專利名稱：用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的新的方法和過程，所述哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì) 產(chǎn)物，優(yōu)選糖基化蛋白質(zhì)產(chǎn)物。細(xì)胞培養(yǎng)方法和過程的性能導(dǎo)致高細(xì)胞生存力并且還可以 導(dǎo)致高產(chǎn)物質(zhì)量和數(shù)量，延長生長期，延遲死亡期的出現(xiàn)，和遏制死亡期。
背景技術(shù)：
動物細(xì)胞培養(yǎng)，特別是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選用以表達(dá)用于治療和/或預(yù)防應(yīng)用 的重組產(chǎn)生的糖基化蛋白質(zhì)。重組糖蛋白的糖基化模式是重要的，因為糖蛋白的寡糖側(cè)鏈 影響蛋白質(zhì)功能，以及蛋白質(zhì)的不同區(qū)域之間的分子內(nèi)相互作用。這些分子內(nèi)相互作用與 蛋白質(zhì)構(gòu)象和糖蛋白的三級結(jié)構(gòu)有關(guān)(見，例如，A.Wittwer等人，1990，Biochemistry, 29 4175-4180 ；Hart, 1992，Curr. Op. Cell Biol.，4 :1017_1023 ；Goochee 等人，1991，Bio/ Technol.，9 :1347_1355 ；和 R. B. Parekh, 1991, Curr. Op. Struct. Biol.，1 :750_754)。此外， 寡糖基于特異細(xì)胞糖受體可以將特定多肽靶定到某些結(jié)構(gòu)。(M. P. Bevilacqua等人，1993， J.Clin. Invest. ,91 :379_387 ；R.M.Nelson 等人，1993，J.Clin. Invest. ,91 :1157_1166 ； K. E. Norgard 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 1068-1072 ；和 Y. mai 等人，1993， Nature, 361-555-557)。公知糖蛋白寡糖側(cè)鏈的末端唾液酸成分影響糖蛋白的多種方面和 性質(zhì)，包括吸收、溶解性、熱穩(wěn)定性、血清半壽期、從血清的清除，以及其物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)/ 行為和其免疫原性(A. Varki, 1993, Glycobiology, 3 :97_100 ；R. B. Parekh, Id.，Goochee 等人，Id.，J. Paulson 等人，1989，TIBS, 14 :272_276 ；和 A. Kobata, 1992，Eur. J. Biochem.， 209 483-501 ；E. Q. Lawson 等人，1983，Arch. Biochem. Biophys. ，220 :572_575 ；禾口 E. Tsuda 等人，1990，Eur. J. Biochem.，188 405-411)。通常基于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)中蛋白質(zhì)表達(dá)水平比微生物表達(dá)系統(tǒng)，例如， 細(xì)菌或者酵母表達(dá)系統(tǒng)中低得多。然而，細(xì)菌和酵母細(xì)胞在最佳地表達(dá)高分子量蛋白質(zhì)產(chǎn) 物、正確地折疊具有復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，和/或提供必要的翻譯后修飾使所表達(dá)的糖 蛋白成熟的能力方面受到限制，從而影響產(chǎn)物的免疫原性和清除速度。由于培養(yǎng)動物或哺乳動物細(xì)胞，尤其產(chǎn)生重組產(chǎn)物的動物或者哺乳動物細(xì)胞的限 制，已經(jīng)研究了多種參數(shù)的操作，這些參數(shù)包括使用大規(guī)模培養(yǎng)容器；改變基本培養(yǎng)條件， 如孵育溫度、溶解氧濃度、PH等等；使用不同類型的培養(yǎng)基和向培養(yǎng)基加入添加劑；和增加 所培養(yǎng)細(xì)胞的密度。此外，延長運(yùn)行時間以增加終產(chǎn)物濃度而保持高產(chǎn)物質(zhì)量的能力的發(fā) 展將有益于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法開發(fā)。重要的產(chǎn)物質(zhì)量參數(shù)是溫度和多肽產(chǎn)物的糖基 化結(jié)構(gòu)的完全性，唾液酸含量通常用于糖蛋白質(zhì)量的量度。
細(xì)胞培養(yǎng)過程，尤其非連續(xù)方法的運(yùn)行時間通常受到細(xì)胞的剩余生存力的限制， 所述剩余生存力通常隨著運(yùn)行過程減小。因此希望最大可能地延長高細(xì)胞生存力。產(chǎn)物質(zhì) 量的考慮也促使最小化存活細(xì)胞密度的減小并且保持高細(xì)胞生存力，因為細(xì)胞死亡可以釋 放唾液酸酶到培養(yǎng)上清液中，這可以減少所表達(dá)的蛋白質(zhì)的唾液酸含量。蛋白質(zhì)純化考慮 進(jìn)一步促使最小化存活細(xì)胞密度的減小并且保持高細(xì)胞生存力。培養(yǎng)物中存在細(xì)胞碎片和 死亡細(xì)胞的成分可以負(fù)面地影響在培養(yǎng)試驗?zāi)┒朔蛛x和/或純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力。通過 培養(yǎng)中使細(xì)胞保持更長時間的存活，伴隨著細(xì)胞蛋白質(zhì)和酶對培養(yǎng)基的污染的減少，所述 細(xì)胞蛋白質(zhì)和酶為例如，細(xì)胞蛋白酶和唾液酸酶，它們可以導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的所希望的糖蛋 白的降解和最終質(zhì)量降低。已經(jīng)研究了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中高細(xì)胞生存力的多種參數(shù)。一種參數(shù)包括最初在37°C 培養(yǎng)后僅降低培養(yǎng)溫度(例如,Roessler 等人，1996，Enzyme and Microbial Technology, 18 423-427 ；T. Etcheverry 等人的美國專利號 5，705, 364 和 5，721，121，1998 ；K. Furukawa 等人的美國專利號5，976，833，1999 ；L. Adamson等人的美國專利號5，851，800，Genentech， Inc.的 TO 99/61650 和 WO 00/65070 ；W000/36092 to Biogen, Inc.；和 Girard 等人的美 國專利號4，357，422)。所研究的其他參數(shù)包括向培養(yǎng)基中加入組分。證明生長因子抑制劑蘇拉明在CH0 K1 :CycE的指數(shù)生長期間防止編程性細(xì)胞死亡(Zhangi等人，Biotechnol. Prog. 2000,16， 319-325)。然而，蘇拉明不在死亡期保護(hù)細(xì)胞防止編程性細(xì)胞死亡。結(jié)果，蘇拉明能夠在生 長期保持高生存力，但是不允許延長培養(yǎng)壽命。相同的作者報導(dǎo)對于CHOI 11-10PF細(xì)胞系， 硫酸葡聚糖和硫酸聚乙烯類似于蘇拉明可以相對于對照培養(yǎng)物增加第三天存活細(xì)胞密度 和生存力。然而沒有報導(dǎo)死亡期期間硫酸葡聚糖或者硫酸聚乙烯的作用。還報導(dǎo)蘇拉明、 硫酸葡聚糖和硫酸聚乙烯可以有效防止細(xì)胞聚集。已經(jīng)向動物細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)加肝素以便使依賴錨定的細(xì)胞系適應(yīng)懸浮條件(例 如，McKenna和Granados的美國專利號5，348，877，1994)。還公知肝素結(jié)合生長因子，如肝 素結(jié)合類 EGF 生長因子(HB-EGF ；Raab 和 Klagsbrun，Biochim. Biophys. Acta 1997，1333， F179-F199)。報導(dǎo)細(xì)胞表面硫酸類肝素蛋白聚糖(HSPG)增強(qiáng)HB-EGF結(jié)合和某些細(xì)胞類型 (包括野生型CH0細(xì)胞)的生物活性(Raab和Klagsbrun，1997)。[硫酸類肝素和肝素的區(qū) 別僅在于硫酸類肝素具有更少的N-和0-硫酸基團(tuán)和更多N-乙酰基(McKerma和Granados， 1994)。為了本公開的目的，認(rèn)為肝素和硫酸類肝素是等價的并且將通常稱作肝素]。對于 結(jié)合肝素的生長因子EGF-2，已經(jīng)提出對HSPG的結(jié)合增加細(xì)胞表面上局部FGF-2濃度，這 又增加了 FGF-2結(jié)合細(xì)胞的酪氨酸激酶受體的可能性(Raab和Klagsbrun，1997)。已經(jīng)表 明聚硫酸戊聚糖可以阻斷培養(yǎng)的細(xì)胞上肝素結(jié)合生長因子的作用(Zugmaier等人，J.Nat. Cancer Inst.1992，84，1716—1724)。關(guān)于在動物細(xì)胞培養(yǎng)物中使用硫酸葡聚糖的專利文獻(xiàn)涉及向培養(yǎng)基補(bǔ)加硫酸葡 聚糖，目的是1)提高生長速度和增加人內(nèi)皮細(xì)胞衰老前群體加倍的次數(shù)(Levine等人的 美國專利號4，994，387和5，132，223，1991，1992) ；2)增加哺乳動物細(xì)胞系中重組蛋白產(chǎn)率 (Israel，1994的美國專利號5，318，898) ；3)誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞系中單一細(xì)胞懸浮(Shuler和 Dee的美國專利號5，728，580，1996) ；4)增加人肝細(xì)胞生長因子的生長促進(jìn)活性和抑制其 降解(Naka的美國專利號5，545，722和5，736，506，1996和1998) ；5)增加存活細(xì)胞密度和重組蛋白質(zhì)表達(dá)(Gorfien等人的W0 98/08934,1997)。在關(guān)于在培養(yǎng)基中存在或者補(bǔ)加硫酸葡聚糖的所有報導(dǎo)的情況中，在該給定培養(yǎng) 基中整個培養(yǎng)時間內(nèi)都存在硫酸葡聚糖。沒有報導(dǎo)延遲加入的益處。而且，還沒有報導(dǎo)硫 酸葡聚糖可以延遲死亡期的出現(xiàn)，延長生長期，或者遏制死亡期。隨著培養(yǎng)中產(chǎn)物濃度的增加，可以在細(xì)胞培養(yǎng)過程中觀察到產(chǎn)物質(zhì)量下降，這通 過寡糖糖結(jié)構(gòu)的所測量的唾液酸含量確定。通常存在通過藥物清除研究確定的可接受的唾 液酸含量的下限。培養(yǎng)中細(xì)胞產(chǎn)生的高豐度蛋白質(zhì)優(yōu)選伴隨著高質(zhì)量蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì) 最終經(jīng)回收用于所計劃的用途。正確糖基化的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)上和臨床上變得越來越重要，用于治療和 預(yù)防。因此，開發(fā)經(jīng)濟(jì)而有效地實(shí)現(xiàn)增加的最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物濃度，以及高水平產(chǎn)物質(zhì)量(如 通過唾液酸含量確定)的可靠的細(xì)胞培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)了本領(lǐng)域中所希望和需要的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了通過動物或者哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)產(chǎn) 物，更優(yōu)選糖蛋白產(chǎn)物的新方法。這些新方法實(shí)現(xiàn)了增加的細(xì)胞生存力。本發(fā)明的一方面涉及使用兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換。在該方面，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方 法可以有利地實(shí)現(xiàn)增加的最終滴定度或者產(chǎn)物(例如，糖蛋白)濃度，以及所培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生 的糖蛋白的增加的唾液酸含量。更具體地，根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)期期間兩次或多次溫度轉(zhuǎn) 換維持培養(yǎng)中細(xì)胞的高細(xì)胞生存力并且可以在整個培養(yǎng)運(yùn)行期間提供所產(chǎn)生的產(chǎn)物的高 數(shù)量和質(zhì)量。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法可有利地 允許延長培養(yǎng)的生產(chǎn)期。在延長的生產(chǎn)期期間，所希望的產(chǎn)物的滴定度增加了，產(chǎn)物質(zhì)量 (如以唾液酸含量為特征)保持在高水平；并且細(xì)胞生存力也保持在高水平。此外，與本發(fā) 明的培養(yǎng)方法有關(guān)的延長的生產(chǎn)期允許產(chǎn)物的產(chǎn)量超過標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期期間產(chǎn)生的產(chǎn)量。在本發(fā)明的一個方面，使用多步溫度轉(zhuǎn)換，優(yōu)選包含兩次或者多次向下溫度轉(zhuǎn)換 的定時多步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞以產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，尤其糖蛋白產(chǎn)物。兩 次或多次(即，至少兩次)溫度轉(zhuǎn)化可以在培養(yǎng)的生長期之后進(jìn)行，其構(gòu)成本發(fā)明的方法。 使用至少兩次溫度轉(zhuǎn)換，優(yōu)選在轉(zhuǎn)換之間相隔約4天，可以實(shí)現(xiàn)高蛋白質(zhì)產(chǎn)率以及伴隨著 所希望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的高唾液酸含量。包括多次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物 的高質(zhì)量和數(shù)量，以及在培養(yǎng)期的持續(xù)時間內(nèi)維持細(xì)胞生存力。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法可允許細(xì)胞在培養(yǎng) 物中保持一段時間，其有利地延長培養(yǎng)運(yùn)行以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的高質(zhì)量和數(shù)量。本發(fā)明有 利地提供的蛋白質(zhì)生產(chǎn)期的這種延長指可以進(jìn)行的生產(chǎn)期超過培養(yǎng)運(yùn)行中沒有溫度轉(zhuǎn)換， 或者僅一次溫度轉(zhuǎn)換時得到的蛋白質(zhì)生產(chǎn)期。延長的生產(chǎn)期與包括所描述的細(xì)胞培養(yǎng)方法 的多次溫度轉(zhuǎn)換有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的新的細(xì)胞培養(yǎng)方法，溫度中兩次、三次、四次或多次向 下轉(zhuǎn)換與第一次溫度轉(zhuǎn)換的聯(lián)合允許細(xì)胞培養(yǎng)物維持高細(xì)胞生存力并且在本發(fā)明的一個 實(shí)施方案中提供了延長的生產(chǎn)期，在該期間蛋白質(zhì)產(chǎn)物的滴定度增加了并且以唾液酸含量 為特征的產(chǎn)物質(zhì)量保持直到培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束都保持高水平。本文中所用的培養(yǎng)運(yùn)行指培養(yǎng)期，優(yōu)選整個培養(yǎng)期。對于包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn) 換的培養(yǎng)運(yùn)行，整個培養(yǎng)運(yùn)行的長度可以持續(xù)短至僅第二次溫度轉(zhuǎn)換后(例如，約10-14天)到長達(dá)約28到30天，或更長。對于含有三次(或者多次)溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)運(yùn)行，整個 運(yùn)行的長度可以從短至僅第三次(或者最后一次)溫度轉(zhuǎn)換后(例如，約14到21天)到 長達(dá)約28到30天或者更長時間。從而，按照本發(fā)明的方法，可以培養(yǎng)細(xì)胞的總的運(yùn)行期為 大于10天，大于14天，或者大于21天。優(yōu)選地，培養(yǎng)運(yùn)行持續(xù)至少約10到14天到約21 到30天，或者更長時間?？偟呐囵B(yǎng)運(yùn)行可以包括2、3、4或多步溫度轉(zhuǎn)換。作為非限制性實(shí)例，如下實(shí)施兩 步溫度轉(zhuǎn)換從第0天到約第6天，培養(yǎng)溫度最初保持在37°C，或者接近37°C ；從約第6天 到約第10天，培養(yǎng)溫度保持在34°C，或者約34°C ；從約第10天往后，例如，到約第14到28 天，到約第14到18天，或者到培養(yǎng)運(yùn)行末，培養(yǎng)溫度保持在32°C，或者接近32°C。根據(jù)本 發(fā)明的三步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)方法包括下面的非限制性、代表性形式從第0天到約第6天，培 養(yǎng)溫度控制37°C，或者接近37°C ；從約第6天到約第10天，培養(yǎng)溫度保持在34°C，或者約 34°C ；從約第10天到約第14天，培養(yǎng)溫度保持在32°C，或者接近32°C ；從約第14天往后， 例如，到約第21到30天，或者更長時間，例如到培養(yǎng)運(yùn)行末，培養(yǎng)溫度保持在30°C，或者接 近 30°C。從而，使用本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)方法不僅對具有“更短”，例如標(biāo)準(zhǔn)持續(xù)時間(例如，約 10到約14天)的培養(yǎng)運(yùn)行有益，而且對可以比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)運(yùn)行耐受更長時間的培養(yǎng)運(yùn)行有 益，其中本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)方法包括兩次或者多次溫度轉(zhuǎn)換，其中實(shí)現(xiàn)了高數(shù)量和質(zhì)量的蛋 白質(zhì)產(chǎn)物。實(shí)現(xiàn)這種更長的持續(xù)時間培養(yǎng)運(yùn)行是因為本發(fā)明的方法提供了延長培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn) 生蛋白質(zhì)的最初或者標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)期(最初或者標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期通常在約第6到14天發(fā)生)。