專利名稱：藻青素二肽的生物技術(shù)制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過用CGP酶降解聚合物制劑從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物制劑酶 法制備二肽組合物的方法，特別適于所述方法的CGP酶，以及藻青素(CGP)或CGP樣聚合物 或其片段、尤其是通過如上所定義的方法獲得的二肽組合物作為藥物組合物、藥物或作為 食品或飼料替代品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
已知天然存在三種不同的聚(氨基酸)聚(ε-L-賴氨酸)(ε-PL)、聚(γ-谷 氨酸)(Y-PGA)和藻青素(CGP)。聚(氨基酸)存在于許多環(huán)境中，并且為生產(chǎn)性生物體 實(shí)現(xiàn)不同的功能(Obst, Μ.等，Biomacromolecules5 :1166-1176(2004))。例如，藻青素 (多-L-精氨酰-聚-[L-天冬氨酸])，作為藻青素顆粒性多肽(CGP)被熟知，在100多年 前在藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)(Borzi, A.，Malpighia 1 :28-74 (1887))，其為該生物體提供氮、碳和能 量。它在每個(gè)結(jié)構(gòu)單元中含有5個(gè)氮原子并且因此形成理想的細(xì)胞內(nèi)氮儲(chǔ)庫(Mackerras， Α. H.等，J. Gen. Microbiol. 136 :2057-2065 (1990))。聚(氨基酸)的生物相容性和徹底的 生物可降解性使它們成為生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)、個(gè)人護(hù)理和藥學(xué)領(lǐng)域中人類生活的許 多應(yīng)用的理想候選物(0bst，M.等，Biomacromolecules 5 :1166-1176 (2004)) 包括藍(lán)綠藻螺旋藻(Spirulina)的藍(lán)細(xì)菌的幾個(gè)種已經(jīng)被制成為人和動(dòng)物 的營(yíng)養(yǎng)來源(Kihlberg，R.，A. Rev. Microbiol. 26 :427-466 (1972))。CGP 本身于 1887 年在藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。藍(lán)細(xì)菌的大多數(shù)屬帶有功能性藻青素合成酶基因(cphA)并合成 CGP (Mackerras, A. H.等，J. Gen. Microbiol. 136 :2057-2065 (1990))。編碼 CphA 的基 因也在異氧細(xì)菌中被鑒定(Krehenbrink, M.等，Arch. Microbiol. 177 :371-380(2002)； Fuser，G.等，Macromol. Biosci. 7 =278-296 (2007)) 支化聚合物作為不溶的細(xì)胞內(nèi)無膜 顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中(Allen, Μ. Μ.等，J. Bacteriol. 154 1480-1484(1983))。其由等摩 爾量的精氨酸和天冬氨酸以聚(天冬氨酸)(PAA)主鏈形式排列組成，一部分精氨酸通過 其α -氨基與每個(gè)天冬氨酸的β -羧基連接(Simon，R. D.等，Biochim. Biophys. Acta420 165-176(1976))。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，藍(lán)細(xì)菌cphA基因異源地克隆進(jìn)大腸桿菌、谷氨酸棒 桿菌(Corynebacterium glutamicum)、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)禾口惡臭 假單胞菌(Pseudomonas putida) 0來自重組細(xì)菌的CGP含有很少的賴氨酸(Voss, I.等， Metabol.Eng. 8 :66-78(2006))o CGP廣泛地分布在不同的自然生活環(huán)境中，并且被細(xì)胞內(nèi) 或細(xì)胞外的CGP酶降解(分別為CphB、CphE)。具有CphE的細(xì)菌見于多個(gè)生活環(huán)境中； CphE15Jn CphEan分別從病鱔假單胞菌Bl (P. angulliseptica Bi)和巨大芽孢桿菌BAC19 (B. megaterium BAC19)分離和表征(Obst，M.等，J. Biol. Chem. 277 :25096-25105 (2002)； Obst，M.等，Biomacromolecules 5 153-161 (2004)) CGP 降解還發(fā)生在缺氧的生活環(huán)境 中，分別由諸如香港互營(yíng)單胞菌KI (Sedimentikicter hongkongensis KI)或產(chǎn)堿假單胞菌 DIPl (P. alcaligenes DIP1)的專性厭氧菌或兼性厭氧菌進(jìn)行(0bst，M.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 =3642-3652(2005) ；Sallam, Α.等，已投稿待發(fā)表(2008)) 所有已知的 CGP
4酶從CGP產(chǎn)生水溶性β-二肽，然后其被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中進(jìn)一步被分解代謝(Mllam，Α.等， 已投稿待發(fā)表Ο008))。蛋白消化和轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)生命是至關(guān)重要的。例如在反芻動(dòng)物中，飲食蛋白質(zhì)的主要 部分被瘤胃菌叢(rumen flora)降解成氨基酸和肽。氨基酸結(jié)合至微生物蛋白中或傳送 至消化道的下一部位或經(jīng)過瘤胃壁直接吸收至血液中(Faix，§.等，Acta Vet. Brno. 70 M3-M6(2001))。然而，三肽和二肽比游離氨基酸更有效地被利用，具有較高的營(yíng)養(yǎng) 價(jià)值，被更好地吸收(至多達(dá)游離氨基酸的185% ) (Adibi, S.A.，J.Clin. Invest. 50 2266-2275(1971))并且比完整蛋白保留更多的氮，從而促進(jìn)體重增長(zhǎng)的增加(Dock， D.B.等，Biocell 28 :143-150(2004)).在其某些氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳性受損的患者中的 吸收研究顯示，如果作為二肽施用則這些氨基酸的吸收正常。這表明存在二肽的專用 和有效的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(Adibi, S. A. , Gastroenterology 113:332-340(1997))。因此，水 解蛋白飲食經(jīng)常用作飼料補(bǔ)充劑以使?fàn)I養(yǎng)不良的病例痊愈(Dock，D. B.等，Biocell28 143-150(2004))ο半必需氨基酸精氨酸在細(xì)胞生理學(xué)中具有多個(gè)關(guān)鍵的作用，并且因此被應(yīng)用 于許多心血管、生殖泌尿、胃腸、或免疫疾病的治療方案中(其綜述參見(Appleton，J.， Al tern. Med. Rev. 7 512-522 (2002))。必需氨基酸賴氨酸已知作為用于人和動(dòng)物的食 品添加劑，具有抗單純皰疹病毒的活性，并且改善小腸中的鈣吸收，因此起對(duì)抗骨質(zhì)疏松 癥的作用(Cynober, L. A. , Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在臨床營(yíng)養(yǎng)中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRC Press LLC, Boca Raton, USA(2003) ) 0非必需氨基酸中的天冬氨酸充當(dāng)L-精氨酸的前體，用于能量 代謝(Voet, D.等，Biochemistry (生物化學(xué))·第三版，John Wiley and Sons Inc.，New ^rkQ004))，并且用于陽離子或其它氨基酸的藥物遞送(Cynober，L. Α.，Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在 床營(yíng)養(yǎng)中M基酸白勺 代謝和治療狀況)，第二版，CRC Press LLC, Boca Raton, USA(2003)) 由于二肽形式的氨 基酸具有較高的生物利用度，因此它們作為二肽的施用在臨床上得到批準(zhǔn)并可在市場(chǎng)上作 為產(chǎn)品獲得(Duruy,A.等，Vie. Med. Int. 9 :1589(1965) ；Duruy,A. ,Med. Int. 1 :203(1966)； Sellier, J. ， Rev. Med. Toulouse 5 :879(1979) ；De-Aloysio, D.等，Acta Eur. Ferti 1. 13 133-167(1982) ；Rohdewald, P.，Int.J.Clin. Pharmacol. Ther. 40 :158-168(2002) ；Lamm, S.等，Eur. Bull. Drug Res. 11 :29-37 (2003))。迄今，對(duì)于CGP本身還未知有直接的應(yīng)用。以前對(duì)CGP的研究受到CGP作為生 物可降解 PAA 的潛在來源的啟發(fā)(Mooibroek，H.等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 77 257-267(2007)) ο 后者具有許多潛在的應(yīng)用(Obst, M.等，Biomacromolecules 5 1166-1176(2004))，例如作為透析膜、人工皮膚和整形外科植入體中的成分或作為藥物載 體。PAA還可以替代非生物可降解的具有多種技術(shù)應(yīng)用的聚丙烯酸酯。這是關(guān)于哺乳動(dòng)物、 禽類和魚類腸道菌叢生物降解CGP，和隨之CGP和其二肽作為營(yíng)養(yǎng)和/或治療添加劑的潛在 應(yīng)用的最初研究。對(duì)哺乳動(dòng)物、禽類和魚類腸道菌叢的幾個(gè)樣品研究藻青素降解。所有樣品在37°C 中12 48h的孵育期內(nèi)實(shí)現(xiàn)了徹底的厭氧降解CGP。在所有樣品中發(fā)現(xiàn)了 CGP降解細(xì)菌， 并且其高度地集中在來自兔和綿羊的盲腸菌叢和來自鯉魚的消化道菌叢中?？傆?jì)62株未被污染的培養(yǎng)物被分離并且需氧地降解CGP，其中46株還在24h 7天的孵育期內(nèi)厭氧地 降解CGP。HPLC分析表明所有分離株菌將CGP降解成其組成性的二肽。8株通過16S rDNA 測(cè)序鑒定，并且隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevikicillus)、假單胞菌 屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)禾口小單孢菌屬(Micromonospora)。CGP 可以 見于三種不同的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)市售產(chǎn)品中，這些產(chǎn)品中含有0. 06 0. 15% (wt/wt)CGP。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)CGP可以在細(xì)胞外被降解，以及關(guān)于消化道中CGP生物可降 解性的最初證據(jù)，和隨后，CGP及其二肽在營(yíng)養(yǎng)和治療中作為精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和可 能其它的氨基酸的可高度生物利用的來源的潛在應(yīng)用。CGP在從指數(shù)生長(zhǎng)期至靜止生長(zhǎng)期的過渡期間在藍(lán)細(xì)菌中積累(Mackerras， Α. H.等，J. Gen. Microbiol. 136 :2057-2065 (1990) ；Sherman, D. Μ.等，J. Phycol. 36 932-941(2000))。藍(lán)細(xì)菌的大多數(shù)屬帶有功能性藻青素合成酶基因(cphA)并合 成 CGP(Simon, R. D. 1987. Inclusion bodies in the cyanobacteria :cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies (藍(lán)細(xì)菌中的包涵體藻青素、聚磷酸酯(鹽)、 多面體)，199-225 頁。見 P. Fay 禾口 C. van Baalen (編輯)，The cyanobacteria (藍(lán)細(xì) 菌),Elsevier, Amsterdam, The Netherlands ；Allen, Μ. Μ.等，Methods Enzymo1. 167 207-213 (1988) ；Mackerras, Α. H. J. Gen. Microbiol. 136 :2057-2065 (1990)； Liotenberg, S.等，Microbiology 142 :611-622 (1996) ；ffingard, L. L 等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :1772-1777 (2002))。cphA 基因還在異氧細(xì)菌中被鑒定(Krehenbrink， Μ. Arch. Microbiol. 177 :371-380 (2002) ；Ziegler, K. Naturforsch. 57c 522-529(2002))。聚合物作為無膜顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中并且在中性pH下以及生理學(xué)離 子強(qiáng)度中是不溶的(Allen, Μ. Μ.等，J. Bacteriol. 141 :687-693 (1980))。CGP 在限制條 件下積累，所述條件包括低溫、低光強(qiáng)度、磷或硫限制(St印han等，Z. Naturforsch. 55 927-942(2000))。在藍(lán)細(xì)菌中，聚合物鏈的分子質(zhì)量范圍為25 IOOkDa(Simon，R. D.， Biochim. Biophys. Acta 422 :407-418 (1976))，而來自重組菌株的聚合物鏈則顯示較低 的范圍(25 30kDa)和多分散性。此外，發(fā)現(xiàn)來自重組菌株的聚合物含有賴氨酸作為 另外的氨基酸組分(Ziegler, K.等，Eur. J. Biochem. 254 154-159 (1998) ；Aboulmagd, E.等，Biomacromolecules 2:1338-1342(2001))。CGP 的作用是臨時(shí)性的氮、能量和可 能的碳的儲(chǔ)庫(Li, H.等，Arch. Microbiol. 176 :9-18(2001) ；Elbahloul，Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767 (2005))。由于CGP在每個(gè)結(jié)構(gòu)單元中含有5個(gè)氮原 子，因此其滿足完善的細(xì)胞內(nèi)氮儲(chǔ)庫的標(biāo)準(zhǔn)(Simon，R. D. 1987. Inclusion bodies in the cyanobacteria :cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies ( i細(xì)胃中白勺^IlMiy[本 藻青素、聚磷酸酯(鹽)、多面體)，199-225頁。見P. Fay和C. van Baalen (編輯)，The cyanobacteria (藍(lán)細(xì)菌)，Elsevier, Amsterdam, The Netherlands)。CGP的細(xì)胞內(nèi)降解由在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)的高度特異性的藻青素酶(CphB)催化 并且經(jīng)α-裂解機(jī)制進(jìn)行，結(jié)果形成β- 二肽(Richter，R.等，Eur. J. Biochem. 263 163-169(1999))。CGP作為還用于不能夠積累CGP的細(xì)菌的有價(jià)值底物(Obst，M.等， Appl.Environ. Microbiol. 71 :3642-3652(2005) ；Sallam, Α.禾口 k. Steinbuchel. 2007a)。 從池塘沉積物中分離的一種新的嗜溫性蛋白水解細(xì)菌，硫酸鹽還原梭菌(Clostridium sulfatireducens sp. nov.)能夠還原硫代硫酸鹽、硫磺以及短暫地還原硫酸鹽，這些細(xì)
6菌中的許多顯示具有細(xì)胞外藻青素酶，該酶將CGP降解成其可利用的二肽，二肽可以被 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中并進(jìn)一步被利用(Sal lam，A.和 A. Steinbuchel. 2007b. Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株對(duì)藻青素的厭氧和需氧降解-混合細(xì)菌聚 生體中其它三種共分離物的作用)。已投稿待發(fā)表)。這些酶的幾種實(shí)例被分離和表征，諸 如來自革蘭氏陰性細(xì)菌病鱔假單胞菌O^seudomonas angullis印tica)Bl株的CphEpa。此細(xì) 胞外酶顯示類似于CphB的用于CGP降解的α -裂解機(jī)制(Obst, M.等，J. Biol. Chem. 277 25096-25105(2002))ο當(dāng)從巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)BAC19株中分離細(xì)胞外CphEail時(shí)發(fā)現(xiàn) 革蘭氏陽性細(xì)菌也分泌CGP酶(0bst，M.等，Biomacromolecules 5 153-161 (2004)),CphEpa 和CphEan均鑒定為絲氨酸型水解酶。最近的研究揭示了細(xì)胞外CGP降解也可由分別來自專 性以及兼性厭氧菌，諸如香港互營(yíng)單胞菌KI株(0bst，M.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 3642-3652(2005))和產(chǎn)堿假單胞菌 DIPl 株(Sallam, Α.和 A. Steinbuchel. 2007b. Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株對(duì)藻青素的厭氧和需 氧降解-混合細(xì)菌聚生體中其它三種共分離物的作用)。已投稿待發(fā)表)的CGP酶催 化。所有研究的CGP酶產(chǎn)生β -Asp-Arg 二肽作為裂解產(chǎn)物，然而，在CphEan時(shí)另外檢測(cè) 到(Asp-Arg)2 四肽(Obst，Μ.等，Biomacromolecules5 153-161 (2004)) 直到最近，已 知對(duì)于CGP本身或其二肽沒有實(shí)際的應(yīng)用。相反，對(duì)于聚(天冬氨酸)(PAA)已經(jīng)確立了 作為非生物可降解的聚丙烯酸酯的替代品的經(jīng)濟(jì)上重要的應(yīng)用，所述PAA是CGP的結(jié)構(gòu)元 件(聚合物主鏈)(Schwamborn, M.，Polym. Degrad. Stab. 59 :39-45 (1998))。PAA 還可以 用于許多領(lǐng)域包括造紙、涂料和油工業(yè)(其綜述見Joentgen，W.等人，2003. Polyaspartic acids (聚天冬氨酸)，175-199 頁，見；S. R. Fahnestock 和 A. Steinbuchel (編輯)， Biopolymers, vol 7. Wiley，Weinheim)。對(duì)于 PAA 也描述了 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Leopold， C. S.等，J. Pharmacokinet. Biopharm. 4 :397-406 (1995) ；Yokoyama, M.等，CancerRes. 6 1693-1700(1990))。僅在最近，出現(xiàn)對(duì)于CGP- 二肽和可能對(duì)于CGP本身的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用， 這些應(yīng)用首先取決于CGP降解細(xì)菌在大量研究的哺乳動(dòng)物、禽類和魚類群落中的令人驚奇 的廣泛分布，這表明CGP可能在各自的消化道中是可降解的。另一方面，如果以二肽或三肽 形式施用氨基酸的生物利用度提高是熟知的理論并且有效地應(yīng)用于一些治療領(lǐng)域中。因 此，CGP和/或其β - 二肽可以被認(rèn)為是不久將來的潛在的天然食品和/或治療用添加劑 (Sallam，A.禾口A.Steinbuchel. 2007c. Potential of cyanophycin and its β -dipeptides as possible additives in therapy, food and feed industries (藻青素禾口其 β - 二月太 作為治療、食品和飼料工業(yè)中的可能添加劑的潛力))。僅在最近幾年期間建立了對(duì)CGP的半工藝量生產(chǎn)和有效分離。應(yīng)用大腸桿菌、富 養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和鮑氏不 動(dòng)桿菌(Acinetobacter baylyi) ADPl 株，后者顯示約 46% 的最大 CGP 收率(wt/wt) (Obst, Μ.等，167-194 頁。見 J.M. Shively (編輯)，Inclusions in Prokaryotes (原核生物中的包涵體)，vol. 1. Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg(2006))。然而，要求的底物和培養(yǎng) 條件也是選擇經(jīng)濟(jì)適當(dāng)?shù)腃GP-生產(chǎn)源的決定性因素?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)純CGP- 二肽可以在經(jīng)濟(jì)的大規(guī)模工藝中制備，該工藝從含有CGP的生物 量開始并以純CGP-二肽結(jié)束。由于產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株可以顯示在簡(jiǎn)單生長(zhǎng)要求基礎(chǔ)上 的高酶生產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)此菌株對(duì)于這樣的工藝方法是理想的。藻青素在每個(gè)結(jié)構(gòu)單元中含有5個(gè)碳原子，并且因此確實(shí)達(dá)到了完善的動(dòng)態(tài) 細(xì)胞內(nèi)氮儲(chǔ)庫的標(biāo)準(zhǔn)((Simon, R. D. 1987. Inclusion bodies inthe cyanobacteria cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies (藍(lán)細(xì)菌中的包涵體藻青素、聚憐酸酉旨 (鹽)、多面體)，199-225 頁。見 P. Fay 禾口 C. van Baalen (編輯)，The cyanobacteria (藍(lán) 細(xì)菌)，Elsevier, Amsterdam, The Netherlands)；其量根據(jù)細(xì)胞的需要而波動(dòng)(Carr, N. G. 1988. Nitrogen reserves and dynamic reservoirs in cyanobacteria (藍(lán)細(xì)菌中 的氮儲(chǔ)庫和動(dòng)態(tài)儲(chǔ)庫)，13-21 頁。見 L. J. Rogers 和 J. R. Gallon(編輯)，Biochemistry of the algae and cyginob￡icteri￡i( 禾口 1^ ■白勺LUf )，Armual Proceedings of the Phytochemical Society of Europe，Clarendon，Oxford.)。當(dāng)?shù)鞍缀铣蓽p少 時(shí)聚合物在藍(lán)細(xì)菌積累，所述蛋白合成減少是從指數(shù)生長(zhǎng)期至靜止生長(zhǎng)期的過渡期間 天然引起的(Simon, R. D.，Arch. Microbiol. 92 115-122 (1973a))或是通過添加蛋白 生物合成的抑制劑(例如，氯霉素)導(dǎo)致的(Ingram, L. 0.等，Arch. Microbiol. 81 1-12(1972) ；Simon, R. D.，J. Bacteriol. 114 :1213-1216 (1973b))并且當(dāng)繼續(xù)平衡生長(zhǎng)時(shí) 該聚合物消失(Mackerras，Α. H.等，J. Gen. Microbiol. 136 :2057-2065 (1990))。CGP 積 累也受磷限制( 印han 等，Z. Naturforsch. 55 :927-942 Q000))、硫限制(Ariho，X.等， Arch. Microbiol. 163 :447-453 (1995))、低溫、低光強(qiáng)度或這些因素的組合(Obst, M.等， Biomacromolecules 5 :1166-1176(2004))促進(jìn)。不同的方法被開發(fā)用于確定和定量純化的CGP或其在細(xì)胞中的含量。通過 Sakagushi試劑在水解或在未水解的聚合物中以比色法定量CGP的精氨酸含量(Simon， R.D.，J. Bacteriol. 114 1213-1216 (1973b))。純化的藻青素的氨基酸組分可以通過HPLC 測(cè)定(Aboulmagd, E.等，Arch. Microbiol. 174 :297-306 (2000)) 對(duì)于藻青素的快速和靈 敏的測(cè)定，開發(fā)了基于1H核磁共振(NMR)的方法(Erickson, N. A.等，Biochim. Biophys. Acta. 1536 5-9(2001)) CGP降解(細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外)主要引起其可利用的二肽的釋放，然后這些二肽在細(xì) 胞內(nèi)裂解成其組成性的氨基酸以進(jìn)入細(xì)胞代謝中。藻青素的細(xì)胞內(nèi)降解由藻青素酶(CphB) 催化。Gupta，Μ.等，J. Gen. Microbiol. 125 :17-23(1981)描述了在柱胞魚腥藻(Anabaena cylindrica)的異形胞和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中的第一種藻青素酶。該酶是一種單體為四.4kDa、絲 氨酸型和藻青素特異性的外肽酶，其主要降解產(chǎn)物是經(jīng)α -裂解機(jī)制的天冬氨酸-精氨酸 二肽(Richter，R.等，Eur. J. Biochem. 263 163-169 (1999))。在近幾年中，分離了 能夠通 過細(xì)胞外藻青素酶(CphE)降解藻青素的需氧和厭氧細(xì)菌(Obst，Μ.等，J. Biol. Chem. 277 25096-25105(2002)) ；Obst, Μ.等，Biomacromolecules 5 :153-161(2004) ；Obst, M.等， Appl. Environ. Microbiol. 71 :3642-3652(2005) ；Sallam, Α.禾口 k. Steinbuchel. 2007b. Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strainDIPl—Role of other three co-isolates in the
