專利名稱：酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶b5(trap 5b)的底物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶 (Tartrate-Resistant Acid Phosphatase, TRAP)，優(yōu)選 TRAP 5b 的底物的用途。本發(fā)明也 涉及測量在受試者樣本中作為骨吸收率指標(biāo)的TRAP 5b的量，以及與其相關(guān)的方法。本發(fā) 明也提供了酞類化合物的單磷酸酯在測量樣本中TRAP 5b中的用途，和實(shí)施本發(fā)明的方法 的試劑盒。
背景技術(shù)：
骨由2種主要的細(xì)胞類型組成負(fù)責(zé)形成骨的成骨細(xì)胞和負(fù)責(zé)破壞(吸收)骨的 破骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞是進(jìn)入礦化骨，將其破壞為其組成部分的多核細(xì)胞。吸收過程包括破 骨細(xì)胞向骨單位的附著。然后破骨細(xì)胞引發(fā)其細(xì)胞膜的內(nèi)摺，并分泌膠原酶和其它在吸收 過程中重要的酶。由于骨被吸收，高水平的鈣、鎂、磷酸根和膠原的產(chǎn)物被釋放到細(xì)胞外液。 通常成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞處于平衡中，以使吸收的骨的量和形成的骨的量相同。在童年，骨 形成超過吸收，但隨年齡增長，吸收超過形成。已知若干醫(yī)學(xué)病況與骨吸收率的變化相關(guān)，可能最廣泛存在的是骨質(zhì)疏松。這種 特定病況被認(rèn)為是破骨細(xì)胞活性增加的結(jié)果，其特別是在絕經(jīng)后婦女中導(dǎo)致骨量減少。這 導(dǎo)致骨的弱化并增加了對骨折的易感性。該年齡組的婦女中骨折可能是潛在嚴(yán)重的，由骨 質(zhì)疏松引起的這些和其它癥狀的治療是昂貴的并需要醫(yī)學(xué)專業(yè)。長期以來對那些易患骨質(zhì) 疏松的人的診斷被認(rèn)為是重要的，以預(yù)防這種病況的潛在嚴(yán)重后果。已日益通過例如雌性 激素替代治療或雙膦酸酯治療成功治療骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松或其易感性的指標(biāo)是測量受試者中骨密度，其中低的骨密度暗示骨吸收 過量，因此有骨質(zhì)疏松或其它病況的可能。由于該組人群被認(rèn)為是重要的商業(yè)市場，特別是 在西方國家，已發(fā)展了很多方法和儀器以測量骨密度。其中，以那些特異性、快速和廉價的 為人所歡迎。根據(jù)其電泳遷移率，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)屬于酸性磷酸酶的5型種類。它 是已鑒定的7種酸性磷酸酶中酸性最強(qiáng)的，并且是唯一一種抵抗酒石酸引起的抑制的酸性 磷酸酶。TRAP是一種在分子的活性位點(diǎn)含有自旋-偶聯(lián)鐵單位的堿性糖蛋白。TRAP的雙 核鐵單位含有2個高鐵離子，其使蛋白質(zhì)呈紫色，因此它也被稱為紫色酸性磷酸酶。這種蛋 白有32kd的分子量。當(dāng)酶被例如β-巰基乙醇還原，其中一個高鐵離子被還原，酶變?yōu)榉?紅色。TRAP在體外可以作為蛋白酪氨酸磷酸酶起作用，其氨基酸序列含有與磷蛋白磷酸酶 同源的區(qū)域。但是，TRAP的天然底物依然是未知的。若干研究已涉及在骨吸收過程中的TRAP。小鼠中TRAP基因的破壞(Hayman，A. R et al Development 122:3151-3162,1996)導(dǎo)致軟骨內(nèi)骨化被破壞和輕度骨質(zhì)疏松，其暗 示TRAP通過對骨基質(zhì)吸收的關(guān)鍵作用在骨發(fā)展、保持成年骨的完整性和更新中對于軟骨 正常的礦化是必需的。
在人類中，已發(fā)現(xiàn)存在TRAP的正常細(xì)胞僅有破骨細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞。已發(fā) 現(xiàn)在骨吸收期間TRAP被破骨細(xì)胞分泌到血液中。因此暗示TRAP在血清中的濃度作為 骨吸收的標(biāo)記，并且已發(fā)現(xiàn)TRAP在血清中的濃度與骨吸收率相關(guān)(Kraenzlin Μ. E et al.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 71(2) 442~451,1990 ；Cheung C. K et al. Clin. Chem 41(5) :679-686,1995 ；Chamberlain P. et al. Clin. Chem. 41(10) 1495-1499，1995 禾口 Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10) 1444-1452，1996)。