例 如，與不使用溫度轉(zhuǎn)換或者，最多使用一次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)產(chǎn)生和產(chǎn)物質(zhì)量相 比，通過在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)運(yùn)行中使用兩次、三次或者多次溫度轉(zhuǎn)換，蛋白質(zhì)產(chǎn)生的高質(zhì) 量和數(shù)量和細(xì)胞生存力可以保持和維持約10-14天的總運(yùn)行時間到約21到28天或者更長 時間的總運(yùn)行時間。本發(fā)明的另一方面提供了包含大于如上描述的兩次或三次溫度轉(zhuǎn)換的細(xì)胞培養(yǎng) 方法。在這些多步溫度轉(zhuǎn)換運(yùn)行中，基本上如對于三步培養(yǎng)期所描述的培養(yǎng)細(xì)胞，并進(jìn)行額 外的向下溫度轉(zhuǎn)換直到培養(yǎng)期結(jié)束。例如，可以在第三次溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)期后在從培養(yǎng)開始 后的第15-19天或約第15-19天，優(yōu)選第18天實(shí)施第四次向下溫度轉(zhuǎn)換，S卩，溫度降低，其 中細(xì)胞培養(yǎng)溫度進(jìn)一步從約30°C轉(zhuǎn)換到約28°C或29°C，優(yōu)選約29°C。所述細(xì)胞培養(yǎng)方法 中可以包括額外的溫度轉(zhuǎn)換，其中細(xì)胞保持在更低的溫度，例如，< 29°C，以進(jìn)一步延長蛋 白質(zhì)產(chǎn)生直到運(yùn)行結(jié)束，優(yōu)選長于28-30天。在所有情況中，通常使用如本文中描述的本領(lǐng) 域中常規(guī)實(shí)施的技術(shù)回收，例如分離和/或充分純化(如果希望)培養(yǎng)期末細(xì)胞產(chǎn)生的蛋 白質(zhì)。此外，通過常規(guī)方法評估唾液酸含量。在一個具體方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中通過使用兩步或多步溫度轉(zhuǎn)換方 法，產(chǎn)物的最終滴定度得到增強(qiáng)，并且所產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸含量更高。根據(jù)該具體方 面，兩次或多次定時溫度轉(zhuǎn)換維持了培養(yǎng)物的高細(xì)胞生存力，從而使得培養(yǎng)期延長，在該培 養(yǎng)期期間產(chǎn)物，優(yōu)選重組產(chǎn)物的滴定度增加并且以唾液酸含量為特征的產(chǎn)物質(zhì)量保持在高 水平。這種兩步或多步溫度轉(zhuǎn)換可以使得細(xì)胞培養(yǎng)過程期間產(chǎn)物的生產(chǎn)中蛋白質(zhì)滴定度和 唾液酸含量之間的優(yōu)勢折衷(prevailing trade-off)最小。從而，溫度轉(zhuǎn)換為增強(qiáng)培養(yǎng)過 程的一個重要參數(shù)，即“終(即最終)滴定度”X “終(即最終)唾液酸”的算術(shù)乘積(“終滴定度X終唾液酸”)提供了正效應(yīng)。因此，在另一具體方面，對于在如本文中新近描述的兩步培養(yǎng)方法，從第0天到第 6天或約第6天，細(xì)胞保持在37°C，或者接近37°C的培養(yǎng)物中；在第6天或約第6天，細(xì)胞 培養(yǎng)物的溫度降低到34°C，或者接近34°C;在第10-14天或者約第10-14天，溫度再次降低 到32°C，或者接近32°C。在這種兩步溫度轉(zhuǎn)換方法的一個實(shí)施方案中，生產(chǎn)期延長到超過 約第14天并持續(xù)到培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束，例如，直到約第21天，或者約第28天到30天，或更長， 在該時間內(nèi)細(xì)胞保持在32°C，或者接近32°C的較低溫度下培養(yǎng)?？梢匀绫疚闹羞M(jìn)一步描述 的在延長的生產(chǎn)期結(jié)束時回收蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本發(fā)明的再一方面是提供通過在培養(yǎng)運(yùn)行期間將細(xì)胞進(jìn)行兩次或者多次溫度轉(zhuǎn) 換增加培養(yǎng)物中細(xì)胞生存力的方法。如果存在諸如溫度中兩次或多次轉(zhuǎn)換的條件時在一段 時間內(nèi)培養(yǎng)物中細(xì)胞生存力比不存在該條件時的細(xì)胞生存力更高，那么該條件導(dǎo)致增加的 細(xì)胞生存力。根據(jù)該方面，如所描述的兩次或者多次溫度轉(zhuǎn)換細(xì)胞培養(yǎng)方法允許細(xì)胞在更 長的時間內(nèi)，如超過標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期的時間內(nèi)保持存活。如本文中討論的，所培養(yǎng)細(xì)胞的增加的 細(xì)胞生存力的有益結(jié)果可以是在誘導(dǎo)保持存活細(xì)胞的條件下，培養(yǎng)期結(jié)束時產(chǎn)生更大量的 (高質(zhì)量)產(chǎn)物。本發(fā)明的另一方面是兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換細(xì)胞培養(yǎng)方法的實(shí)施導(dǎo)致的增加的細(xì) 胞生存力與培養(yǎng)物中細(xì)胞碎片和死亡或者將死細(xì)胞隨時間釋放的內(nèi)容物的量相關(guān)。培養(yǎng)物 中存在細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞內(nèi)容物可以負(fù)面地影響分離和/或純化培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束時蛋白 質(zhì)產(chǎn)物的能力。通過使細(xì)胞在培養(yǎng)中更長時間地保持存活，伴隨著細(xì)胞蛋白質(zhì)和酶，例如， 細(xì)胞蛋白酶和唾液酸酶對培養(yǎng)基污染的減少，所述酶可以導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的所希望的糖蛋白 的降解和最終質(zhì)量降低。本發(fā)明的另一方面涉及向細(xì)胞培養(yǎng)物延遲加入聚陰離子化合物。延遲加入聚陰離 子化合物實(shí)現(xiàn)增加的細(xì)胞生存力。聚陰離子化合物優(yōu)選為硫酸葡聚糖。在孵育后的某一時 間向培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物。在本發(fā)明的一個方面，在接種后某個時間向培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物，該時間 在最初的死亡期開始之前，或者最初的生長期期間，或者最初生長期的后半期期間，或者在 最初生長期結(jié)束時或者約最初生長期結(jié)束時。根據(jù)本發(fā)明的該方面，生長期延長和/或死 亡期來臨延遲了一段時間，如數(shù)天。此外，一旦死亡期開始，死亡速度被極大地減小。在本發(fā)明的另一方面，在最初死亡期期間向培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物。根據(jù)本 發(fā)明的該方面，細(xì)胞死亡受到一段時間，如數(shù)天的遏制。在本發(fā)明的另一優(yōu)選的方面并且作為本文中進(jìn)一步描述的，該新近開發(fā)的細(xì)胞培 養(yǎng)方法(包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的那些方法和包括延遲加入聚陰離子化合物的方法)尤 其適于生產(chǎn)可溶CTLA4分子和可溶CTLA4突變分子，如CTLA4Ig和L104EA29YIg，它們可通 過基因工程化以表達(dá)和產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生(見實(shí)施例1到11)。本發(fā)明的 優(yōu)選實(shí)施方案包括在培養(yǎng)運(yùn)行期間使用多次溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)產(chǎn)生CTLA4Ig和L104EA29YIg的 細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)大量高質(zhì)量CTLA4Ig和L104EA29YIg產(chǎn)物，所述高質(zhì)量可通過終產(chǎn)物的唾液酸 測量確定。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括使用延遲加入聚陰離子化合物培養(yǎng)產(chǎn)生CTLA4Ig和 L104EA29YIg 的細(xì)胞。在閱讀了本發(fā)明的詳細(xì)描述和考慮了附圖后將理解本發(fā)明的其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)o


圖1顯示不同的溫度轉(zhuǎn)換對在5升(5L)反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞生存力的影響。從 本文實(shí)施例3中描述的實(shí)驗得到這些結(jié)果。在包括無溫度轉(zhuǎn)換(“無T轉(zhuǎn)換”)、一次溫度 轉(zhuǎn)換(“一次T轉(zhuǎn)換”)和兩次向下溫度轉(zhuǎn)換(“雙T轉(zhuǎn)換”)的培養(yǎng)方法之間進(jìn)行了比較。圖2顯示不同的溫度轉(zhuǎn)換對在50升(50L)反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞生存力的影響。 從本文實(shí)施例3中描述的實(shí)驗得到這些結(jié)果。在包括三次向下溫度轉(zhuǎn)換(“三次T轉(zhuǎn)換”) 和兩次向下溫度轉(zhuǎn)換(“雙T轉(zhuǎn)換”)的培養(yǎng)方法之間進(jìn)行了比較。圖3描繪了 CTLA4Ig的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和所編碼的氨基酸序列(SEQID NO 2)，CTLA4Ig具有信號肽、在+1位甲硫氨酸開始到+124位天冬氨酸結(jié)束，或者在_1位 丙氨酸開始到+124位天冬氨酸結(jié)束的CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域的野生型氨基酸序列，和Ig區(qū)。圖4描繪了 CTLA4突變分子(L104EA29YIg)的核苷酸序列(SEQ IDN0 3)和所編碼 的氨基酸序列(SEQID NO :4)，該CTLA4突變分子具有信號肽、在+1位甲硫氨酸開始到+124 位天冬氨酸結(jié)束，或者在-1位丙氨酸開始到+124位天冬氨酸結(jié)束的CTLA4的突變胞外結(jié) 構(gòu)域的野生型氨基酸序列，和Ig區(qū)。圖5描繪了與制癌蛋白M信號肽(-26位到-2位)融合的人CTLA4受體(此處稱 作“野生型” CTLA4)的核酸序列(SEQ ID NO 5)和所編碼的完整氨基酸序列(SEQ ID NO 6)(美國專利號 5，434，131 和 5，844，095)。圖6顯示了延遲加入硫酸葡聚糖對培養(yǎng)物中活細(xì)胞密度、總細(xì)胞密度，和生存力 的影響，在所述培養(yǎng)基中，硫酸葡聚糖在最初生長期結(jié)束時加入。從本文的實(shí)施例6中描述 的實(shí)驗得到這些結(jié)果。在最初生長期結(jié)束時加入硫酸葡聚糖的培養(yǎng)物和其中未加入硫酸葡 聚糖的培養(yǎng)物之間進(jìn)行了比較。對平均值作圖；誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖7顯示了延遲加入硫酸葡聚糖對死亡率的影響。其為存活細(xì)胞密度作為時間的 函數(shù)的對數(shù)表示。從本文實(shí)施例6中描述的實(shí)驗得到這些結(jié)果。在其中在最初生長期結(jié)束 時加入硫酸葡聚糖的培養(yǎng)物和其中未加入硫酸葡聚糖的培養(yǎng)物之間進(jìn)行了比較。對平均值 作圖；誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖8顯示了延遲加入硫酸葡聚糖對培養(yǎng)物中存活細(xì)胞密度、總細(xì)胞密度，和生存 力的影響，在所述培養(yǎng)基中，硫酸葡聚糖在最初死亡期期間加入。從本文實(shí)施例7中描述的 實(shí)驗得到這些結(jié)果。在其中在最初死亡期期間加入硫酸葡聚糖的培養(yǎng)物和其中未加入硫酸 葡聚糖的培養(yǎng)物之間進(jìn)行了比較。圖9顯示了延遲加入硫酸葡聚糖對培養(yǎng)物中存活細(xì)胞密度、總細(xì)胞密度，和生存 力的影響，在所述培養(yǎng)基中，硫酸葡聚糖在最初死亡期期間加入。從本文實(shí)施例8中描述的 實(shí)驗得到這些結(jié)果。在最初死亡期期間加入硫酸葡聚糖的培養(yǎng)物和其中未加入硫酸葡聚糖 的培養(yǎng)物之間進(jìn)行了比較。圖10顯示了培養(yǎng)物中存活細(xì)胞密度、總細(xì)胞密度，和生存力，所述培養(yǎng)基中在培 養(yǎng)的第0天加入硫酸葡聚糖。這些結(jié)果從本文實(shí)施例9中描述的實(shí)驗得到。圖11顯示了培養(yǎng)物中存活細(xì)胞密度和生存力，所述培養(yǎng)基中在最初生長期的三 個不同的時間(第三天、第四天和第五天)加入硫酸葡聚糖。這些結(jié)果從本文實(shí)施例10中
9描述的實(shí)驗得到。圖12顯示了不同溫度轉(zhuǎn)換對存活細(xì)胞密度的影響。這些結(jié)果從本文實(shí)施例11中 描述的實(shí)驗得到。在包括無溫度轉(zhuǎn)換(“無T轉(zhuǎn)換”)、一次溫度轉(zhuǎn)換(“一次T轉(zhuǎn)換”)和 兩次向下溫度轉(zhuǎn)換(“兩次T轉(zhuǎn)換”)的培養(yǎng)方法之間進(jìn)行了比較。圖13顯示了不同溫度轉(zhuǎn)換對生存力的影響。這些結(jié)果從本文實(shí)施例11中描述的 實(shí)驗得到。在包括無溫度轉(zhuǎn)換(“無T轉(zhuǎn)換”)、一次溫度轉(zhuǎn)換(“一次T轉(zhuǎn)換”)和兩次向 下溫度轉(zhuǎn)換(“兩次T轉(zhuǎn)換”)的培養(yǎng)方法之間進(jìn)行了比較。圖14顯示了不同溫度轉(zhuǎn)換對滴定度的影響。這些結(jié)果從本文實(shí)施例11中描述的 實(shí)驗得到。在包括無溫度轉(zhuǎn)換(“無T轉(zhuǎn)換”)、一次溫度轉(zhuǎn)換(“一次T轉(zhuǎn)換”)和兩次向 下溫度轉(zhuǎn)換(“兩次T轉(zhuǎn)換”)的培養(yǎng)方法之間進(jìn)行了比較。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明描述在哺乳動物或動物細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物，更 優(yōu)選糖蛋白產(chǎn)物的新方法。這些方法實(shí)現(xiàn)了增加的細(xì)胞生存力。伺龍碰細(xì)包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)了增加的細(xì)胞生存 力并且可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)中細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)物的最終滴定度或濃度增加。此外，所培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生 的糖蛋白的唾液酸含量可以為高水平，從而表明在培養(yǎng)期產(chǎn)生高質(zhì)量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。更具體地，根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)行期間兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換保持并維持培養(yǎng) 物中細(xì)胞的高細(xì)胞生存力，例如，實(shí)現(xiàn)增加的細(xì)胞生存力，并且可以在整個培養(yǎng)運(yùn)行期間提 供高數(shù)量和質(zhì)量的產(chǎn)物。而且，根據(jù)本發(fā)明，兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換可有利地允許延長培養(yǎng)的 生產(chǎn)期。在延長的生產(chǎn)期期間，細(xì)胞生存力得到保持；并且所希望的產(chǎn)物的滴定度增加了 ； 并且以唾液酸含量為特征的產(chǎn)物質(zhì)量保持在高水平。根據(jù)本發(fā)明，與不包括溫度轉(zhuǎn)換，或者僅一次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法相比，在細(xì)胞培 養(yǎng)期間，兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換，優(yōu)選向下溫度轉(zhuǎn)換可允許在培養(yǎng)期結(jié)束時細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)產(chǎn)物的高數(shù)量和質(zhì)量。作為例證，如實(shí)施例3中所示，與沒有溫度轉(zhuǎn)換或者僅一次溫度轉(zhuǎn) 換相比，不管培養(yǎng)運(yùn)行的總長度如何，證明具有兩次或三次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法導(dǎo)致蛋白 質(zhì)數(shù)量(例如，最終滴定度)增加。此外，本發(fā)明的方法尤其適于生長和保持為補(bǔ)料-分批 培養(yǎng)的細(xì)胞，如下文中進(jìn)一步描述。因為培養(yǎng)方法的兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換還保持和維持培養(yǎng)中細(xì)胞的高生存力，所以 該培養(yǎng)方法可以延長蛋白質(zhì)的生產(chǎn)期。具體地，在包含延長的生產(chǎn)期的細(xì)胞培養(yǎng)方法期間， 細(xì)胞生存力保持高水平，并且所希望的產(chǎn)物的滴定度增加了 ；并且以唾液酸含量為特征的 產(chǎn)物質(zhì)量也保持在高水平。如本發(fā)明新提供的，所述細(xì)胞培養(yǎng)方法提供的生產(chǎn)期超過通過 包括無溫度轉(zhuǎn)換，或者最多一次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的生產(chǎn)期。^M^im^mmmmmm-ti^在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)中使用定時多步溫度轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生 所希望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，尤其糖蛋白產(chǎn)物。