8mixed bacterial consortium.(反硝化細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株對(duì)藻青素的厭氧和需 氧降解-混合細(xì)菌聚生體中其它三種共分離物的作用)已投稿待發(fā)表)。類似于CphB，以 前表征的分別來自病鱔假單胞菌O^seudomonas anguillis印tica)Bl株和巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)BAC19株的細(xì)胞外CGP酶；CphEh和CphEail被鑒定為絲氨酸型藻青 素特異性酶并且產(chǎn)生CGP-二肽作為降解產(chǎn)物，然而，在CphEail時(shí)另外檢測(cè)到(Asp-Arg)2四 肽。CphE15a的標(biāo)記研究顯示該酶在羧基末端處水解CGP并且從降解的聚合物鏈端連續(xù)地釋 放 β-Asp-Arg 二肽(其綜述參見 0bst，M.等，Biomacromolecules 5 1166-1176 (2004)) 此外，來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl的第三種細(xì)胞外藻青素酶(CphEal)最近以粗制形式應(yīng)用于 CGP-二肽的工藝生產(chǎn)中(Sal lam, A.，禾Π A. Steinbuchel. 2008b. Biotechnological process for the technical production of β—dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中 工藝生產(chǎn)β - 二肽的生物工藝方法)Under preparation.(準(zhǔn)備中))。僅在近幾年期間建立了半工藝量的CGP的生產(chǎn)和有效分離。成功了應(yīng)用了幾種 細(xì)菌菌株大腸桿菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌和鮑氏不動(dòng)桿菌(Obst，M.等，Biomacromolecules 5 :1166-1176(2004)).然而，CGP的生物工藝相關(guān)性在理論上基于其是聚(天冬氨酸)的 來源，后者在工業(yè)應(yīng)用中具有很高的潛力[例如，用于水處理；造紙和皮革工業(yè)，作為分散 劑(Roweton，S.等，J. Environ. Polym. Degrad. 5 :175-181 (1997) ；Mooibroek, H.等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 77 :257-267(2007))或作為用于聚丙烯酸酯的生物可降解替代品 (Schwamborn, M.，Polym. Degrad. Stab. 59 :39-45 (1998))。PAA 還具有潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng) 用作為透析膜、人工皮膚、整形外科植入體中的成分和作為藥物載體(Leopold，C. S.等， J.Pharmacokinet. Biopharm. 4 :397-406(1995))。如上所述，揭示了 CGP-二肽和可能CGP本身的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，這表明CGP在哺乳 動(dòng)物和魚類消化道內(nèi)可能是可降解的；這顯示在不久的將來該聚合物和其二肽作為天然食 品和/或治療用添加劑的可能性。因此，最近構(gòu)建了用于使用來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的 粗制CphEal從CGP生產(chǎn)二肽的大規(guī)模工藝。此初步工藝包括三個(gè)階段；階段I :CGP的大規(guī) 模提取和純化，階段II 粗制CphEal粉末的大規(guī)模生產(chǎn)，階段III 如上所述建立CGP至其 二肽的降解。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，該初步工藝的后兩個(gè)階段可以為未來的應(yīng)用被大大地優(yōu)化。此外， CphEal從粗制粉末中工藝純化，并且揭示了其生物化學(xué)特征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供(1) 一種從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物制劑中酶法制備二肽組合物的方法，所述 方法包括以CGP酶降解所述聚合物制劑；(2)上面(1)所述的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，其中所述CGP酶(i)其分子量為45kDa，最適溫度為50°C，且最適pH范圍為7 8. 5并且將CGP降 解為β -Asp-Arg ；和/或(ii)其是能夠?qū)GP或CGP樣聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作為DSM 21533保 藏的產(chǎn)堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突變體、衍生物或片段；(3)如上面(2)中所述的CGP酶；和(4) 一種組合物、藥物組合物、藥物、食品或飼料補(bǔ)充劑，其含有藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段；(5)藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段在制備用于營(yíng)養(yǎng)治療的藥物，或作為食 品或飼料補(bǔ)充劑中的應(yīng)用；(6) 一種用于需要營(yíng)養(yǎng)治療的患者的營(yíng)養(yǎng)治療的方法，所述方法包括向所述患者 施用合適量的含有藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段的組合物；(7)上面(4) (6)的優(yōu)選實(shí)施方式，其中所述組合物、藥物組合物、藥物、食品或 飼料補(bǔ)充劑含有通過酶法蛋白水解從CGP或CGP樣聚合物得到的二肽或二肽混合物，優(yōu)選 所述二肽混合物由β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸構(gòu)成和/或可由上面 ⑴或⑵所述的方法獲得。


圖1 基于16S rDNA序列的相鄰連接樹(Neighbour-joining tree)顯示以前 以及本研究期間分離的CGP降解細(xì)菌的評(píng)估親緣關(guān)系。粗體的菌株是本研究期間分離的 菌株。下劃線的菌株是以前用于CGP降解的研究的菌株(Obst，Μ.等，J. Biol. Chem. 277 25096-25105(2002) ；Obst, Μ.等，Biomacro-molecules 5 :153-161(2004) ；Obst, Μ.等， Appl. Environ. Microbiol. 71 :3642-3652(2005) ；Sallam，A.等，已投稿待發(fā)表(2_)。大 腸桿菌K12用作外類群。登錄號(hào)在括號(hào)中給出。步長(zhǎng)值顯示為100次重復(fù)的百分比。Bar: 2%序列趨異。圖2 由來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的細(xì)胞外CGP酶在CGP覆層瓊脂板上引起的降 解暈；CphE 降解階段(階段III)之前的粗制粉末，CphE R 降解階段后回收的粉末。圖3 產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株在不同底物上的生長(zhǎng)。培養(yǎng)在100ml帶有擋板的Klett 培養(yǎng)瓶中進(jìn)行；每個(gè)培養(yǎng)瓶含有10ml SM培養(yǎng)基和Ig Γ1的測(cè)試底物。試驗(yàn)進(jìn)行兩次，其接 種以在相同測(cè)試條件下生長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)物。在30°C中的24h孵育期后通過OD578nm的增加監(jiān)測(cè) 生長(zhǎng)。圖4:在不同濃度(1 10g/l)的粗制CphE的催化作用下完全降解不同濃度 (10 50g/l)的CGP需要的孵育時(shí)間。反應(yīng)試管在30°C中在轉(zhuǎn)速為3rpm的試管旋轉(zhuǎn)器中 孵育。最高測(cè)試濃度的CGP(50g/l)在2g/l粗制CphE粉末的存在下可以在IOh內(nèi)降解。圖5 產(chǎn)堿假單胞菌DIPl在Biostat D650攪拌釜式反應(yīng)器中的分批發(fā)酵，所述 反應(yīng)器含有具有g(shù)/Ι檸檬酸鈉的4201 SM培養(yǎng)基并接種以4% (vol/vol)預(yù)培養(yǎng)物。預(yù)培 養(yǎng)物培養(yǎng)在含有11相同培養(yǎng)基的21帶有擋板的培養(yǎng)瓶中并在30°C中孵育12h。Biostat D650反應(yīng)器中的發(fā)酵參數(shù)和培養(yǎng)條件為；pH為6. 9 7. 5，溫度為30°C，并以0. 2vvm通風(fēng)。 PO2設(shè)置為40%的最小值，并且通過攪拌自動(dòng)地調(diào)整，否則攪拌保持為lOOrpm。箭頭指示誘 導(dǎo)時(shí)間。*600nm處的光密度(OD600)， ) *pH，丄)· *攪拌器速度(rpm)，▲ )。*p02 飽和 度)，_)。* 通氣量(ImirT1)，·)。圖6 用于在產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的發(fā)酵上清液中收集、濃縮和脫鹽蛋白的連續(xù) 系統(tǒng)(階段II)。為了收集，CEPA Z41連續(xù)離心機(jī)用來分離細(xì)胞，上清液收集在中央的1001 槽中。為了濃縮，具有30kDa盒的錯(cuò)流裝置連接到中央槽；濃縮的滲余物重新泵入槽中，同 時(shí)直接棄去滲透物。調(diào)節(jié)錯(cuò)流的流速以保持槽中僅501。最后濃縮的51用5柱床體積的 H2O脫鹽，在-30°C中冷凍并凍干。
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圖7:用于制備的CGP-二肽的質(zhì)量控制的TLC板。I 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和在測(cè)試的過 濾系統(tǒng)后獲取的直接二肽樣品；1 :30kDa。-COP.錯(cuò)流盒(cross flow cassette)。2 濾膜 (IOkDa. -COP)。3 濾膜(5kDa. -COP)。4 濾膜(lkDa. -COP)。5 濾膜(0. 5kDa. -COP)。6 CGP- 二肽(錯(cuò)流和凍干后的最終裝料)。II 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和下列的水解樣品；a =CGP- 二肽 (錯(cuò)流和凍干后的最終裝料)。b =Asp-Arg 二肽。c =Asp-Lys 二肽。(b，c ；Sigma Aldrich， DeisenhofemDeutschland)。僅一個(gè)斑點(diǎn)指示所有直接樣品(I)而水解樣品顯示標(biāo)準(zhǔn)氨基 酸天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸的典型斑點(diǎn)(II)。圖8 大腸桿菌 DHl (pMa/c5-914 CphApcc6803)在 Biostat D650 攪拌釜式反應(yīng)器中 的分批發(fā)酵，所述反應(yīng)器含有具有IOOmg Γ1氨芐西林的4001 7% (vol/vol)protamylase 培養(yǎng)基。預(yù)培養(yǎng)物G%，vol/vol)在21培養(yǎng)瓶中制備，每個(gè)培養(yǎng)瓶含有11與發(fā)酵相同的培 養(yǎng)基并在30°C中孵育20h。Biostat D650反應(yīng)器中的發(fā)酵參數(shù)和培養(yǎng)條件為印!1為7.5，以 0. 17vvm通風(fēng)，p02恒定地保持在20%并且通過攪拌自動(dòng)地調(diào)節(jié)。發(fā)酵進(jìn)行15h，首先在30°C 中乩，然后在37°C中以誘導(dǎo)CGP-合成酶的表達(dá)。濁度(OD85tl) (4)^02(%飽和度)(▼)， 通風(fēng)(1/min) ( ▲)，攪拌(rpm) ( ·)，溫度(°C ) ( ■)。圖9 在Biostat D650反應(yīng)器中在 % (vol/vol) protamylasse培養(yǎng)基上發(fā)酵第 15h時(shí)大腸桿菌DHl (pMA/c5. 914: cphAPCC6803)細(xì)胞的相差顯微照片。CGP色素粒作為細(xì)胞 中的反光積聚物出現(xiàn)。BardOym。圖10 經(jīng)對(duì)CGP的特異性結(jié)合來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的CphEal的純化步驟的 SDS-PAGE0凝膠A 通過硝酸銀法染色的SDS-PAGE ；M 分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，C 粗制CphEal的對(duì) 照，SI 在將CGP和粗制CphEal混合在一起后即刻獲得的上清液樣品，S2 :6min結(jié)合時(shí)間后 的上清液樣品，S2' 10倍濃縮后的與SI相同的樣品，Wl，W2 兩次洗滌步驟后的上清液樣 品。凝膠B:使用如A中三倍體積的純化CphEal并用硝酸銀染色較長(zhǎng)時(shí)間的SDS-PAGE。除 了在45kDa處CphEal的條帶以外可以觀察到很少其它的低-濃縮蛋白條帶。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的方面(1)的方法中，二肽組合物可以由單個(gè)二肽或二肽混合物構(gòu)成。 然而優(yōu)選所述二肽含有選自天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和存在于CGP樣聚合物的其它氨基 酸殘基的氨基酸殘基。特別優(yōu)選的是所述二肽選自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨 酸-賴氨酸。根據(jù)本發(fā)明的“CGP”和“CGP樣聚合物”是主要由一個(gè)或多個(gè)二肽單元構(gòu)成的肽結(jié) 構(gòu)，優(yōu)選所述二肽單元由下列氨基酸殘基的兩種構(gòu)成天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、 瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸等。本領(lǐng)域中已知的大量CGP酶可以用于CGP降解(參見表2和4)。然而，優(yōu)選CGP 酶是來自產(chǎn)堿假單胞菌的CGP酶，特別優(yōu)選來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株。根據(jù)本發(fā)明的方面 ⑵，CGP酶(i)其具有45kDa的分子量，最適溫度為50°C，且最適pH范圍為7 8. 5并且 將CGP降解為β -Asp-Arg ；和/或(ii)其是能夠?qū)GP或CGP樣聚合物裂解成二肽的已 在DSMZ作為DSM 21533保藏的產(chǎn)堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突變體、衍生物或 片段。上述天然CGP酶的突變體、衍生物或片段包括片段(具有至少50個(gè)天然序列的連續(xù) 氨基酸殘基，優(yōu)選N-和/或C-末端截短產(chǎn)物，其中至多50，至多30，或至多10個(gè)末端氨基酸殘基被去除)，衍生物(特別是具有功能蛋白和肽諸如分泌肽、前導(dǎo)序列等的融合產(chǎn)物， 和具有化學(xué)結(jié)構(gòu)部分諸如PEG、醇類、胺類等的反應(yīng)產(chǎn)物)和突變體(特別是添加、置換、倒 位和/或缺失的變異體，基于氨基酸與天然酶具有至少80%、優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少 95%序列同一性，或其中1 20，優(yōu)選1 10個(gè)連續(xù)或分離的氨基酸被添加、置換、倒位和 缺失；對(duì)于置換突變體，特別優(yōu)選保守置換)，然而，條件是所述修飾的CGP酶具有天然CGP 酶的酶活性。本發(fā)明的方面(1)和( 所述的方法可以進(jìn)一步包括通過培養(yǎng)原核或真核生物生 產(chǎn)細(xì)胞系來制備CGP或CGP樣聚合物制劑。所述生產(chǎn)細(xì)胞系可以是能夠產(chǎn)生CGP或CGP樣 聚合物的任何細(xì)胞系。優(yōu)選所述生產(chǎn)細(xì)胞系選自大腸桿菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baylyi)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、惡臭假單胞菌(I^eudomonas putida)、酵母菌株和植物生物質(zhì)。特別優(yōu)選的 生產(chǎn)細(xì)胞系是富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16-PHB-4- Δ eda (pBBRlMCS-2 cphA6308/edaH16)和大腸 桿菌 DHl (pMa/c5-914: cphAPCC6803)。上述方法可以進(jìn)一步包括分離、純化和/或化學(xué)修飾通過培養(yǎng)所述生產(chǎn)細(xì)胞系獲 得的所述CGP產(chǎn)物的步驟。這樣的分離、純化和化學(xué)修飾分離可以通過本領(lǐng)域中充分確立 的方法來實(shí)現(xiàn)。然而對(duì)于方面(1)和( 所述的方法優(yōu)選通過培養(yǎng)所述生產(chǎn)細(xì)胞系獲得的CGP產(chǎn) 物直接用所述CGP酶進(jìn)行降解，即，無需分離或純化。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，方面(1)和( 所述的方法進(jìn)一步包括純化或分離降解 產(chǎn)物和/或化學(xué)修飾降解產(chǎn)物。同樣，這樣的純化、分離或化學(xué)修飾可以通過本領(lǐng)域中充分 確立的方法來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方面(3)涉及一種CGP酶，(i)其分子量為45kDa，最適溫度為50°C，且最適pH范圍為7 8. 5并且將CGP降 解為β -Asp-Arg ；和/或(ii)其是能夠?qū)GP或CGP樣聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作為DSM 21533保 藏的產(chǎn)堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突變體、衍生物或片段。對(duì)于突變體、衍生物 和片段，其指上面給出的定義。根據(jù)本發(fā)明的方面(4)、(5)和(6)的藥物組合物、藥物、食品或飼料補(bǔ)充劑可以進(jìn) 一步含有藥學(xué)或飲食可接受的合適載體、粘合劑等。它們可以進(jìn)一步含有用于各種藥用目 的的其它活性化合物。該藥物組合物特別適合于營(yíng)養(yǎng)治療。營(yíng)養(yǎng)治療的類型當(dāng)然取決于組 合物/藥物內(nèi)存在的氨基酸，如下所述將變得顯而易見近年來在病危患者的營(yíng)養(yǎng)治療中的進(jìn)展更好地揭示了某些氨基酸對(duì)在疾病過 程中維持組織蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)的必要性(Witte, M. B.和Barbul A.，Wound Rep. Reg. 11 419-423(2003))。以前，氨基酸被分類為非必需氨基酸(非必要的)或必需氨基酸(必要 的)。然而，隨著對(duì)涉及氨基酸的體內(nèi)生理學(xué)的更好理解，提出了可替代的分類法，該分類 將某些氨基酸的必要性重新定義為是有條件地非必要的(Laidlaw，S. Α.和Kopple，J. D.， Am. J. Clin. Nutr. 46 :593-605 (1987))。這使得這些氨基酸單獨(dú)作為完備的營(yíng)養(yǎng)方案或作為 營(yíng)養(yǎng)方案的一部分以改善營(yíng)養(yǎng)結(jié)局、免疫應(yīng)答、和組織痊愈的應(yīng)用變得有吸引力。在下面的 章節(jié)中，討論關(guān)于構(gòu)成CGP的這三種氨基酸的生理學(xué)和作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)。這些氨基酸為非必需的L-天冬氨酸、半必需的L-精氨酸和必需氨基酸L-賴氨酸。由于精氨酸具有大量的 生理效應(yīng)，對(duì)精氨酸給予了特別的關(guān)注。L-天冬氨酸非必需的L-天冬氨酸的分子質(zhì)量為133. lOg/mol，并且是二羧基氨 基酸。大多數(shù)L-天冬氨酸可以在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，而在體液和在植物中也發(fā)現(xiàn)小量的其游離 形式(Barrett, G. C.禾口 Elmore D.T.Amino Acids and Peptides.(氛基酸禾口月太)Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998) ) L-天冬氨酸是天然生物聚合物CGP和合成甜 味劑阿斯巴甜(Aspartame)的組成成分。天冬氨酸在水中微溶，并且其鹽形式水溶性較 高。飲食的天冬氨酸從小腸通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)被吸收以進(jìn)入門靜脈循環(huán)，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在 此其許多被代謝為蛋白、嘌呤類、嘧啶類物質(zhì)(Barrett, G. C.和Elmore D.T.Amino Acids andPeptides (氨基酸禾口肽)· Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998))。L_ 天 冬氨酸還可以充當(dāng)檸檬酸循環(huán)中的能量來源，并且因此被認(rèn)為有效地對(duì)抗疲勞(還參見下 面=Asp-Arg)。