專利名稱：：基于srap標記的茄子親緣關系的檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種農(nóng)作物育種
技術領域：
的檢測方法，具體是一種基于SRAP(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism,序列相關擴增多態(tài)性)標記的茄子親緣關系的檢測方法。
背景技術：
：在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中與人類經(jīng)濟生活密切相關的絕大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀是數(shù)量性狀，這些性狀呈連續(xù)變異，由大量的、效應微小并且可加的基因控制，并且易受環(huán)境因素的影響。這些性狀由于存在很小的差異，在親本選配時通常憑借育種學家的田間觀察，這在很大程度上限制了作物新品種選育。而分子標記技術的發(fā)明有助于理清育種材料之間的親緣關系，大大推進了育種進程。人類遺傳學家D.R.L.Botstein等于1980年首先提出了RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)技術即通過限制性內(nèi)切酶酶切基因組DNA，然后利用同位素標記的探針與酶切產(chǎn)物雜交來揭示其DNA多態(tài)性。1985年，聚酶鏈式反應(PCR)技術的誕生，使直接體外擴增DNA以檢測其多態(tài)性成為可能。隨后基于這兩種技術的新型分子標記不斷涌現(xiàn)如RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)、AFLP(amplifiedfragmentslengthpolymorphism,擴增片段長度多態(tài)性)、SSR(simplesequencer印eats，簡單序列重復)以及SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism，相關序列擴增多態(tài)性)。但研究表明RAPD標記需要的DNA量少，分析程序簡單，但為顯性標記，不能區(qū)分純合與雜合型，且重復性差，在實際應用中也存在一定困難；RFLP標記存在需要DNA樣品量大，操作程序繁瑣和多態(tài)性檢出率低的缺點；SSR屬共顯性標記，可靠性高，重演性好，分辨力強，但茄子上已經(jīng)開發(fā)的SSR標記數(shù)量較少。SRAP技術由Li和Quiros于2001年發(fā)明的基于PCR的雙引物分子標記系統(tǒng)。該技術針對基因外顯子富含GC，內(nèi)含子富含AT的特點，進行特殊的引物設計。其中，正向引物對外顯子進行特異擴增，反向引物對內(nèi)含子區(qū)域和啟動子區(qū)域進行特異擴增。由于外顯子序列在不同個體中通常是保守的，由于內(nèi)含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大，富含AT的區(qū)域序列通常見于啟動子和內(nèi)含子中，從而使得擴增片段呈現(xiàn)多態(tài)性。正向引物5'端為一段14堿基的核心序列組成，其中前10個堿基為"填充"序列(fillersequence)，無任何特異組成，接著為CCGG序列，隨CCGG之后為3個選擇性堿基，選擇性堿基的變化與相同核心序列組合成一套正向引物。反向引物的組成與正向引物類似，但"填充"序列后連接的為AATT;AATT序列后為3個選擇性可變堿基，位于引物3'端。由于該方法擴增片段是保守的開放閱讀框架(openreadingframe)區(qū)域，而且茄子遺傳基礎非常狹窄，于是Li，G和S皿，Z.D等開發(fā)了更多的SRAP引物。由于SRAP技術具有簡單、高效、高共顯性、重復性高、易測序等優(yōu)點，現(xiàn)在已經(jīng)用于甘藍、西葫蘆、野牛草、棉花等的遺傳圖譜構建和遺傳親緣關系分析。經(jīng)對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Karihaloo，J.L等在《TheoreticalandAppliedGenetics》(理論與應用遺4傳學)1995年第6期767770頁發(fā)表了題為《RandomamplifiedpolymorphicDNAvariationintheeggplant,SolariummelongenaL(Solanaceae)》(禾U用RAPD技術檢領lj茄子變異)一文，文中評述22對RAPD引物中一共擴增出130條條帶，但是只有4條在栽培種中存在差異，由此說明RAPD技術在檢測茄子尤其是栽培種的多態(tài)性較差；Mace，E.S等在《TheoreticalandAppliedGenetics》(理論與應用遺傳學)1999年第34期626633頁發(fā)表了題為《AFLPanalysisofgeneticrelationshipsamongthecultivatedeggplant,Sola皿mmelongenaL，andwildrelatives(Solanaceae)》(莉子栽培種及野生種遺傳關系AFLP分析)一文，文中評述AFLP是一種有效的評價遺傳親緣關系的工具，但是AFLP技術對模板DNA要求較高，成本較高，操作步驟繁瑣，不利于在實踐中應用；Stagel，A等在《BMCGenomics》(BMC基因組學)2008年第7期357370頁發(fā)表了題為《Gene-basedmicrosatellitedevelopmentformappingandphylogenystudiesineggplant》(為茄子圖譜與系統(tǒng)發(fā)生學研究開發(fā)基于基因的微衛(wèi)星標記)一文，作者設計了50對引物，其中有39對可以擴增出產(chǎn)物，但是只有11對可以在栽培種呈現(xiàn)多態(tài)性。