更優(yōu)選地，培養(yǎng)中的細(xì)胞產(chǎn)生了重組產(chǎn)生的蛋白 質(zhì)、多肽或者肽產(chǎn)物。然而，在某些情況中，細(xì)胞可以積極產(chǎn)生，或者過量產(chǎn)生內(nèi)源或者天然 產(chǎn)物，所述產(chǎn)物可以在實(shí)施本發(fā)明方法后收獲或回收。如本文描述，兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換，優(yōu)選受控的向下溫度轉(zhuǎn)換(在培養(yǎng)期期間以適當(dāng)定時間隔實(shí)施)可用于本發(fā)明的方法中以 實(shí)現(xiàn)高蛋白質(zhì)產(chǎn)率以及相伴的高唾液酸含量。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法和過程(也稱作生產(chǎn)或者發(fā)酵運(yùn)行)，在培養(yǎng)運(yùn)行期 間結(jié)合兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)的細(xì)胞可以在運(yùn)行期間產(chǎn)生高數(shù)量和質(zhì)量的產(chǎn)物，所述 高數(shù)量和高質(zhì)量為例如通過運(yùn)行結(jié)束時終點(diǎn)滴定度和唾液酸含量所測量。不管培養(yǎng)運(yùn)行實(shí) 施的總運(yùn)行時間為約10-14天還是大于14天，相對于沒有溫度轉(zhuǎn)換，或者最多使用一次溫 度轉(zhuǎn)換的方法，得到了與本發(fā)明方法相關(guān)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的高數(shù)量和質(zhì)量。此外，作為培養(yǎng)過 程期間兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的結(jié)果，細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中保持一段時間，該時間段基本上 延長了標(biāo)準(zhǔn)或者最初生產(chǎn)期。標(biāo)準(zhǔn)或者最初生產(chǎn)期通常為約6到14天。在包括兩次或多 次溫度轉(zhuǎn)換的本培養(yǎng)方法的延長的生產(chǎn)期期間實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量蛋白質(zhì)的增加的產(chǎn)量，以及持 續(xù)的細(xì)胞生存力。還根據(jù)本培養(yǎng)方法，細(xì)胞可以培養(yǎng)的總運(yùn)行期大于約10天，大于約14天，大于約 21天，或者大于約28天，優(yōu)選約14到30天，或者以上。例如，在包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的 本發(fā)明的培養(yǎng)運(yùn)行中，整個培養(yǎng)的長度可以持續(xù)短至僅第二次(或最后)溫度轉(zhuǎn)換后(例 如，約14天)到長達(dá)約21到30天或以上，優(yōu)選約28天或以上。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的多次溫度轉(zhuǎn)換與延長的培 養(yǎng)期相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的新的細(xì)胞培養(yǎng)方法，第二次、第三次或多次溫度轉(zhuǎn)換與第一次溫度 轉(zhuǎn)換的聯(lián)合不僅允許細(xì)胞培養(yǎng)物在整個培養(yǎng)運(yùn)行持續(xù)時間內(nèi)產(chǎn)生高數(shù)量和質(zhì)量的產(chǎn)物，還 允許在整個運(yùn)行和/或整個延長的生產(chǎn)期直到培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束培養(yǎng)物都維持高細(xì)胞生存力。 在包括延長的生產(chǎn)期的培養(yǎng)運(yùn)行期間，蛋白質(zhì)產(chǎn)物的滴定度增加了并且如以唾液酸含量為 特征的產(chǎn)物質(zhì)量保持高水平。更具體地，在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)胞培養(yǎng)方法，其延長了培養(yǎng)細(xì)胞 的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的最初生產(chǎn)期(即包括約6-14天的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期得到延長)。通過在根據(jù)本 發(fā)明的培養(yǎng)運(yùn)行中使用兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)了約14-21天的延長生產(chǎn)期。使用培養(yǎng) 運(yùn)行中的三次(或多次)溫度轉(zhuǎn)換，將培養(yǎng)運(yùn)行進(jìn)一步延長到約第21-28天或30天，或者 更長，并且伴隨著高質(zhì)量(例如，高唾液酸含量)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的更高產(chǎn)率(例如，實(shí)施例 3)。在本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)(或發(fā)酵)方法包括兩步向下溫度轉(zhuǎn) 換，其中細(xì)胞在整個培養(yǎng)運(yùn)行期間保持在三種不同的溫度下。在該實(shí)施方案中，總細(xì)胞培養(yǎng) 期持續(xù)大于約10天，更具體地，約14到28天或更長，即，約2到3周或更長，之后得到最終 蛋白質(zhì)產(chǎn)物(并測量唾液酸含量)。例如，在這種兩步方法中，細(xì)胞在約36°C到38°C，優(yōu)選 37°C或者接近37°C的第一種溫度下保持從第0天到約第6天的最初培養(yǎng)期。之后，從約第 5天到第7天，優(yōu)選第6天到約第10天，培養(yǎng)溫度保持在約33°C到約35°C，優(yōu)選34°C，或接 近34°C的第二種溫度下。在34°C或接近34°C的細(xì)胞培養(yǎng)后，將溫度再次轉(zhuǎn)換(再次_T轉(zhuǎn) 換)到約31°C到33°C，優(yōu)選32°C或接近32°C的第三種溫度。再次T轉(zhuǎn)換發(fā)生在或約第6 天到約第14天，優(yōu)選從約第10天到約第14天，更優(yōu)選在或者約第10天，所述再次T轉(zhuǎn)換 在多種實(shí)施方案中可以在標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期期間、生長期期間，或者死亡期期間。優(yōu)選地，在第一 次和第二次溫度轉(zhuǎn)換之間有約4天增量，更優(yōu)選4天增量。細(xì)胞保持在32°C或者接近32°C 的溫度下直到總培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束，例如，長于約第10天，更特別地，到約12-18天，或者到約14-18天，或者約14-28天或30天，或者更長時間。在培養(yǎng)過程結(jié)束時，通常從例如培養(yǎng)上 清液(如果產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中)分離和/或純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物。備選地，在本發(fā)明的多次溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)方法中，可以首先基于培養(yǎng)期降低溫度。第 一次溫度轉(zhuǎn)換優(yōu)選發(fā)生在死亡期開始前。在一個實(shí)施方案中，首先降低溫度，同時細(xì)胞生長 減慢。例如，溫度從37°C，或者接近37°C轉(zhuǎn)換到34°C或者接近34°C，此時細(xì)胞不再處于它 們的指數(shù)生長期并且培養(yǎng)物處于穩(wěn)定期，例如，在或者約培養(yǎng)的第6天。此時，存活細(xì)胞濃 度已經(jīng)達(dá)到蛋白質(zhì)生產(chǎn)，優(yōu)選增強(qiáng)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的適宜的細(xì)胞密度，例如，約2-12X106個 細(xì)胞 /mL，如 2-9 X 106 個細(xì)胞 /mL，3-7 X 106 個細(xì)胞 /mL，4-5 X 106 個細(xì)胞 /mL，3-4 X 106 個 細(xì)胞 /mL，2-4 X 106 個細(xì)胞 /mL，4-6 X 106 個細(xì)胞 /mL，6-8 X 106 個細(xì)胞 /mL，8-10 X 106 個細(xì) 胞/mL，或10-12X106個細(xì)胞/mL。不希望被理論所束縛，可能細(xì)胞生長的減慢與細(xì)胞培養(yǎng) 基中的營養(yǎng)物和/或特定組分的耗竭，例如，培養(yǎng)基中氮限制相關(guān)。在另一實(shí)施方案中，第一次溫度轉(zhuǎn)換發(fā)生在生長期期間，例如，當(dāng)存活細(xì)胞濃度為 約2-12 X 106個細(xì)胞/mL，如2-9 X 106個細(xì)胞/mL，3-7 X 106個細(xì)胞/mL，4-5 X 106個細(xì)胞/ mL, 3-4 X106 個細(xì)胞 /mL，2-4 X 106 個細(xì)胞 /mL，4-6 X 106 個細(xì)胞 /mL，6-8 X 106 個細(xì)胞 /mL， 8-10 X 106 個細(xì)胞 /mL，或 10-12 X 106 個細(xì)胞 /mL 時。在包括兩步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)方法的另一特定實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)14天運(yùn)行期，其 中從第0到第6天培養(yǎng)溫度保持在或者接近37°C。從約第6天到約第10天，培養(yǎng)溫度保 持在或者接近34°C ；從約第10天到約第14天，培養(yǎng)溫度保持在或者接近32°C。作為另一 實(shí)施方案，細(xì)胞培養(yǎng)約21天時期，其中從第0到約第6天培養(yǎng)溫度保持在或者接近37°C ； 從約第6天到約第10天，培養(yǎng)溫度保持在或者接近34°C ；從約第10天到約第21天，培養(yǎng) 溫度保持在或者接近32°C。作為再一個實(shí)施方案，細(xì)胞培養(yǎng)約28天時期，其中從第0到約 第6天培養(yǎng)溫度保持在或者接近37°C ；從約第6天到約第10天，培養(yǎng)溫度保持在或者接近 34°C ；從約第10天到約第28天，培養(yǎng)溫度保持在或者接近32°C。本發(fā)明還包括實(shí)施方案，其中細(xì)胞培養(yǎng)方法包括三次或多次溫度轉(zhuǎn)換。在包括三 步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)方法的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞最初在約36°C到38°C，優(yōu)選在或約37°C的第 一種溫度下培養(yǎng)約6天；之后，轉(zhuǎn)換培養(yǎng)溫度并在約33°C到35°C，優(yōu)選在或接近34°C下保 持給定時限；之后發(fā)生第二次轉(zhuǎn)換到約31°C到33°C，優(yōu)選在或接近32°C的溫度。在或接近 32°C的培養(yǎng)期之后，第三次溫度轉(zhuǎn)換到約29°C到31°C，優(yōu)選在或接近30°C的溫度；然后溫 度保持在或接近30°C直到運(yùn)行結(jié)束。在其他實(shí)施方案中，在所述培養(yǎng)方法的第三次溫度轉(zhuǎn)換后可以進(jìn)行進(jìn)一步溫度轉(zhuǎn) 換，優(yōu)選向下溫度轉(zhuǎn)換。例如，可以在第三次轉(zhuǎn)換后在或者接近培養(yǎng)開始后的第15-20天， 優(yōu)選約第18天進(jìn)行第四次溫度轉(zhuǎn)換。第四次向下轉(zhuǎn)換保持培養(yǎng)溫度在或者接近28°C到 29°C，優(yōu)選約29°C，并增加培養(yǎng)運(yùn)行到大于約28天，例如，到約28-32天或者更長，此時得到產(chǎn)物。如在根據(jù)本發(fā)明的兩步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)運(yùn)行方法中，當(dāng)細(xì)胞基本上停止生長并且變 得穩(wěn)定或者大約穩(wěn)定時，可發(fā)生本發(fā)明的多次溫度轉(zhuǎn)換中的第一次溫度轉(zhuǎn)換。作為例證， 當(dāng)存活細(xì)胞濃度為約2-12X 106個細(xì)胞/mL，如2-9X 106個細(xì)胞/mL，3-7X106個細(xì)胞/ mL, 4-5 X 106 個細(xì)胞 /mL, 3-4 X 106 個細(xì)胞 /mL, 2-4 X 106 個細(xì)胞 /mL, 4-6 X 106 個細(xì)胞 /mL, 6-8 X 106個細(xì)胞/mL，8-10 X 106個細(xì)胞/mL，或10-12 X 106個細(xì)胞/mL時進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換。備選地，在生長期期間，例如，當(dāng)存活細(xì)胞濃度為約2-12 X 106個細(xì)胞/mL，如2-9 X 106個細(xì)胞 /mL, 3-7 X 106 個細(xì)胞 /mL，4-5 X 106 個細(xì)胞 /mL，3-4 X 106 個細(xì)胞 /mL，2-4 X 106 個細(xì)胞 /mL， 4-6 X 106 個細(xì)胞 /mL, 6-8 X 106 個細(xì)胞 /mL, 8-10 X 106 個細(xì)胞 /mL,或 10-12 X 106 個細(xì)胞 / mL時發(fā)生第一次溫度轉(zhuǎn)換。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多步細(xì)胞培養(yǎng)方法包括在約3到4周，例 如，21-30天或以上，優(yōu)選28天或以上的培養(yǎng)期期間的三次定時和受控的溫度轉(zhuǎn)換，從而提 供培養(yǎng)物中細(xì)胞更長時間地生產(chǎn)產(chǎn)物。為了闡明，三步溫度轉(zhuǎn)換方法包括從0到約第6天， 優(yōu)選第6天的最初培養(yǎng)期，在該期間細(xì)胞在37°C，或者接近37°C培養(yǎng)。從約第6天到約第 10天，細(xì)胞在34°C，或者接近34°C培養(yǎng)。從約第10天到約第14天，細(xì)胞在32°C，或者接近 32°C培養(yǎng)；從約第14天往后，即，到約第21天到第30天或以上，或者到運(yùn)行結(jié)束時，培養(yǎng)溫 度保持在30°C，或者接近30°C。因此，在本發(fā)明的三步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)方法中，也可以延長生 產(chǎn)期以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的更高終點(diǎn)滴定度和保持更高細(xì)胞生存力長于約14天的時限，相比具 有僅一次或者沒有溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)方法的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期為約6到約14天。有利地，通過所述 三步T轉(zhuǎn)換方法可以將生產(chǎn)期和細(xì)胞生存力進(jìn)一步延長，即延長到三周或者更長時間，伴 隨著如通過唾液酸含量所測量的產(chǎn)物的高質(zhì)量。在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，第二次溫度轉(zhuǎn)換到32°C，或者接近32°C允許培養(yǎng)運(yùn) 行結(jié)束時蛋白質(zhì)的更高的數(shù)量和質(zhì)量，并且還與運(yùn)行期間更長的蛋白質(zhì)生產(chǎn)有關(guān)，該運(yùn)行 可以持續(xù)約2周以上。溫度中兩次或多次轉(zhuǎn)換允許培養(yǎng)物的細(xì)胞生存力的緩慢下降穩(wěn)定下 來，所述細(xì)胞生存力的緩慢下降可以在培養(yǎng)的前兩周發(fā)生。在約兩周或兩周附近定時的從 32°C或接近32°C到30°C，或者接近30°C的另一次溫度轉(zhuǎn)換提供了生產(chǎn)期的進(jìn)一步延長，從 而將細(xì)胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)期延長到培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束，例如，到約第21天到第30天或者以上，而 保持細(xì)胞生存力并且不犧牲所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量(如通過唾液酸化測量)。(見實(shí)施例5， 表2和3)。額外的溫度轉(zhuǎn)換可以將細(xì)胞生產(chǎn)延長到超過兩次和三次溫度轉(zhuǎn)換運(yùn)行的細(xì)胞生 產(chǎn)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(i)細(xì)胞培養(yǎng)方法，(ii)增加蛋白質(zhì)生產(chǎn)，優(yōu)選聯(lián) 合增加的細(xì)胞生存力的方法，(iii)增強(qiáng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的唾液酸化的方法，(iv)增強(qiáng)細(xì)胞生 存力的方法，或(v)延長細(xì)胞生產(chǎn)，包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的方法，該方法包括在允許 細(xì)胞生長的條件下在37°C或者接近37°C的溫度下培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞允許該 細(xì)胞生長的時間；當(dāng)培養(yǎng)物處于穩(wěn)定期時，降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度并在34°C或者接近34°C的 第二種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞；再次降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度并在約第6天到第14天的標(biāo)準(zhǔn)生長期期 間的某一時間，例如，在或者約從培養(yǎng)開始第10天，在32°C或者約32°C的第三種溫度下培 養(yǎng)細(xì)胞直到培養(yǎng)期結(jié)束。如本文中已經(jīng)提到的，培養(yǎng)期可以包括大于10天、大于14天、大 于21天，或者大于28-30天的總運(yùn)行時間。細(xì)胞在32°C培養(yǎng)后，即在培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束后，得到 所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，優(yōu)選糖蛋白。