天冬氨酸用于陽離子如Mg2+、K+、Ca2+、Si2+，或其它氨基酸的藥物遞送中以增 力口其生物利用度(Cynober,L. A. ,Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在臨床營(yíng)養(yǎng)中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRC Press LLC, Boca Raton，USA(2003))。L-精氨酸L-精氨酸是分子質(zhì)量為174. 2g/mol的強(qiáng)堿性氨基酸并且見于大多數(shù) 蛋白中。其每分子含有4個(gè)氮原子，并且因此是人和動(dòng)物中氮豐度最高的載體(Appleton， J.，Altern. Med. Rev. 7 :512-522 (2002)) 精氨酸對(duì)于魚類必不可少的(Ahmed, I.和 Khan, Μ. Α.，Aquacult. Nutr. 10 :217-225 (2004))，而在哺乳動(dòng)物中，由于其可以經(jīng)營(yíng)養(yǎng)攝取或經(jīng) 重新合成(內(nèi)源性的)來補(bǔ)償，其被認(rèn)為是半必需的。在腎臟中，大多數(shù)內(nèi)源性精氨酸來源 于瓜氨酸，后者是腸道或肝臟中谷氨酰胺代謝的副產(chǎn)物。然而，由于精氨酸生物合成不能 增加以補(bǔ)償耗竭或供應(yīng)不足，因此飲食攝取(對(duì)人平均為大約5 6g/天，ffitte, M. B.和 Barbul. A.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423(2003))仍然是血漿精氨酸水平的基本決定因素。 約50%攝入的精氨酸在小腸中直接利用，而剩余的釋放至門靜脈循環(huán)中。通常，攝入的精氨 酸的約一半主要通過精氨酸酶迅速地轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸(Modolell，Μ.等，Eur. J. Immunol. 25 1101-1104(1995) ；ffitte, Μ. B.和 Barbul. Α.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423 (2003))。鳥 氨酸，依次地，可被代謝為谷氨酸和脯氨酸，或通過酶鳥氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)變?yōu)榫郯?Boutard， V.等，J. Immunol. 155 :2077-2084 (1995))。剩余的精氨酸被四種其它酶之一加工一氧化 氮合成酶(以變?yōu)橐谎趸?，精氨酸甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(以變成肌氨酸)，精氨酸脫羧 酶(以變成胍丁胺)，或精氨酰-tRNA合成酶(以變成精氨酰-tRNA，一種蛋白合成的前體) (Vodovotz, Y.等，J. Exp. Med. 178 :605-613 (1993))。精氨酸對(duì)人和動(dòng)物的內(nèi)分泌功能具有顯著的效應(yīng)，特別是對(duì)腎上腺和垂體分泌 功能。然而，關(guān)于精氨酸發(fā)揮這些效應(yīng)的確切機(jī)制了解很少。精氨酸是一氧化氮(NO) 的生物前體，一氧化氮是參與心血管系統(tǒng)中多種內(nèi)皮依賴性生理效應(yīng)的內(nèi)源性信使分子 (ffitte, Μ. B.禾口 Barbul. Α.，Wound R印.Reg. 11 :419-423 (2003))。因此，精氨酸的許多臨 床作用被認(rèn)為是通過其對(duì)內(nèi)皮源性舒張因子的作用來介導(dǎo)的。NO-合成酶具有兩種變異體 (Rohdewald，P.和Ferrari V.，專利申請(qǐng)US2004137081 (2004))；具有其亞型的組成型變異 體(cNOS) ；eNOS(在血管內(nèi)皮細(xì)胞襯里)和nNOS(在神經(jīng)元中)，和在巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、成 纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)型變異體(iNOS)。NO的功能可以隨著其細(xì)胞來源的不同而不同；成纖維細(xì)胞NO支持膠原合成，而內(nèi)皮細(xì)胞NO影響血管發(fā)生，和巨 噬細(xì)胞 NO 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)(Rohdewald, P.和 Ferrari V.，專利申請(qǐng) US2004137081 (2004))。 另一方面，精氨酸酶共用并競(jìng)爭(zhēng)NOS的天然底物，即L-精氨酸。L-羥基精氨酸和亞硝酸 鹽，分別是NO途徑的中間體和終產(chǎn)物，它們均為強(qiáng)的精氨酸酶抑制劑(Hrabak，A.等，F(xiàn)EBS Lett. 390 :203-206 (1996))。相反，精氨酸酶活性的終產(chǎn)物尿素抑制NO形成和NO依賴性過 程(Witte，Μ. B.和 Barbul. Α.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423 (2003))。精氨酸在心血管病癥中在眾多的臨床試驗(yàn)中，證明若施用于患有心血管病癥的 患者中，精氨酸是有益的(由 Appleton，J.，Altern. Med. Rev. 7 :512-522(2002)綜述)。 例如，口服補(bǔ)充精氨酸極大地改善了心絞痛患者的運(yùn)動(dòng)能力和耐力(Bednarz，B.等，ht. J. Cardiol. 75 :205-210 (2000))，并且顯著改善充血性心力衰竭(CHF)病例的血流量、動(dòng) 脈順應(yīng)性和腎功能(ffatanabe, G. H.等，J. Hypertens. 18 :229-234(2000))。動(dòng)物研究表 明補(bǔ)充精氨酸的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，包括血膽固醇過多的成人中改善的血管擴(kuò)張，抑制 斑塊形成，減少主動(dòng)脈內(nèi)膜的增厚，和血小板凝集的正?；?Nakaki，Τ.和Kato R.，Jpn J. Pharmacol. 66 167-171 (1994))。此外，早期提供精氨酸在大鼠和人中改善高血壓，預(yù)防 腎衰竭(Sanders, P. W.，Am. J. Kidney Dis. 28 :775-782 (1996))，和提高高血壓患者對(duì)諸如 依那普利的藥物的反應(yīng)(Pezza, V.等，Am. J. Hypertens. 11 1267-1270 (1998))。另外，精 氨酸顯著地改善間歇性跛行(Boger，R. H.等，J. Am. Coll. Cardiol. 32 1336-1344 (1998))， 和先兆子癇(Roberts, J. Μ.，Am. J. Kidney Dis. 33 :992-997 (1999))的癥狀。精氨酸在生長(zhǎng)激素(GH)分泌和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)中生長(zhǎng)激素負(fù)責(zé)增加肌肉生長(zhǎng)，燃燒脂 肪和維護(hù)免疫系統(tǒng)，然而，在人體中到30歲時(shí)其分泌開始下降(由Dean，W.和ftyor，K.， Growth hormone amino acids as GH secretagogues-a review of the literature.(生 長(zhǎng)激素作為GH促分泌物質(zhì)的氨基酸-文獻(xiàn)綜述)Vit. Res. News ；可在mm. vrp. com處獲 得O001)綜述)。盡管機(jī)制未完全闡明，但已知精氨酸能增加GH分泌。此外，臨床醫(yī)生常 規(guī)地在人中使用精氨酸輸注試驗(yàn)來確定垂體對(duì)釋放GH的反應(yīng)性(Penny，R.等，J.Clin. Endocrinol. 29 :1499-1501 (1969))。精氨酸的低劑量靜脈內(nèi)(IV)攝入引起血清精氨酸 的52%升高和血清GH水平的顯著增加。另一方面，口服精氨酸，不像IV精氨酸，被認(rèn)為 對(duì)于增加 GH 分泌是無效的(Marcel 1, T.J.等，J. Gerontol. M :395-399 (1999))，而口服 高劑量的精氨酸天冬氨酸被認(rèn)為僅在晚上充當(dāng)生長(zhǎng)激素促分泌物(Besset，Α.等，Acta Endocrinol. 99 18-23 (1982))。在魚類中，精氨酸是必需氨基酸，因此，飲食精氨酸對(duì)于最 適生長(zhǎng)和有效的飼料利用是必不可少的，并且其缺乏導(dǎo)致生長(zhǎng)速率減慢，免疫應(yīng)答低下和 死亡率增加(Ahmed，I.和 Khan，Μ. Α.，Aquacult. Nutr. 10 :217-225 (2004)) 精氨酸在創(chuàng)傷、燒傷、危重創(chuàng)傷和老年性癡呆中由于精氨酸通過產(chǎn)生一氧化氮 密切地參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中，和通過其代謝為鳥氨酸和其它聚胺而與細(xì)胞增殖相關(guān)，因此 大量的研究顯示其補(bǔ)充對(duì)于愈合是必不可少的。此作用不依賴于給藥途徑，并且推測(cè)與 膠原、N0、鳥氨酸和聚胺的合成途徑相關(guān)(ffitte, M. B.和Barbul. Α.，Wound Rep. Reg. 11 419-423(2003))ο膠原合成對(duì)于瘢痕形成是必不可少的，而瘢痕形成是大多數(shù)哺乳動(dòng)物愈合的基 礎(chǔ)。飼以無精氨酸飲食的大鼠顯示傷口愈合不良而飼以富精氨酸飲食的人和動(dòng)物具有改善 的膠原沉積和傷口斷裂強(qiáng)度(Barbul,A.等，Surgery 108 :331-336 (1990))。由于iNOS抑制
14劑減少膠原沉積并且延緩切開傷口的愈合，而在補(bǔ)充精氨酸后在傷口液體中發(fā)現(xiàn)較高水平 的NO代謝物，推測(cè)精氨酸對(duì)膠原合成的作用部分地經(jīng)由NO合成介導(dǎo)，(Murrell,G. Α. C.等， Inflamm. Res. 46 :19-27(1997) ；Schaffer, Μ. R.等，Eur. J. Surg. 165 :262-267 (1999))。 NO對(duì)傷口愈合的作用甚至被認(rèn)為是全身性介導(dǎo)的(Witte，M.B.和Barbu i. Α.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423 ^)03))，這是由于1)無精氨酸營(yíng)養(yǎng)不僅在傷口部位而且在幾個(gè) 器官中抑制誘導(dǎo)的NO合成；2)N0介導(dǎo)炎癥誘導(dǎo)的水腫并抑制細(xì)胞浸潤(rùn)至肉芽腫中；3) 由于eNOS敲除小鼠也顯示愈合不良，NO對(duì)傷口愈合的作用不僅是iNOS-介導(dǎo)的；和4) iNOS抑制劑在高濃度下具有高致死率。另外，傷口收縮很大程度上歸因于開放性傷口的 閉合，而 iNOS 抑制延緩切開傷口 的閉合(Stallmeyer，B.等，J. Invest. Dermatol. 113 1090-1098(1999))并且iNOS敲除小鼠顯示切開傷口的閉合延緩，其可通過用iN0S_cDNA轉(zhuǎn) 染來逆轉(zhuǎn)(YamasakiX等，J. Clin. Invest. 101 :967-971 (1998))。所有這些數(shù)據(jù)使人相信 精氨酸經(jīng)NOS的代謝是精氨酸對(duì)愈合的積極作用所必不可少的(》 ，Η.Ρ.等，SUrgeryl28 374-378(2000))ο精氨酸酶的誘導(dǎo)或過度表達(dá)，其是聚胺生物合成的第一個(gè)步驟，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增 殖(Wei，L. H.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA98 :9260-9264(2001) ；ffitte, Μ. B.和 Barbui. Α.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423 (2003))。精氨酸還已知通過刺激宿主和傷口 T細(xì)胞應(yīng)答， 然后T細(xì)胞應(yīng)答增加成纖維細(xì)胞反應(yīng)，從而增強(qiáng)傷口愈合(Barbui，Α.等，Surgery 108 331-336(1990))。在健康人體中，精氨酸增強(qiáng)外周血淋巴細(xì)胞的有絲分裂活性并且極大地 減少淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的創(chuàng)傷后損害(Daly, J. Μ.等，Arm. Surg. 208 :512-23 (1988))。精氨酸 已經(jīng)顯示對(duì)于骨髓淋巴細(xì)胞分化是必不可少的。由于T淋巴細(xì)胞對(duì)于正常傷口愈合是必不 可少的，因此清除T細(xì)胞的小鼠和大鼠具有顯著的傷口愈合不良。其它研究顯示補(bǔ)充精氨 酸對(duì)傷口愈合的有益作用類似于向創(chuàng)傷的動(dòng)物或燒傷的兒童施用GH的作用(Jorgensen， P. H 禾口 Andreassen，Τ. Τ.，Acta Chir. Scand. 154 :623-626 (1988) ；Herndon, D. N.等，Ann. Surg. 212 :4^-9(1990))，這是因?yàn)榫彼釋?duì)垂體和胰腺的熟知的高促分泌活性。這通過 對(duì)切除垂體的動(dòng)物的試驗(yàn)來證實(shí)，在該試驗(yàn)中精氨酸不影響傷口愈合(Wei，L.H.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9260-9264(2001) ；ffitte,Μ. B.和 Barbui. Α. ,Wound Rep. Reg. 11 419-423(2003))οSeifter, E.等，Surgery 84 =224-230(1978)顯示精氨酸在創(chuàng)傷后的情形中變得 很重要；接受較小創(chuàng)傷的精氨酸缺陷大鼠顯示顯著較多的體重減輕和死亡率。燒傷損傷也 顯著地增加精氨酸氧化和其儲(chǔ)備的波動(dòng)。經(jīng)常使用的全胃腸外營(yíng)養(yǎng)(TPN)增加精氨酸至鳥 氨酸的轉(zhuǎn)化并成正比地增加不可逆的精氨酸氧化。增加的精氨酸氧化，結(jié)合以有限的重新 合成，使精氨酸在接受TPN的嚴(yán)重?zé)齻颊咧袟l件性必需的(Yu，Y. Μ.等，Am. J. Physiol. Endocrino 1 · Metab. 280 :E509_E517 (2001))。幾個(gè)其它研究證明精氨酸縮短住院期，減 少獲得性感染，減少燒傷和創(chuàng)傷患者中的免疫損害(Appleton，J.，Altern. Med. Rev. 7 512-522(2002))，以及減少患有老年癡呆癥的老年患者中的脂質(zhì)過氧化(Ohtsuka，Y.和 NakayaJ.，Am. J. Med. 1 108-439 (2000))。這些大量的觀察結(jié)果，結(jié)合相對(duì)的安全性，使 得精氨酸在創(chuàng)傷、燒傷或危重患者的護(hù)理中的應(yīng)用中變得非常有吸引力(Witte，M.B.和 Barbui. Α.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423 (2003))。精氨酸在免疫調(diào)節(jié)和癌癥中精氨酸是有效的免疫調(diào)節(jié)劑，并且顯示在分解代謝狀態(tài)下諸如膿毒癥和術(shù)后應(yīng)激中具有有益的作用(Evoy，D.等Nutrition 14: 611-617(1998) ；Appleton, J. ,Altern. Med. Rev. 7 :512-522 (2002)) 精氨酸還在患有 HIV/ AIDS的個(gè)體中是有益的。谷氨酰胺、精氨酸和HMB(丁酸羥甲酯)的組合預(yù)防患有AIDS的 個(gè)體中的瘦體質(zhì)體重減輕(Swanson，B. ,Nutrition 18 =688-690 (2002)) 動(dòng)物和人體試驗(yàn) 顯示大劑量的精氨酸可以干擾腫瘤誘發(fā)并且短期補(bǔ)充大劑量精氨酸有助于維持化療期間 的免疫功能(Appleton, J.，Altern. Med. Rev. 7 :512-522 Q002))。精氨酸在糖尿病和胰島素抵抗中在患有糖尿病(DM)的人和動(dòng)物中觀察到降 低的血漿精氨酸水平和內(nèi)皮依賴性舒張受損。推測(cè)其原因可能是內(nèi)皮NO缺乏。因此，補(bǔ) 充精氨酸被認(rèn)為能改善這些狀況；在I型DM患者中IV精氨酸降低血壓和減少血小板聚 集(Giugliano, D.等，Am. J. Physiol. 273 :E606_E612 (1997))，而在肥胖癥和 2 型 DM 患者 以及健康受試者中低劑量IV精氨酸改善胰島素敏感性(Wascher，Τ. C.等，Eur. J. Clin. Invest. 27 :690-695 (1997))。精氨酸還可以抵抗脂質(zhì)過氧化，并且因此減少DM的微血管長(zhǎng) 期并發(fā)癥。此外，雙盲試驗(yàn)顯示口服補(bǔ)充精氨酸顯著地改善2型DM患者中外周和肝臟的胰 島素敏感性(Appleton, J.，Altern. Med. Rev. 7 :512-522 (2002))。精氨酸在胃腸病癥中在初步研究中，精氨酸對(duì)NO、胃泌素和聚胺的作用與 加速潰瘍愈合有關(guān)，該作用發(fā)揮其充血、血管生成和促生長(zhǎng)效應(yīng)(Brzozowski，Τ.， J. Gastroenterol. 32 =442-452 (1997)) 另外，NO在胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用?？?服補(bǔ)充精氨酸顯著地降低食管動(dòng)力障礙患者中胸痛發(fā)作的頻率和強(qiáng)度(Appleton，J.， Altern. Med. Rev. 7 =512-522 (2002)) 0同樣，L-精氨酸-NO途徑參與膽囊運(yùn)動(dòng)和攝入 L-精氨酸增加的飲食節(jié)制和殘余膽囊體積的調(diào)節(jié)(Luiking，Y. C.等，Am. J. Physiol. 274 984-991(1998))。精氨酸在生殖泌尿病癥中在美國(guó)進(jìn)行的觀察(1999)指出年齡為18 59歲 的31%男性和43%女性具有不同程度的性功能障礙(Christianson，D. W.，Ace. Chem. Res. 38 :191-201(2005)).此問題可以具有生理原因或心理原因，或兩者皆有。在男性中， 性功能障礙被簡(jiǎn)單地描述為勃起功能障礙(陽痿或ED)，而在女性，性功能障礙分為4種主 要類別性欲減退，性高潮障礙，性交疼痛障礙和性喚起障礙(Basson，R.等，J. Urol. 163 888-893(2000))。后者被定義為不能達(dá)到或維持充分的性沖動(dòng)包括陰蒂勃起和生殖器充 血，其類似于男性ED，由生殖器血液循環(huán)不足所導(dǎo)致。這可以導(dǎo)致兩種性別發(fā)生支配進(jìn)出海 綿體的血流量的酶促反應(yīng)中的生理性缺陷，海綿體是在勃起的陰莖或陰蒂中變得充血的可 擴(kuò)張組織的肌化腔室(Christianson，D. W.，Ace. Chem. Res. 38 :191-201 (2005)) 特別地，陰莖勃起是涉及在中樞或外周性刺激后增加的動(dòng)脈流入和限制性的靜脈 流出的血液動(dòng)力學(xué)過程(Musicki,B.等，Biol. R印rod. 70 =282-289 (2004)) 0由作為陰莖勃 起的主要介質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞NO合成酶(eNOQ和神經(jīng)元陰莖NO合成酶(PnNOQ兩者產(chǎn)生的 NO的參與也有大量的文獻(xiàn)記載。NO擴(kuò)散至鄰近的靶平滑肌組織，刺激鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生環(huán) 鳥甘酸(cGMP)導(dǎo)致海綿體的舒張(Ferrini，M.等，Biol. R印rod. 64 :974-982 Q001))。相 反，當(dāng)cGMP特異性磷酸二酯酶(PDEs)將cGMP水解為5 ‘ -GMP導(dǎo)致平滑肌收縮時(shí)勃起結(jié)束 (Firoozi, F.等，Br. J. Urol. Int. 96 164-168 (2005)) 因此，L-精氨酸和作用于 L-精氨 酸-NO途徑的藥物作為ED治療劑是有吸引力的。此外，PDE的選擇性抑制劑如西地那非枸 櫞酸鹽(偉哥(Viagra) )被廣泛地應(yīng)用，其抑制cGMP降解并因此延長(zhǎng)勃起。然而，西地那非具有全身性血管舒張和降血壓作用，導(dǎo)致從疼痛開始的大范圍的副作用，并且可以甚 至導(dǎo)致死亡(Cohen，J. S.，Ann. Pharmaco. Ther. 35 :337-342 (2001)) L-精氨酸“營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”經(jīng)常被開發(fā)為用于男性和女性性喚起的藥物。例如，長(zhǎng)期 或補(bǔ)充以超生理劑量的飲食L-精氨酸分別增加大鼠(Moody等1997)和男性的海綿體內(nèi)壓 和勃起功能。長(zhǎng)期補(bǔ)充L-精氨酸改善具有異常一氧化氮代謝的男性的ED (Zorgniotti和 Lizza 1994)，而在另一個(gè)對(duì)女性的研究，73. 5%的測(cè)試受試者中L-精氨酸營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充使整 體性生活滿意度得到改善(Ito，T. Y.等，J. Sex Marital Ther. 27 :541-549 Q001))。另一方 面，NOS并不是唯一影響陰莖勃起的酶，精氨酸酶共用其唯一底物精氨酸并且與NOS在男性 和女性生殖器中的平滑肌組織中共表達(dá)。因此，精氨酸酶抑制可以增強(qiáng)性喚起所需的NO依 賴性生理過程。由于許多精氨酸酶抑制劑對(duì)全身動(dòng)脈血壓沒有明顯的影響，因此其成為治 療性功能障礙的另一潛在靴標(biāo)(Christianson, D. W.，Acc. Chem. Res. 38 :191-201 (2005)) 精氨酸在不育和妊娠中精氨酸是男性正常精子發(fā)生所必需的(Appleton，J.， Altern. Med. Rev. 7 :512-522 (2002))。在50年前，研究者發(fā)現(xiàn)食以缺乏精氨酸的飲食9天 的成年男性的精子計(jì)數(shù)減少90%并且不運(yùn)動(dòng)精子的百分比增加大約10倍(Holt，L.E. Jr. 和 Albanese，A. A. , Trans. Assoc. Am. Physicians 58 :143-156 (1944))。不育男性每天口服 施用0. 5g精氨酸-HCl幾周顯著地增加大多數(shù)測(cè)試患者中的精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)，并且引起成 功的妊娠(Tanimura, J.，Bull. Osaka Med. School 13 :84-89 (1967))。在其它初步試驗(yàn)中 已經(jīng)報(bào)道了對(duì)少精液癥和受孕率的類似作用(Tanimura, J.，Bull. Osaka Med. School 13 84-89(1967) ；De-Aloysio，D.等，Acta Eur. Ferti 1. 13 :133-167(1982))以及改善的生育 力。然而，當(dāng)基數(shù)精子計(jì)數(shù)小于1000萬個(gè)/ml時(shí)，補(bǔ)充精氨酸可能沒有幫助(Mroueh，Α.， Fertil. Steril. 21 :217-219 (1970) ；Appleton, J.，Altern. Med. Rev. 7 :512-522 (2002))。在一個(gè)研究中對(duì)體外受精反應(yīng)差的女性口服補(bǔ)充精氨酸改善卵巢反應(yīng)、子宮內(nèi)膜 容受性和妊娠率Battaglia，C.等，Hum. R印rod. 14 1690-1697 (1999))。另外，在早產(chǎn)宮縮 的女性中靜脈內(nèi)精氨酸輸注(30g，在30min內(nèi))暫時(shí)性地減少子宮收縮性(i^cchinetti， F.等，J. Perinat. Med. 24:283-285(1996))。來自人和動(dòng)物研究的更多證據(jù)表明一氧化氮 抑制妊娠期間的子宮收縮性并且可能有助于和由此拮抗早產(chǎn)陣痛和分娩(Appleton，J.， Altern. Med. Rev. 7 :512-522 (2002))。在間質(zhì)性膀胱炎患者(IC)中，在6個(gè)月內(nèi)口服精氨酸顯著地減少排尿不適、 腹痛和/或陰道/尿道疼痛。晝夜尿頻也顯著減少(Smith，S.D.等，J. Urol. 158 703-708(1997) ；Appleton, J.，Altern. Med. Rev. 7 :512-522(2002))。L-賴氨酸L_賴氨酸是必需的基礎(chǔ)氨基酸，其分子量為146. 19g/mol，并且在生理 PH下攜帶正電荷。盡管賴氨酸的D-立體異構(gòu)體沒有生物活性，但L-賴氨酸是已知的用于 人禾口云力物的食品添力口齊U (Cynober, L. A. , Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在臨床營(yíng)養(yǎng)中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRC Press LLC,Boca Raton,USA(2003)) 0攝入的L-賴氨酸通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)從小腸腔吸收至腸細(xì) 胞。其一部分在腸細(xì)胞內(nèi)代謝，剩余的經(jīng)門靜脈循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟參與蛋白生物合成或代謝 為L(zhǎng)-a-氨基己二酸半醛，后者進(jìn)一步代謝為乙酰乙酰CoA。在肝臟中不代謝的L-賴氨酸