已鑒定出 2 種 TRAP 的同工型，TRAP 5a 禾口 TRAP 5b (Lam W. K. W. et al. (Clin. Chem. 24 (7) : 1105-1108，1978) )。TRAP 5a在較低最佳pH比TRAP 5b更具活性，由此允許對 TRAP各同工型的的功能測定。為了測定例如骨吸收率而進(jìn)行的TRAP 5b血清或血漿的濃 度測量中的主要困難，是存在主要由巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生的酶的5a同工型。這兩種同 工型都是acp5基因的產(chǎn)物，區(qū)別僅在于在翻譯后修飾中的變異。TRAP 5b缺少某些在TRAP 5a中存在的唾液酸殘基(在蛋白質(zhì)的糖基團(tuán)上)。所述同工型也在如下方面有所不同氨 基酸鏈的約14個殘基片段已經(jīng)從TRAP 5b被蛋白水解切除。另外，核心蛋白是相同的，在 單純免疫學(xué)基礎(chǔ)上沒有區(qū)分這兩種同工型的方法。因此，商業(yè)上存在的TRAP 5b免疫測定 利用這兩種形式之間的生化差異?？梢酝ㄟ^分光光度計測定TRAP的活性，例如在酒石酸存在時通過給予對硝基苯 基磷酸酯(PNPP)作為底物，酒石酸抑制大多數(shù)其它酸性磷酸酶。但是，該方法特異性不強(qiáng)， 因此為了測定TRAP，已發(fā)展了更具特異性的方法即免疫測定。已發(fā)展了多種使用多克隆抗 體的 TRAP 的測定方法(Stepan J. J et al (Biochem, Biophs. Res. Commun. 165 1027-1034， 1989), Kraenzlin Μ. E et al(Journal of Clinical Endrocrinology and Metabolism 71(2) :442-451，1990)和 Cheung C. Ket al (Clin. Chem. 41 (5) :679_686，1995))。針對TRAP 使用多克隆抗體的研究顯示兒童和絕經(jīng)后婦女具有升高的血清TRAP濃度(Halleen J. et al Journal of Bone and Mineral Research 11(10 :1444_1452，1996)。Chamberlain P. et. Al (Clin. Chem. 41(10) :1495_1499，1995)描述了針對重組產(chǎn) 生的TRAP使用單克隆抗體的測定?；赥RAP 5b是比總TRAP更具特異性的骨吸收的生化標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，國際專利申請 No. WO 1999/050662描述了 TRAP 5b的測定，所述測定在具有確定pH范圍的緩沖液中使用 普通磷酸酶底物，對硝基苯基磷酸酯(PNPP)以使5b同工型的活性最大化，而降低TRAP 5a 的干擾。歐洲專利No. 1598670描述了適于測量TRAP 5b的酸性磷酸酶底物，其中實(shí)施例 底物之一，2-氯-4-硝基苯基磷酸酯，對TRAP 5b相對TRAP 5a的相對活性僅僅比上述 W01999/050662中獲得的活性高0. 8倍。美國專利No. 7，074, 903描述了自稱相對TRAP 5a顯示對TRAP 5b的特異性的單 克隆抗體。但是該抗體顯示與重組人TRAP5等效的交叉反應(yīng)性，這被認(rèn)為與TRAP 5b (從人 血清中分離)相比更類似于天然的TRAP 5a。因此，所述測定中的抗體功能特異性在區(qū)別 TRAP 5a和5b方面并不顯著優(yōu)于描述于W01999/050662或EP1598670中的活性測定。已知的商業(yè)測定適于使用在某些臨床應(yīng)用中，因為TRAP 5a的酶促活性比5b (臨 床應(yīng)用的形式)低相當(dāng)多。但是，通過評價公布于諸多研究范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，可以估計在正常樣本中5a的影響可能高達(dá)50%。盡管對于某些TRAP 5b水平的變化是顯著的臨床應(yīng)用，這 并不代表一種顯著的困難，但是已知的方法可能缺乏區(qū)分TRAP 5b水平中更細(xì)微的變化的 能力。應(yīng)用于已知測定中的底物pNPP及其4-鹵-取代衍生物在溶液中是不穩(wěn)定的。當(dāng) 手工進(jìn)行測定且其中底物是作為在使用之前立即溶解的固體應(yīng)用時，這不是問題。