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(i)細(xì)胞培養(yǎng)方法，(ii)增加蛋白質(zhì)生產(chǎn)，優(yōu)選聯(lián) 合增加的細(xì)胞生存力的方法，(iii)增強(qiáng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的唾液酸化的方法，(iv)增強(qiáng)細(xì)胞生 存力的方法，或(v)延長細(xì)胞生產(chǎn)，包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的方法，該方法包括在允許 細(xì)胞生長的條件下在37°C或者接近37°C的溫度下培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞允許該 細(xì)胞生長的時間；從第5天到第7天開始降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度并在34°C或者接近34°C的第 二種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞；再次降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度并在約第6天到第14天開始，例如，在或者約從培養(yǎng)開始第10天，在32°C或者約32°C的第三種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞直到培養(yǎng)期結(jié)束。如 本文中已經(jīng)提到的，培養(yǎng)期可以包括大于10天、大于14天、大于21天，或者大于28-30天 的總運(yùn)行時間。細(xì)胞在32°C培養(yǎng)后，即在培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束后，得到所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，優(yōu)選 糖蛋白。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了培養(yǎng)方法，其還包括從培養(yǎng)開始的14天或約14 天將在或者接近32°C的溫度向下轉(zhuǎn)換到在或者接近30°C直到培養(yǎng)過程結(jié)束，從而將培養(yǎng) 期延長到適當(dāng)?shù)爻^標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期。為了進(jìn)一步延長培養(yǎng)過程期間的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，以及細(xì)胞 生存力，該方法可以包括從培養(yǎng)開始的15天或約15天到19天，優(yōu)選18天，將在或者接近 30 °C的溫度向下轉(zhuǎn)換到在或者接近29 °C直到培養(yǎng)過程結(jié)束。本發(fā)明的溫度轉(zhuǎn)換通常在或者約培養(yǎng)期的第6天，其可以在培養(yǎng)物的生長期期間 或者之后，并且之后以約4天增量，優(yōu)選4天增量。在某些實(shí)施方案中，溫度轉(zhuǎn)換的定時可以 接近標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期的開始(例如，在或者約第6天)，中間(例如，在或者約第10天)和末尾 (例如，在或者約第14天)。在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)過程或者方法中，通過使用多步(例如， 兩步、三步或更多步)溫度轉(zhuǎn)換，所產(chǎn)生的糖蛋白的最終滴定度和唾液酸含量得到增強(qiáng)，至 少兩種定時溫度轉(zhuǎn)換的組合允許總培養(yǎng)運(yùn)行實(shí)施10天以上、14天以上、21天以上，或者28 天以上或更多天，而不犧牲產(chǎn)物的最終滴定度和唾液酸化。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，與進(jìn)行 相同時限但是不包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的運(yùn)行相比，兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換維持培養(yǎng)物的 高細(xì)胞生存力并且可以允許在培養(yǎng)運(yùn)行中產(chǎn)生更高滴定度和高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。而且，兩次 或多次溫度轉(zhuǎn)換可以允許培養(yǎng)的生產(chǎn)期延伸超過標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期和/或超過沒有溫度轉(zhuǎn)換，或 者最多一次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)的生產(chǎn)期。這種多步溫度轉(zhuǎn)換，如兩步或多步溫度轉(zhuǎn)換，可以最 小化細(xì)胞培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生產(chǎn)中滴定度(“終滴定度”)和唾液酸含量之間的優(yōu)勢 折衷。從而，溫度轉(zhuǎn)換為增強(qiáng)“終滴定度” X “終唾液酸”的算術(shù)乘積提供了正效應(yīng)，其改進(jìn) 了蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法。包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的細(xì)胞培養(yǎng)方法的根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括在允許細(xì)胞生長的條 件下37°C或接近37°C的第一種溫度下培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞允許該細(xì)胞生長的 時間。細(xì)胞生長期后，當(dāng)細(xì)胞生長減慢并且接近穩(wěn)定時，在34°C或者接近34°C的第二種溫 度下培養(yǎng)細(xì)胞。之后，在培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)期期間，即在或者約第6天到在或者約第14天在 32或者接近32°C的第三種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞。在培養(yǎng)過程結(jié)束時，可以得到所產(chǎn)生的蛋白質(zhì) 產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，細(xì)胞以分批補(bǔ)料方法培養(yǎng)，該分批補(bǔ)料方法包括幾 個時期，即生長期，在該期間細(xì)胞培養(yǎng)在37°C或者接近37°C的第一種溫度下；最初或者標(biāo) 準(zhǔn)生產(chǎn)期，在該期間細(xì)胞在34°C或者接近34°C的第二種溫度下和在32°C或者接近32°C的 第三溫度下培養(yǎng)，以便提供延長的蛋白質(zhì)生產(chǎn)期，其可以包括30°C或者接近30°C的第四種 溫度，并且任選之后，還包括額外的降低溫度，如29 °C或者接近29 °C。對于本發(fā)明的兩步或 多步溫度轉(zhuǎn)換運(yùn)行，蛋白質(zhì)生產(chǎn)的延長與溫度的兩次或多次向下轉(zhuǎn)換有關(guān)。如本文中描述， 延長的生產(chǎn)期包括從37°C或接近37°C到34°C或接近34°C的第一次溫度轉(zhuǎn)換后將培養(yǎng)溫度 以不同的間隔連續(xù)降低兩次或多次。相對于沒有溫度轉(zhuǎn)換，或者僅一次溫度轉(zhuǎn)換，通過實(shí)施 包括培養(yǎng)運(yùn)行期間兩次或多次向下溫度轉(zhuǎn)換的這些方法，蛋白質(zhì)生產(chǎn)增加了并且得到高產(chǎn)物質(zhì)量(如通過終產(chǎn)物的唾液酸含量測量)。在細(xì)胞培養(yǎng)的生長期，例如，從第0天到約第6天，由于在該指數(shù)細(xì)胞生長期或者 對數(shù)期細(xì)胞通常快速分裂，培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度增加。在本發(fā)明的某些方法中存在的非生 長相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法中，在生長期期間沒有產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在所述 生長期中細(xì)胞生長在適宜的生長條件下基本上最大化。從而，由于培養(yǎng)中營養(yǎng)限制的原因， 細(xì)胞通常在約第4到6天進(jìn)入穩(wěn)定期，其中快速生長達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)和/或下降。在這些培 養(yǎng)方法中，當(dāng)細(xì)胞生長基本上結(jié)束(例如，在約第6天到約第10天)時，開始蛋白質(zhì)生產(chǎn)期 (實(shí)施例3)。根據(jù)一個實(shí)施方案的培養(yǎng)方法，當(dāng)在約第6天細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期時，溫度從37°C或 者接近37°C向下轉(zhuǎn)換到34°C或者接近34°C。之后，在接近第一次溫度轉(zhuǎn)換(約第6天)和 延長的生產(chǎn)期開始(約第14天)之間中點(diǎn)某一時間，再次將培養(yǎng)溫度從34°C或者接近34°C 降低到32°C或者接近32°C。第二次溫度轉(zhuǎn)換允許培養(yǎng)穩(wěn)定細(xì)胞生存力，細(xì)胞生存力通常從 約第14天緩慢下降；之后，開始生產(chǎn)期的延長(在約第14天到約第21到30天或更長，優(yōu) 選到約21天到約28天或更長)。如上面描述的，在培養(yǎng)運(yùn)行的延長的生產(chǎn)期期間可以使用 其他溫度轉(zhuǎn)換，例如，第三次、第四次或更多次溫度轉(zhuǎn)換。伺艦識.力口入聚_軒仆剎勿白誠根據(jù)本發(fā)明，提供了包括延遲加入聚陰離子化合物的細(xì)胞培養(yǎng)方法。該方法包括 接種后某一時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物。與不加入聚陰離子化合物時所觀察到 的相比，或者與接種時加入聚陰離子化合物所觀察到的相比，聚陰離子化合物的延遲加入 實(shí)現(xiàn)了更大的細(xì)胞生存力。從而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白 質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在接種后某一時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(實(shí)施例6)當(dāng)實(shí)施本發(fā)明時，細(xì)胞培養(yǎng)物的百分?jǐn)?shù)細(xì)胞生存力增加了。 百分?jǐn)?shù)細(xì)胞生存力，也稱作細(xì)胞生存力，是細(xì)胞總數(shù)中活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。如果存在某一條件 時培養(yǎng)物中細(xì)胞生存力比不存在該條件時長一段時間，那么該條件(如延遲加入聚陰離子 化合物)導(dǎo)致增加的細(xì)胞生存力。從而，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)增加培養(yǎng)物中細(xì) 胞生存力的方法，該方法包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在接種后某一時間向 細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞生存力增加了。聚陰離子化合物包括，但不限于，硫酸葡聚糖(可從Sigma-Aldrich，St. Louis,M0 得到)、肝素(可從Sigma-Aldrich得到)、硫酸乙酰肝素(可從Sigma-Aldrich得到)、硫酸 甘露聚糖、硫酸軟骨素(可從Sigma-Aldrich得到)、硫酸皮膚素(可從Sigma-Aldrich得 到)、硫酸角質(zhì)素(可從Sigma-Aldrich得到)、透明質(zhì)酸鹽(可從Sigma-Aldrich得到)、 聚(乙烯基硫酸鹽)(可從Sigma-Aldrich得到)、k -角叉菜膠(可從Sigma-Aldrich得 到)、和蘇拉明(可從Sigma-Aldrich得到)。所述化合物可以容易地從所列來源得到，或 者通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的方法容易地得到。這些化合物通常以鹽的形式(包括但不 限于鈉鹽)得到，但是也可以以非鹽形式使用。聚陰離子化合物包括其所有形式，包括但不 限于鹽形式，如鈉鹽。優(yōu)選的聚陰離子化合物為多硫酸化化合物，包括但不限于硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸戊聚糖、硫酸甘露聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、聚(乙烯 基硫酸鹽)、k-角叉菜膠、和蘇拉明。最優(yōu)選為硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖可以具有5，000 到500，OOODa的平均分子量。優(yōu)選具有5，OOODa分子量的硫酸葡聚糖。根據(jù)本發(fā)明，接種后某一時間加入聚陰離子化合物，即聚陰離子化合物不存在于 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并且接種時不存在。優(yōu)選地，在培養(yǎng)的第1天或者更晚加入聚陰離子化合物。 接種在第0天進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，在特定時限(例如，孵育后某時)期間可以向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離 子化合物一次、兩次、三次、或任何次數(shù)?？梢月?lián)合使用一種或多種聚陰離子化合物。即，聚 陰離子化合物的任何給定的單次加入可以包括加入一種或多種聚陰離子化合物。類似地， 如果存在一次以上的聚陰離子化合物加入，可以在不同的加入時加入不同聚陰離子化合 物。額外的化合物和物質(zhì)，包括聚陰離子化合物，可以在加入聚陰離子化合物之前、之時或 者之后加入(在或者不在所述特定時限期間)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，存在單次，即一次聚陰 離子化合物加入。在優(yōu)選實(shí)施方案中，加入一種聚陰離子化合物。根據(jù)本發(fā)明，可通過任何方法向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物。加入聚陰離子 化合物的方法包括，但不限于，溶于水中、溶于培養(yǎng)基中，溶于送料培養(yǎng)基中、溶于適宜的培 養(yǎng)基中，和以其所得的形式。優(yōu)選地，所加入的聚陰離子化合物溶于水中。根據(jù)本發(fā)明，加入聚陰離子化合物使培養(yǎng)物中濃度達(dá)到適宜的水平。作為非限制 性實(shí)例，加入聚陰離子化合物到濃度為l-1000mg/L、l-200mg/L、l-100mg/L、或25-75mg/L。 優(yōu)選地，加入聚陰離子化合物到濃度25-200mg/L或25_100mg/L，更優(yōu)選地約50_100mg/L或 50-100mg/L，更優(yōu)選地約 50mg/L 或約 100mg/L，最優(yōu)選地 50mg/L 或 100mg/L。根據(jù)本發(fā)明，加入聚陰離子化合物后培養(yǎng)物可以運(yùn)行任何時間長度。本領(lǐng)域中技 術(shù)人員基于相關(guān)因素，如可回收蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，和細(xì)胞裂解導(dǎo)致的上清液中污染性 細(xì)胞種類(例如，蛋白質(zhì)和DNA)的水平(其將目標(biāo)蛋白質(zhì)的回收復(fù)雜化)確定培養(yǎng)運(yùn)行時 間。在本發(fā)明的增加細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)過程和方法的具體實(shí)施方案中，在接種后 某一時間加入聚陰離子化合物，該時間在最初死亡期開始之前。優(yōu)選地，在接種后最初生長 期期間的某一時間加入聚陰離子化合物。更優(yōu)選地，在最初生長期的后半期期間加入聚陰 離子化合物。更優(yōu)選地，在最初生長期結(jié)束時或者約結(jié)束時加入聚陰離子化合物。最初生長期指不存在聚陰離子化合物的特定加入時觀察到的生長期。最初死亡期 指不存在聚陰離子化合物的特定加入時觀察到的死亡期。當(dāng)最初死亡期開始時最初生長期結(jié)束，或者在最初生長期和最初死亡期之間存在 任何長度的穩(wěn)定期。在特定實(shí)施方案中，在其中最初生長期為從第0天到第6天并且最初死亡期在第 7天開始的細(xì)胞培養(yǎng)中，在特定實(shí)施方案中，在接種后并且第7天前加入聚陰離子化合物。 在特定實(shí)施方案中，在接種后并且到第6天時加入聚陰離子化合物。在特定實(shí)施方案中，在 第1天和第6天之間加入聚陰離子化合物。在一特定實(shí)施方案中，在第4、5或6天加入聚 陰離子化合物。在其他特定實(shí)施方案中，在約第6天，或者在第6天加入聚陰離子化合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見實(shí)施例6和10)，當(dāng)接種后并且在最初的死亡期開始之前的某一時間 加入聚陰離子化合物時，生長期可以超過最初生長期。超過最初生長期的生長期具有比最初生長期更長的持續(xù)時間，即比不加入聚陰離子化合物時觀察到的生長期更長。優(yōu)選地，在 延長的生長期期間，實(shí)現(xiàn)了比最初生長期期間實(shí)現(xiàn)的峰值活細(xì)胞密度更高的峰值活細(xì)胞密度。從而，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)延長細(xì)胞培養(yǎng)物 的生長期的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；在接種后最初死亡期開始前 的某一時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中生長期得到延長。在更具體的實(shí)施方 案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)延長細(xì)胞培養(yǎng)物的生長期的方法，其包括培養(yǎng) 表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在接種后最初生長期期間的某一時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚 陰離子化合物；其中生長期得到延長。在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方 法，和(2)延長細(xì)胞培養(yǎng)物的生長期的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和 在最初生長期的后半期期間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中生長期得到延長。