由于從網(wǎng)上可以獲得的EST序列很少，通常設計大量SSR引物需要構建基因組文庫，并對每個克隆進行測序，盡管操作簡單，但是耗費成本較高，不利于推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法。本發(fā)明的方法簡單易行，成本低，效率高，每個SRAP引物在栽培種中平均檢測出0.75個多態(tài)位點。本發(fā)明是通過以下的技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟步驟一，提取茄子的DNA;步驟二，SRAP-PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；步驟三，對擴增產(chǎn)物電泳，得電泳凝膠；步驟四，對電泳凝膠進行銀染顯色；步驟五，對電泳結(jié)果結(jié)合形態(tài)性狀和系譜關系來區(qū)分不同品種茄子間的親緣關系。所述的結(jié)合形態(tài)性狀和系譜關系來區(qū)分，是指如果這兩者相同，則是同一種材料，或來自于同一祖先，反之，則沒有親緣關系。此方法可以非常清晰和直觀地說明各品系之間的親緣關系遠近步驟二中，所述SRAP-PCR擴增具體為采用lOiiL反應體系進行SRAP擴增，其中，10iiL反應體系具體為2.Ommol*L—'MgCl^200iimol*L—MNTPs，0.5iimol*L—1引物，Taq聚合酶0.5U，4050ng模板DNA，用重蒸水調(diào)整終體積至10yL，反應混合物用20yL石蠟油覆蓋；PCR擴增程序為94°C3分鐘；94°C45秒，35°C45秒，72°C1分鐘，5個循環(huán)；94°C45秒，50°C45秒，72°C1分鐘，35個循環(huán)；最后72°C7分鐘。步驟二中，所述SRAP-PCR擴增所用引物選自以下引物組合中的多種5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的方法簡單易行，成本低，效率高，每個SRAP引物在栽培種中平均檢測出0.75個多態(tài)位點。圖1為實施例1中15種不同茄子品系親緣關系的聚類分析圖2為實施例2中15種不同茄子品系親緣關系的聚類分析圖3為實施例3中15種不同茄子品系親緣關系的聚類分析圖。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實施例中涉及到的茄子品種均可以通過公開的市售渠道獲得，并均在已經(jīng)公開的期刊文獻中記載。實施例1以15份茄子品系為試驗材料，具體如表1所示。培養(yǎng)如下選用55t:溫水浸種15分鐘；然后轉(zhuǎn)入3(TC的常溫水中繼續(xù)浸泡810小時。將浸過的種子用干凈的紗布包好，放于3(TC光照培養(yǎng)箱中黑暗中催芽。待34天后，見7080%的種子破嘴時可停止催芽，播到由草炭、蛭石及有機肥(體積比4:4:1)混合的基質(zhì)中，澆透水后打0.5cm深的孔，將種子播到孔中，然后覆O.5cm厚的草炭。用黑色膜封嚴后置于3(TC左右的苗床上，45天后茄子種子出土，然后轉(zhuǎn)到日溫25°C，夜溫18°C的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)2周，等兩葉一心時取茄子真葉提取DNA。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>步驟一，DNA的提取基因組DNA提取和純化參照CTAB方法。提取后的DNA稀釋到20ngyL，4。C保存。步驟二，SRAP-PCR擴增采用10iiL反應體系進行SRAP擴增2.OmmolL—1MgCl2(氯化鎂)，200iimolL—MNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)，0.5iimo1L—1弓|物，Taq聚合酶0.5U，4050ng模板DNA，用重蒸水調(diào)整終體積至10yL，反應混合物用20yL石蠟油覆蓋。PCR擴增程序為94t:預變性3分鐘；94t:變性45秒，35。C復性45秒，72。C延伸1分鐘，5個循環(huán)；94°C變性45秒，5(TC復性45秒，72t:延伸1分鐘，35個循環(huán)；最后72"C延伸7分鐘。所用試劑25,1L—1MgCl2，10,1L—1dNTP，5UiiL—1Taq聚合酶、引物及電泳所用試劑，均購自上海生物工程公司。SRAP-PCR擴增中，采用的引物具體為以下組合，見表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中，所述引物具體如表3所示表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>步驟三，電泳PCR擴增產(chǎn)物通過6%的變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離。擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液l:1體積混合，變性之后加于膠板上樣孔，在60W的恒功率下電泳。步驟四，銀染顯色(1)固定將帶膠的玻板放入盛有2L新配制的0.5%的冰醋酸和10%無水乙醇混合液的固定盒中，在搖床上輕搖20分鐘，直至膠面上二甲苯氰顏色全部褪掉；(2)水洗放到盛有蒸餾水的水洗盒中，輕搖3分鐘；(3)銀染水洗完畢，放入盛有2L0.2X的AgN03染色液的染色盒中，輕搖30分鐘；(4)事先配制2L1.5%NaOH和0.5%甲醛的顯影液，搖勻待用；(5)再水洗從染色盒中取出膠板，放到水洗盒中清洗，時間不超過10秒。