(Cynober, L. A. ,Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在臨床營(yíng)養(yǎng)中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRCPress LLC,Boca Raton，USA(2003))。賴氨酸具有許多功能。它作為糖原、葡萄糖和脂質(zhì)的前體起作用，或其直接用于 產(chǎn)生能量。它在肌肉中濃集，促進(jìn)骨生長(zhǎng)并且增加膠原的形成(Voet，D.和Voet，J. G.， Biochemistry.(生物化學(xué))，第三版，John Wiley and Sons Inc.，New York(2004)) 膠原 是結(jié)締組織(見前)、皮膚、軟骨和骨的基礎(chǔ)基質(zhì)。賴氨酸缺乏可能促進(jìn)生長(zhǎng)減緩和免疫力 下降，精子健康受損，以及尿鈣增加。后一事實(shí)表明充足的賴氨酸可以有助于通過鈣的更好 吸收和沉積來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥(Flodin，N. W.，J. Am. Coll. Nutr. 16 :7-21 (1997))。當(dāng)一些 研究顯示L-賴氨酸可以降低單純皰疹感染的復(fù)發(fā)率和刺激生長(zhǎng)激素分泌時(shí)，它作為一種 營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑得到普及(見下)。推薦的劑量、副作用和禁忌癥上面討論的氨基酸的補(bǔ)充劑量變化很大，取決于 待治療的病癥。然而，對(duì)于普通人必需氨基酸賴氨酸的正常飲食需求估計(jì)為每天0.75 Ig,以避免缺乏的問題。在臨床研究中使用的精氨酸劑量變化相當(dāng)大，從用于少精液癥的 少至每天0. 5g至用于癌癥、先兆子癇和早產(chǎn)宮縮的多至每天30g。對(duì)于本文各處中討論的 氨基酸的補(bǔ)充尚未報(bào)道有顯著的不良反應(yīng)。然而，提及的臨床應(yīng)用中的許多需要更多的對(duì) 照以及長(zhǎng)期研究來證實(shí)。本文僅概述了對(duì)這些氨基酸的作用的肯定報(bào)道，而也存在相反的 報(bào)道，其中這些作用中的許多可能沒有被證實(shí)(對(duì)于完全的綜述參見Flodin，N. W.，J.Am. Coll. Nutr. 16 :7-21(1997) ；Appleton, J. ,Altern. Med. Rev. 7 :512-522(2002)；以及 Dean, W.禾口 Pryor, K. , Growth hormone amino acids as GH secretagogues-a review of the literature.(生長(zhǎng)激素作為GH促分泌物質(zhì)的氨基酸一文獻(xiàn)綜述)Vit. Res. News ；可在 www. vrp. com 處獲得(2001))。二肽和天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸在臨床治療中天冬氨酸和精氨酸有利地作為 二肽或以混合物一起施用以對(duì)兩種氨基酸提供更高的生物利用度，并且因此以較低的劑量 增加它們的功效。在幾個(gè)對(duì)不同生理功能障礙的治療的研究中研究了兩種氨基酸的給藥。 通常，對(duì)于上述用于游離氨基酸的所有應(yīng)用，兩種氨基酸均可以以二肽形式施用。盡管下面 的章節(jié)進(jìn)行了概述，但報(bào)道的研究結(jié)果專門針對(duì)聯(lián)合的給藥形式。這些報(bào)道來源于關(guān)于傷 口愈合、關(guān)于內(nèi)分泌病癥如GH分泌障礙和提高運(yùn)動(dòng)能力，或關(guān)于生殖泌尿系病癥包括勃起 功能障礙以及男性和女性不育的研究。精氨酸-天冬氨酸于1965年第一次針對(duì)身體虛弱和神經(jīng)衰弱進(jìn)行了臨床試 驗(yàn)(Duruy, A.和 Baujat，J. P.，Vie. Med. Int. 9 :1589 (1965))并且后來證實(shí)了 積極作 用(Duruy，Α.，Med. Int. 1 :203(1966))。其它研究顯示精氨酸-天冬氨酸的長(zhǎng)期給藥改 善需氧能量代謝和能力(Sellier, J.，Rev. Med. Toulouse 5 :879(1979) ；Schmid, P.等， Leistungssport 10:486-495(1980))。精氨酸-天冬氨酸補(bǔ)充增強(qiáng)傷口愈合和T細(xì)胞的 免疫功能(Barbul，A.等，Surgery 108:331-336(1990))。關(guān)于運(yùn)動(dòng)能力也報(bào)道了其它積 極作用；例如關(guān)于脂質(zhì)代謝，其中精氨酸攝入僅2周就引起總膽固醇濃度下降(Hurson， Μ.等，J. Parenter. Enteral Nutr. 19 :227-230 (1995)) 因此，L-精氨酸-L-天冬氨酸 (Sargenor )廣泛地被運(yùn)動(dòng)員和患者使用以增加訓(xùn)練效果以及運(yùn)動(dòng)耐量。在此領(lǐng)域已 經(jīng)報(bào)道了對(duì)耐力表現(xiàn)的令人驚奇的效果，在延長(zhǎng)攝入L-精氨酸-L-天冬氨酸后導(dǎo)致亞 極量運(yùn)動(dòng)期間的降低的血乳酸鹽濃度和心率以及隨著工作負(fù)荷量增加而增加的耗氧量 (Schmid, P.等，Leistungssport 10 :486-495(1980) ；Sellier, J. ， Rev. Med. Toulouse 5
18879(1979) ；Burtscher, M. J. Sports. Sci. Med. 4 :314-322 (2005)) 健康的老年人志愿者飲食補(bǔ)充30g/d精氨酸天冬氨酸2周顯著地增加了傷口膠原 積累(Witte，Μ. B.和 Barbul.A.，Wound Rep. Reg. 11 :419-423 (2003))。當(dāng)向 5 名年齡為 20 35歲的健康受試者口服施用250mg/kg/天精氨酸天冬氨酸7天，在慢波睡眠期間出現(xiàn) GH 增加 60% (Besset, A.等，Acta Endocrinol. 99 18-23 (1982))。另一組研究人員在采 用一次大劑量(37. 5g) 口服精氨酸天冬氨酸治療12名正常成人后獲得了有效的結(jié)果，該治 療引起小但顯著的血清hGH的釋放(Elsairl987)。這使得健身者對(duì)精氨酸天冬氨酸產(chǎn)生興 趣，希望能夠利用 hGH 的合成代謝特性(Macintyre，J. G，Sports Med. 4 :129-142 (1987))。還報(bào)道了在一些類型癌癥的治療中口服施用L-精氨酸-L-天冬氨酸誘導(dǎo)了積 極作用。例如，其在小鼠中誘導(dǎo)對(duì)涎腺腺樣囊性癌的抗轉(zhuǎn)移作用，伴有肺轉(zhuǎn)移灶形成受抑 制和存活延長(zhǎng)。此外體外和體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了這些結(jié)果(Li，F(xiàn).等，Chin. J. Stomatol. 36 464-466(2001) ；Li, F.等，Chin. J. Momatol. 37 :87-89 Q002) ；Appleton, J. ,Altern. Med. Rev. 7 :512-522(2002)) ο在牙齒健康領(lǐng)域，牙菌斑，其為牙齒表面上緊密附著的海綿狀有機(jī)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在其 基質(zhì)內(nèi)接納一定尺寸和形狀的肽類。此外，2 4個(gè)單元的肽類，其中一個(gè)或多個(gè)是精氨酸， 顯示保存在牙菌斑內(nèi)避免被稀釋并且有效地將口 PH恢復(fù)至無齲水平(6. 1或更高)。還顯 示這些寡聚體甚至當(dāng)與碳水化合物同時(shí)提供時(shí)仍然有效。這表明這樣的肽可以包含在常見 的牙用產(chǎn)品諸如牙膏和口香糖中(Kleinberg, I.，美國(guó)專利申請(qǐng)4225579 (1980))。L-精氨酸-L-天冬氨酸也應(yīng)用治療生殖泌尿系功能障礙。ED常見于年齡為45 70歲的男性中，25%患有中度勃起功能障礙，且10%患有嚴(yán)重勃起功能障礙(Kernohan， Α. F. B.等，Br. J. Clin. Pharmacol. 59 :85-93 (2004))。近年來，“L_ 精氨酰天冬氨酸”用 作用于治療男性ED的幾種藥物的成分，這些藥物諸如Prelox (Lamm, S.等，Eur. Bull. Drug Res. 11 :29-37 (2003)) 0關(guān)于Prelox 的成分的臨床研究顯示在患有ED的40名男 性中在接受3次劑量的單獨(dú)lg "L-精氨酰天冬氨酸”(Sargenor )(每天i. 7g精氨酸)， 或與Pycnogenol (刺激NOS分泌)一起使用，分別在5%和92%的上述男性中改善 了勃起功能(Stanislavov, R.和 Nikolova, V.，J. Sex Marit. Ther. 29 :207-213 (2003))。 在長(zhǎng)期研究中，年齡在45和60歲之間的50名患有ED、精液量較低、精子運(yùn)動(dòng)減少和精 子形態(tài)學(xué)異常的男性首先用Sargenor 單獨(dú)治療ι個(gè)月。這些男性中的10%體驗(yàn)到正 常勃起。在治療中加入Pycnogenol 持續(xù)第二個(gè)月后，具有正常勃起的男性的百分比增 加至80%。該治療持續(xù)1年的時(shí)間，期間精子質(zhì)量顯著改善，并且42%的夫婦實(shí)現(xiàn)了妊 娠(Stanislavov, R.禾口 Nikolova, V. ， Int. J. Impot. Res. 14(4) :S65(2002) ；Lamm, S.等， Eur. Bull. Drug Res. 11 J9-37 (2003))。后一觀察結(jié)果證實(shí)了先前對(duì)精氨酸-天冬氨酸 的應(yīng)用的研究，其中補(bǔ)充幾個(gè)月增加了精子計(jì)數(shù)和質(zhì)量(Tanimura，J.，Bull. Osaka Med. School 13 :84-89(1967) ；Schellen, Τ. Μ.禾口 Declerq，J. Α.，Dermatol. Monatsschr. 164 578-80(1978) ；De-Aloysio, D.等，Acta Eur. Ferti 1. 13 :133-167(1982))和改善的生 育力(Schacter, Α.等，J. Urol. 110 :311-13(1973) ；Schacter, Α.等，Int. J. Gynaecol. Obstet. 11 :206-209(1973))。由于此二肽不能大量獲得，關(guān)于由天冬氨酸和賴氨酸組成的二肽的臨床報(bào)道幾乎 不存在。然而，賴氨酸的此二肽形式可以在已知用于游離賴氨酸或其鹽的應(yīng)用領(lǐng)域中(見前)，在具有賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白遺傳缺陷的人中，或簡(jiǎn)單地作為食品添加劑是有效的，對(duì)于人 和動(dòng)物其具有比游離賴氨酸更高的生物利用度。精氨酸和賴氨酸協(xié)同地作用以釋放生長(zhǎng)激素(GH) (Suminski, R. R.等，ht. J.Sport Nutr. 7 :48-60(1997))并且它們的濃度在人和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中非常重要(Ahmed, I. ^P Khan, Μ. Α. , Aquacult. Nutr. 10 :217-225 (2004)) 低賴氨酸精氨酸比具有降低 膽固醇的作用(Sanchez, Α.等，Nutr. 38 :2四_238 (1998))，并且因此，提出了用于心血管 疾病患者的Arg Lys比為至少5.5 1的蛋白混合物的專利(Radha，C.等，專利申請(qǐng) 7091001(2006))。相反，由于單純皰疹病毒的蛋白富含L-精氨酸，因此飲食中的高賴氨 酸/精氨酸比已知有助于減少病毒復(fù)制，減少愈合時(shí)間，和爆發(fā)流行期間的致細(xì)胞病變性 (Griffith, R. S.等，Dermatologica 156(5) :257-267 (1978))。因此，在皰疹預(yù)防和治療 中，避免富含精氨酸的食物和使用更多富含賴氨酸的食物認(rèn)為是有幫助的。最近的研究已經(jīng)提出在刺激hGH時(shí)共同使用L-賴氨酸和L-精氨酸的治療是有用 的并且可能甚至好于精氨酸/鳥氨酸組合，并且因此改善肌肉增長(zhǎng)、體重增加和免疫支持。 在年齡為15 20歲的15名健康男性受試者中，1. 2g精氨酸焦谷氨酸結(jié)合L-賴氨酸鹽酸 鹽在消耗該氨基酸混合物后使H水平顯著地升高2 8倍(Isidori，A.等，Curr. Med. Res. Opin. 7 :475-481 (1981))。另一研究指出在休息狀態(tài)下攝入1.5g精氨酸和1.5g賴氨酸引 起 GH 分泌的急劇增加(Suminski, R. R.等，Int. J. Sport Nutr. 7 :48-60 (1997))。為了模擬消化道內(nèi)的自然條件，制備的腸“液”用作含有CGP的厭氧Himgate試 管中的培養(yǎng)液并用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。在所有試管中CGP的完全降解指示CGP可以容易地在 這樣的類似于消化道的厭氧環(huán)境中被降解。這還通過短降解期來證實(shí)，該短降解期類似 于以前對(duì)于專性和兼性厭氧CGP降解細(xì)菌所觀察到的現(xiàn)象(Obst，Μ.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :3642-3652(2005) ；Sallam, Α.等，已投稿待發(fā)表(2008)) 在此研究中，并且第一次證明了 CGP降解細(xì)菌在動(dòng)物、禽類和魚類消化道中的廣 泛分布(表1，幻。先前關(guān)于環(huán)境樣品的研究還顯示了在純化步驟期間觀察到的CGP降解 集落之間和后來所得的純性培養(yǎng)物之間的形態(tài)學(xué)多樣性，這顯示了 CGP降解者在原核動(dòng) 物中的廣泛分布(表幻。另一方面，降解CGP的能力似乎更多地分布在特定屬的種間； 迄今關(guān)于細(xì)胞外CGP降解的研究顯示CGP降解者在假單胞菌屬和芽孢桿菌屬間廣泛分布 (Obst, M.等，J. Biol. Chem. 277 :25096-25105(2002) ；Obst, M.等，Biomacromolecules 5 153-161(2004) ；Sallam, Α.等，已投稿待發(fā)表(2008)，本研究)。然而，這可能與應(yīng)用的 實(shí)驗(yàn)室條件有關(guān)，這些條件可能已經(jīng)有利于這些細(xì)菌，或簡(jiǎn)單地因?yàn)檫@些細(xì)菌屬在自然界 中的超優(yōu)勢(shì)度。另外，許多CGP降解細(xì)菌，不像假單胞菌屬和芽孢桿菌屬的菌株，在不喪 失降解CGP的能力的條件下非常難以得到無污染的培養(yǎng)物(Obst，Μ.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :3642-3652(2005) ；Krug, Α. , Diplom thesis, Institut fur Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westfalische WiIheIms-Universitat, Munster, Gemany(2001))并且通常被忽視。在厭氧條件下對(duì)于純性培養(yǎng)物僅觀察到部分CGP降解，并且46個(gè)菌株中僅8株厭 氧性地降解CGP。對(duì)此似乎合理的原因是在這些菌株和其它菌株之間缺少如在它們的天然 環(huán)境中那樣的天然相互作用，這分別經(jīng)常導(dǎo)致限制性的或必需物質(zhì)的積累或消耗。這與以 前對(duì)專性厭氧內(nèi)生孢子生產(chǎn)株香港互營(yíng)單胞菌KI株的觀察結(jié)果相吻合，在其共分離物無丙二酸檸檬酸桿菌(CitrcAacter amalonaticus) G株的存在下該菌株的生長(zhǎng)和CGP利用極 大地提高(Obst，Μ.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :3642-3652 (2005))。在8種已鑒定的分離物中，7個(gè)菌株顯示厭氧性降解CGP的能力，盡管它們術(shù) 語已知為需氧的屬如芽孢桿菌屬或假單胞菌屬。然而，枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌 的菌株已知厭氧地生長(zhǎng)，并且一些已知還原硝酸鹽(Glaser，P.等，J. Bacteriol. 177 1112-1115(1995))。同樣，假單胞菌屬成員的厭氧生長(zhǎng)和硝酸鹽還原作用被充分地研究 (Sallam, Α.等，已投稿待發(fā)表Q008))。小單孢菌屬、鏈霉菌數(shù)和短芽孢桿菌屬的種還 己知是兼性厭氧的(Cochrane, V. W. ，Annu. Rev. Microbiol. 15 :1-26(1961) ；Borodina, I.等，Genome Res. 15 :820-829(2005) ；Baek, S. H.等，Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56 2665-2669 (2006))。通常，近年來對(duì)CGP降解的研究針對(duì)CGP降解細(xì)菌在兼性厭氧菌間的 廣泛分布。盡管CGP和其二肽是天然來源的簡(jiǎn)單的蛋白物質(zhì)，但需要臨床研究來將這些物質(zhì) 推向市場(chǎng)。CGP降解細(xì)菌在本研究中測(cè)試的哺乳動(dòng)物、禽類或魚類的腸道菌叢中的廣泛分布 提供了第一個(gè)證據(jù)，即，口服使用CGP將是快速的，并且至少容易被微生物降解。這些細(xì)菌 從不同動(dòng)物和鳥類的下消化道中的分離(表1)顯示，如果CGP的消化在上消化道中沒有完 成，則其可能在下消化道中繼續(xù)進(jìn)行。HPLC分析揭示了二肽是所有62株分離物的CGP降解產(chǎn)物。從CGP沒有產(chǎn)生更 高級(jí)的二肽寡聚體如(P-Asp-Arg)2四肽。這與來自病鱔假單胞菌BI株(Obst，M.等， J. Biol. Chem. 277 :25096-25105(2002)、香港互營(yíng)單胞菌KI 株(0bst，M.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :3642-3652(2005))和產(chǎn)堿假單胞菌 DIPl 株(Sallam, Α.等，已投稿待發(fā) 表0008))的CGP酶的作用相吻合。螺旋藻的營(yíng)養(yǎng)和治療作用已經(jīng)已知了幾個(gè)世紀(jì)，并且 迄今其在許多國(guó)家中作為食品消費(fèi)。螺旋藻的蛋白含量已知達(dá)到60%以上(Narasimha， D. L. R.等，J. Sci. Food Agric. 33 :456-460 (1982))。在鈍頂螺旋藻的市售產(chǎn)品中CGP的存 在指示CGP可能參與了定期服用螺旋藻的健康作用。然而，在被分析的樣品中測(cè)定的CGP 含量變化很大，并且相對(duì)很低。這與先前對(duì)藍(lán)細(xì)菌中的CGP積累的研究一致，其中CGP的 積累已知受到許多因素的影響，并且相應(yīng)地發(fā)生變化(Elbahloul, Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767 ^00 )。而且，市售的螺旋藻產(chǎn)品在其獲得商業(yè)化許可之前一定 已經(jīng)經(jīng)過了大量的臨床和毒性試驗(yàn)。這顯示提取的CGP和CGP- 二肽如果經(jīng)口攝入將不會(huì) 誘發(fā)毒性作用。此外，CGP 二肽通常被細(xì)菌攝取并利用于生長(zhǎng)，并且在靶向研究(數(shù)據(jù)未顯 示)期間顯示沒有抑菌或殺菌作用。通常，螺旋藻的已知作用和應(yīng)用非常類似于對(duì)精氨酸 所證明的那些作用，表明這些作用的一部分可能實(shí)際上是由其精氨酸含量(約6%)所引起 的，包括CGP的作用。細(xì)菌具有三種肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，兩種屬于ABC(ATP_結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的大家族，寡肽 透膜酶(Opp)和二肽透膜酶(Dpp)，和用于二肽和三肽的一種屬于PTR(肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)家 族。僅后一系統(tǒng)在從酵母開始的高級(jí)真核生物中是保守的(Daniel，H.等，Physiology 21 93-102(2006)).在哺乳動(dòng)物中，用于二肽和三肽的載體系統(tǒng)PEPT (SLC15家族)包括2種變 異體；腸PEPTl (SLC15A1)和腎亞型PEPT2 (SLC15A2)。它們以立體選擇性的方式轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎所 有可能的二肽和三肽，對(duì)于L-α氨基酸和它們的衍生物是優(yōu)先的。含僅D-氨基酸或四個(gè)以 上氨基酸的肽不被接受。因?yàn)镻EPTl在整個(gè)小腸中具有顯著的表達(dá)，并且由于其高轉(zhuǎn)運(yùn)能力，PEPTl的所有藥物底物具有優(yōu)異的口服利用度，因此，PEPTl已經(jīng)成為了藥物遞送的主 要靶標(biāo)(Daniel,H.等，Physiology 21 :93-102 (2006)) CGP 二肽、Asp-Arg 和 Asp-Lys (重 組CGP)的構(gòu)成性L-氨基酸經(jīng)α-β肽鍵連接。此類型的鍵和CGP 二肽的立體結(jié)構(gòu)強(qiáng)力地 提示它們可以充當(dāng)PEPT系統(tǒng)的底物，并且當(dāng)它們被攝入時(shí)可以從哺乳動(dòng)物腸腔轉(zhuǎn)運(yùn)。因 此，CGP和/或其二肽的應(yīng)用將是用于構(gòu)成性氨基酸作為治療和/或營(yíng)養(yǎng)劑的口服給藥的從幾個(gè)世紀(jì)前便已知氨基酸的營(yíng)養(yǎng)和臨床價(jià)值，包括構(gòu)成CGP的那些氨基酸諸如 天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸以及仍然可以結(jié)合至其結(jié)構(gòu)中的那些如瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨 酸或谷氨酸。這些氨基酸的合成寡聚體組合證明比游離氨基酸更高的生物利用度并且因此 經(jīng)常在營(yíng)養(yǎng)和治療中進(jìn)行研究和應(yīng)用(見前)。CGP代表了這些寡聚體的理想天然來源，預(yù) 期其可以在比其游離形式的構(gòu)成性氨基酸更低的劑量下更為有效。因此，CGP和其二肽的吸 收、安全性和作用目前正在研究當(dāng)中。而且，關(guān)于將其它氨基酸結(jié)合在CGP中的研究顯示了 有效的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。得到的二肽可以應(yīng)用于幾個(gè)治療領(lǐng)域中，例如，天冬氨酸-鳥 氨酸用于治療肝臟疾病(Kircheis，G.等，H印atology 25:1351-1360(1997))。因此，未來 對(duì)CGP結(jié)構(gòu)的任何改變將增加CGP 二肽的范圍并且隨之?dāng)U展其作為治療和/或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑 的應(yīng)用范圍。對(duì)于從藻青素(CGP)大規(guī)模制備β - 二肽建立了三階段方法。階段I基于用于從 生物質(zhì)工藝分離CGP的優(yōu)化的酸提取法，獲得總計(jì)704g純CGP，并且在結(jié)構(gòu)上該CGP含有天 冬氨酸、精氨酸和少量的賴氨酸。階段II是細(xì)胞外CGP酶(CphE)的發(fā)酵制備，該酶從產(chǎn)堿 假單胞菌DIPl株中以5001規(guī)模并且使用Ig/檸檬酸鹽作為唯一底物制備，獲得17. 5g粗 制蛋白粉末，并且該蛋白顯示對(duì)CGP的高降解活性。階段III包括經(jīng)CphE降解CGP，250g CGP降解為β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸二肽，純度級(jí)別超過99% (TLC， HPLC)。階段III的總效率為91%，同時(shí)回收了 78% (wt/wt)的使用的CphE粉末，并且該 粉末顯示對(duì)CGP的持久活性。建立的方法取決于根據(jù)工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的原料和設(shè)備，并且對(duì)于每 一種所需的規(guī)模均適用。產(chǎn)堿假單胞菌的菌株，包括DIPl株，已知生長(zhǎng)在大范圍的底物上，并且需要量 其極微量。這些菌株的高酶生產(chǎn)率也是其應(yīng)用于細(xì)胞外脂肪酶的發(fā)酵制備中的主要原 因(W0 95/30744 ；Gerritse, G.等，Appl. Environ. Microbiol. 64 :2644-2651 (1998)； Moore, Ε. R. B.等 Mai 1999. Pseudomonas =Nonmedical.(假單胞菌屬非醫(yī)學(xué))見 Moore 等(編 輯)，The Prokaryotes :An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community,(原核生物微生物群體的進(jìn)化電子資源)第三版，release 3. 0，Springer-Verlag，New York))。除了來自DIP 1株的CGP酶的高穩(wěn)定性和活性 以夕卜(Sallam, A.禾口 A. Steinbuchel. 2007b. Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反銷化 細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株對(duì)藻青素的厭氧和需氧降解-混合細(xì)菌聚生體中其它三種共分 離物的作用)已投稿待發(fā)表)，這些特性是考慮此菌株理想地用于設(shè)計(jì)的工藝方法的主要 因素。在建立最終的三階段方法之前，進(jìn)行了幾個(gè)試驗(yàn)通過直接在CGP上培養(yǎng)DIPl株以