在 其他具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)延長細(xì)胞培養(yǎng)物的生長期的方 法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在最初生長期結(jié)束或者約結(jié)束時向細(xì)胞 培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中生長期得到延長。生長期可以比最初生長期的持續(xù)時間延長任何時限。僅作為實(shí)例，生長期可以延 長1-10天、2-9天、3-8天、或者約5天。優(yōu)選地，生長期延長1天或多天，更優(yōu)選2天或多 天，更優(yōu)選3天或多天，最優(yōu)選4天或多天。例如，在實(shí)施例6中，生長期延長到第11天，其 中最初生長期為直到第6天。從而，在實(shí)施例6中，生長期已經(jīng)比最初生長期的持續(xù)時間延 長5天。所延長的生長期可以接著是死亡期或者穩(wěn)定期。同樣，最初生長期可以接著死亡 期或者穩(wěn)定期。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見實(shí)施例6和10)，當(dāng)接種后并且在最初的死亡期開始之前的某一時間 加入聚陰離子化合物時，死亡期的出現(xiàn)可以比最初的死亡期延遲，即，比不加入聚陰離子化 合物時觀察到的死亡期的出現(xiàn)延遲。出現(xiàn)受到延遲的死亡期在比最初死亡期更晚的時間開 始。從而，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)延遲細(xì)胞培養(yǎng)物 的死亡期的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在接種后最初死亡期開始 前的某一時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中死亡期的出現(xiàn)得到延遲。在更具體 的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)延遲細(xì)胞培養(yǎng)物的死亡期的方法，其 包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在接種后最初生長期期間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚 陰離子化合物；其中最初死亡期的出現(xiàn)得到延遲。在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1) 細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)延遲細(xì)胞培養(yǎng)物的死亡期的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿 主細(xì)胞；和在接種后最初生長期的后半期期間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中最 初死亡期的出現(xiàn)得到延遲。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及延遲細(xì)胞培養(yǎng)物的死亡期的方 法，該方法包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在最初生長期結(jié)束或者約結(jié)束時向 細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中死亡期的出現(xiàn)得到延遲。死亡期的出現(xiàn)可以延遲任何時限。僅作為實(shí)例，死亡期的出現(xiàn)可以延遲1-10天、 2-9天、3-8天、或者約5天。優(yōu)選地，死亡期的出現(xiàn)延遲1天或多天，更優(yōu)選2天或多天，更 優(yōu)選3天或多天，最優(yōu)選4天或多天。在增加上面本發(fā)明的細(xì)胞生存力的細(xì)胞培養(yǎng)過程和 方法的另一個具體實(shí)施方案中，在接種后最初死亡期期間加入聚陰離子化合物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見實(shí)施例7和8)，當(dāng)在最初死亡期期間加入聚陰離子化合物時，死亡期 可以受到遏制。遏制死亡期指不加入聚陰離子化合物時觀察到的活細(xì)胞密度下降停止一段 時間。該遏制可以發(fā)生在聚陰離子化合物加入即刻后，或者可以在更晚的時間發(fā)生。當(dāng)死 亡期受到遏制時，接下來可以是生長期或者穩(wěn)定期。當(dāng)然，最后培養(yǎng)物將再次進(jìn)入死亡期。從而，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(1)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)遏制細(xì)胞培養(yǎng)物 的死亡期的方法，其包括培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和在最初死亡期期間的某時 刻向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物；其中死亡期受到遏制。死亡期可以受到任何時限的遏制，之后再次進(jìn)入死亡期。僅作為實(shí)例，死亡期可以 受到抑制1-20天，例如2-18天，5-15天，或者8-13天。優(yōu)選地，死亡期受到1天或多天的 抑制，更優(yōu)選地，受到2天或多天的抑制，更優(yōu)選地，受到3天或多天的抑制，最優(yōu)選地，受到 4天或多天的抑制。不一定暗含死亡抑制的連續(xù)性，即，在兩段恒定或者增加的活細(xì)胞密度 之間可以存在活細(xì)胞密度圖中“局部”減少。細(xì)胞培養(yǎng)方法，尤其非連續(xù)方法的運(yùn)行時間通常受到剩余的活細(xì)胞密度的限制， 剩余活細(xì)胞密度在死亡期期間減小。更長的運(yùn)行時間可以允許實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)物滴定度。因 此希望延遲死亡期，包括盡可能地延長生長期，或者遏制死亡期。產(chǎn)物質(zhì)量的考慮也提供了 延遲或者遏制死亡期的動機(jī)，因為細(xì)胞死亡可以向培養(yǎng)物上清液釋放唾液酸酶，其可以減 少所表達(dá)的蛋白質(zhì)的唾液酸含量。蛋白質(zhì)純化考慮提供了延遲或者遏制死亡期的另一動 機(jī)。細(xì)胞碎片的存在和培養(yǎng)物中死亡細(xì)胞的含量可以不利地影響分離和/或純化培養(yǎng)運(yùn)行 結(jié)束時蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力。在特定實(shí)施方案中，本文中描述的包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的細(xì)胞培養(yǎng)方法的任 一種與本文中描述的包括延遲加入聚陰離子化合物的細(xì)胞培養(yǎng)方法的任一種一起用于細(xì) 胞培養(yǎng)中。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及(i)細(xì)胞培養(yǎng)方法，和(2)增加細(xì)胞生存力的方 法，其包括a)在允許細(xì)胞生長的條件下在37°C或者接近37°C培養(yǎng)產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主 細(xì)胞允許細(xì)胞生長的時間；b)降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度并從約第5天到第7天開始在34°C或者 接近34°C的另一溫度下培養(yǎng)細(xì)胞；(c)再次降低細(xì)胞培養(yǎng)的溫度并從約第6天到第14天開 始在32°C或者接近32°C的第三種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞；和(d)在接種后的某一時間向細(xì)胞培養(yǎng) 物加入聚陰離子化合物。涉及糖蛋白純化和分析的技術(shù)和方法在本發(fā)明包括的培養(yǎng)方法(兩種細(xì)胞培養(yǎng)方法都包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換并且 所述細(xì)胞培養(yǎng)方法包括延遲加入聚陰離子化合物)中，通常在總細(xì)胞培養(yǎng)期結(jié)束時使用本 領(lǐng)域中公知的和實(shí)踐的分離和純化方法收集、回收、分離、和/或純化，或者基本上純化(如 希望)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，從培養(yǎng)基或者上清液分離培養(yǎng)細(xì)胞分泌的糖蛋白；然 而，使用本領(lǐng)域中公知和實(shí)踐的如下文進(jìn)一步描述的方法也可以從宿主細(xì)胞，例如，細(xì)胞裂 解物回收蛋白質(zhì)。含有通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的糖蛋白的復(fù)雜碳水化合物可以常規(guī)地分析，如果希 望，通過碳水化合物分析的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行分析。例如，本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，如凝集素印跡 揭示末端甘露糖或者其他糖，如半乳糖的比例。通過使用無水胼或者酶促方法從蛋白質(zhì)釋 放糖并通過離子交換層析、大小排阻層析，或者本領(lǐng)域中熟知的其他方法分級分離寡糖可 以證實(shí)單_、二 _、三_、或四_觸角寡糖以唾液酸結(jié)束。
在神經(jīng)氨酸酶處理以除去唾液酸之前和之后，還可以測量糖蛋白的pi。神經(jīng)氨酸 酶處理后pl的增加表明該糖蛋白上存在唾液酸。碳水化合物結(jié)構(gòu)通常在所表達(dá)的蛋白質(zhì) 上作為N-連接或者0-連接的碳水化合物發(fā)生。N-連接和0-連接的碳水化合物主要在它 們的核心結(jié)構(gòu)中不同。N-連接的糖基化指糖部分通過GlcNAc附著肽鏈中的天冬酰胺殘基。 N-連接的糖都含有共同的Manl-6(Manl-3)Man3 1_4G1cNAc3 l_4GlcNAc 3 -R核心結(jié)構(gòu)，其 中該核心結(jié)構(gòu)中的R代表天冬酰胺殘基。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的肽序列將含有天冬酰胺-X-絲 氨酸、天冬酰胺-X-蘇氨酸、和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X為除了脯氨酸之外的任何氨 基酸。相比，0-連接的糖的特征是共同的核心結(jié)構(gòu)，其為附著到蘇氨酸或絲氨酸的羥基 的GalNAc。N-連接的和0-連接的糖中，最重要的是復(fù)雜N-和0-連接的糖。這些復(fù)雜糖 含有數(shù)個觸角結(jié)構(gòu)。單_、二 _、三_、和四-外部結(jié)構(gòu)對于加入末端唾液酸是重要的。這些 外部鏈結(jié)構(gòu)為包括所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物的糖的特定糖和連接提供了額外的位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中任何公知的技術(shù)分析所得糖。一些方法在本領(lǐng)域中公知用于分 析糖基化并且可用于本發(fā)明背景中。這些方法提供了關(guān)于連接所產(chǎn)生的肽的寡糖的身份和 組成的信息?？捎糜诒景l(fā)明的糖分析方法包括，但不限于凝集素層析；HPAEC-PAD，其使用 高PH陰離子交換層析基于電荷分離寡糖；NMR ；質(zhì)譜；HPLC ；GPC ；單糖組成分析；和順序酶 促消化。此外，釋放寡糖的方法是本領(lǐng)域中公知并且實(shí)踐的。這些方法包括1)酶促方法， 其通常使用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)半乳糖苷酶進(jìn)行；2) 消去法，使用苛刻堿性環(huán)境以 釋放主要0-連接的結(jié)構(gòu)；和3)化學(xué)方法，使用無水胼釋放N-和0-連接的寡糖。使用下 面的步驟進(jìn)行分析1.針對去離子水透析樣品以除去所有緩沖鹽，然后凍干。2.用無水胼 釋放完整寡糖鏈。3.用無水含甲醇鹽酸處理完整寡糖鏈以釋放作為0-甲基衍生物的單獨(dú) 的單糖。4.任何伯氨基團(tuán)的N-乙?；?。5.衍生化以產(chǎn)生per-0-三甲基甲硅烷基甲基糖 苷。6.通過在CP-SIL8柱上毛細(xì)管氣相液相層析(GLC)分離這些衍生物。7.通過GLC和 質(zhì)譜的存留時間與公知的標(biāo)準(zhǔn)相比鑒定各種糖苷衍生物。8.通過FID使用內(nèi)標(biāo)(13-0-甲 基-D-葡萄糖)定量各種衍生物。通過高效陰離子交換層析聯(lián)合脈沖電流檢測(HPAE-PADCarbohydrate System ； Dionex Corp.)可以確定中性和氨基糖。例如，通過在20% (v/v)三氟乙酸中100°C水解6 小時釋放糖。然后通過凍干或者使用Speed-Vac (Savant Instruments)干燥水解產(chǎn)物。將殘 漁溶于三水合乙酸鈉溶液中并在HPLC-AS6柱(如Anumula等人，1991，Anal.Biochem.， 195 269-280描述)上分析。備選地，可以實(shí)施免疫印跡碳水化合物分析。在該方法中，使用商業(yè)化聚糖檢 測系統(tǒng)(Boehringer)檢測蛋白質(zhì)結(jié)合的糖，所述系統(tǒng)是基于Haselbeck等人(1993， Glycoconjugate J.，7:63)描述的氧化免疫印跡方法。按照生產(chǎn)商推薦的染色方案，只是 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯膜而不是硝酸纖維素膜，并且封閉緩沖液含有10mM Tris緩 沖液(pH 7.4)中的5%牛血清白蛋白，該緩沖液含有0.9%氯化鈉。用連接堿性磷酸酶綴 合物(Boehringer)的抗地高辛抗體實(shí)施檢測，該抗體以1 1000在Tris緩沖鹽溶液中稀 釋，使用磷酸酶底物溶于lOOmMTris緩沖液(pH 9. 5)的0. 03% (w/v)氯化4-氮藍(lán)四唑和 0. 03 % (w/v) 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸，該緩沖液含有l(wèi)OOmM氯化鈉和50mM氯化鎂。通常在約10到15分鐘內(nèi)顯現(xiàn)含有糖的蛋白質(zhì)帶。通過肽-N-糖苷酶F消化也可以分析結(jié)合蛋白質(zhì)的糖。根據(jù)該方法，將殘基懸 浮在含有0. 18% SDS，18mM 3 -巰基乙醇，90mM磷酸鹽，3. 6mM EDTA的14 y L緩沖液(pH 8.6)中并在100°C加熱3分鐘。冷卻到室溫后，將樣品分成兩個相等部分。一份不進(jìn)一步 處理，其作為對照。另一份調(diào)節(jié)到約NP-40去污劑，然后加入0. 2單位肽-N-糖苷酶 F (Boehringer)。兩份樣品都在37°C保溫2小時，然后通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。此外，通過常規(guī)方法評估糖蛋白產(chǎn)物的唾液酸含量。例如，通過直接比色方 法(Yao等人，1989，Anal. Biochem. , 179 :332_335)，優(yōu)選使用一式三份樣品分別測定 唾液酸。另一種唾液酸測定方法包括使用硫代巴比妥酸，如Warren等人，1959，J.Biol Chem.，234 1971-1975所描述。再一種方法包括高效層析，如H. K. Ogawa等人，1993， J. Chromatography, 612 145-149 描述。作為例證，對于糖蛋白回收、分離和/或純化，離心細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物以除 去顆粒細(xì)胞和細(xì)胞碎片。通過適宜的純化技術(shù)從污染性可溶蛋白和多肽分離或純化所希望 的多肽產(chǎn)物。下面的方法提供了代表性但是非限制性蛋白質(zhì)純化方法在免疫親和或者離 子交換柱上分離或者分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC ；在樹脂，如硅膠，或者陽離子交換樹 脂，例如，DEAE上層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；凝膠過濾，使用例如，Sephadex G-75，S印harose ；蛋白質(zhì)As印harose層析以除去免疫球蛋白污染物；等等。其他添加劑， 如蛋白酶抑制劑(例如，PMSF或者蛋白酶K)可用于抑制純化期間蛋白質(zhì)水解性降解。技 術(shù)人員將理解給定目標(biāo)多肽的純化方法可能需要修改以容許細(xì)胞培養(yǎng)中重組表達(dá)的多肽 中的變化。尤其優(yōu)選可以選擇糖并且富集唾液酸的那些純化方法，例如，離子交換軟凝膠層 析，或者使用陽離子_或者陰離子_交換樹脂的HPLC，其中收集更酸性的級分。細(xì)胞、蛋白質(zhì)和細(xì)胞培養(yǎng)物在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)過程或方法(包括兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的細(xì)胞培養(yǎng)方法以 及包括延遲加入聚陰離子化合物的細(xì)胞培養(yǎng)方法)中，如本領(lǐng)域中公知的，細(xì)胞可以保持 在多種細(xì)胞培養(yǎng)基中，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。例如，這些方法可以用于將大體積細(xì)胞保持在細(xì)胞 培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基可以補(bǔ)加營養(yǎng)物等等。通常，“細(xì)胞培養(yǎng)基”(也稱作“培養(yǎng)基”)是本領(lǐng) 域中技術(shù)人員理解的術(shù)語并且公知表示營養(yǎng)溶液，其中生長細(xì)胞，優(yōu)選動物或者哺乳動物 細(xì)胞，并且該營養(yǎng)溶液通常提供下面的至少一種或多種組分能源(通常為糖，如葡萄糖的 形式)；所有必需氨基酸，通常20種基本氨基酸，加上半胱氨酸；維生素和/或以低濃度需 要的其他有機(jī)化合物；脂質(zhì)或游離脂肪酸，例如亞油酸；和微量元素，例如，無機(jī)化合物或 者天然發(fā)生的元素，它們通常以極低濃度需要，通常在微摩爾范圍內(nèi)。還可以向細(xì)胞培養(yǎng)基 補(bǔ)加多種任選組分，如激素和其他生長因子，例如，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、血清， 等等；鹽，例如，鈣、鎂和磷酸鹽，和緩沖液，例如HEPES ；核苷和堿基，例如腺苷、胸苷、次黃 嘌呤；和蛋白和組織水解物，例如水解動物蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其可以從動物副 產(chǎn)品獲得，純化的明膠或植物材料)；抗生素，例如慶大霉素和細(xì)胞保護(hù)基，例如，Pluronic 多元醇(Pluronic F68)。優(yōu)選無血清并且沒有動物來源的產(chǎn)物或者成分的細(xì)胞營養(yǎng)培養(yǎng) 基。如技術(shù)人員所理解的，動物或者哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)于適于特定細(xì)胞培養(yǎng)并且可以 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員不用過多實(shí)驗就可以確定的培養(yǎng)基中。可以使用通過商業(yè)途徑得到的培養(yǎng)基并且它們包括，例如，最小基本培養(yǎng)基(MEM，Sigma，St. Louis，MO) ；Ham' s FlO培養(yǎng) 基(Sigma) ；Dulbecco 氏改良的 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM, Sigma) ；RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sigma)； HyClone細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone，Logan，UT)；和化學(xué)定義的(⑶)培養(yǎng)基，它們用于特定細(xì)胞 類型，例如⑶-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。如必需或者希望，可以向前面的代 表性培養(yǎng)基添加適宜濃度或量的上述補(bǔ)充組分或成分，包括任選組分，并且所述添加將是 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且使用常規(guī)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)的。