(6)顯影水洗后迅速將膠板放入顯影盒中顯影，直至出現(xiàn)清晰的條帶；(7)定影最后用2L0.75%無水化20)3定影液定影。取出膠板，清水沖洗，銀染結(jié)束。步驟五，聚類分析結(jié)果13對引物組合總共產(chǎn)生62條差異條帶。將電泳圖譜上同一擴增位點上有帶記錄為1，無帶記錄為0，作0，1矩陣圖輸入計算機。采用NTSYS-pc軟件(版本2.1)，計算Jaccard相似矩陣，根據(jù)UPGMA方法構建聚類樹狀，如圖1所示。從圖1可以看出這15份材料大體可以分為三類，第一類包括1、3、7、8、9、10、14，其中1與14號遺傳相似系數(shù)為1.00，說明親緣關系最近。第二類包括2、4、5、6、11、12號，13與15號構成第三類，它與其它品系的遺傳相似系數(shù)分別為0.20，0.IO，從而與第一類和第二類的親緣關系最遠?？傊?，通過這種方法可以非常清晰和直觀地說明各品系之間的親緣關系遠近，為育種上親本選配提供理論依據(jù)。實施例2以15份茄子品系為試驗材料，具體如表4所示，培養(yǎng)過程同實施例1。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>DNA的提取，同實施例1。SRAP-PCR擴增，同實施例1，不同之處在在于，所用引物組合如表5所示0D8GA340D26GA340D10GA19SA7GA50D12GA5SA7GA120D15GA11SA8GA30D15GA33SA14GA20D22GA19SA17GA50D22GA34SA18PM180D26GA30SA21GA5步驟三，電泳，同實施例1。步驟四，銀染顯色，同實施例1。步驟五，聚類分析結(jié)果16對引物組合總共產(chǎn)生80條差異條帶。將電泳圖譜上同一擴增位點上有帶記錄為l，無帶記錄為O，作O，l矩陣圖輸入計算機。采用NTSYS-pc軟件(版本2.l)，計算Jaccard相似矩陣，根據(jù)UPGMA方法構建聚類樹狀，如圖2所示。這15份材料都是栽培種，其平均遺傳相似系數(shù)為0.89。從圖2可以看出這15份材料大體可以分為三類，第一類包括1、3、4、14，第二類包括2、5、6、7、9、10、11、12和13號，第二類中有三組沒有被區(qū)分開，分別為(2、6、7)，(9、10)，(12、13)。要區(qū)分它們，則需要結(jié)合形態(tài)性狀和系譜關系來區(qū)分。如果這兩者相同，則可能是同一種材料，或來自于同一祖先。而8與15號構成第三類。此方法可以非常清晰和直觀地說明各品系之間的親緣關系遠近，為育種上親本選配提供理論依據(jù)。實施例3以15份茄子品系為試驗材料，具體見表6，培養(yǎng)過程同實施例1。表6步驟一，步驟二，表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>步驟一，DNA的提取，同實施例1。步驟二，SRAP-PCR擴增，同實施例1，不同之處在在于，所用引物組合如表7所示表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>步驟三，電泳，同實施例1。步驟四，銀染顯色，同實施例1。步驟五，聚類分析結(jié)果16對引物組合總共產(chǎn)生80條差異條帶。將電泳圖譜上同一擴增位點上有帶記錄為l，無帶記錄為O，作O，l矩陣圖輸入計算機。采用NTSYS-pc軟件(版本2.l)，計算Jaccard相似矩陣，根據(jù)UPGMA方法構建聚類樹狀，如圖3所示。從圖3可以看出這15份材料大體可以分為三類。第一類為15，其與其它品系的平均相似系數(shù)為0.49;第二類為12，其與其它品系的平均相似系數(shù)為0.54;其它13份材料為第三類。從而非常清晰和直觀地說明各品系之間的親緣關系遠近，為育種上親本選配提供理論依據(jù)。0080]序列表0081]〈110〉上海交通大學0082]〈120〉基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法0083]〈160>210084]〈170>PatentInversion3.30085]〈210>10086]〈211>180087]〈212>DNA0088]〈213〉人工序列0089]〈400>10090]cac朋gtcgctg3g朋gg0091]〈210>20092]〈211>180093]〈212>DNA0094]〈213〉人工序列0095]〈400>20096]￡lgg￡lggg￡l￡l￡lggtctggt0097]〈210>30098]〈211>210099]〈212>DNA0100]〈213〉人工序列0101]〈400>30102]ttg朋tetccagtgt朋ggtt0103]〈210>40104]〈211>180105]〈212>DNA0106]〈213〉人工序列0107]〈400>40108]gcgaggatgctactggtt0109]〈210>5:o"o]:o川]:o"2]:o"3]:oii4]<211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5gcgaggatgctactggtt:0115]〈210>6:0116]〈211>17:0117]〈212〉DNA:0118]〈213>人工序列:0119]〈400>6.0120]cgcaagacccaccacaa17:0121]〈210>7:0122]〈211>17:0123]<212>DNA:0124]〈213>人工序列:0125]〈400>7.0126]ggatgaagcgacaagtc17:0127]〈210>8:0128]〈211>21:0129]〈212>DNA:0130]〈