22達(dá)到相同的目標(biāo)，然而，由于CGP- 二肽被正在生長(zhǎng)的細(xì)胞快速消耗，該策略不太有效，在該 三階段方法的規(guī)定步驟中避免了此問題，在該三階段方法中去除了 DIPl株的細(xì)胞。此外， 通過直接培養(yǎng)獲得的二肽溶液具有大的體積，并且因此難以處置，在得到的二肽溶液中還 存在小蛋白和鹽類，作為該策略的另一缺點(diǎn)。相反，通過三階段方法CGP的降解濃度以及降 解時(shí)間是完全可以控制的。因此，獲得的二肽溶液限于小且容易處置的體積。最高的測(cè)試濃 度(50g/l)是各個(gè)方面之一，其仍可以為未來應(yīng)用而進(jìn)行優(yōu)化，使得該方法更為經(jīng)濟(jì)有效。對(duì)于工藝方法經(jīng)濟(jì)因素通常是最重要的，因此在培養(yǎng)基優(yōu)化和底物利用中獲得 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)是令人滿意的，檸檬酸鹽是工藝數(shù)量級(jí)時(shí)的廉價(jià)底物，并且理想地作為唯一底 物用于應(yīng)用的菌株，其已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞外脂肪酶的發(fā)酵制備中(Gerritse，G.等，Appl. Environ. Microbiol. 64 :2644-2651 (1998))，然而，對(duì)于粗制 CphE 的制備階段(階段 II)需 要優(yōu)化的培養(yǎng)基，使得必需準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)發(fā)酵期間的濁度等級(jí)，尤其是在誘導(dǎo)和降解階段期 間。以前試驗(yàn)性CGP降解的經(jīng)驗(yàn)顯示不透明的培養(yǎng)基以及細(xì)胞的強(qiáng)力生長(zhǎng)可能會(huì)令人誤 解，除此之外，較好的細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)質(zhì)上不意味細(xì)胞外CGP酶的較高產(chǎn)量(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。Frey, K. M.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :3377-3384(2002)的 CGP 酸提取法在 以前的研究中被成功地應(yīng)用，該方法被優(yōu)化以適用于從任何工藝量的生物質(zhì)中分離純CGP。 對(duì)原始方法的最有效的改變是溶解的CGP的無菌過濾步驟，此步驟保證完全去除不溶于稀 HCl的任何細(xì)胞碎片。相反，增加的使用稀酸和水的純化步驟可能不必要地增加CGP的損 失，這就解釋了獲得的CGP和預(yù)測(cè)量之間的差異。CGP的損失以及其提取所需的時(shí)間可以通 過將CGP離心代替將其置于4°C而最小化。備選地，如果應(yīng)用有效的設(shè)備諸如錯(cuò)流，則此提取法的總生產(chǎn)率可以大幅度增加， 在此情況下，需要具有兩種不同的COP的2個(gè)盒；一個(gè)比待分離的CGP的分子大小大，而另 一個(gè)比該大小小，這兩個(gè)盒被應(yīng)用于分別交替地過濾溶解和沉淀狀態(tài)下的CGP。然而，這樣 的超濾盒的相對(duì)高的價(jià)格和然而有限的壽命使其應(yīng)用成為一個(gè)成本的問題。在粗制CphE 的發(fā)酵制備(階段II)期間，在靜止生長(zhǎng)期內(nèi)采用CGP的誘導(dǎo)以保證CphE的最大制備，并 且僅僅參考培養(yǎng)基中CGP量的濁度變化。培養(yǎng)基的pH增加超過耐受范圍(pH 6. 9 7. 5)并且通過加入HCl來控制，這最 可能的原因是產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的細(xì)胞釋放氨的緣故。類似的生理行為也在以前關(guān) 于 CGP 降解的研究中對(duì)此菌株提及(Sallam，Α.和 A. Steinbuchel. 2007b. Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反硝化細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株對(duì)藻青素的厭氧和需氧降解-混合細(xì)菌聚 生體中其它三種共分離物的作用)已投稿待發(fā)表)。在不同的測(cè)試過濾系統(tǒng)之前和之后，得到的CGP-二肽純度等級(jí)相同的原因顯然 是初始二肽溶液中開始就沒有雜質(zhì)。這顯示與使用細(xì)菌細(xì)胞直接培養(yǎng)的策略相比，應(yīng)用確 定的酶法過程的另一優(yōu)點(diǎn)。另一方面，由于過濾造成的二肽的定量損失是預(yù)期的并且可惜 是無法避免的；已知有幾種一般因素會(huì)導(dǎo)致這樣的損失，包括；過濾材料，截留點(diǎn)，和/或被 過濾的物質(zhì)本身的特性。這還解釋了降解階段(階段III)期間9% CGP和22%粗制CphE 的損失。除此之外，僅測(cè)試了新的濾膜(0.5 IOkDa. COPs)，并且因此CGP-二肽的損失量 最可能附著在膜表面上直至飽和。
即便91 %的總過程產(chǎn)率是十分高的，幾個(gè)方面可以甚至進(jìn)一步改進(jìn)，并且均在優(yōu) 化之中，這些方面包括粗制CphE的較高生產(chǎn)率，對(duì)CphE的可能工藝純化策略和用于降解階 段的更有效的條件(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。CGP-二肽的商業(yè)價(jià)值與CGP本身的生產(chǎn)成本直接相 關(guān)，盡管，在過去幾年中，CGP的生產(chǎn)被廣泛地研究并且使用幾種細(xì)菌菌株進(jìn)行優(yōu)化，從而正 在使用新的和更適合的經(jīng)濟(jì)底物來實(shí)現(xiàn)對(duì)CGP含量的提高，這些發(fā)展似乎在商業(yè)化CGP生 產(chǎn)的方向上快速地發(fā)展(見上)，此方式也是其它已知的細(xì)菌性聚(氨基酸)諸如聚(谷氨 酸)和聚(ε -賴氨酸)被商業(yè)化以用于工藝以及食品應(yīng)用所需要的(由Oppermarm-Sanio F. B.等，Naturwissenschaften 89 :11-22(2002) ；Obst, M.等，Biomacromolecules 5 1166-1176(2004)綜述)。到那時(shí)，CGP-二肽的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值可能才事實(shí)上為CGP的實(shí)際 生產(chǎn)成本提供均衡的關(guān)系。因此，CGP-二肽的生物醫(yī)學(xué)作用目前正在研究之中(Mllam， Α.，禾口 A. Steinbuchel. 2007c. Potential of cyanophycin and its β -dipeptides as possible additives in therapy, food and feed industries (藻青素禾口其 β-二月太作為 治療、食品和飼料工業(yè)中的可能添加劑的潛力))。以前應(yīng)用的用于從藻青素(CGP)大規(guī)模生產(chǎn)β - 二肽的生物工藝方法被優(yōu)化；該 原始方法由三個(gè)階段組成；階段I 從生物質(zhì)中大規(guī)模提取純CGP，階段II 從產(chǎn)堿假單胞 菌DIPl株大規(guī)模生產(chǎn)粗制藻青素酶(CphEal),階段III 將CGP降解為其二肽。對(duì)于第二階 段確定最適培養(yǎng)條件；2g Γ1檸檬酸鹽，ρΗ 6. 5和培養(yǎng)溫度為37°C。作為CphEal的誘導(dǎo)物 的CGP的最適濃度為50g Γ1，這是以前應(yīng)用的濃度的1/5。在誘導(dǎo)后證獲得最大酶濃度。 相同濃度的CGP-二肽在僅池后顯示類似的誘導(dǎo)效率。然而，最適的4g Γ1 L-天冬氨酸也 誘導(dǎo)CphEal，其效率為CGP的1/3。CphEaJS CGP上的底物特異性結(jié)合來純化。純化的酶被 表征并且結(jié)果顯示是一種絲氨酸蛋白酶，在50°C和ρΗ 7 8.5時(shí)具有最大活性。對(duì)于初始 方法的階段HI (CGP降解)的條件:50g F1CGP, IOgF1粗制CphEal和在30°C中孵育IOh可 以優(yōu)化為=IOOg Γ1 CGP，IOg Γ1粗制CphEal和在50°C中僅孵育4h。CGP降解為β _天冬 氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸二肽，純度等級(jí)超過99% (HPLC)。這些優(yōu)化使得該 工藝方法是更成本、時(shí)間和投入有效的。在protamylasse上以500-1規(guī)模發(fā)酵制備CGP之前，在可利用的protamylasse 裝料上進(jìn)行的預(yù)試驗(yàn)表明對(duì)于CGP制備7% (vol/vol)是最適的，然而，在先前Elbahloul， Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767(2005)對(duì)以前的 protamylasse 裝料的研究 中，最適濃度發(fā)現(xiàn)為6% (vol/vol) 0這是因?yàn)閜rotamylasse (其是工業(yè)淀粉生產(chǎn)的殘余化 合物)是一種復(fù)雜的培養(yǎng)基，其組成可以在每批裝料之間發(fā)生變化，并且因此必需在作為 培養(yǎng)基應(yīng)用之前進(jìn)行調(diào)節(jié)。在發(fā)酵期間和第一個(gè)他之后，溫度升高至37°C以便使溫度敏感的λ -抑制物 (cl857)失活，并且因此能夠誘導(dǎo)CGP-合成酶(CphA)基因。在此時(shí)間點(diǎn)，重組大腸桿菌菌株 細(xì)胞已經(jīng)處于指數(shù)生長(zhǎng)期中池。此發(fā)酵過程證明對(duì)于CGP-合成酶的誘導(dǎo)以及對(duì)于CGP的最 大細(xì)胞內(nèi)積累是最適的(Frey，K. M.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :3377-3384 (2002))。在發(fā)酵Mi后，培養(yǎng)基的濁度還顯示突跳(sudden jump)，自動(dòng)控制的攪拌與其相 平行地增加。這可以解釋為，通過除溫度升高至37°C以外，由于強(qiáng)力的細(xì)胞生長(zhǎng)引起的培養(yǎng) 基中氧的減少。顯然，培養(yǎng)基中的氧含量變得低于預(yù)先調(diào)節(jié)的最小值并且導(dǎo)致攪拌的自動(dòng) 增加，這引起較多地形成泡沫和氣泡，并且隨后引起失真的OD85tlnm值。人工地加入消泡乳液導(dǎo)致濁度快速降至正常水平。當(dāng)用顯微鏡估計(jì)達(dá)到細(xì)胞中的最大CGP積累(1 后)時(shí)，終止發(fā)酵。然而，后 來對(duì)發(fā)酵樣品的分析指示較好的收獲時(shí)間為孵育1 后。在該時(shí)間點(diǎn)處，CGP含量為約 13% (CDM的wt/wt)，而在1 后，其下降至10% (CDM的wt/wt)。這種損失顯然是由 于顯微鏡對(duì)CGP含量估計(jì)的不準(zhǔn)確造成的，該方法是發(fā)酵期間僅有的可用方法。此外， CGP含量的降低最可能是由于質(zhì)粒損失引起的，這種質(zhì)粒損失在孵育期間隨著時(shí)間推移 而發(fā)生(Elbahloul, Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767 (2005))。在提取和 純化聚合物后，HPLC分析指示CGP的高純度等級(jí)，并且其由三種氨基酸組成天冬氨酸 (47. 7mol % )，精氨酸(45. 6mol % )和賴氨酸(6. 8mol % )。SDS-PAGE顯示CGP的分子大小 為25 30kDa。這些特征與以前由相同菌株在幾種培養(yǎng)基上產(chǎn)生的CGP的特征非常一致 (Frey, K. M.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :3377-33840002) ；Elbahloul, Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767(2005))。近年來，含有Ig Γ1檸檬酸鹽的簡(jiǎn)單礦物鹽培養(yǎng)基(SM-培養(yǎng)基)被應(yīng)用于從 產(chǎn)堿假單胞菌DIPl菌株中大規(guī)模生產(chǎn)CphEal。此培養(yǎng)基是有利的，原因是其簡(jiǎn)單和節(jié) 約成本的組成以及其對(duì)使用的菌株的適合性(Milam，Α.，和A. Steinbuchel. 2008b. Biotechnological process for the technical production of β —dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產(chǎn)β _ 二肽的生物工藝方法)Under preparation. (準(zhǔn)備中))。然而，在此研究中，即使對(duì)生長(zhǎng)最適的檸檬酸鹽濃度為6g Γ1，在這樣的培養(yǎng)中 也不產(chǎn)生CphEal。CphEal的最大產(chǎn)量出現(xiàn)在2g Γ1檸檬酸鹽上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中；這說明該 酶僅在底物的限制條件下被誘導(dǎo)。其它對(duì)溫度和PH最適值的試驗(yàn)顯示37°C和5. 5 7. 5 的PH范圍，最適值為6. 5，對(duì)于DIPl株以及對(duì)于CphEal的生產(chǎn)是最適的。這提高了生產(chǎn)過 程的效率，該生產(chǎn)過程最初應(yīng)用在Ig Γ1檸檬酸鹽上，PH 7. 5和孵育溫度為30°C (Sallam, A.,禾口A.Steinbuchel.2008b. Biotechnological process for the technical production of β-dip印tides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產(chǎn)β _ 二肽的生物工藝方 法)Under preparation.(準(zhǔn)備中))。對(duì)CphEal誘導(dǎo)的滲入研究揭示了以前應(yīng)用的CGP濃度Q50mg Γ1)的僅1/5 (50mg Γ1)就足以達(dá)到相同的作用。在相同的濃度(50mg Γ1)下CGP-二肽也足以以相同的效率 誘導(dǎo)CphEal。然而，至收獲用二肽誘導(dǎo)的培養(yǎng)物時(shí)所需的較短孵育期(3h)顯示CGP-二肽 是CphEal的實(shí)際誘導(dǎo)物而非CGP本身。另外，天冬氨酸是CphEal的成功誘導(dǎo)物，而與CGP-二肽不同，對(duì)于最大CphEal產(chǎn)量 需要4g Γ1的濃度和更長(zhǎng)的證孵育期，這顯示CphEal生產(chǎn)效率僅為CGP或其二肽的三分之 一。因此，在未來應(yīng)用中選擇誘導(dǎo)物仍然取決于個(gè)例和成本。原始方法的第三個(gè)階段(經(jīng)粗制CphEal大規(guī)模降解CGP)發(fā)現(xiàn)在50°C中是非常有 效的，而非在30°C中。此優(yōu)化使得高得多的CGP濃度(至多達(dá)IOOg Γ1)可容易地在為30°C 中降解時(shí)間的僅四分之一的時(shí)間內(nèi)降解。這是根據(jù)Van' t Hoff方程，其中溫度增加10開 (10°C )，反應(yīng)速率加倍。在此升高的溫度下降解混合物的體積和其污染的風(fēng)險(xiǎn)被最小化。 在30°C和50°C兩種孵育溫度下，降解時(shí)間顯示隨著粗制CphEal的濃度下降和隨著CGP濃度 增加而共線增加。因此，所得的公式可以有助于在未來的工藝應(yīng)用中應(yīng)用最適的降解參數(shù)。 由于降解階段的效率在50°C中高得多，因此該公式對(duì)在50°C中的應(yīng)用進(jìn)行計(jì)算，并且隨后適合于至多達(dá)IOOg Γ1的CGP濃度。有機(jī)溶劑或硫酸銨沉淀提供弱的純化作用和低的酶回收速率。相反，通過對(duì)CGP 的特異性結(jié)合開發(fā)的方法證明高度有效，并且具有使用一種底物(CGP)從粗制溶液中的其 它蛋白中分離CphEal的優(yōu)點(diǎn)。純化方法以CGP混合物降解為其二肽結(jié)束；這些同時(shí)的都是 該方法的有價(jià)值的終產(chǎn)物，并且因此可以進(jìn)一步引導(dǎo)至主生產(chǎn)物流(無原料損失)。該純化 方法容易擴(kuò)大規(guī)模并且如果需要結(jié)合在未來的工藝應(yīng)用中。建立兩個(gè)公式來增加原始方法的第二階段(粗制CphEal的大規(guī)模生產(chǎn))和其可能 的純化的效率。第一個(gè)公式(s. a.)基于CphEal的光量分析，并且能夠在粗上清液中快速測(cè) 定CphEal含量。測(cè)定的CphEal濃度可以然后結(jié)合至第二個(gè)公式中以估計(jì)要結(jié)合的CGP的所 需量，并且因此純化上清液中全部的CphEal含量。此方案為未來粗制CphEal的生產(chǎn)裝料提 供了 一種可信賴的手段，這些裝料在其蛋白組成方面可能極大地不同。在用于純化CphEal的底物特異性的試驗(yàn)中，不僅CGP被降解，然而，BSA也以較小 的程度被降解。這顯示來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的CGP酶可能分別不如以前表征的來自 病鱔假單胞菌Bl株和巨大芽孢桿菌BAC19株的CphEpa和CphEBm特異。對(duì)此非特異性作用 的更為合理的解釋是在純化的酶溶液中存在少數(shù)其它的蛋白。即使這些蛋白僅在高度濃縮 的樣品和用強(qiáng)烈的硝酸銀染色在SDS-PAGE中可見到；僅極小量的非特異性蛋白酶就可能 對(duì)CGP以外的測(cè)試物質(zhì)產(chǎn)生這樣的作用。來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPI株的CphEal主要被絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc 和 PMSF抑制。這顯示此CGP酶最可能屬于絲氨酸型蛋白酶。這與以前表征的CGP酶；CphB， CphEpa和CphEail的結(jié)果一致。此外，CphEal被色氨酸氧化劑N-溴代琥珀酰亞胺完全抑制，顯 示色氨酸殘基可能參與該酶的分解代謝中。這還指出了 CphEal和細(xì)胞外CphEpa和CphEail之 間的高度相似性。用亮抑酶肽或EDTA處理的CphEal樣品顯示在CGP覆層瓊脂板上沒有活 性抑制，然而，對(duì)用EDTA處理的樣品的HPLC分析顯示CGP酶的抑制為約75%。這是由于在 OPA衍生化期間形成了大量的沉淀物引起，而不是由于酶抑制引起的(0bst，M.等，J.Biol. Chem. 277 :25096-25105(2002) ；Obst, M. Biomacromolecules5 153-161 (2004)) 與 以前表征的分別來自集胞藻屬(SynechoCyStiSSp.)PCC6803、病鱔假單胞菌Bl株和巨大芽 孢桿菌BAC19株的CphB，CphEpa和CphEail相比較，在表3中說明了產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株 的CphEal的生化特性。盡管純化CphEal的幾種特性相對(duì)地類似于CphEpa和CphEBm，但可以 觀察到一些相關(guān)的差異諸如分子大小和最適溫度。對(duì)于CphEal后者為50°C，這是對(duì)于所 有已知CGP酶的最高最適溫度，并且因此，為以純凈形式以及以粗制形式應(yīng)用此酶提供了 極大的益處。純化的酶顯示最適pH范圍為7 8. 5，最適值為8. 5，該范圍偏離了對(duì)粗酶 所測(cè)定的范圍(5. 5 7. 5，最適值為6. 5)。這最可能是由于粗提取物中許多其它蛋白的 存在引起的，所述粗提取物代表了復(fù)雜的環(huán)境；在這種環(huán)境內(nèi)的相互作用可能反過來影響 CGP酶的結(jié)構(gòu)和/或性質(zhì)。細(xì)胞系產(chǎn)堿假單胞菌DIPl于2008年6月10日保藏在DMSZ， Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb,38124Braunschweig, Germany，保藏號(hào)為 DSM 21533。在下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，然而，這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限 制。實(shí)施例