此外，適于本發(fā)明方法的細(xì)胞培養(yǎng)條件是細(xì)胞的分批、補(bǔ)料分批，或者連續(xù)培養(yǎng)通 常使用和公知的那些條件，注意PH，例如約6. 5到約7. 5 ；溶解氧(O2)，例如空氣飽和度的約 5-90%和二氧化碳(CO2),攪拌和濕度，以及溫度。作為闡明性且非限制性實(shí)例，適于本發(fā)明 的補(bǔ)料分批方法的細(xì)胞培養(yǎng)基包括改良CD-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad, CA)，例如 實(shí)施例1。還可以使用送料培養(yǎng)基，如改良的eRDF培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad, CA)，例 如，實(shí)施例1或?qū)嵤├?。優(yōu)選還含有D-半乳糖的送料培養(yǎng)基。動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、動物或哺乳動物宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞、重組 細(xì)胞、重組宿主細(xì)胞等等都是細(xì)胞術(shù)語，它們可以根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)。這些細(xì)胞通常 是從哺乳動物得到或來源于哺乳動物的細(xì)胞系并且當(dāng)置于含有適宜營養(yǎng)物和/或生長因 子的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)或者懸浮培養(yǎng)時能夠生長和存活。特定細(xì)胞培養(yǎng)物的生長和保持 所必需的生長因子和營養(yǎng)物可以容易地由相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員通過經(jīng)驗確定，如例如由 Barnes禾口 Sato, (1980, Cell, 22 :649) ；Mammalian Cell Culture,編者，J. P. Mather, Plenum Press, NY, 1984 ；和美國專利號5，721，121描述。根據(jù)本發(fā)明方法可以培養(yǎng)多種細(xì)胞類型。細(xì)胞通常是動物或者哺乳動物細(xì)胞，它 們可以表達(dá)和分泌，或者經(jīng)分子工程化后表達(dá)和分泌大量特定蛋白質(zhì)，更具體地，目標(biāo)糖蛋 白到培養(yǎng)基中。將理解宿主細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白可以是宿主細(xì)胞內(nèi)源的或者同源的。備選 地，和優(yōu)選地，糖蛋白是異源的，即宿主細(xì)胞外來的，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細(xì)胞產(chǎn) 生和分泌的人糖蛋白。還優(yōu)選哺乳動物糖蛋白，即最初從哺乳動物生物得到和來源的那些 糖蛋白可通過本發(fā)明方法得到并且優(yōu)選通過細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。通過本發(fā)明方法可以優(yōu)選產(chǎn)生的哺乳動物糖蛋白的實(shí)例包括，但不限于，細(xì)胞因 子、細(xì)胞因子受體、生長因子(例如，EGF、HER-2、FGF-α、FGF-β、TGF-α、TGF-β、PDGF, IGF-U IGF-2, NGF, NGF-β)；生長因子受體，包括融合和嵌合蛋白。其他非限制性實(shí)例包括 生長激素(例如，人生長激素、牛生長激素)；胰島素(例如，胰島素A鏈和胰島素B鏈)、胰 島素原；紅細(xì)胞生成素(EPO)；集落刺激因子(例如，G-CSF、GM-CSF、M-CSF)；白介素(例如， IL-I到IL-12)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和其受體(VEGF-R)；干擾素(例如，IFN-α、β、 或Y)；腫瘤壞死因子(例如，TNF-α和TNF-β)和它們的受體TNFR-I和TNFR-2 ；血小板生 成素(TPO)；凝血酶；腦鈉尿肽(BNP)；凝血因子(例如，因子VIII、因子IX，馮 維勒布蘭德 因子，等等)；抗凝因子；組織纖溶酶原激活物(TPA)，例如，尿激酶或者人尿或組織型TPA; 促卵泡激素(FSH)；黃體生成素(LH)；降鈣素；CD蛋白(例如，CD3、CD4、CD8、⑶28、D19等 等)；CTLA蛋白(例如，CTLA4) ；T-細(xì)胞和B-細(xì)胞受體蛋白；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs，例如， BMP-I、BMP-2、BMP-3等等)；神經(jīng)營養(yǎng)因子，例如，骨來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)；神經(jīng)營 養(yǎng)蛋白，例如3-6 ；腎素；類風(fēng)濕因子；RANTES ；白蛋白；松弛素；巨噬細(xì)胞抑制蛋白(例如， MIP-U MIP-2)；病毒蛋白質(zhì)或抗原；表面膜蛋白；離子通道蛋白；酶；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；免疫調(diào)節(jié)蛋白(例如，HLA、MHC，B7家族)；歸巢受體；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；超氧化物歧化酶(SOD) ；G-蛋白 偶聯(lián)的受體蛋白(GPCRs)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白；阿爾茨海默氏病相關(guān)蛋白質(zhì)和肽(例如，Α-β)， 和本領(lǐng)域中公知的其他糖蛋白。通過本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生的適宜的蛋白質(zhì)、多肽和肽還 包括融合蛋白和多肽、嵌合蛋白和多肽，以及上面提到的蛋白質(zhì)任一種的片段或部分，或者 突變體、變體或類似物。
適于容納、表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)以隨后分離和/或純化的動物或哺乳動物宿主細(xì)胞 的非限制性實(shí)例包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，如CHO-Kl (ATCC CCL-61)、DG44 (Chasin等 人，1986，Som. Cell Molec. Genet.，12 :555_556 ；KoIkekar 等人，1997，Biochemistry, 36 10901-10909 ；)、CHO-Kl Tet-On 細(xì)胞系(Clontech)、CHO 指定的 ECACC85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、CHO 克隆 13 (GEIMG, Genova, IT)、CHO 克隆 B (GEIMG，Genova, IT)、CHO-Kl/SF 指定的 ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、RR-CHOKl 指 定的 ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、二氫葉酸脫氫酶陰性 CHO 細(xì)胞 (CH0/-DHFR, Urlaub 和 Chasin，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77 4216)，和 dpl2. CHO 細(xì) 胞(美國專利號5，721，121)、SV40轉(zhuǎn)換的猴腎CVl細(xì)胞(COS細(xì)胞，C0S-7，ATCCCRL-1651)； 人胚胎腎細(xì)胞(例如，293細(xì)胞，或亞克隆以懸浮培養(yǎng)的293細(xì)胞，Graham等人，1977， J. Gen. Virol. ,36 :59)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCC CCL-10)、猴腎細(xì)胞(CVLATCC CCL-70)、 非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76, ATCC CRL-1587 ；VERO, ATCC CCL-81)、小鼠支持細(xì)胞(TM4， Mather, 1980，Biol. R印rod. ,23 :243_251)、人宮頸癌細(xì)胞(HELA, ATCC CCL-2)、犬腎細(xì)胞 (MDCK, ATCC CCL-34)、人肺細(xì)胞(wu38, ATCC CCL-75)、人肝癌細(xì)胞(HEP-G2，HB 8065)、小 鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(MMT 060562，ATCC CCL-51)、水牛大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL-1442)、 TRI 細(xì)胞(Mather, 1982，Annals NYAcad. Sci.，383 44-68)、MCR 5 細(xì)胞、FS4 細(xì)胞。優(yōu)選 CHO細(xì)胞，特別是CH0/-DHFR細(xì)胞。適于在本發(fā)明的培養(yǎng)方法和過程中培養(yǎng)的細(xì)胞可以含有導(dǎo)入的(例如，通過轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)染、感染，或者注射)的表達(dá)載體(構(gòu)建體)，如質(zhì)粒等等，其含有編碼序列或者其 部分，所述編碼序列或者其部分編碼在培養(yǎng)過程中表達(dá)和生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。這種表達(dá)載 體含有所插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必要的元件。本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知并且實(shí)踐 的方法可用于構(gòu)建表達(dá)載體，其含有編碼所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽的序列，以及適宜的轉(zhuǎn) 錄和翻譯控制元件。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，和體內(nèi)基因重組。這 些技術(shù)在 J. Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.禾口 F. Μ. Ausubel 等人，1989, CurrentProtocoIs in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.中描述?？刂圃?，或者調(diào)節(jié)序列是載體的非翻譯區(qū)，例如，增強(qiáng)子、啟動子、5’和3’非翻譯 區(qū)，這些非翻譯區(qū)與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用以實(shí)施轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件可以在長度和 特異性方面不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主細(xì)胞，可以使用任何數(shù)目的適宜的轉(zhuǎn)錄和翻 譯元件，包括組成性和可誘導(dǎo)的啟動子。在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中，優(yōu)選來自哺乳動物基因或 者哺乳動物病毒的啟動子。設(shè)計用于蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建體以含有至少一種啟動子、一 種增強(qiáng)子序列(任選地，用于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng))，和基因表達(dá)的正確轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)所必需或 者需要的其他序列(例如，轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、復(fù)制位點(diǎn)的原點(diǎn)、多腺苷酸化序列，例如， 牛生長激素(BGH)多聚A序列)。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，適宜的載體，例如質(zhì)粒，和真核(例如，哺乳動物)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和分離組分的選擇是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知并且常 規(guī)確定和實(shí)踐的。根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)可以置于啟動子的控制下，所 述啟動子為例如病毒啟動子，例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、磷酸甘油激酶 (PGK)、胸苷激酶(TK)，或者α-肌動蛋白啟動子。此外，特定化合物或者分子可以賦予受 調(diào)節(jié)啟動子的可誘導(dǎo)性，例如，小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)的糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GRE)受 到糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)(V. Chandler等人，1983，Cell,33 :489_499)。而且，如果必要或者希 望，可以使用組織特異啟動子或者調(diào)節(jié)元件(G. Swift等人，1984，Cell,38 :639_646)。通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的多種基因轉(zhuǎn)移方法可以將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中， 所述方法為例如，常規(guī)基因轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔，和感 染或者病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。方法的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的。本領(lǐng)域中技術(shù)人員將 明白可以將攜帶在細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列的一種或多種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而在所述細(xì)胞 中隨后產(chǎn)生或者從所述細(xì)胞得到表達(dá)產(chǎn)物。在具體方面，含有適宜的控制和調(diào)節(jié)序列的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選用于本發(fā)明的 表達(dá)蛋白質(zhì)的哺乳動物細(xì)胞中。通常用于產(chǎn)生哺乳動物表達(dá)載體的真核控制序列包括與 哺乳動物細(xì)胞相容的啟動子和控制序列，例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(CDM8載體)和 鳥肉瘤病毒(ASV)，(jiLN)。其他常用的啟動子包括源于猿病毒40(SV40)的早和晚啟動 子(Fiers等人，1973，Nature，273 :113)，或者其他病毒啟動子，如源于多形瘤、腺病毒2、和 牛乳頭狀瘤病毒的那些啟動子。也可以使用可誘導(dǎo)的啟動子，如hMTII (Karin等人，1982， Nature,299 797-802)。適于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的實(shí)例包括，但不限于，哺乳動物細(xì)胞的載體(例 如，BPV-U pHyg、pRSV、pSV2、pTK2 (Maniatis)、pIRES (Clontech)、pRc/CMY2、pRc/RSV、 pSFVl (LifeTechnologies)、pVPakc 載體、pCMV 載體、pSG5 載體(Stratagene)、逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體(例如，PFB載體(Stratagene))、pcDNA-3 (Invitrogen)、腺病毒載體；腺相關(guān)病毒載 體、桿狀病毒載體、酵母載體(例如，PESC載體(Stratagene))、或者前面任一種載體的改 良修飾。載體還可以包括含有用于優(yōu)化基因表達(dá)的啟動子區(qū)域序列上游或下游的增強(qiáng)子序 列。也可以在重組載體(例如，質(zhì)粒)中使用可選擇標(biāo)記以賦予對含有(優(yōu)選已經(jīng)穩(wěn) 定整合)該載體的細(xì)胞抗性以允許它們在適宜的選擇培養(yǎng)基中選擇?？