213〉人工序列:0131]〈400>8:0132]ttaccttggtcatacaacatt21:0133]〈210>9:0134]〈211>21:0135]〈212>DNA:0136]<213>人工序列:0137]〈400>9:0138]ttaccttggtcatacaacatt21:0139]〈210>10:0140]〈211>17:0141]〈212>DNA:0142]〈213>人工序列:0143]〈400〉10:0144]acgagttgcggaagtgg17:0145]〈210>11:0146]〈211>19:0147]〈212>DNA:0148]〈213>人工序列〈400>11g朋tgcagg3gaacacgtt〈210>12〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>12ttgaactggc3gaaagggt<210>13〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400>13tcatctcaaaccatctacac〈210>14〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>14ggjmcc朋3c3catg朋ga〈210>15〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>15cattgtggtggttattgtca〈210>16〈211>20〈212>醒<213>人工序列〈400>16caccaccatcatcatatctt〈210>17〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>17tt朋gggcata肪3catgg;at〈210>1819192019202021:0188]:0189]:0190]:0191]〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>18:0192]:0193]〈210>19:0194]〈211〉18:0195]〈212>DNA:0196]<213>人工序列:0197]〈400>19.0198]ctctccaccgcacatatc18:0199]〈210>20:0200]<211>20:0201]〈212>DNA:0202]〈213>人工序列:0203]〈400>20:0204]ccaaatggaac朋aatgatg20:0205]〈210>21:0206]〈211>18:0207]〈212>DNA:0208]<213>人工序列:0209]〈400>21:0210]aagcgatcaaagcgggtg18權利要求一種基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，提取茄子的DNA；步驟二，SRAP-PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；步驟三，對擴增產(chǎn)物電泳，得電泳凝膠；步驟四，對電泳凝膠進行銀染顯色；步驟五，對電泳結(jié)果結(jié)合形態(tài)性狀和系譜關系來區(qū)分各個品種茄子間的親緣關系。2.根據(jù)權利要求1所述的基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法，其特征是，所述的結(jié)合形態(tài)性狀和系譜關系來區(qū)分，是指如果這兩者相同，則是同一種材料，或來自于同一祖先，反之，則沒有親緣關系。3.根據(jù)權利要求1所述的基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法，其特征是，步驟二中，所述SRAP-PCR擴增具體為采用lOiiL反應體系進行SRAP擴增，其中，lOiiL反應體系具體為2.OmmolL-lMgC12，200iimolL_ldNTPs，0.5iimolL_l引物，Taq聚合酶0.5U，4050ng模板DNA，用重蒸水調(diào)整終體積至10yL，反應混合物用20yL石蠟油覆蓋；PCR擴增程序為94°C3分鐘；94°C45秒，35。C45秒，72。C1分鐘，5個循環(huán)；94°C45秒，50°C45秒，72t:1分鐘，35個循環(huán)；最后72°C7分鐘。4.根據(jù)權利要求1或3所述的基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法，其特征是，步驟二中，所述SRAP-PCR擴增所用引物選自以下引物組合中的多種<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>其中，所述引物具體如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>全文摘要一種農(nóng)作物育種
技術領域：
的種基于SRAP標記的茄子親緣關系的檢測方法，包括如下步驟步驟一，提取茄子的DNA；步驟二，SRAP-PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；步驟三，對擴增產(chǎn)物電泳，得電泳凝膠；步驟四，對電泳凝膠進行銀染顯色；步驟五，對電泳結(jié)果進行聚類分析，確定不同品種茄子間的親緣關系。本發(fā)明的方法簡單易行，成本低，效率高，每個SRAP引物在栽培種中平均檢測出0.75個多態(tài)位點。文檔編號C12Q1/68GK101712998SQ20091030922公開日2010年5月26日申請日期2009年11月3日優(yōu)先權日2009年11月3日發(fā)明者劉楊,莊天明,李懷志,陳火英,韓洪強申請人:上海交通大學