材料和方法樣品采集和樣品制備腸道菌叢樣品采集自剛處死的健康標(biāo)本(表1)。除了反芻 動(dòng)物以外(飼養(yǎng)史不能確定)，所有選擇的動(dòng)物，鳥類和魚類至少部分地自由生活或自由放 牧。通過完全填充50ml無菌falcon試管，從每個(gè)來源動(dòng)物的幾個(gè)部位(表1)以及消化道 采集樣品，樣品在4°C保存?zhèn)溆?。樣品用無菌生理鹽水稀釋(表1)，然后在無菌體檢下過濾 (折紙漏斗，Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)固體物質(zhì)。排泄物樣品在無菌鹽水 中切碎并如上所述過濾。培養(yǎng)基為了富集能夠在厭氧條件下降解CGP的細(xì)菌，應(yīng)用下列的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (BM)每 1 蒸餾水中 l.Og NH4Cl, 3. Og KH2PO4, 3. Og K2HPO4,0. Ig KCl, 0. 5g MgCI2 · 6H20， 0. Ig CaCl2 ·2Η20，0· 5g NaCl,0. 5g半胱氨酸_HC1，0. 5g酵母提取物(除非文中另外指明)， IOml SLlO微量元素溶液，和Img刃天青。pH用KOH調(diào)節(jié)至7. 0。將培養(yǎng)基煮沸，并在加入 Na2S · 9H20至0. 04% (wt/vol)的終濃度后，立即將其轉(zhuǎn)移至含有i^ormier氣體(N2 H2, 95 5%, vol/vol)的氣氛的厭氧培養(yǎng)室(A型-手動(dòng)氣閘；Coy Inc.，Grass Lake, MI, USA)中。在冷卻至室溫后，將IOml等分試樣分配至Hungate試管中，密封，從厭氧培養(yǎng)是中 取出，隨后通過在121°C中高壓滅菌20min而進(jìn)行滅菌。厭氧培養(yǎng)在含有缺少還原劑半胱氨 酸-HCl和Na2S · 9H20的BM培養(yǎng)基的100ml Klett培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。Luria Bertani (LB) J^ 1^ (Sambrook, J.等，Molecular cloning -.a Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)，第二版，Cold Spring Harbor，NY Co Id Spring Harbour Laboratory (1989))用于純化CGP降解細(xì)菌和用于維持有活力的培養(yǎng)物。對(duì)于產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的分離，使用Dufresne, A.等，Macromolecules 31 6426-6433(1998)的改良礦物質(zhì)培養(yǎng)基(SM-medium)；每 1 自來水中，l.Og NH4Cl, 5. Og KH2PO4, Ig MgSO4 · 7H20(滅菌并單獨(dú)地加入)和IOml微量元素儲(chǔ)備溶液。微量元素儲(chǔ) 備溶液含有次氮基三乙酸(70mM, pH 6.5)，F(xiàn)eSO4 · 7H20(5g/l), MnCl2 · 4H20(0. 85g/l)， CoCl2 · 6H20 (0. 14g/l)，CuCl2 · 2H20 (0. 085g/l)，H3BO3 (0. 17g/l)，ZnSO4 · 7H20 (0. 9g/l)，和 Na2MoO4 ·2Η20(0. 09g/l)。培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7. 0丙醚隨后通過在121°C中高壓滅菌20min 而進(jìn)行滅菌。液體培養(yǎng)在帶有擋板的Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中進(jìn)行，并且在Pilotshake RC-4/6-ff 水平式振蕩器(Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)上以 150rpm 孵育。為 了制備 CGP 覆 層瓊脂板，1.2% (wt/vol)細(xì)菌-瓊脂加入至CGP懸液(1 2g/l)中，此混合物隨后通過 在121°C中高壓滅菌20min而進(jìn)行滅菌，冷卻至45°C后，將其傾倒在事先制備的SM瓊脂板 上成為薄層。為了制備CGP覆層瓊脂板，將1.2% (wt/vol)細(xì)菌-瓊脂加入至CGP懸液(1 2g Γ1)中，此混合物隨后通過在121°C中高壓滅菌20min而進(jìn)行滅菌，冷卻至45°C后，將其 傾倒在事先制備的SM瓊脂板上成為薄層。CGP的來源和分離“重組”CGP分離自富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16-PHB-4-Aeda(pBBRl MCS-2: :cphA6308/edaH16)的細(xì)胞(Voss, I.等，Metabol. Eng. 8 :66-78(2006))并根據(jù)改良 的酸提取法純化(Frey,K. Μ.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :3377-3384 Q002))。CGP 根 據(jù)以前對(duì)于藍(lán)細(xì)菌所述的方法分離自螺旋藻市售產(chǎn)品(Simon，R. D.等，Biochim. Biophys. Acta 420 :165-176(1976))。
為了以較大的規(guī)模分離和純化CGP，酸提取法(Frey, K. M.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :3377-3384(2002))如下進(jìn)行優(yōu)化；含CGP的干物質(zhì)懸浮在自來水中得到 0. lg/ml的終濃度。pH用濃HCl (32% )降低至1并攪拌過夜。懸液用CEPA Z61連續(xù)離心機(jī) (CEPA,Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Germany)以 17000rpm離心，片狀沉淀物 重新懸浮在201 HCl 0. IN中，攪拌lh，再次離心，將上清液加入至第一批裝料中，并棄去片 狀沉淀物。用NaOH (50% )在301玻璃瓶中中和含CGP的上清液(pH 7. 3)，使得CGP沉淀。 使乳狀懸液放置在4°C澄清過夜，然后棄去上清液。反復(fù)溶解CGP并中和三次以上以去除所 有在稀HCl中不溶的雜質(zhì)。得到的CGP溶解在301 HCL 0. IN中，并通過0. 2μπι Sartobran-P 00 型過濾裝置(Sartorius AG，Gottingen，Germany)。溶液再次用 NaOH 中和(pH 7. 3)，放置 澄清過夜，棄去上清液。為了去除任何水溶性雜質(zhì)和使CGP脫鹽，片狀沉淀物用5柱床體積 的蒸餾水連續(xù)洗滌3次。最后，CGP片狀沉淀物以20000rpm離心(CEPA Z41連續(xù)離心機(jī))， 在-30°C冷凍和在 BETA 1-16 型凍干機(jī)(Christ Gefriertrocknungsanlagen, Osterode, Germany)凍干。CGP的滅菌為了制備CGP的無菌儲(chǔ)備懸液，二乙醚以3 1 (vol/wt)的比率加入 至CGP。15min后，棄去溶劑，完全蒸發(fā)后，通過將CGP溶解在無菌0. IN HCl中，然后通過 加入等體積的無菌0. IN NaOH在pH 7. 3下將聚合物沉淀，而獲得懸浮液。備選地，CGP首 先溶解在 0. IN HCl 中，通過濾器(孔徑 0. 2 μ m，Millipore GmbH, Eschborn，Germany)并 且最終如上所述再沉淀。通過短暫離心(3500Xg，2分鐘)沉降CGP，或通過使CGP放置在 4°C沉積過夜來調(diào)節(jié)儲(chǔ)備溶液中CGP的濃度。在兩種情況下，然后部分棄去上清液，從而最 終獲得所需濃度的CGP。在含有帶有或不帶有0. 5g Γ1酵母提取物的10ml BM的厭氧制備 的Himgate試管中進(jìn)行厭氧CGP降解的試驗(yàn)。將無菌CGP懸液直接注入至厭氧制備的BM Himgate試管中至Ig Γ1的終濃度?？吹皆嚬苤蠧GP消失指示其降解。為了制備CGP覆層 瓊脂板，將1.2% (wt/vol)細(xì)菌-瓊脂加入至CGP懸液中，此混合物隨后通過在121°C中高 壓滅菌20min而進(jìn)行滅菌，冷卻至45°C后，將其傾倒在事先制備的SM瓊脂板上成為薄層。哺乳動(dòng)物、禽類和龜類腸道菌叢對(duì)CGP的厭氧件降解為了模擬獲取菌叢樣品的 生活環(huán)境的自然條件，制備的樣品用作接種物和同時(shí)用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。含有在BM培養(yǎng)基 (不含酵母提取物)中的Ig Γ1 CGP的無菌厭氧Himgate試管接種至10%的終濃度，并在 37 °C中孵育直至CGP降解出現(xiàn)。在腸道菌叢中篩選CGP降解細(xì)菌為了分離CGP降解細(xì)菌，100 μ 1等分試樣的已 制備的菌叢樣品涂布在厭氧制備的帶有CGP覆層的BM瓊脂板上。在37°C孵育幾天期間，檢 查各板中由CGP降解細(xì)菌集落導(dǎo)致的暈圈(halo)的出現(xiàn)。在孵育期間，還應(yīng)用集落計(jì)數(shù)步 驟以確定CGP降解細(xì)菌集落和非降解集落之間的比率。CGP降解純件培養(yǎng)物的分離選擇形態(tài)學(xué)不同的CGP降解細(xì)菌集落并通過將來自 顯示降解暈的集落的物質(zhì)轉(zhuǎn)移至新鮮的CGP覆層瓊脂板上進(jìn)行三次連續(xù)傳代而進(jìn)一步純 化。在LB瓊脂板上應(yīng)用另外三次純化步驟，然后在CGP覆層瓊脂板上測(cè)試純性培養(yǎng)物以確 認(rèn)它們保留了降解CGP的能力。純度對(duì)照分離的純性培養(yǎng)物的純度通過顯微鏡，且還通過在不同的培養(yǎng)基上在 厭氧以及需要條件下培養(yǎng)定期地確認(rèn)。分析技術(shù)游離氨基酸和小肽(CGP-二肽)通過反相HPLCQiontron Instruments,Neufahrn, Germany)檢測(cè)，在檢測(cè)前它們的游離氨基用鄰苯二甲醛(OPA)試劑如前所述 (Aboulmagd, E.等，Arch. Microbiol. 174 :297-306(2000))進(jìn)行柱前衍生化。對(duì)于 CGP 樣 品的分析，聚合物預(yù)先進(jìn)行酸水解(6N HC1，95°C，過夜)。同樣，應(yīng)用酸水解以進(jìn)行二肽構(gòu) 成的氨基酸的定性和定量確認(rèn)。HPLC系統(tǒng)安裝有B801柱(Pr印Nova-Pak HR 3. 9x300) (Knauer GmbH, Berlin, Germany)，并用起始洗脫液(81%，vol/vol，硝酸鈉(50mM) 19%, vol/vol，甲醇)平衡。氨基酸的OPA衍生物用甲醇梯度(19 75%，vol/vol)在40°C中和 以1. 0ml/min的流速洗脫，然后采用1046A型熒光檢測(cè)儀(Hewlett Packard, ffaldbronn, Germany)在330/450nm(激發(fā)/發(fā)射)下進(jìn)行熒光檢測(cè)。為進(jìn)行校準(zhǔn)，使用色譜純的氨基 酸(來自 Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Germany 的 Kollection AS-10)或使用通 過采用產(chǎn)堿假單胞菌DIPl的細(xì)胞外CGP酶(CphEal)通過CGP的完全酶法水解產(chǎn)生的二肽 (Sallam, A.等，已投稿待發(fā)表(2008) )0在將Klett-培養(yǎng)瓶插入至 Eppendorf IlOlM 分光光度計(jì)(Eppendorf，Hamburg， Germany)后，通過測(cè)量578nm處的濁度增加監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)。在硅膠60 板(Merck，Darmstadt, Germany)上應(yīng)用薄層色譜(TLC)分析，HPLC 的 起始稀釋液也用作TLC的rum緩沖液，為進(jìn)行染色，應(yīng)用丙酮中的20% (wt/vol)茚三酮溶 液。在電泳示蹤緩沖劑(Laemmli)后在11. 5% (wt/vol)凝膠中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚 丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，U.K.，Nature 227 :680-685 (1970)。蛋白和藻青素用考 馬斯染色法染色(Weber, K.等，J. Biol. Chem. 244 :4406-4412 (1969))，之后用銀染法染色 (Heukeshoven, J.等，Electrophoresis 6:103-112(1985))使得較低濃度的蛋白顯現(xiàn)。DNA提取和16S rRNA基因的分析來自純性培養(yǎng)物的全基因組DNA的分離如前所 述進(jìn)行(Rao，R.N.等，Methods Enzymol. 153 166-198 (1987))。16S rRNA 基因通過 PCR 從 總DNA使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸引物(MWG-BI0TECH AG, Ebersberg, Germany)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn) 物使用 Nucleo-trap CR 試劑盒(Macherey-Nagel，Duren, Germany)純化，然后直接測(cè)序。 DNA測(cè)序在臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(W. W. U. Munster，Germany)在毛細(xì)管測(cè)序儀(ABI Prism 3730DNA分析儀)上定制進(jìn)行，并且序列通過數(shù)據(jù)采集軟件v3. 0 (均獲自Applied Biosystems，Darmstadt，Germany)進(jìn)行分析。使用BigDye 終止子v3. 1循環(huán)測(cè)序試劑盒 (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)根據(jù)生產(chǎn)廠商說明的步驟和下列的測(cè)序引物 制備序列反應(yīng)
0130]27f (5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘ ；SEQ ID NO 1),
0131]343r(5' -CTGCTGCCTCCCGTA-3‘ ； SEQ ID NO 2)，
0132]357f (5' -TACGGGAGGCAGCAG-3‘ ； SEQ ID NO 3)，
0133]519r(5' -G(T/A)-ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3‘ ；SEQ ID NO :4)，
0134]536f(5' -CAGC(C/A)GCCGCGGTAAT(T/A)C_3‘ ； SEQ ID NO : 5)，
0135]803f(5' -ATTAGATACCCTGGTAG-3‘ ；SEQ ID NO :6)，
0136]907r(5' -CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3‘ ； SEQ ID NO :7)，
0137]1114f (5' -GCAACGAGCGCAACCC-3‘ ；SEQ ID NO :8)，
0138]1385r(5' -CGGTGTGT(A/G)CAAGGCCC-3‘ ； SEQ ID NO :9)禾口
0139]1525r(5' -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3‘ ；SEQ ID NO :10)
0140](MWG-BI0TECH AG, Ebersberg, Germany)。
序列分析和比對(duì)，以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建如前所述進(jìn)行(Mllam，Α.等，已投稿 待發(fā)表Ο008))核酸序列數(shù)據(jù)用Contig匯編程序(CAP)在線軟件分析。序列與以前發(fā) 表的代表性菌株和其它細(xì)菌的序列使用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫上獲得的 blast功能進(jìn)行比對(duì)。參考序列使用ClustalX 1. 8軟件進(jìn)行比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹使用程序 TreeViewl. 6. 5和NJplot構(gòu)建。應(yīng)用靴帶法(Bootstraping)通過進(jìn)行100次重排來評(píng)價(jià) 樹形布局。以5001規(guī)模的培養(yǎng)在Biostat D650不銹鋼生物反應(yīng)器(B. BraunBiotech International, Melsungen，Germany)中進(jìn)行5001規(guī)模的培養(yǎng)，該反應(yīng)器的總體積為 6501(6km內(nèi)徑和198cm高度)以及d/D值關(guān)系(攪拌器直徑與容器直徑的關(guān)系)為 0. 375。此生物反應(yīng)器安裝有三個(gè)攪拌器，每個(gè)含有6個(gè)槳和Fimda-Foam機(jī)械消泡器 (B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany)。另夕卜，多個(gè)孑L用于可滅菌探 頭測(cè)量溶解氧(PO2) (25 型；Mettler Toledo GmbH, Steinbach, Switzerland), pH(Pa/25 型；Mettler-Toledo GmbH),泡沫(L300/Rd. 28 型；B. Braun BiotechInternational, Melsungen, Germany),溫度(pt 100 電極；Μ. K. Juchheim GmbH, Fulda, Germany),禾口 850nm 處的光密度(CT6型；Sentex/Monitek Technology Inc. ) 0操作由數(shù)字控制裝置結(jié)合 MFCS/win軟件包(B. Braun Biotech hternational)控制和記錄。培養(yǎng)在30°C中完成， 且PO2調(diào)節(jié)至在培養(yǎng)基中超過40 %飽和度，其自動(dòng)地通過攪拌控制，通風(fēng)率穩(wěn)定地保持在 0. 7vvm(體積/體積X分鐘)。培養(yǎng)基的初始pH為6. 9且在生長(zhǎng)期間耐受增加至7. 5的 pH，否則，通過加入4N HCl控制pH。細(xì)胞分離，上清液蛋白的濃縮和脫鹽細(xì)胞通過用CEPA Z41型或Z61型連續(xù)離 心機(jī)(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Germany)離心收獲。使用 COP(截留 點(diǎn)(cut-off point))為 30kDa 和帶有Sartocon 2Plus 型(Sartorius AG, Gottingen, Germany)不銹鋼支架的錯(cuò)流Sartocon 聚醚砜_盒濃縮分子大小超過30kDa的蛋白并隨 后脫鹽(5柱床體積的H2O)。在不同底物上生長(zhǎng)在IOOml帶有擋板的Klett培養(yǎng)瓶中研究底物利用；每個(gè)培 養(yǎng)瓶含有IOml SM培養(yǎng)基和Ig Γ1下列底物之一乳酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、丙 酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖、果糖、蔗糖和甘油。所有底物的儲(chǔ)備溶液通過過濾(孔徑0.2um， Millipore GmbH, Eschborn, Germany)滅菌。試驗(yàn)一式兩份地進(jìn)行，接種在相同測(cè)試條件下 生長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)物。在30°C中M小時(shí)孵育期后通過OD578nm的增加監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)。藻青素的發(fā)酵生產(chǎn)使用帶有質(zhì)粒pMa/c5-914 CphArce68tl3的大腸桿菌DHl的 重組菌株以 500-1 規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn) CGP (Frey, K. M.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 3377-3384 (2002))。作為底物和培養(yǎng)基，使用以前應(yīng)用的protamylasse (Avebe, Veendam, The Netherlands)培養(yǎng)基，并如(Elbahloul，Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 7759-7767 (2005))所述通過稀釋、篩分和離心制備。為了測(cè)定用于CGP生產(chǎn)的protamylasse的可利用裝料的最適濃度，在濃度為4 8% (vol/vol)的protamylasse培養(yǎng)基上的IOOml培養(yǎng)物在200ml帶擋板的培養(yǎng)瓶中測(cè)試； 培養(yǎng)基的PH為7. 5，并且含有IOOmgr1氨芐西林。接種后，培養(yǎng)瓶在37°C中孵育1 并振 搖(120rpm) (G 25 型振蕩器，New Brunswick Scientific GmbH, Nurtingen, Germany)，最 后，在來自每個(gè)培養(yǎng)瓶的50ml樣品中估計(jì)CGP含量。
30
在發(fā)酵之前，16-1預(yù)培養(yǎng)物培養(yǎng)在2-1帶擋板的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶含有1-1 protamylasse 培養(yǎng)基(7% ；vol/vol, pH 7. 5) UOOmg Γ1 氨節(jié)西林和 0. 15% (vol/vol)含 硅消泡乳液(50% ；vol/vol, Wacker Silicones, Burghausen, Germany)，并在 30°C 中孵育 20h 并振搖(llOrpm，RC-6-W 型振蕩器，Adolf Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland).在不銹鋼生物反應(yīng)器(B. Braun Biotech International,Melsungen,Germany)中 進(jìn)行主要培養(yǎng)，該反應(yīng)器的總體積為6501 (6km內(nèi)徑和198cm高度)以及d/D值關(guān)系(攪 拌器直徑與容器直徑的關(guān)系)為0.375。該生物反應(yīng)器安裝有三個(gè)攪拌器，每個(gè)含有6個(gè) 獎(jiǎng)禾口 Funda-Foam 機(jī)械消泡器(B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany)。 另外，多個(gè)孔用于可滅菌探頭測(cè)量溶解氧(PO2) (25型；Mettler Toledo GmbH, Steinbach, Switzerland)，pH (Pa/25 型；Mettler-iToledo GmbH),泡沫(L300/Rd.沘型；B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany),溫度(pt 100 電極；Μ· K. Juchheim GmbH, Fulda，Germany)，和 850nm 處的光密度(CT6 型；Sentex/Monitek Technology Inc.) 操作 由數(shù)字控制裝置結(jié)合MFCS/win軟件包(B. Braun Biotech International)控制和記錄。該生物反應(yīng)器填充以400-1 7% protamylasse-培養(yǎng)基(pH 7. 5)和75ml消泡溶 液，原位滅菌，并在冷卻至30°C后，加入IOOmg Γ1無菌氨芐西林溶液后，接種以4% (vol/ vol)預(yù)培養(yǎng)物。在30°C中進(jìn)行第一個(gè)Mi的培養(yǎng)，通過加入6M NaOH或6M HCl將培養(yǎng)基的 PH保持在7. 5。p02恒定地保持20%飽和度，并自動(dòng)地通過攪拌調(diào)節(jié)，通風(fēng)率穩(wěn)定地保持在 0. 17vvm(體積/體積X分鐘)。他孵育后，溫度升高至37°C直至發(fā)酵結(jié)束。細(xì)胞通過用 CEPA 型 Z61 連續(xù)離心機(jī)(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Germany)離心收獲。CGP的大規(guī)模提取和純化為了從得到的濕生物質(zhì)獲得純的CGP，應(yīng)用以前優(yōu) 化的用于大規(guī)模提取和純化CGP的酸提取法(Milam，Α.，和A. Steinbuchel. 2008b. Biotechnological process for the technical productionof β —dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產(chǎn)β _ 二肽的生物工藝方法)Under preparation. (準(zhǔn)備中))。最后，提取的CGP在-30°C中冷凍，并在BETA 1_16型凍干機(jī)(Christ Gefriertrocknungsanlagen，Osterode，Germany)中凍干。CGP的滅菌CGP通過二乙醚滅菌或如前所述通過溶解在0. IN HCl中并過濾 滅菌(Sallam, Α.禾口 A. Steinbuchel. 2007b. Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other three co-isolates in the mixed bacterial consortium.(反石肖化 細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株對(duì)藻青素的厭氧和需氧降解-混合細(xì)菌聚生體中其它三種共分 離物的作用)已投稿待發(fā)表)。通過短暫離心O800Xg，2分鐘)沉降CGP，或通過使CGP 放置在4°C沉積過夜來調(diào)節(jié)儲(chǔ)備溶液中CGP的所需濃度，然后部分棄去上清液，以獲得所需 濃度的CGP。分析技術(shù)在將Klett-培養(yǎng)瓶插入至Klett-光度計(jì)(Manostat Corporation, New York, USA)后，通過測(cè)量濁度變化，或通過用Libra S5光度計(jì)(Biochrom Ltd., Camebridge, UK)測(cè)量600nm處Iml樣品的OD來監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)和CGP降解。在電泳示蹤緩 沖劑(Laemmli)后在11. 5% (wt/vol)凝膠中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，U. K.，Nature 227 :680-685(1970)。在(Lacks，S. Α.等，J. Biol. Chem. 225 7467-7473(1980))后進(jìn)行蛋白的凝膠中復(fù)性。蛋白和藻青素用考馬斯染色法染色(Weber，K.