但是，底 物的不穩(wěn)定性使這些化合物難以應(yīng)用于自動化免疫測定平臺，所述平臺需要底物在溶液中 穩(wěn)定若干周。專利No. US 3，975，405描述了一種鄰甲酚酞的單磷酸酯及其在血清樣本中作為 測量堿性磷酸酶的底物的用途，并自稱具有如下利益避免由膽紅素引起的干擾，并且與百 里酚酞單磷酸酯相比對堿性磷酸酶的腸道和胎盤內(nèi)的同工型更敏感。所述方法不區(qū)分堿性 磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型，或描述其作為TRAP 5b的底物的用途。專利No. US 4，045，290描述了百里酚藍(lán)單磷酸酯作為磷酸酶底物用于在血清中 測量總堿性磷酸酶和在血清中適宜PH條件下測量總酸性磷酸酶的制備和用途。所述方法 不區(qū)分堿性磷酸酶或酸性磷酸酶的不同同工型。因此，需要用于測定TRAP 5b的方法，其中與現(xiàn)有測定相比TRAP 5a的干擾顯著減 少，并且其可易于應(yīng)用于自動化模式中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRAP 5b)的 底物的用途。在本文中，酞類化合物的單磷酸酯定義為下式的化合物其中A是取代或未經(jīng)取代的0-磷?；膶Ρ椒?；B是取代或未經(jīng)取代的對苯酚磷酸酯；X 是 CO 或 SO2 ；R1 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, -C(O)OR5、-OC(O)R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；R2 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, -C(O) OR5、-OC(O) R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；R3 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, _C(0) OR5、_0C(0) R5、-S(O) nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；并且R4 選自氫、鹵素、三氟甲基、氰基、硝基、-OR5、-C(O)R5, _C(0) OR5、_0C(0) R5、-S(O)
8nR5、-N (R5) R6、-C (0) N (R5) R6 和 R7 ；其中η 是 0、1 或 2;R5和R6各自獨(dú)立地是氫或R7 ；并且R7選自烴基、-(CH2)k-雜環(huán)基、-(CH2)k-C(O)-雜環(huán)基，其中的任意基團(tuán)任選地被1、 2、3、4或5個獨(dú)立地選自鹵素、氰基、氨基、羥基、-COOH和其酯(例如-C (0) -C1^6烷基)、亞 磷酰胺、Cp6烷基和CV6烷氧基的取代基取代；并且k是0、1、2、3、4、5或6。優(yōu)選地，酞類化合物的單磷酸酯定義為下式的化合物
權(quán)利要求
1.酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP 5b)的底物的用途。
2.用于測量樣本中TRAP5b的量的方法，所述方法包括使用酞類化合物的單磷酸酯作 為底物測定TRAP 5b的活性。
3.用于測量受試者中骨吸收率的方法，所述方法包括通過使用酞類化合物的單磷酸 酯作為底物測定TRAP 5b的活性而測量受試者樣本中TRAP 5b的量，其中存在于樣本中的 TRAP 5b的量反映了骨吸收率。
4.診斷受試者中與骨吸收率的變化相關(guān)的障礙的易感性的方法，所述方法包括通過 使用酞類化合物的單磷酸酯作為底物測定TRAP5b的活性而測量受試者樣本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量是患者患有該障礙的指示。
5.監(jiān)測用于預(yù)防或治療與骨吸收率的變化相關(guān)的障礙的藥物在服用該藥物的受試者 中的效果的方法，所述方法包括(a)通過使用酞類化合物的單磷酸酯作為底物測定TRAP 5b的活性而測量受試者樣本中存在的TRAP 5b的量；和(b)將TRAP 5b在上述樣本中的量 與TRAP5b在對照樣本中的量進(jìn)行比較。