梢允褂迷S多選擇 系統(tǒng)，它們包括但不限于，單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV TK) (Wigler等人，1977，Cell,11 223)；次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT) (Szybalska和Szybalski，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，48 :202)；和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy 等人，1980，Cell, 22 817)基因，它們分別可用于tk-、hgprt-、或aprt-細(xì)胞(APRT)中?？勾x物抗性也可用作標(biāo)記基因的下面的非限制性實(shí)例的選擇基礎(chǔ)dhfr， 其賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler 等人，1980，Natl. Acad. Sci. USA 77 357 ；0 ‘ Hare 等 人，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 1527) ；gpt,其賦予霉酚酸抗性(Mulligan 和 Berg, 1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 2072) ；neo,其賦予氨基糖苷 G-418 抗性 (ClinicalPharmacy,12 488-505 ；Wu 禾口 Wu，1991，Biotherapy,3 87-95 ；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol.Toxicol. ,32 :573_596 ；Mulligan, 1993, Science,260 926-932 ；Anderson,1993，Ann. Rev. Biochem. ,62 191-21 ；May,1993，TIB TECH,11(5) 155-215)；和hygro，其賦予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，Gene 30:147)。本領(lǐng)域 中公知的重組DNA技術(shù)的方法可常規(guī)地用于選擇所希望的重組克隆，并且這些方法在例 如，Ausubel 等人(編者)，Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, StocktonPress, NY (1990)；和第 12 和 13 章，Dracopoli 等人(編者)，CurrentProtocols in Human Genetics, John Wiley & Sons，NY(1994) ；ColberreGarapin 等人，1981，J. Mol. Biol. 150 1中描述，這些文獻(xiàn)在此處被完整并入作為參考。通過載體擴(kuò)增可以提高所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平(綜述，見Bebbington和 Hentschel，使用基于基因擴(kuò)增的載體在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)克隆的基因，DNA cloning，卷 3 (Academic Press, New York，1987))。當(dāng)表達(dá)蛋白質(zhì)的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記物是可擴(kuò)增的 時候，宿主培養(yǎng)物中存在的抑制劑的水平的增加將增加該標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。因為擴(kuò)增的 區(qū)域與編碼蛋白質(zhì)的基因結(jié)合，所以蛋白質(zhì)的產(chǎn)量將伴隨著增加(Crouse等人，1983，Mol. Cell. Biol. 3 257)?？梢苑謩e在藥物甲硫氨酸sulphoximine或者氨甲蝶呤的存在下擴(kuò)增含有作為選 擇標(biāo)記的編碼谷氨酰胺合酶(GS)或者二氫葉酸還原酶(DHFR)的核酸的載體?；诠劝滨?胺合酶的載體的優(yōu)點(diǎn)是可以利用谷氨酰胺合酶陰性細(xì)胞系(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞系，NSO)。 通過提供額外抑制劑以防止谷氨酰胺合酶內(nèi)源基因的作用，谷氨酰胺合酶表達(dá)系統(tǒng)也可以 在表達(dá)谷氨酰胺合酶的細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)中發(fā)揮功能。表達(dá)作為選擇標(biāo)記的DHFR的載體包括，但不限于pSV2_dhfr質(zhì)粒(Subramani等 人，Mol. Cell. Biol. 1 :854(1981)。表達(dá)作為選擇標(biāo)記的谷氨酰胺合酶的載體包括，但不限 于 St印hens 和 Cockett，1989，Nucl. Acids. Res. , 17 7110 中描述的 ρΕΕ6 表達(dá)載體。谷氨酰 胺合酶表達(dá)系統(tǒng)和其組分在 PCT 公布W087/04462、W086/05807、W089/01036、W089/10404、 和TO91/06657中詳述，這里完整引用這些文獻(xiàn)作為參考。此外，可以根據(jù)本發(fā)明使用的 谷氨酰胺合酶表達(dá)載體可通過商業(yè)途徑從供應(yīng)商(包括，例如，Lonza Biologies, Inc. (Portsmouth, NH))得到。在特定實(shí)施方案中，可以將編碼可溶性CTLA4分子或者可溶性CTL4突變分子的核 酸序列插入經(jīng)設(shè)計用于在真核宿主中表達(dá)外來序列的載體中。所述載體的調(diào)節(jié)元件可以根 據(jù)具體真核宿主而變。在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶CTLA4或者可溶CTLA4突變體的載體包 括用于優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)的增強(qiáng)子序列。細(xì)胞培養(yǎng)類型為了理解的目的，然而不限制，技術(shù)人員將理解用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)和培 養(yǎng)運(yùn)行可以包括三種通常的類型；即連續(xù)培養(yǎng)、分批培養(yǎng)和補(bǔ)料-分批培養(yǎng)。在連續(xù)培養(yǎng) 中，例如，在培養(yǎng)期間為細(xì)胞提供新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充(即，補(bǔ)料培養(yǎng)基)，而每天除去舊培養(yǎng) 基，并且例如，每天或者連續(xù)收獲產(chǎn)物。在連續(xù)培養(yǎng)中，送料培養(yǎng)基每天加入并且可以連續(xù) 地，即作為滴液或者輸注加入。對于連續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中保持所希望的長時間， 只要細(xì)胞保持活著并且保持環(huán)境和培養(yǎng)條件。在分批培養(yǎng)中， 細(xì)胞最初在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)運(yùn)行期間或者結(jié)束前該培 養(yǎng)基既不除去、替換，也不補(bǔ)加，即不用新鮮培養(yǎng)基“喂養(yǎng)”細(xì)胞。在培養(yǎng)運(yùn)行末收獲所希望的產(chǎn)物。 對于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，通過在運(yùn)行期間用新鮮培養(yǎng)基每天補(bǔ)加培養(yǎng)基一次或多次 (或者連續(xù))，即在培養(yǎng)期期間用新鮮培養(yǎng)基(“送料培養(yǎng)基”)“喂養(yǎng)”細(xì)胞。補(bǔ)料分批培 養(yǎng)可以包括多種喂飼方案和次數(shù)，例如，每天、每隔一天、每兩天，等等，每天一次以上，或者 每天小于一次，等等。此外，可以用送料培養(yǎng)基連續(xù)喂飼補(bǔ)料分批培養(yǎng)物。然后在培養(yǎng)/生產(chǎn)運(yùn)行結(jié)束時收獲所希望的產(chǎn)物。本發(fā)明優(yōu)選包括補(bǔ)料_分批細(xì) 胞培養(yǎng)，其中培養(yǎng)期期間兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換產(chǎn)生了更高數(shù)量和質(zhì)量的蛋白質(zhì)并且可以延 長蛋白質(zhì)生產(chǎn)期使其超過不使用溫度轉(zhuǎn)換，或者僅使用一次溫度轉(zhuǎn)換時發(fā)生的生產(chǎn)期。本 發(fā)明優(yōu)選包括補(bǔ)料-分批細(xì)胞培養(yǎng)，其中在接種后加入聚陰離子化合物。還設(shè)想在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，可以向送料培養(yǎng)基補(bǔ)加D-半乳糖，或者D-半乳糖 可以通過不同于在送料培養(yǎng)基中的方法喂飼培養(yǎng)物。在培養(yǎng)運(yùn)行期間并且直到培養(yǎng)運(yùn)行結(jié) 束，優(yōu)選每天(或者連續(xù))用含有半乳糖的送料培養(yǎng)基喂飼，或者其他形式喂飼，盡管可以 應(yīng)用其他喂飼方案。在包括D-半乳糖的這種連續(xù)喂飼方案中，培養(yǎng)物接受送料培養(yǎng)基，其 作為連續(xù)提供的“滴液”，或者輸注，或者其他向培養(yǎng)物的自動化添加，以定時的、受調(diào)節(jié)的， 和/或程序化的方式加入，以期實(shí)現(xiàn)并保持培養(yǎng)物中適宜量的半乳糖。最優(yōu)選的方案包括 在培養(yǎng)運(yùn)行的每天，從培養(yǎng)運(yùn)行開始到收獲細(xì)胞的那一天用含有半乳糖的送料培養(yǎng)基每天 一次大丸劑喂飼。根據(jù)本發(fā)明的包括用半乳糖喂飼的方法，送料培養(yǎng)基中D-半乳糖的濃度 優(yōu)選以如此的量提供，所述量提供在培養(yǎng)過程培養(yǎng)物，或者反應(yīng)器中D-半乳糖的持續(xù)或者 穩(wěn)定的水平。適于用于送料培養(yǎng)基中的D-半乳糖的量為約lg/L到約50g/L，優(yōu)選約3g/L 到約25g/L，更優(yōu)選約3g/L到約20g/L。作為具體但是非限制性實(shí)例，送料培養(yǎng)基中12. 5g/ L D-半乳糖適于用于本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，尤其例如，用于50L反應(yīng)器規(guī)模。此外，優(yōu)選 用于培養(yǎng)細(xì)胞的送料培養(yǎng)基中殘留半乳糖的濃度(例如，反應(yīng)器或者培養(yǎng)容器中)在整個 培養(yǎng)運(yùn)行中保持并維持在約0. l-10g/L，優(yōu)選約0. l_5g/L，更優(yōu)選約0. 2-5g/L，更優(yōu)選，約 0. 2-2. 5g/L，甚至更優(yōu)選，約0. 5-2g/L，最優(yōu)選約0. 5-1. Og/L (見，共同轉(zhuǎn)讓的專利申請美
國序號60/436，050 (2002年12月23日提交)和相伴提交的美國序號10/_，這里引
用所述專利申請作為參考)。在包含兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換的本發(fā)明的方面，本發(fā)明的包含兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換 的細(xì)胞培養(yǎng)方法導(dǎo)致培養(yǎng)物中更多活細(xì)胞，直到該方法或者生產(chǎn)運(yùn)行結(jié)束。存活細(xì)胞的數(shù) 目越大，在蛋白質(zhì)生產(chǎn)的非生長相關(guān)過程，如本文中例證的過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量 就越大。從而，在這些情況中，在該方法結(jié)束時得到的所希望的產(chǎn)物的累積量越大。根據(jù)本 發(fā)明，培養(yǎng)物中單獨(dú)細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)或者糖蛋白的速度(即，細(xì)胞特定生產(chǎn)率)不受本發(fā)明 的溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)方法的影響或增加(例如，實(shí)施例6)。相比，在生長相關(guān)的培養(yǎng)過程中，主 要通過培養(yǎng)物的生長期期間正生長的細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。(例如，見下文和實(shí)施例4)。根據(jù)本發(fā)明，使用慣用于動物或者哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器和/或培養(yǎng)設(shè) 備，在大規(guī)模或者小規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)條件下，可以實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)，并且可以由細(xì)胞產(chǎn)生糖 蛋白。如本領(lǐng)域中技術(shù)人員將理解的，組織培養(yǎng)皿、T-燒瓶和旋轉(zhuǎn)瓶通常用于實(shí)驗室規(guī) 模。對于大規(guī)模培養(yǎng)(例如，500L，5000L，等等，例如，如在一般轉(zhuǎn)讓的專利申請美國序號
60/436，050 (2002年12月23日提交)和相伴提交的美國序號10/_所描述的，這里
引用所述專利申請作為參考)，方法包括，但不限于，可以使用流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶培養(yǎng)，或者攪拌釜生物反應(yīng)器系統(tǒng)。微載體可以與或者不與滾瓶或者攪拌釜生物反應(yīng)器系統(tǒng)一起使用。系統(tǒng)可以以分批、連續(xù)、或者補(bǔ)料-分批模式運(yùn)行。此外，培 養(yǎng)設(shè)備或者系統(tǒng)可以裝備或者不裝備細(xì)胞分離器，該分離器使用過濾、重力、離心力，等等。細(xì)胞培養(yǎng)期和相關(guān)參數(shù)術(shù)語“接種”指向起始培養(yǎng)基加入細(xì)胞以開始培養(yǎng)。培養(yǎng)的生長期指這樣的期間，在該期間任何時間點(diǎn)的活細(xì)胞密度都高于任何以前 的時間點(diǎn)的活細(xì)胞密度。培養(yǎng)的穩(wěn)定期指這樣的期間，在該期間活細(xì)胞密度在任何長度的時限內(nèi)約恒定 (即在測量誤差內(nèi))。培養(yǎng)的死亡期是生長期之后或者生長期和穩(wěn)定期之后出現(xiàn)的時期，在該期間內(nèi)任 何時間點(diǎn)的活細(xì)胞密度都低于前面期內(nèi)任何時間點(diǎn)的活細(xì)胞密度。在生長相關(guān)的培養(yǎng)方法中，如聚陰離子化合物導(dǎo)致延長的生長期的情況，生產(chǎn)期 可以在延長的生長期期間開始。在非生長相關(guān)的培養(yǎng)方法中，細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期可以是穩(wěn)定期。優(yōu)選地，在生產(chǎn)期期間補(bǔ)加(“喂飼”)培養(yǎng)基以提供持續(xù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)，尤其在延長 的生產(chǎn)期中，以得到大量高質(zhì)量糖蛋白產(chǎn)物(如通過蛋白質(zhì)回收時高水平終末唾液酸含量 例證和/或確定)。喂飼可以每天發(fā)生，或者根據(jù)其他方案進(jìn)行以維持細(xì)胞生存力和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。在延長的生產(chǎn)期期間，溫度經(jīng)轉(zhuǎn)換而連續(xù)低于生長和標(biāo)準(zhǔn)(最初)生產(chǎn)期的溫度， 細(xì)胞得到喂飼并保持存活。這導(dǎo)致在比最初培養(yǎng)溫度下，或者當(dāng)溫度從最初培養(yǎng)溫度僅轉(zhuǎn) 換一次時發(fā)生的總時限延長的或者更長的總時限內(nèi)生產(chǎn)所希望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明 的培養(yǎng)方法可以導(dǎo)致更多活細(xì)胞存活直到培養(yǎng)期結(jié)束。因此，在一些實(shí)施方案中，存活的細(xì) 胞越多，產(chǎn)生所希望的產(chǎn)物的細(xì)胞越多。這又導(dǎo)致培養(yǎng)方法結(jié)束時積累更大量的產(chǎn)物，而單 個細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的速度，即細(xì)胞特定生產(chǎn)率保持相同(見，例如實(shí)施例4)。如本領(lǐng)域中公 知的細(xì)胞特定生產(chǎn)率或者細(xì)胞特定速度通常指每個細(xì)胞，或者細(xì)胞質(zhì)量或者體積的每一量 度產(chǎn)生的產(chǎn)物的特定表達(dá)速度。例如，以所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)克數(shù)/細(xì)胞/天測量細(xì)胞特定生 產(chǎn)率，并且可以根據(jù)積分方法測量細(xì)胞特定生產(chǎn)率，該積分方法包括下式dP/dt = qpX，或者P = qp / Xdt其中qp為細(xì)胞特定生產(chǎn)率常數(shù)；X為細(xì)胞數(shù)或者細(xì)胞體積，或者細(xì)胞質(zhì)量當(dāng)量； dP/dt為蛋白質(zhì)生產(chǎn)速度。從而，可以從產(chǎn)物濃度對活細(xì)胞的時間積分得到qp( / C1tXdt“活 細(xì)胞天數(shù)”)。根據(jù)該公式，當(dāng)將產(chǎn)生的糖蛋白產(chǎn)物的量對可變細(xì)胞數(shù)作圖時，斜率等于細(xì)胞 特定速度?？梢酝ㄟ^幾種量度確定細(xì)胞，所述量度為例如，生物量、O2攝取速度、乳糖脫氫酶 (LDH)、壓緊細(xì)胞體積或者濁度(例如，T. Etcheverry等人的美國專利號5，705，364)。通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法產(chǎn)生可溶CTLA4分子和可溶CTLA4突變分子在本發(fā)明包括的其他實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)方法用于產(chǎn)生可溶CTLA4分子或可溶 CTLA4突變分子，如下述?？扇蹸TLA4分子優(yōu)選為CTLA4融合蛋白，優(yōu)選CTLA4Ig。更優(yōu)選含 有如圖3中所示的-1到357或者+1到357位氨基酸的CTLA4Ig。最優(yōu)選由圖3中所示的_1 到357或者+1到357位氨基酸組成的CTLA4Ig?？扇蹸TLA4突變分子優(yōu)選為L104EA29YIg，其含有如圖4中所示的-1到357或者+1到357位氨基酸。最優(yōu)選由圖4中所示的_1到 357或者+1到357位氨基酸組成的L104EA29YIg。包括蛋白質(zhì)產(chǎn)物的延長生產(chǎn)期的兩步或 三步溫度轉(zhuǎn)換細(xì)胞培養(yǎng)方法尤其適于通過培養(yǎng)物中的宿主細(xì)胞產(chǎn)生高質(zhì)量和大量可溶性 CTLA4分子和可溶性CTLA4突變分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過重組工程化宿主細(xì)胞產(chǎn)生CTLA4Ig。