等，J. Biol. Chem. 244 :4406-4412 (1969))，或用銀染法染色(僅用于蛋白)(Nesterenko, Μ. V.等，J. Biochem. Biophys. Methods 3:239-242(1994))?！た偟鞍缀?CGP 的濃度使用 Bradford 試劑如(Elbahloul，Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767(2005))所 述測(cè)定。從 CGP-二肽中通過使用 IOkDa-膜 Vivaspin 管(Vivascience AG, Hannover, Germany)或使用帶有用于較大體積的 IOkDa-膜(Millipore Corporation, Bedford, USA) 的Amicon-室(Amicon，Beverly, USA)通過超濾濃縮、脫鹽和分離培養(yǎng)樣品中的大尺寸蛋 白。游離氨基酸和二肽通過反相 HPLC(Kontron Instruments, Neufahrn, Germany)檢測(cè)， 在檢測(cè)前它們的游離氨基用鄰苯二甲醛(OPA)試劑如前所述(Aboulmagd，Ε.等，Arch. Microbiol. 174 :297-306(2000))進(jìn)行柱前衍生化。對(duì)于CGP或CGP-二肽的構(gòu)成氨基酸的 分析，樣品預(yù)先進(jìn)行酸水解(6N HC1，95°C，過夜)。HPLC系統(tǒng)安裝有B801柱(Pr印Nova-Pak HR 3. 9x 300) (Knauer GmbH, Berlin, Germany)，并用起始洗脫液(81%，vol/vol，硝酸鈉 (50mM) :19%，V01/V01，甲醇)平衡。氨基酸的OPA衍生物用甲醇梯度(19-75%，vol/vol) 在40°C中以1. Oml/min的流速洗脫，然后采用1046A型熒光檢測(cè)儀(Hewlett Packard, ffaldbronn, Germany)在330/450nm(激發(fā)/發(fā)射)下進(jìn)行熒光檢測(cè)。CphE2l活件和濃度的測(cè)定藻青素酶(CphEal)的活性通過小等分試樣的濃縮 酶溶液在CGP覆層瓊脂板上形成降解暈來檢查，為此，5ml培養(yǎng)物樣品以^OOx g離心 30min (Megafuge 1. OR, Heraeus Sepatech GmbH, Osterode, Germany)并且 4ml 所得上清 液通過超濾離心100倍。對(duì)于培養(yǎng)樣品中酶的定量測(cè)定，開發(fā)了如下的光度測(cè)定法2μ 1 濃縮的培養(yǎng)上清液加入至Iml CGP懸液(IOOmg Γ1)中并在試管旋轉(zhuǎn)器中(3rpm，502S型， Watson-Marlow GmbH，Rommerskirchen，Germany)在 30°C中孵育 30min。最后，測(cè)量樣品的 OD6tltlnm以指示由于降解而引起的CGP量的減少；此反過來通過各自的校準(zhǔn)曲線用來指示溶 液中CphEal的濃度。CGP降解的最適濃度和條件使用前面使用產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株(&illam，A.，和 A.Steinbuchel. 2008b. Biotechnological process for the technical production of β-dip印tides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產(chǎn)β-二肽的生物工藝方法) Under preparation.(準(zhǔn)備中))獲得的粗制CphEal粉末，并且測(cè)量CGP濃度和粗制CphEal 之間關(guān)于所需降解時(shí)間的最適比率，在Eppendorf管中制備純CGP懸液(水中，pH 7.3)的 系列稀釋液(50 IOOg Γ1)，每個(gè)稀釋液總體積為1ml，將不同量的粗制CphEal粉末[4. 6% (WtzVt)CphEal含量]加入至每種制備的CGP濃度中，反應(yīng)管在試管旋轉(zhuǎn)器(3rpm)中在30°C 中孵育以揭示用于CGP完全降解所需的孵育時(shí)間。在含有Iml CGP懸液(IOOg Γ1)的Eppendorf管中進(jìn)行測(cè)定CGP降解的最適pH 的試驗(yàn)，懸液的pH值為5. O 9. 0，反應(yīng)管含有另外的IOg Γ1粗制CphEal,并且在30°C中 孵育30min。用于最適降解溫度的反應(yīng)混合物含有類似濃度的CGP(pH 7.0)和CphEal并在 15、20、25、30、35、37、40、50、60或70°C中孵育30min。兩個(gè)試驗(yàn)后，所有試管中的CGP降解 以百分比進(jìn)行計(jì)算并一起進(jìn)行比較。通過有機(jī)溶劑和硫酸銨沉淀純化CphEd :1ml濃度為10 100 % (vol/vol)的冷 乙醇、丙酮或甲醇加入至Eppendorf管中的50 μ 1濃縮的粗制CphEal溶液(14g Γ1)中，反 應(yīng)混合物在_20°C中孵育60min。反應(yīng)管以16000x g離心5min后，片狀沉淀物干燥并重懸 在50 μ 1磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)中。通過在IOml粗制CphEal溶液(3. 5g Γ1)中逐步增加硫酸銨飽和度百分比(10 100% )來進(jìn)行硫酸銨分級(jí)分離，在每個(gè)步驟中，試管在室溫下 孵育30min并以16000x g離心lOmin，片狀沉淀物懸浮在磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)中，然后 通過超濾脫鹽。所有蛋白沉淀物測(cè)定CGP覆層瓊脂板上的CGP降解以及SDS-PAGE中的蛋
白含量。CphE2l的特異件底物純化根據(jù)粗提取物中的酶與其不溶性底物(CGP)的強(qiáng)親和 力開發(fā)CphEal的純化方法，其中僅CphEal與CGP結(jié)合，并且因此可以通過沉淀收獲。為了確 定在pH 7. O下酶與CGP的完全結(jié)合所需的時(shí)間，0. 5ml濃縮的粗制CphEal溶液(14g Γ1) 加入至0.5ml CGP懸液(IOOg Γ1)中。在每次首個(gè)10分鐘孵育后，測(cè)試來自反應(yīng)上清液的 2 μ 1等分試樣(短暫離心后)在CGP覆層瓊脂板上的降解活性，降解暈的消失指示
CGP的完全結(jié)合。實(shí)際純化過程在類似的Iml反應(yīng)混合物中進(jìn)行，并且如下進(jìn)行在CphEal 與CGP完全結(jié)合后，混合物離心30秒(16000Xg)，棄去上清液，并且片狀沉淀物用IOml磷酸 鈉緩沖液(50mM)洗滌5次。之后，片狀沉淀物懸浮在Iml磷酸鹽緩沖液中，并在30°C中在 旋轉(zhuǎn)(3rpm)下孵育過夜直至發(fā)生CGP的完全降解?；旌衔镫x心(5min，16000xg)，然后通過 超濾去除CGP- 二肽，并且通過SDS-PAGE分析上清液的濃縮蛋白級(jí)分的純度。來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的CDhE2l的表征為了確定純化的CphEal的溫度穩(wěn)定 性，10 μ 1等分試樣在不同的溫度(10 80°C )下孵育20min，然后其中3μ 1在30°C中測(cè) 試在CGP覆層瓊脂板上的降解活性。對(duì)于最適降解溫度，3 μ 1等分試樣的純化CphEal溶液 加入至Iml CGP懸液(50mM磷酸鈉緩沖液中的IOOg l-SpH 7.0)并在不同的溫度(10,20, 30，40，45，50和60°0下孵育20min。對(duì)于純化CphEal對(duì)CGP的最適降解pH，3 μ 1等分試樣 的純化CphEal儲(chǔ)備溶液加入至Iml具有不同pH值(5，5. 5，6，6. 5，7，7. 5，8，8. 5或9)的CGP 懸液(50mM磷酸鈉緩沖液中的IOOg Γ1)并在30°C中孵育30min。最后，如上所述在兩個(gè)試 驗(yàn)的反應(yīng)管中光度法測(cè)定CGP降解。如前所述測(cè)試純化CphEal對(duì)下列多肽底物的底物特異 性(0bst，M.等，Biomacromolecules 5 :153-161(2004)) :CGP，牛酪蛋白(Hammersten-級(jí)) (Merck, Darmstadt, Germany),牛血清白蛋白(BSA) (Roth, Karlsruhe, Germany)禾口聚(a, β -D/L-天冬氨酸)(Bayer AG, Leverkusen, Germany)。為了揭示酶抑制劑對(duì)純化CphEal的作用，50 μ 1等分試樣的純化酶儲(chǔ)備溶液 加入至450 μ 1磷酸鈉緩沖液(50mM)并在下列基團(tuán)特異性抑制劑(Group-specific inhibitors)的存在下在30°C中孵育池亮抑酶肽(巰基蛋白酶)，EDTA(金屬蛋白酶)， Pefabl0C(絲氨酸蛋白酶)，PMSF(絲氨酸蛋白酶)或N-溴代琥珀酰亞胺(色氨酸殘基)。 測(cè)定每種反應(yīng)混合物的5 μ 1樣品在CGP覆層瓊脂板上的活性。之后，5 μ 1等分試樣的CGP 儲(chǔ)備懸液(50g Γ1)加入至反應(yīng)管，孵育另外15min，離心和經(jīng)HPLC篩選降解產(chǎn)物。實(shí)施例1來自哺乳動(dòng)物、禽類和鳥類腸道菌叢的樣品對(duì)CGP的厭氧降解過濾的菌 叢樣品含有大量的不同細(xì)菌以及高含量的底物。為了模擬獲得這些樣品的消化道內(nèi)的自然 條件，菌叢溶液用作接種物并且同時(shí)用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。含有BM培養(yǎng)基和作為唯一底物的Ig F1CGP的無菌厭氧Himgate管以10%的濃度接種。所有接種的厭氧管顯示在這些條件下完 全降解CGP。在試管中完全降解CGP所需的孵育時(shí)間為12-4 的范圍。在腸道菌叢中篩選CGP降解細(xì)菌為了分離CGP降解細(xì)菌，100 μ 1等分試樣的已 制備的菌叢樣品涂布在CGP覆層瓊脂板上。在37°C中孵育幾天期間，瓊脂板顯示CGP降解 細(xì)菌的出現(xiàn)在不同的菌叢之間變化很大(表1)。在來自兔(埃及)、綿羊(德國(guó))的盲腸菌叢和來自鯉魚(德國(guó))的消化道菌叢的情況下出現(xiàn)最高的發(fā)生率。降解集落的形態(tài)學(xué)特 征，所需的孵育時(shí)間和由CGP降解導(dǎo)致的暈圈(halos)的形式和強(qiáng)度在不同的菌叢樣品以 及每個(gè)樣品內(nèi)的集落間變化也很大。這指示存在有具有各種各樣的CGP降解能力的獨(dú)特的 細(xì)菌物種。CGP降解株的分離和純化選擇形態(tài)學(xué)上獨(dú)特的CGP降解細(xì)菌集落并通過將顯示 降解暈的集落轉(zhuǎn)移至新鮮的CGP覆層瓊脂板而進(jìn)一步純化。在純化工作期間，許多CGP降 解集落喪失了其作為純性培養(yǎng)物誘導(dǎo)降解暈的能力，并且因此被丟棄。同樣，幾種CGP降解 群顯示非常難以作為純性培養(yǎng)物獲得，并且也被忽略而不進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟。另一方 面，純化階段產(chǎn)生62個(gè)純性培養(yǎng)物，它們顯示形態(tài)學(xué)上獨(dú)特的特征且保留了 CGP降解的能 力。如表1中所證明，CGP降解細(xì)菌分離自每種動(dòng)物的沿消化道的不同部位。這與關(guān)于例 如反芻動(dòng)物中飲食蛋白的降解所已知的事實(shí)相符；而瘤胃是飲食蛋白的主要降解部位，未 消化的蛋白(過瘤胃蛋白(bypass或escape protein))隨著消化物移動(dòng)至下消化道，在此 其一部分被動(dòng)物的酶破壞或被下消化道菌叢破壞，然后被吸收，之后剩余物被排泄。過瘤胃 蛋白的降解對(duì)于特殊生理功能是很重要的，諸如產(chǎn)奶(Holter，J. B.等，J. Dairy. Sci. 76 1342-1352(1993))。鈍件培養(yǎng)物在厭氧,和需氧,備件下降解檢驗(yàn)62個(gè)純性培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中在 需氧條件下降解CGP的能力。這在含有Ig Γ1 CGP和0.5g Γ1酵母提取物的BM培養(yǎng)基中 進(jìn)行，并且顯示所有純性培養(yǎng)物降解CGP的能力(表1)。在除還原劑以外含有類似培養(yǎng)基 的Hungate管中的厭氧CGP降解試驗(yàn)表明在62個(gè)分離株中，46個(gè)也能夠厭氧性降解CGP。 這些中，38個(gè)完全地降解CGP，而剩余的顯示部分降解CGP。純性培養(yǎng)物厭氧降解CGP所需 的孵育時(shí)間的范圍為在37°C中24h至7天。CGP的降解產(chǎn)物在需氧和厭氧培養(yǎng)中62個(gè)純分離物對(duì)CGP完全降解后，立即通 過HPLC測(cè)定培養(yǎng)上清液中CGP的降解產(chǎn)物，在HPLC測(cè)定之前如方法章節(jié)中所述用OPA試 劑進(jìn)行柱前衍生化。如預(yù)期的那樣，HPLC分析表明所有分離物將CGP降解為構(gòu)成其的二 肽。對(duì)之前已經(jīng)進(jìn)行酸水解的上清液樣品的類似分析表明存在三種構(gòu)成CGP的氨基酸天 冬氨酸，精氨酸和賴氨酸。后三種氨基酸的檢測(cè)依照重組CGP的已知組成，該重組CGP應(yīng) 用于這些試驗(yàn)中，其中約6Mol%的精氨酸部分用賴氨酸替換(Voss，I.等，Metabol.Eng.8 66-78(2006))。CGP降解純性培養(yǎng)物的分類學(xué)隸屬關(guān)系分離的純性培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)特征 提示約50%的分離物屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，而其余的分離物屬于其它的屬包括鏈 霉菌屬和小單孢菌屬。為了對(duì)檢驗(yàn)的腸道菌叢中CGP降解細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生提供更清楚的理 解，來自62個(gè)菌株的8個(gè)菌株進(jìn)一步通過16S rDNA測(cè)序鑒定。如表中所示，三種分離物 分別來自綿羊(德國(guó))的瘤胃菌叢、火雞(埃及)的盲腸菌叢和羅非魚(埃及)的消化道 菌叢的17，35，49，被鑒定為芽孢桿菌屬的成員，它們與巨大芽孢桿菌AC46bl，巨大芽孢桿 菌MPF-906和B. KoguryoaeSMC4352-2T的16S rDNA序列相似性分別超過99%。兩種分離 物來自奶牛(德國(guó))的結(jié)腸菌叢和鴿子(埃及)的盲腸菌叢的15和47發(fā)現(xiàn)屬于短芽孢 桿菌屬，它們與羅伊茲氏芽孢桿菌(B. reuszeri)DSM9887T和短芽孢桿菌SE004的16S rDNA 序列相似性分別超過98%。分離自兔盲腸(德國(guó))的株31隸屬為鏈霉菌屬，其與阿維鏈 霉菌(S. avermitilis)NCIMB 12804τ的序列相似性超過98%。16S rDNA序列分析還顯示 來自鴨盲腸(德國(guó))的株38屬于小單孢菌屬，并且與小單孢菌0138種的序列相似性超過
3499%。最后，在鑒定的分離物中還發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬的代表來自鯉魚(德國(guó))的株52顯 示與CGP降解細(xì)菌產(chǎn)堿假單胞菌DIPl的16S rDNA序列相似性超過99%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)顯示來自各種動(dòng)物、禽類和魚類菌叢的8個(gè)鑒定株與它 們密切相關(guān)的菌株和與其它細(xì)菌之間的關(guān)系。此外，在系統(tǒng)發(fā)育樹中證明了所有能夠細(xì)胞 外降解CGP的已知細(xì)菌的分類學(xué)位置。此外表2提供了對(duì)能夠細(xì)胞外降解CGP的細(xì)菌的廣 泛分布、生活環(huán)境和系統(tǒng)發(fā)生的概述。鈍頂螺旋藻市售產(chǎn)品中的CGP:市場(chǎng)名稱螺旋藻，其常常與幾種營(yíng)養(yǎng)益處相關(guān), 并且因此用作用于人和動(dòng)物的添加劑(Narasimha, D. L. R.等，J. Sci. Food Agric. 33 456-460 (1982) ；Kihlberg, R. ， A. Rev. Microbiol. 26 :427-466 (1972) ；Lu, J.等, Aquaculture 254 :686-692(2004) ；Ross, Ε.，Poult-Sci. 69 :794-800 (1990)))。為 了研究 研究這是否與CGP的存在相關(guān)，在德國(guó)市場(chǎng)可獲得的三種螺旋藻產(chǎn)品檢查CGP的存在。兩 禾中產(chǎn)品；來自 Sanatur GmbH (Singen, Germany)禾口 Greenvally GmbH (Berlin, Germany)由 100%鈍頂螺旋藻組成，而第三種變種來自AuricaGmbHGctiwallDach-Elm，Germany)，其含有 40%。通過在CGP分離之前研磨成細(xì)粉制備這三種產(chǎn)品的每一種的IOg CDM，此對(duì)應(yīng)于大約 普通日劑量的兩倍。三種市場(chǎng)變種分別0.06%，0. 13%和0. 15%的CGP含量。如期望的， 分離的CGP的水解樣品的驗(yàn)證性HPLC分析表明，藍(lán)細(xì)菌CGP的典型構(gòu)成性氨基酸為天冬 氨酸和精氨酸。^MM 2 開發(fā)用干從CGP牛產(chǎn)β - 二flt的Jli舌方法首先以小規(guī)模優(yōu)化幾個(gè)因 素，例如；所需要的合適和經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基，高度濃縮的CGP懸液，其在實(shí)踐中可以被制備用 于降解，和規(guī)定細(xì)胞外酶在相對(duì)短的孵育期內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全的CGP降解的必需量。在CphE的制備期間，由于加入誘導(dǎo)物(CGP)和其隨后的降解，OD600nm的變化代表 CphE釋放的明確跡象，因此，清亮的培養(yǎng)基和細(xì)胞的可控生長(zhǎng)是必需的，這通過材料和方法 章節(jié)中提及的最終培養(yǎng)基組成來實(shí)現(xiàn)。而且，在測(cè)試的底物中，產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株顯示 在檸檬酸鹽上生長(zhǎng)最好(圖幻，作為唯一底物的檸檬酸鹽的施用濃度(lg/Ι)確保合理但同 時(shí)在誘導(dǎo)和降解階段期間確保培養(yǎng)物可控的生長(zhǎng)濁度。為了測(cè)定用于大規(guī)模方法的降解階段(階段III，見下)的CGP和粗制CphE濃度之 間的平衡比率，進(jìn)行下列小規(guī)模試驗(yàn)；在Eppendorf管中制備純CGP懸液(在水中，pH 7. 3) 的系列稀釋液(10 50g/l)，每個(gè)管中的總體積為1ml。此外，對(duì)每個(gè)制備的CGP濃度測(cè)試 粗制CphE的系列稀釋液(1 10g/l)，反應(yīng)管在30°C中在試管旋轉(zhuǎn)器中以3rpm的旋轉(zhuǎn)速 度孵育。試驗(yàn)顯示當(dāng)施用較低濃度的粗制CphE時(shí)，CGP降解時(shí)間的相對(duì)恒定的增加。最高 測(cè)試濃度的CGP(50g/l)可以在2g/l粗制CphE粉末的存在下在IOh內(nèi)被降解(圖4)。CGP- 二肽的大規(guī)樽牛產(chǎn)為了能夠常規(guī)牛產(chǎn)大量的純CGP- 二肽，津立三階段方 法階段I :CGP的大規(guī)模分離和純化，階段II 粗制CphE粉末的大規(guī)模生產(chǎn)，階段III =CGP 降解為其二肽。階段I (CGP的大規(guī)模分離和純化)為了獲得大量的CGP，使用4776g細(xì)胞干質(zhì) 量的含〔6 細(xì)胞，此量是以前在使用富養(yǎng)羅爾斯通氏菌!116- 冊(cè)-4-八6(^( 881 11 ^-2::0 phA6308/edaH16)的一次5001發(fā)酵期間產(chǎn)生的。此生物質(zhì)裝料的CGP含量為32% (wt/ wt) (Voss, I.等，Metabol. Eng. 8 :66-78 Q006))。另外，混合來自使用富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 H16-PHB—4- Δ ldh/ Ω km-cphA6308的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵的幾種其它干生物質(zhì)裝料(總計(jì)M90g)并且被認(rèn)為是第二裝料。根據(jù)在材料和方法章節(jié)中提到的改良的酸提取法從每種裝料中單 獨(dú)地提取和純化CGP。得到的CGP濕生物質(zhì)對(duì)于主要細(xì)胞裝料為1948g，且對(duì)于第二裝料為 295g,在凍干純化的CGP后，分別從兩種裝料中獲得621. 83g和82. 17g純CGP。對(duì)來自兩種 細(xì)胞裝料的分離的CGP的各自氨基酸成分的HPLC分析表面，該聚合物主要由天冬氨酸和精 氨酸組成，并且其含有僅少量的4. 5% (mol/mol)的賴氨酸。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳表明 兩種裝料中分離的CGP的分子量為約20-30kDa。然而，HPLC分析和SDS聚丙烯酰胺凝膠電 泳指示在獲得的CGP中沒有任何雜質(zhì)。因此，兩種CGP裝料可以混合在一起達(dá)到最終量為 704g 的純 CGP。階段II (耜制CphE粉末的大規(guī)樽牛產(chǎn))為了繼續(xù)開發(fā)CGP- 二肽的商業(yè)生產(chǎn)方 法，從產(chǎn)堿假單胞菌DIPl中生產(chǎn)足量的粗制CphE是必需的，因此，該菌株在Biostat D650 生物反應(yīng)器中以5001規(guī)模培養(yǎng)。產(chǎn)堿假單胞菌DIPl的預(yù)培養(yǎng)物在含有11具有l(wèi)g/Ι檸檬 酸鈉的SM培養(yǎng)基的21帶擋板的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)；將培養(yǎng)瓶在30°C中孵育12h并振搖。 生物反應(yīng)器充以4201含有l(wèi)g/Ι檸檬酸鈉的SM培養(yǎng)基，滅菌，并接種以4% (vol/vol)預(yù)培 養(yǎng)物。初始的PH調(diào)節(jié)至6.9。在發(fā)酵期間，產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的細(xì)胞在發(fā)酵的第一個(gè)小 時(shí)后開始緩慢地生長(zhǎng)，并達(dá)到0. 4的OD6tltlnm值，從而在差不多9h后進(jìn)入靜止生長(zhǎng)期。在靜 止生長(zhǎng)期的第一個(gè)池后通過加入0. 25g/l無菌CGP懸液誘導(dǎo)CphE的分泌，誘導(dǎo)物(不溶 的CGP)的加入將OD6tltlnm立即從0. 55增加至0. 98，加入的CGP的完全降解需要池并且通過 OD6tltlnm的減小指示達(dá)到接近誘導(dǎo)前的值。Ih后，細(xì)胞開始緩慢地生長(zhǎng)，這最有可能是培養(yǎng)基 中CGP- 二肽的存在所導(dǎo)致的。在總計(jì)14h的培養(yǎng)期后發(fā)酵終止(圖5)。對(duì)于包括分泌的細(xì)胞外藻青素酶的上清液中蛋白的收獲、濃縮和脫鹽，制備連續(xù) 系統(tǒng)，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵(圖6)；為收獲，使用CEPA Z41連續(xù)離心機(jī)來分離細(xì)胞，同時(shí)將上清液 收集在中央1001槽中。為了同時(shí)濃縮收集的上清液，具有30kDa盒的錯(cuò)流裝置連接到中央 槽；含有分子尺寸大于濾器盒的C0P(30kDa)的蛋白的濃縮滲余物重新泵入槽中，同時(shí)直接 棄去滲透物。調(diào)節(jié)錯(cuò)流的流速以保持槽中的體積為約501。為冷卻，將冰袋引入至中央槽 中以保持溶液的溫度在20°C中。在收獲結(jié)束后，繼續(xù)濃縮過程直至僅51濃縮物留在槽中。 為脫鹽，濃縮物用5柱床體積的H2O洗滌。在前面的每個(gè)步驟期間，收集樣品并檢查在CGP 覆層瓊脂板上的CGP降解活性(圖幻。最后，濃縮物冷凍在-30°C并凍干從而獲得最終干 重為17. 5g的粗制蛋白粉末。階段111(純CGP降解為其二肽)=CGP至其二肽的大規(guī)模降解在250g純CGP上并 使用IOg粗制CphE粉末進(jìn)行，這些量代表最高的、易于制備的CGP濃度(50g/l)和充足的粗 制CphE濃度Qg/1)從而卻找不到12h內(nèi)的完全降解，如通過小規(guī)模試驗(yàn)所測(cè)定的。250g CGP粉末同屆在51 0. IM HCL中，中和至pH 7. 3，置于在4°C中沉降，并且最后通過用自來水 洗滌3次脫鹽，從而獲得最終體積為51的所需濃度。之后，IOg粗制CphE粉末加入至CGP 懸液中，并在30°C中孵育12h并輕輕攪拌。CGP完全降解后，將二肽溶液過濾除菌，使用在 階段II期間采用的相同錯(cuò)流系統(tǒng)從粗制蛋白成分中分離，在_30°C下冷凍，并且最后凍干， 從而獲得227. 5g CGP- 二肽。