6.篩選受試者對與骨吸收率的變化相關(guān)的障礙的易感性的方法，所述方法包括通過 使用酞類化合物的單磷酸酯作為底物測定TRAP5b的活性而測量受試者樣本中存在的TRAP 5b的量，其中TRAP 5b的非正常量表明對這類障礙的易感性。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6任一項的方法，所述方法包括(a)將樣本中存在的TRAP與結(jié)合 總TRAP (TRAP 5a和TRAP 5b)的抗體結(jié)合；和(b)通過使用酞類化合物的單磷酸酯作為底 物測定與所述抗體結(jié)合的TRAP 5b的活性而測量樣本中TRAP 5b的量。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7任一項的方法，其中TRAP5b活性的測定步驟在pH 6. 8至7. 6， 優(yōu)選pH 6. 8至7. 4，最優(yōu)選pH 7進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至8任一項的方法，其中通過測量TRAP5b活性后樣本顏色而測量 TRAP 5b 的量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項的方法，其中測定樣本中TRAP5b的活性的步驟包括如 下連續(xù)的步驟(e)溫育酞類化合物的單磷酸酯和樣本以使TRAP5b代謝底物；(f)停止代謝；(g)任選地調(diào)節(jié)樣本的PH；(h)測量由于被TRAP5b代謝而導(dǎo)致的底物的特征變化。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中使用分光光度計測量樣本的顏色。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至10任一項的方法，所述方法還包括通過將任一項權(quán)利要求中所 得的TRAP 5b的測量值與校正標(biāo)準(zhǔn)或曲線比較而得到存在于樣本中的TRAP 5b的量的絕對值。
13.根據(jù)權(quán)利要求2至11任一項的方法，其中TRAP5b活性的測定步驟在固體基質(zhì)上 進(jìn)行，優(yōu)選平臺、多孔板或陣列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述平臺是自動化的。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中所述自動化平臺包括磁珠。
16.用于實(shí)施根據(jù)任一項權(quán)利要求的方法的試劑盒，所述試劑盒包含酞類化合物的單 磷酸酯和任選地包含結(jié)合總TRAP的抗體。
17.酞類化合物的單磷酸酯通過作為TRAP5b的底物而用作骨吸收的指示物的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其用于根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項的方法中。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，所述用途包括將所述單磷酸酯與受試者的樣本接觸，隨 后測量樣本的顏色。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物是酚酞或磺酞。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物是苯酚磺酞。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物是具有式I的化 合物
23.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的用途、方法或試劑盒，其中酞類化合物的單磷酸酯選自 酚酞單磷酸酯、甲酚酞單磷酸酯、百里酚酞單磷酸酯、鄰氯酚酞單磷酸酯、苯酚磺酞單磷酸 酯、鄰甲酚磺酞單磷酸酯、間甲酚紫單磷酸酯、溴甲酚紫單磷酸酯、溴甲酚綠單磷酸酯、溴酚藍(lán)單磷酸酯、百里酚藍(lán)單磷酸酯、溴百里酚藍(lán)單磷酸酯、二甲苯酚藍(lán)單磷酸酯和氯酚紅單磷酸酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及酞類化合物的單磷酸酯作為抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的底物的用途。在用于測量受試者樣本中TRAP 5b的量的測定中使用所述底物，所述TRAP 5b的量作為骨吸收率的指標(biāo)，以及因此作為類似病況，例如骨質(zhì)疏松的指標(biāo)。本發(fā)明也提供了包含酞類化合物的單磷酸酯和任選包含結(jié)合總TRAP的抗體的試劑盒，以及方法。
文檔編號C12Q1/42GK102007411SQ200980113346
公開日2011年4月6日 申請日期2009年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日
發(fā)明者B·休斯敦, D·勞里, J·哈倫 申請人:伊姆諾診斷系統(tǒng)有限公司