACAT-3，(下劃線為限制性內(nèi)切酶BioI識別位點)(2)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體在大腸桿菌中的表達(dá)將上述的表達(dá)質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司)中。將得到的轉(zhuǎn)化體接種到含有100 μ /ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基800ml X 2，在37°C振蕩。在600nm的濁度到達(dá)0. 6 0. 8的時刻添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使得最終濃度為0. 5mM，進(jìn)而在18°C培養(yǎng)15小時。采用離心分離從培養(yǎng)液中收集菌體，懸浮于緩沖液OOmM磷酸鈉(pH6. 3)、0. 5MNaCl、IOmM咪唑)。(3)重組蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的純化將在O)中得到的懸浮液在冰水中進(jìn)行20分鐘、200 μ A的超音波處理后，供給14000rpm、4°C、30分的離心分離，得到粗提取液。將其供給給Ni-NTA親合層析^jiagen公司)，用20mM磷酸鈉/300mM咪唑(pH7. 0)洗脫。將獲得的洗脫蛋白質(zhì)提供給TALON親合層析(Clontech公司)，同樣用20mM磷酸鈉/300mM咪唑pH7. 0洗脫，獲得了蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體。用0. IM磷酸鈉(pH 6. 1)，對該純化物進(jìn)行緩沖液交換，并濃縮至27. 5mg/ml左右ο(4)結(jié)晶化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶前體的結(jié)晶化按以下程序進(jìn)行。首先，使用Hampton Research公司的PEG/Ion Screen，通過使用兩塊M孔板的沉滴蒸氣擴(kuò)散法進(jìn)行篩選。20°C下靜置，數(shù)日后，觀察到22個孔中的結(jié)晶。這其中，最好的結(jié)晶用由2μ 1的酶液(27mg/ml)和2μ 1的貯存溶液(20% PEG3350，0. 2Μ檸檬酸銨ρΗ5. 1)構(gòu)成的4 μ 1沉滴獲得。在X線分析之前用含有20%甲基戊二醇的貯存溶液處理后，用液氮(_173°C )驟冷。(5)X線分析X射線衍射數(shù)據(jù)在液氮溫度下使用Sft~ing-8(兵庫縣)的同步加速
器-放射線BL-38B1收集，使用HKL2000程序加工。收集1.73入分解能的X射線衍射數(shù)據(jù)，確定結(jié)晶學(xué)參數(shù)。空間組為P2A&、晶格常數(shù)為
a=56.644A、b=103.290A、c=132.510A。(6)三維構(gòu)造確定三維構(gòu)造使用先前分析的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶原子坐標(biāo)，通過分子置換法，在分解能A確定。位相確定中使用Phaser，使用WinCoot建模，結(jié)構(gòu)精密化中使用RefmaC5。數(shù)據(jù)收集和精密化的統(tǒng)計值數(shù)據(jù)示于表2。[表 2]
權(quán)利要求
1.變異型酶的設(shè)計法，包含以下步驟(1)蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，確定從以下氨基酸組成的組中選擇的一個或兩個以上的氨基酸的步驟相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166 位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸；(2)構(gòu)建基于變異對象酶的氨基酸序列，將在步驟(1)確定的氨基酸取代為其它氨基酸或刪除而得到的氨基酸序列的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中，確定從以下氨基酸組成的組中選擇的一個或兩個以上的氨基酸相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中，確定相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的82位氨基酸的氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中，確定從以下氨基酸組成的組中選擇的一個或兩個以上的氨基酸相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中，確定相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的84位氨基酸的氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，在步驟(1)中氨基酸的確定，是通過比較所述變異對象酶的氨基酸序列與序列號2表示的氨基酸序列、以及/或者比較所述變異對象酶的立體構(gòu)造與由序列號2表示的氨基酸序列構(gòu)成的酶的立體構(gòu)造來進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，將步驟(1)中確定的氨基酸取代為電荷狀態(tài)不同的氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是野生型酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是微生物來源的蛋白質(zhì)脫酰胺酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是金黃桿菌屬來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶是解朊金黃桿菌來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求1 11中任一項所述的變異型酶的設(shè)計法，所述變異對象酶的氨基酸序列與序列號2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性。
13.變異型酶的設(shè)計法，包括以下步驟(1)進(jìn)行蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的前體的結(jié)構(gòu)分析，確定與底物特異性或氧化穩(wěn)定性相關(guān)的一個或兩個以上的氨基酸的步驟；(2)構(gòu)建基于變異對象酶的氨基酸序列，將步驟(1)中確定的氨基酸取代為其它氨基酸、或刪除而得到的氨基酸序列的步驟。
14.變異型酶的制備法，包括以下步驟(1)準(zhǔn)備編碼通過權(quán)利要求1 13中任一項所述的設(shè)計法構(gòu)建的氨基酸序列的核酸的步驟；(2)使所述核酸表達(dá)的步驟；和(3)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
15.一種變異型酶，由在蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，將下組氨基酸取代為其它氨基酸或刪除而得到的氨基酸序列構(gòu)成即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、 相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是選自于下組中的一個或二個以上的氨基酸即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的39位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于79位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于142位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于143位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于146位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于166位氨基酸的氨基酸和相當(dāng)于185位氨基酸的氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的82位氨基酸的氨基酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是選自于下組中的一個或二個以上的氨基酸即相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于38位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于40位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于41位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于42位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于43位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于45位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于46位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于49位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于80位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于81位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于82位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于83位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于84位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于103位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于104位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于105位氨基酸的氨基酸、相當(dāng)于106位氨基酸的氨基酸、和相當(dāng)于117位氨基酸的氨基酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的變異型酶，被取代或刪除的氨基酸是相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的84位氨基酸的氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求15 19中任一項所述的變異型酶，所述變異對象酶是野生型酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求15 20中任一項所述的變異型酶，所述變異對象酶是微生物來源的蛋白質(zhì)脫酰胺酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的變異型酶，所述變異對象酶是金黃桿菌屬來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的變異型酶，所述變異對象酶是解朊金黃桿菌來源的蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求15 23中任一項所述的變異型酶，所述變異對象酶的氨基酸序列與序列號2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性。
25.根據(jù)權(quán)利要求16、17、20 23中任一項所述的變異型酶，其對底物蛋白質(zhì)的作用性與所述變異對象酶相比發(fā)生變化。
26.根據(jù)權(quán)利要求18 23中任一項所述的變異型酶，其對過氧化氫的穩(wěn)定性高于所述變異對象酶。
27.編碼權(quán)利要求15 沈中任一項所述的變異型酶的基因。
28.含有權(quán)利要求27所述的基因的重組DNA。
29.具有權(quán)利要求28所述的重組DNA的微生物。
全文摘要
課題在于提供改良對蛋白質(zhì)進(jìn)行脫酰胺化的酶的新方法。根據(jù)以下步驟設(shè)計變異型酶；(1)確定蛋白質(zhì)脫酰胺酶(變異對象酶)的氨基酸序列中，相當(dāng)于序列號2所示的氨基酸序列的35位、38位、39位、40位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、79位、80位、81位、82位、83位、84位、103位、104位、105位、106位、117位、142位、143位、146位、166位、185位氨基酸的氨基酸中的一個或二個以上的氨基酸的步驟；(2)構(gòu)建基于變異對象酶的氨基酸序列，將步驟(1)取代的氨基酸取代為其它的氨基酸、或削除的氨基酸序列的步驟。
文檔編號C12N5/10GK102597232SQ20098013486
公開日2012年7月18日 申請日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者三上文三, 山口莊太郎, 松原寬敬, 松永亞希子, 橋爪亮太 申請人:天野酶株式會社