為了測(cè)定對(duì)于CGP 二肽的純化是否需要進(jìn)一步的純化步驟，將幾個(gè)20ml等分 試樣(在后面的冷凍和凍干步驟之前獲取)用具有下列COP的不同膜過濾10，5，1，和 0. 5kDa。過濾后，通過測(cè)定過濾之前和之后的凍干的Iml等分試樣的干重以及通過HPLC分析評(píng)價(jià)CGP-二肽的損失。與初始的二肽溶液比較，過濾期間的最大干重?fù)p失為具有最小 COP (0. 5kDa)的膜的情況，為78. 5% (wt/wt)，具有IkDa的膜導(dǎo)致47. 8% (wt/wt)的損失， 而具有日！^^的膜導(dǎo)致^』1^ (wt/wt)的損失，具有較高COP(IOkDa)的濾膜顯示7. 4% (wt/ wt)的最小損失。從所有過濾系統(tǒng)獲得的二肽的純度等級(jí)通過TLC以及HPLC分析監(jiān)測(cè)，所有過濾的 二肽樣品顯示相同的高純度等級(jí)(圖7，I)。因此，對(duì)于主要二肽裝料不需要進(jìn)一步的過濾 步驟。具有30kDa盒的錯(cuò)流明顯也是用于回收降解的CGP溶液的蛋白部分的最實(shí)用的設(shè)備。 將回收的蛋白溶液再次冷凍和凍干?；厥盏姆勰┰贑GP覆層瓊脂板上的活性測(cè)試顯示經(jīng)歷 所有前面提到的步驟后CphE存在并且保留了其活性(圖幻。粗制粉末的回收率78%。對(duì)于所得二肽粉末的最后質(zhì)量控制，直接樣品以及酸水解樣品通過TLC檢驗(yàn)；對(duì) 于直接樣品指示僅一個(gè)斑點(diǎn)(圖7，I)，而水解樣品顯示標(biāo)準(zhǔn)氨基酸天冬氨酸、精氨酸和賴 氨酸的典型斑點(diǎn)(圖7，II)。此外，對(duì)酸水解樣品的驗(yàn)證性HPLC分析表明僅有這三種構(gòu)成 性氨基酸的典型峰。在這些結(jié)果中，二肽粉末的純度估計(jì)為超過99%。來自250g CGP降解 的最終結(jié)果(227. 5g純二肽)表明整個(gè)方法的總效率為91%，其通過未來的優(yōu)化甚至可以 更高。實(shí)施例3.以5001規(guī)樽發(fā)酵牛產(chǎn)藻青素用于此研究的足量CGP以500-1規(guī)模發(fā) 酵產(chǎn)生(Elbahloul, Y.等，Appl. Environ. Microbiol. 71 :7759-7767 (2005))。然而，重組 大腸桿菌 DHl 株(pMa/c5-914 cphArcG68Q3)培養(yǎng)在 7% protamylasse (vol/vol)上；在對(duì)可 獲得的protamylasse裝料的預(yù)試驗(yàn)中，此濃度證明對(duì)于CGP制備是最適的。在發(fā)酵期間(圖8)和孵育的第一個(gè)他后，溫度升高至37°C以誘導(dǎo)CGP-合成酶 (CphA)基因(Frey，K.M.等，Appl. Environ. Microbiol. 68 :3377-3384 Q002))，每 h 取的樣 品顯示，如預(yù)期的那樣，聚合物在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行性地積累，在1 后達(dá)到最大(顯微鏡估計(jì)) 并且之后保持恒定(圖9)。1 后OD6tltlnm達(dá)到18. 3，然后發(fā)酵終止，然后，后來的分析顯示 13% (wt/wt CDM)的最大CGP積累為發(fā)酵1 后，并且在收獲期(15h)時(shí)其下降至10% (wt/wt CDM)。從所得的濕重的細(xì)胞中提取CGP (1372g CDM)后，獲得135g純CGP粉 末，CGP的HPLC分析表明除了賴氨酸(占聚合物的6. SMol % )以外僅有構(gòu)成性氨基酸天冬 氨酸、精氨酸。SDS-PAGE證實(shí)CGP的純度并且顯示其分子量為25 30kDa。產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的最適牛長(zhǎng)條件測(cè)試含有不同濃度的檸檬酸鹽 (0. 5 IOg Γ1)的SM-培養(yǎng)基，其以前證明是DIPl株的最適底物(Mllam，Α.，和 A.Steinbuchel. 2008b. Biotechnological process for the technical production of β-dip印tides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產(chǎn)β-二肽的生物工藝方法) Under preparation.(準(zhǔn)備中))，顯示6g Γ1產(chǎn)生最大生長(zhǎng)(4MKlett裝置，在30°C中13h 后)。在相同條件但具有不同的PH值(5. 5 8. 5)下在6g Γ1檸檬酸鹽上培養(yǎng)的DIPl株 的培養(yǎng)物顯示DIPl株具有6. 5的最適生長(zhǎng)ρΗ，而在不同孵育溫度(15 45°C)下的培養(yǎng) 表明37°C是生長(zhǎng)的最適溫度。用于產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的最大CphEjl產(chǎn)量的最適培養(yǎng)條件為了判斷當(dāng)細(xì)胞達(dá) 到靜止生長(zhǎng)期時(shí)用于DIPl株的CphEal最大產(chǎn)量的最適培養(yǎng)條件，通過加入0.25g Γ1 CGP 誘導(dǎo)制備CphEal。在接下來的證期間，將上清液樣品濃縮(100倍)并篩選CGP覆層瓊脂 板上的降解活性以及進(jìn)行光度測(cè)定。來自檸檬酸鹽濃度低于0.5或高于4g Γ1的培養(yǎng)物的上清液樣品不顯示任何降解活性，而對(duì)在2g Γ1檸檬酸鹽上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物誘導(dǎo)證后監(jiān)測(cè)到 最大活性和隨后CphEal最大產(chǎn)量。此外在最適生產(chǎn)條件下的進(jìn)一步培養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)DIPl株 的細(xì)胞在孵育約1 后達(dá)到靜止生長(zhǎng)期，并證明此時(shí)間點(diǎn)對(duì)于CphEal的誘導(dǎo)的最適的。因 此，下面的條件被認(rèn)為對(duì)于CphEal生產(chǎn)是最適的；含有2g Γ1檸檬酸的SM-培養(yǎng)基，pH 6.5， 37°C，在1 后誘導(dǎo)，并且在孵育的第1 期間收獲。使用CGP和可詵的誘導(dǎo)物對(duì)CDhE2l的最適誘導(dǎo):除了 CGP以外，在DIPl株的培養(yǎng) 中測(cè)試其它可能的誘導(dǎo)物；來自CGP的β - 二肽形式，合成二肽(α -精氨酸-天冬氨酸， α -賴氨酸-天冬氨酸，α -鳥氨酸-天冬氨酸)(Sigma-Aldrich，St. Louis, Missouri, USA)，α -聚天冬氨酸(Bayer AG, Leverkusen, Germany)，聚-ε -賴氨酸(Chisso, Tokyo, Japan), L-天冬氨酸，L-精氨酸，L-賴氨酸，L-瓜氨酸，L-鳥氨酸以及天冬氨酸類似物 [N-乙?；?天冬氨酸，脲基琥珀酸(N-氨甲?；?天冬氨酸)]。所有誘導(dǎo)物首先以0. 25g Γ1的濃度測(cè)試，并且CphEal的產(chǎn)生在CGP覆層瓊脂板上測(cè)定并且還經(jīng)光度計(jì)測(cè)定。僅CGP， 其二肽和天冬氨酸誘導(dǎo)顯著量的CphEal。隨后，在用這三種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中研究最 適濃度和最適CphEal收獲時(shí)間；對(duì)于CGPJIHi 0. 001 3. Og Γ1之間的濃度，誘導(dǎo)效應(yīng)隨 著濃度增加而增加直至0.05g Γ1，而較高的濃度顯示相同的效率。在用0.05g F1CGP誘導(dǎo) 證后獲得最大CphEal產(chǎn)量。在與對(duì)于CGP測(cè)試的類似條件下培養(yǎng)但用與其相同的濃度范圍內(nèi)的CGP- 二肽誘 導(dǎo)的培養(yǎng)物，就誘導(dǎo)物的濃度而言，顯示類似的結(jié)果，然而，僅在誘導(dǎo)池后獲得最大CphEal 產(chǎn)量。天冬氨酸還證明是合適的誘導(dǎo)物，其中使用4g Γ1天冬氨酸在誘導(dǎo)證后獲得最大 CphEal產(chǎn)量；然而，與用最適CGP濃度(0.05g Γ1)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物相比，用天冬氨酸誘導(dǎo)后的 CphEal產(chǎn)量?jī)H為三分之一。經(jīng)耜制CDhE2l將CGP降解為二肽的最適條件為了減少處理的反應(yīng)體積和原始方 法的第三階段(CGP降解)所需的時(shí)間，較高CGP濃度(50-100g/l)的降解時(shí)間在30°C中 測(cè)試，這顯示降解時(shí)間隨著粗制CphEal的濃度降低和隨著CGP濃度的升高共線的增加。在 IOg Γ1粗制CphEalW存在下，對(duì)于最低測(cè)試濃度(50g Γ1)的CGP監(jiān)測(cè)到最短的降解時(shí)間 (4h)，而需要16h降解最高測(cè)試濃度的CGPdOOg Γ1)。如材料和方法章節(jié)中所述分別進(jìn)行估計(jì)粗制CphEal粉末降解CGP的最適pH和溫 度。光度法測(cè)定反應(yīng)管中剩余的CGP表明最大CGP降解(45%)發(fā)生在pH 6. 5，然而，5. 5 7. 5的pH范圍顯示了相近的結(jié)果。另一方面，CGP降解隨著溫度增加而增加，在50°C時(shí)達(dá) 到最大值90%。因此，在最適參數(shù)(50°C，pH 6. 5)下重復(fù)CGP和CphEal的濃度之間的最適 關(guān)系。對(duì)于50和IOOg Γ1的CGP濃度，這將所需的降解時(shí)間(在IOgr1粗制CphEal的存在 下)分別減少至1和4h。在最適條件下，降解時(shí)間還顯示隨著粗制CphEal的濃度降低和隨 著CGP濃度的升高的共線增加。此共線關(guān)系可以有助于在未來的工藝應(yīng)用中應(yīng)用最適降解 參數(shù)。各個(gè)公式是對(duì)至多達(dá)IOOg Γ1的CGP濃度并基于純CphEal (E)的濃度計(jì)算的，為了應(yīng) 用粗制提取物，CphEal含量必需在使用該公式(s. u.)之前確定；Pscrc中的降解時(shí)間=17. 55—29. 89IE[所需的純^hiial的濃度(g/1)]從耜制上清液粉末中純化CDhE2l 為了使方法更為有效并獲得關(guān)于來自產(chǎn)堿假單 胞菌DIPl株的CGP酶的特性的更多知識(shí)，測(cè)試了用于從粗制粉末中純化CphEal的幾種工藝 上適用的方法。由于回收率低和純化效果差，使用溶劑諸如乙醇、甲醇或丙酮沉淀和分離酶
38不能提供令人滿意的結(jié)果。然而，硫酸銨沉淀提供相當(dāng)好的結(jié)果，其飽和濃度為70%，而純 度等級(jí)有點(diǎn)太低。經(jīng)特異件底物結(jié)合純化CDhE2l:開發(fā)了一種簡(jiǎn)單的方法純化來自產(chǎn)堿假單胞菌 DIPl株的CGP酶。為此，如材料和方法章節(jié)中所述，不溶的CGP本身用作結(jié)合基質(zhì)以特異 性地結(jié)合CphEal。預(yù)試驗(yàn)顯示在首個(gè)5min后CphEal與CGP完全結(jié)合，因此這被認(rèn)為是在 另外的應(yīng)用中的最小結(jié)合時(shí)間。所有純化步驟的SDS-PAGE顯示酶的逐步純化(圖10A)， 并且前兩個(gè)洗滌步驟是必需的，以去除不結(jié)合CGP的其它蛋白。在XGP基質(zhì)的降解和通過 超濾去除二肽后，獲得高純度等級(jí)的CphEal。CGP覆層瓊脂板顯示純化CphEal的高活性， 并且純化的蛋白顯示在SDS-PAGE中的表觀分子量為45kDa。CphEal的性質(zhì)通過凝膠內(nèi)復(fù) 性(in-gel-renaturation)來證實(shí)，其中其再次獲得活性并且在CGP覆層瓊脂板上形成降 解暈。純化CphEal的濃度為43. 2 μ g πιΓ1，而初始的粗蛋白溶液中的總蛋白含量為944yg Hir10為了更準(zhǔn)確地檢測(cè)純化酶的純度等級(jí)，對(duì)于較大的樣品體積(三倍體積)重復(fù)進(jìn)行 SDS-PAGE，并且用銀染色法染色較長(zhǎng)的時(shí)間；這顯示了少數(shù)的其它蛋白條帶以相當(dāng)?shù)偷臐?度存在(圖10B)。在發(fā)酵上清液中測(cè)定CDhE2l含量如果在未來的工藝應(yīng)用中需要應(yīng)用純CphEal，則 首先要估計(jì)產(chǎn)生的上清液中CGP酶的濃度，因此，使用Iml具有固定濃度(IOOmg Γ1)的CGP 懸液開發(fā)了一種快速檢測(cè)法，所述CGP懸液的OD6tltlnm為0. 215。向此溶液中加入3 μ 1具有 不同濃度(2. 7 43. 2 μ gmr1)的純化酶的溶液。反應(yīng)在30°C中孵育60min，同時(shí)緩慢地旋 轉(zhuǎn)(3rpm)。最后，在600nm下經(jīng)光度法測(cè)定CGP降解的程度。為了保證該檢測(cè)的再現(xiàn)性和 其公式(s. u.)的準(zhǔn)確性，必需保持測(cè)試參數(shù)和OD600下的測(cè)量范圍(0. 15 0. 215)。E[粗制提取物中的 CphEal 含量(lig/ml)] =
/0. 0017 CphEjl的工藝純化所需的CGP量為了將酶純化步驟結(jié)合至主生產(chǎn)方法中，還需要 確定結(jié)合(具有已知CphEal含量的上清液中的)所有CphEal所必需的CGP的量。在0. 5ml 的總反應(yīng)體積中，將50μ 1具有不同濃度(1.4 19yg πιΓ1)的純化的CphEal溶液加入 至不同的CGP濃度(0. 1 6g Γ1)中。反應(yīng)混合物在30°C中孵育lOmin，同時(shí)緩慢地旋轉(zhuǎn) (3rpm)。離心(16000 XgJmin)后，將反應(yīng)管離心，并且篩選上清液在CGP覆層瓊脂板上的 活性。對(duì)于所有測(cè)試的CphEal濃度，為安全起見，不誘導(dǎo)降解暈的最小CGP濃度乘以3，并 且然后結(jié)合至校準(zhǔn)曲線中。得到的公式如下需要的cGp濃度(g/1)] = [￡；[粗制提取物中Wc;pllEal 含量(1Jg/ml)]—4392]/0· 9432純化的CphEd的生化表征純化的CphEal在50°C中顯示最大CGP降解活性，而該 酶的完全滅活發(fā)生在68°C中。CGP降解的最適pH范圍為7-8. 5，最適值為8. 5。測(cè)試純化 的CphEal對(duì)CGP、BSA、牛酪蛋白和聚(天冬氨酸)的底物特異性顯示對(duì)CGP的最高降解活 性。然而，BSA也被部分降解(與CGP相比為65%)。牛酪蛋白和聚(天冬氨酸)受純化 的CphEal的酶活性的影響最小。為了獲得關(guān)于CphEal的催化機(jī)制的信息，采用不同的基團(tuán)特異性抑制劑進(jìn)行抑制 劑試驗(yàn)(表1)。在CGP覆層瓊脂板上和通過CGP降解產(chǎn)物的HPLC分析來測(cè)定CGP酶的抑 制。這表明細(xì)胞外CphEal被絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)強(qiáng) 烈地抑制。N-溴代琥珀酰亞胺(色氨酸氧化劑)也導(dǎo)致酶的完全抑制。相反，CphEal導(dǎo)致 的降解暈形成不受巰基蛋白酶抑制劑亮抑酶肽或受金屬蛋白酶抑制劑EDTA的影響。HPLC分析證實(shí)除了用EDTA處理的樣品以外，這些結(jié)果均顯示對(duì)CphEal的抑制。實(shí)施例4. CaCo-2細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)CGP 二肽的吸收為了證明CGP 二肽在營(yíng)養(yǎng)和治 療中的潛在應(yīng)用，在初步研究中使用Caco2細(xì)胞(人結(jié)腸上皮腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)物 測(cè)試這些高度可溶的二肽的吸收。含有20%胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺溶液的 Dulbecco' s改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)用作培養(yǎng)用培養(yǎng)基。約7000CaCO2細(xì)胞/孔散布 在M孔板中并在5% CO2的氣氛和約98%的濕度下在37°C中孵育。每天在顯微鏡下檢查 細(xì)胞直至大約50h后形成單層。孵育培養(yǎng)基用每孔新鮮的700μ 1相同培養(yǎng)基完全更換，所 述培養(yǎng)基中補(bǔ)充了 350 μ g/ml CGP 二肽(90% Asp-Arg 10% Asp-Lys)或補(bǔ)充了相同量 的游離L-天冬氨酸、L-精氨酸和L-賴氨酸的混合物。一排孔供給以新鮮的700 μ 1不含后 面的添加物的孵育培養(yǎng)基并且被當(dāng)作對(duì)照。在0，13，22，67和11 的孵育期后取樣品，并 且如 Sallam 禾口 Steinbuchel (J. App. Microbiol. DOI :10. 1111/j. 1365-2672. 2009. 04221. x)所述通過HPLC進(jìn)行分析以確定測(cè)試的二肽和氨基酸的濃度變化。培養(yǎng)基樣品的HPLC分析表明在孵育11 后，約60%的藻青素Asp-Arg 二肽和 68 %的藻青素Asp-Lys 二肽被吸收。另一方面，在相同的孵育期后，僅41 %的游離精氨酸和 51%的游離L-賴氨酸被吸收。例外地是，L-天冬氨酸似乎以游離的形式較好地被Caco2細(xì)胞吸收，并且在約6 的較短孵育期內(nèi)被完全吸收。相反，與游離精氨酸和游離賴氨酸的吸收量相比，以CGP 二 肽的形式多31. 6%的精氨酸和多24. 4%的賴氨酸被細(xì)胞吸收。因此，CGP 二肽代表了兩種 氨基酸精氨酸和賴氨酸的更高生物利用度的來源。這些結(jié)果是CGP 二肽在營(yíng)養(yǎng)和治療中 的潛在應(yīng)用的第一個(gè)直接證據(jù)并且證實(shí)了以前關(guān)于腸道菌叢降解CGP的結(jié)果(Mllam和 Steinbuchel J. App. Microbiol. DOI :10. 1111/j. 1365-2672. 2009. 04221. χ))。這些結(jié)果還 與以前的體外和體內(nèi)研究相一致，這些研究證明寡肽(通常)具有比游離形式的其構(gòu)成性 氨基酸高的生物利用度(Adibi, S. A.，J.Clin. Invest. 50 :2266-2275(1971) ；Adibi, S. Α.， Gastroenterology 113:332-340(1997) ；Dock, D. B.等，Biocell 28 :143-150 (2004))
權(quán)利要求
1.一種從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物的制劑酶法制備二肽組合物的方法，所述藻青 素(CGP)或CGP樣聚合物為主要由一個(gè)或多個(gè)二肽單元構(gòu)成的肽結(jié)構(gòu)，所述方法包括以能 夠?qū)?CGP)或CGP樣聚合物裂解為二肽的來自產(chǎn)堿假單胞菌的CGP酶或其突變體、衍生物 或片段降解所述聚合物制劑，所述CGP酶的分子量為約45kDa，活性溫度范圍為10 68°C， 并且活性PH范圍為5 9。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述CGP酶是來自產(chǎn)堿假單胞菌DIPl株的CGP酶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述CGP酶的活性溫度范圍為15 60°C，優(yōu)選40 60°C，并且和最適pH范圍為7 8. 5，并且將CGP降解為其組成性的β - 二肽，最優(yōu)選地，所述CGP酶的分子量為約45kDa，最 適溫度為約50°C，并且最適pH范圍為7 8. 5并且將CGP降解為β -Asp-Argo
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述CGP酶是作為DSM 21533在DSMZ保藏的產(chǎn)堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或其突 變體、衍生物或片段。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于(i)所述二肽單元由下列氨基酸中的兩種構(gòu)成天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、瓜 氨酸、鳥氨酸和刀豆氨酸；和/或( )所述二肽組合物由單個(gè)二肽或二肽的混合物構(gòu)成；和/或(iii)所述二肽組合物由含有選自下列的氨基酸殘基的二肽構(gòu)成天冬氨酸、精氨酸、 賴氨酸和CGP樣聚合物中存在的其它氨基酸殘基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述二肽/二肽單元選自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于還包括通過培養(yǎng)原核或真核生物生產(chǎn)細(xì)胞系制備CGP或CGP樣聚合物制劑。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述生產(chǎn)細(xì)胞系選自大腸桿菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、谷氨酸棒桿菌、惡 臭假單胞菌、酵母菌株和植物生物質(zhì)，最優(yōu)選富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16-PHB-4-Aeda(pBBRlMC S-2: :cphA6308/edaH16)禾口大腸桿菌 DHl (pMa/c5_914: cphAPCC6803)。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于還包括分離、純化和/或化學(xué)修飾通過培養(yǎng)所述生產(chǎn)細(xì)胞系獲得的所述CGP產(chǎn)物。
10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于通過培養(yǎng)所述生產(chǎn)細(xì)胞系獲得的所述CGP產(chǎn)物無需分離或純化，直接進(jìn)行使用所述 CGP酶的降解。
11.如權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于還包括純化或分離降解產(chǎn)物。
12.如權(quán)利要求1 11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于還包括化學(xué)修飾降解產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的CGP酶。
14.一種組合物、藥物組合物、食品或飼料補(bǔ)充劑，其特征在于含有通過酶法蛋白水解從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物獲得的二肽或二肽混合物，所 述藻青素(CGP)或CGP樣聚合物為主要由一個(gè)或多個(gè)二肽單元構(gòu)成的肽結(jié)構(gòu)。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物、藥物組合物、藥物、食品或飼料補(bǔ)充劑，其特征在于 所述二肽或二肽混合物通過權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的方法從所述CGP或CGP樣聚合物獲得。
16.如權(quán)利要求14或15所述的組合物、藥物組合物、藥物、食品或飼料補(bǔ)充劑，其特征 在于所述二肽單元由下列氨基酸中的兩種構(gòu)成天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、瓜氨 酸、鳥氨酸和刀豆氨酸，優(yōu)選所述組合物、藥物組合物、藥物、食品或飼料補(bǔ)充劑含有β-天 冬氨酸-精氨酸和/或β-天冬氨酸-賴氨酸。
17.權(quán)利要求14 16所述的二肽或二肽混合物在制備用于營(yíng)養(yǎng)治療的藥物，或作為食 品或飼料補(bǔ)充劑中的應(yīng)用。
18.一種用于需要營(yíng)養(yǎng)治療的患者的營(yíng)養(yǎng)治療的方法，所述方法包括向所述患者施用 合適量的權(quán)利要求14 16中任一項(xiàng)所述的二肽或二肽混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過用CGP酶降解聚合物制劑從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物制劑酶法制備二肽組合物的方法，特別適于所述方法的CGP酶，以及藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段、尤其是通過如上所定義的方法獲得的二肽組合物作為藥物組合物、藥物或作為食品或飼料替代品的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/52GK102066559SQ200980122099
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者A·施泰因比歇爾, A·薩拉姆 申請(qǐng)人:北萊茵法威廉明斯特大學(xué)