通過用含有編 碼CTLA4Ig的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞可以重組產(chǎn)生CTLA4Ig融合蛋。(見， P. S. Linsley等人的美國專利號5，844，095，和本文中實(shí)施例2)。當(dāng)在本發(fā)明的多步溫度轉(zhuǎn) 換方法中培養(yǎng)時，CTLA4Ig融合蛋白以高數(shù)量產(chǎn)生并且被適宜地唾液酸化。本發(fā)明提供生 產(chǎn)高水平可回收的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，例如，唾液酸化CTLA4Ig蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在另一優(yōu)選實(shí)施方案 中，含有如圖4中所示的-1到357或+1到357氨基酸的可溶性CTLA4突變分子L104EA29YIg 由本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生。CTLA4的配體是B7分子。如本文中所用的“配體”指特異識別并結(jié)合另一分子 的分子。分子和其配體的相互作用可以受到本發(fā)明的培養(yǎng)方法的產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。例如，通過 施用CTLA4Ig分子可以阻斷CTLA4與其配體 B7的相互作用。作為其他實(shí)施例，通過施用 etanerc印t或者其他TNF/TNFR阻斷分子可以阻斷腫瘤壞死因子(TNF)與其配體(TNFR)的 相互作用。野生型CTLA4或者“非突變的CTLA4”具有天然發(fā)生的，全長CTLA4的氨基酸序列， 如圖5中所示(也在美國專利號5，434，131,5, 844，095和5，851，795中描述，這里將它們完 整并入作為參考)，或者識別并結(jié)合B7分子或者干擾B7分子，從而與CD28和/或CTLA4 (例 如，內(nèi)源⑶28和/或CTLA4)的結(jié)合被阻斷。野生型CTLA4含有特定部分，包括，例如，以+1 位甲硫氨酸開始并且以+124位天冬氨酸結(jié)束的野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，或者以-1位 丙氨酸開始并且以+124位天冬氨酸結(jié)束的野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，如圖5中所示。天然發(fā)生的野生型CTLA4是細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，其具有N-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié) 構(gòu)域，和C-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶分子，如B7分子。在細(xì)胞中，天然發(fā)生的， 野生型CTLA4蛋白質(zhì)以不成熟多肽翻譯，其包括氨基端，或者N-末端的信號肽。該不成熟 多肽經(jīng)歷翻譯后加工，其包括切割并除去信號肽以產(chǎn)生CTLA4切割產(chǎn)物，其具有與不成熟 形式中的N-末端不同的N-末端。本領(lǐng)域中技術(shù)人員將理解可以發(fā)生額外的翻譯后加工， 其從CTLA4切割產(chǎn)物的新近產(chǎn)生的N-末端除去一個或多個氨基酸。成熟CTLA4蛋白質(zhì)可 以在+1位甲硫氨酸或者-1位丙氨酸開始。CTLA4分子的成熟形式包括結(jié)合B7的胞外結(jié)構(gòu) 域或者其任何部分。如本文中所用的CTLA4突變分子指含有如圖5中所示的野生型CTLA4的分子，或 者其任何部分或者衍生物，所述衍生物在野生型CTLA4序列，優(yōu)選野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu) 域中具有一處突變或多處突變，并且結(jié)合B7。CTLA4突變分子具有與野生型CTLA4分子相 似，但是不相同的序列，但是仍然結(jié)合B7。所述突變可以包括將一個或多個氨基酸殘基用具 有保守(例如，亮氨酸代替異亮氨酸)或者非保守(例如，色氨酸代替甘氨酸)結(jié)構(gòu)或者化 學(xué)特性的氨基酸、氨基酸缺失、加入、移碼或者截斷代替。CTLA4突變分子可以在其中包括非-CTLA4分子或者附著非-CTLA4分子，即，CTLA4 突變?nèi)诤系鞍?。所述突變分子可以是可溶?即，循環(huán)的)或者它們可以結(jié)合到細(xì)胞表面 (膜結(jié)合)。CTLA4突變分子包括L104EA29YIg和美國專利序號09/865，321,60/214, 065和 60/287，576 ；WO 01/92337 A2 ；美國專利號 6，090，914,5, 844，095 和 5，773，253 ；和 R. J. Peach等人1994，J Exp Med, 180 =2049-2058中描述的那些分子?？梢院铣苫蛘咧亟M 產(chǎn)生CTLA4突變分子。
CTLA4Ig是可溶性融合蛋白，其含有野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，或其結(jié)合B7的部 分，所述胞外結(jié)構(gòu)域或者其部分與免疫球蛋白(Ig)分子，或者其部分結(jié)合。CTLA4的胞外 結(jié)構(gòu)域或者其部分結(jié)合到Ig部分，其含有免疫球蛋白所有或者一部分，優(yōu)選免疫球蛋白恒 定區(qū)的所有或者一部分，如 IgC y 1 (IgCgammal)、IgC γ 2 (IgCgamma2)、IgC γ 3 (IgCgamma3)、 IgC γ 4(IgCgamma4)、IgCy (IgCmu)、IgC α 1(IgCalphal), IgC α 2(IgCalpha2)、 IgC δ (IgCdelta)或IgC ε (IgCepsilon)的所有或者一部分，使得該融合蛋白可溶。Ig部 分可以包括前述恒定區(qū)或者其他恒定區(qū)的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域、或者CH1、鉸鏈、CH2和 CH3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，Ig部分來源于人或者猴，并且包括鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選 地，Ig部分含有人IgC γ 1的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或者由人IgC γ 1的鉸鏈、CH2和CH3 結(jié)構(gòu)域組成。在CTLA4Ig的Ig部分中，可以突變Ig恒定區(qū)或者其部分，從而導(dǎo)致減小其 效應(yīng)物功能(見，例如，美國專利號5，637，481、5，844，095和5，434，131)。本文中所用的 術(shù)語 IgG 部分、Ig 恒定區(qū)、IgC (恒定)結(jié)構(gòu)域、IgC y 1 (IgCgammal), IgC γ 2 (IgCgamma2), IgC γ 3 (IgCgamma3)、IgC γ 4 (IgCgamma4)、IgCy (IgCmu)、IgC α 1 (IgCalphal)、 IgCa 2(IgCalpha2)、IgC δ (IgCdelta)或 IgC ε (IgCepsilon)包括天然序列和已經(jīng)突變的 序列，如在恒定區(qū)中具有突變的序列，其減小效應(yīng)物功能。與CTLA4有關(guān)的特定實(shí)施方案包括在+1位甲硫氨酸開始并且在+124位天冬氨酸 結(jié)束，或者在-1位丙氨酸開始到+124位天冬氨酸的野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域；+125位 的連接氨基酸殘基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，其包括+126位谷氨酸到+357位賴氨酸， 如圖3中所示。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，編碼該CTLA4Ig的DNA在1991年5月31日保 存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd. ,Manassas, VA 20110-2209， 并且已經(jīng)給予 ATCC 保藏號 ATCC 68629 ;P. Linsley 等人，1994，Immunity 1:793-80。表達(dá) CTLA4Ig的CHO細(xì)胞系于1991年5月31日保藏在ATCC，保藏號為CRL-10762。根據(jù)本文中 描述的方法產(chǎn)生的可溶性CTLA4Ig分子可以或不必包括信號(前導(dǎo))肽序列。圖8和9包 括對信號(前導(dǎo))肽序列的說明。通常，分子不包括信號肽序列。L104EA29YIg是融合蛋白，其是可溶性CTLA4突變分子，該分子含有野生型CTLA4 的胞外結(jié)構(gòu)域，其具有氨基酸改變A29Y(酪氨酸氨基酸殘基置換29位的丙氨酸)和 L104E (谷氨酸氨基酸殘基置換+104位亮氨酸)，該胞外結(jié)構(gòu)域連接到IgG尾。備選地， L104EA29YIg的氨基酸序列含有+1位氨基酸位置的甲硫氨酸到+357氨基酸位置的賴氨 酸，如圖4中所示。L104EA29YIg含有+125位的連接氨基酸殘基谷氨酰胺和IgG部分，其 包括+126位谷氨酸到+357位賴氨酸。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，編碼L104EA29YIg的 DNA在2000年6月20日保存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并且已經(jīng)給予ATCC保 藏號PTA-2104。L104EA29YIg在共同待決美國專利申請序號09/579，927,60/287, 576和 6(V214，065和W0/01/923337 A2中描述，將所述專利完整并入本文作為參考。通過本發(fā)明 的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的可溶性L104EA29YIg分子可以或者不必包括信號(前導(dǎo))肽序列。通常， 根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的分子不包括信號肽序列。如本文中所用的，術(shù)語可溶的指不結(jié)合或者附著細(xì)胞的任何分子，或者其片段，即循環(huán)的。例如，通過將Ig部分分別附著到CTLA4、B7或者⑶28的胞外結(jié)構(gòu)域，可以使CTLA4、 B7或者⑶28可溶。備選地，諸如CTLA4的分子可以通過除去其跨膜結(jié)構(gòu)域使該分子可溶。 通常，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的可溶分子不包括信號(或者前導(dǎo))序列。
可溶性CTLA4分子指非細(xì)胞表面結(jié)合(即，循環(huán))的分子，其含有野生型CTLA4， 或者其結(jié)合B7的部分或者衍生物，包括，但不限于，可溶性CTLA4融合蛋白；可溶性 CTLA4融合蛋白，如CTLA4Ig融合蛋白(例如，ATCC 68629)，其中CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域 融合到Ig部分，Ig部分是Ig分子的全部或者一部分，優(yōu)選Ig恒定區(qū)的全部或一部分， 如 IgC y1(IgCgammal)、IgC γ 2(IgCgamma2)、IgC γ 3 (IgCgamma3)、IgC γ 4(IgCgamma4)、 IgC μ (IgCmu), IgC α 1(IgCalphal)、IgC α 2(IgCalpha2) , IgC δ (IgCdelta)或 IgCe (IgCepsilon)的全部或者一部分，使得該融合分子可溶；可溶性CTLA4融合蛋白，其 中胞外結(jié)構(gòu)域融合到或者結(jié)合生物活性或者化學(xué)活性蛋白質(zhì)的一部分，所述蛋白質(zhì)為諸如 乳頭瘤病毒Ε7基因產(chǎn)物(CTLA4-E7)、黑素瘤相關(guān)抗原p97 (CTLA4_p97)或者HIV env蛋白 質(zhì)(CTLA4-erw gpl20)，如美國專利號5，844，095中所描述的，這里將該專利完整并入作為 參考；如美國專利號5，434，131所描述的，雜交(嵌和)融合蛋白如CD28/CTLA4Ig ；這里 將其完整引入作為參考；跨膜結(jié)構(gòu)域被除去而使得該蛋白質(zhì)可溶的CTLA4分子(見，例如， M. K. Oaks 等人，2000，Cellular Immunology, 201 144-153，這里將其完整并入作為參考)； 可溶性CTLA4突變分子L104EA2OTIg?？扇苄訡TLA4分子也可以是可溶性CTLA4突變分子。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的可溶性 CTLA4分子可以包括或不包括信號(前導(dǎo))肽序列。信號肽序列可以是將允許該分子分 泌的任何序列，包括來自制癌蛋白M的信號肽(Malik等人，1989，Molec. Cell. Biol.，9 2847-2853)，或者 CD5 (N. H. Jones 等人，1986, Nature, 323 :346_349)的信號肽，或者來自任 何胞外蛋白質(zhì)的信號肽。通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的可溶性CTLA4分子可以包括制癌蛋 白M信號肽，其連接在CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域的N-末端。通常，在本發(fā)明中，該分子不包括信 號肽序列。本文中所用的CTLA4融合蛋白指含有野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，或者其結(jié)合B7 的部分的分子，所述胞外結(jié)構(gòu)域或者其部分與使得CTLA4分子可溶的非CTLA4部分，如Ig 部分融合。例如，CTLA4融合蛋白可以包括與Ig恒定區(qū)的所有或者部分融合的CTLA4的胞 外結(jié)構(gòu)域。可與CTLA4融合的Ig恒定結(jié)構(gòu)域(或者其部分)的實(shí)例包括所有，但不限于上 文中所列出的那些Ig恒定結(jié)構(gòu)域。CTLA4融合蛋白還可以是CTLA4突變分子。本文中所用的“非CTLA4部分”指不結(jié)合⑶80和/或⑶86并且不干擾CTLA4 與其配體結(jié)合的分子或者其部分。實(shí)例包括但不限于，Ig部分，其為Ig分子的所有或部 分；生物活性或者化學(xué)活性蛋白質(zhì)的一部分，所述蛋白質(zhì)為諸如乳頭瘤病毒E7基因產(chǎn)物 (CTLA4-E7)、黑素瘤相關(guān)抗原 p97(CTLA4-p97)或者 HIV env 蛋白質(zhì)(CTLA4_env gpl20) (如美國專利號5，844，095中所描述的，這里將該專利完整并入作為參考)。Ig部分的 實(shí)例包括免疫球蛋白恒定區(qū)的所有或部分，如IgCy I(IgCgammal)、IgC γ 2 (IgCgamma2), IgC γ 3 (IgCgamma3)、IgC γ 4 (IgCgamma4)、IgCy (IgCmu)、IgC α 1 (IgCalphal)、 IgCa 2(IgCalpha2)、IgCS (IgCdelta)或 IgC ε (IgCepsilon) Ig 部分可以包括前述恒定 區(qū)或者其他恒定區(qū)的鉸鏈、CH2和CH 3結(jié)構(gòu)域、或者CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選 地，Ig部分來源于人或者猴，并且包括鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選地，Ig部分包括人IgC γ 1的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，或者為人IgC γ 1的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在CTLA4Ig的ig部分中，在ig部分中，可以突變ig恒定區(qū)或者其部分，從而導(dǎo)致減小其效應(yīng)物功能 (見，例如，美國專利號 5,637,481,5,844, 095 和 5，434，131)。CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域指識別并結(jié)合B7的野生型CTLA4的任何部分。例如，CTLA4 的胞外結(jié)構(gòu)域含有+1位甲硫氨酸到+124位天冬氨酸(圖5)。例如，CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域 含有-1位丙氨酸到+124位天冬氨酸(圖5)。本文中所用術(shù)語突變指野生型分子中核苷酸或者氨基酸序列中的改變，例如，野 生型ctla4胞外結(jié)構(gòu)域的dna和/或氨基酸序列中的改變。dna中突變可以改變密碼子， 導(dǎo)致所編碼的氨基酸序列中的改變。dna改變可以包括置換、缺失、插入、備選剪接，或者截 斷，或者蛋白質(zhì)的加工或者切割錯誤。備選地，核苷酸序列中的突變可以導(dǎo)致氨基酸序列中 沉默突變，如本領(lǐng)域中熟知的。還如所理解的，某些核苷酸密碼子編碼相同的氨基酸。實(shí)例 包括核苷酸密碼子cgu、cgg、cgcjn cga，它們編碼氨基酸精氨酸(r)；或者密碼子gau和 gac，它們編碼氨基酸天冬氨酸(d)。從而，可以由一種或多種核酸分子編碼一種蛋白質(zhì)，這些核酸分子在它們的特定 核苷酸序列中不同，但是仍然編碼具有相同序列的蛋白質(zhì)分子。突變分子可以具有一個，或 者一個以上的突變。為了指導(dǎo)，氨基酸編碼序列如下 本文中所用的片段或部分是分子的任何部分或節(jié)段。對于CTLA4或者CD28，片段 或部分優(yōu)選為CTLA4或者CD28的胞外結(jié)構(gòu)域，或者其部分，其識別并結(jié)合Β7或者干擾Β7， 從而阻斷其對CD28和/或CTLA4的結(jié)合。而且，如本文中所用的，“相應(yīng)”指具有序列同一性。本文中所用的Β7指分子的Β7家族的任何成員，包括，但不限于，B7_l (⑶80) (Freeman等人，1989，J Immunol.，143 =2714-2722,將其完整并入本文作為參考)、 B7-2 (CD86) (Freeman 等人，1993，Science, 262 :909_911，將其完整并入本文作為參考； Azuma等人，1993，Nature, 366 :76_79，將其完整并入本文作為參考)，其識別并結(jié)合CTLA4 和/或⑶28。CD28指識別并結(jié)合B7的分子，如美國序號5，580，756和5，521，288 (將其完 整并入本文作為參考)所描述。本文中所用的B7陽性細(xì)胞包括在細(xì)胞表面表達(dá)一種或多 種類型的B7分子的任何細(xì)胞。本文中所用的“衍生物”為與其親代分子具有序列相似性并且具有親代分子的活 性的分子。例如，CTLA4的衍生物包括與野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少70%相似的 氨基酸序列并且識別并結(jié)合B7的可溶性CTLA4分子，例如CTLAIg或者可溶性CTLA4突變 分子L104EA29YIg。衍生物指氨基酸序列和/或氨基酸的化學(xué)質(zhì)量的任何改變，例如氨基酸 類似物。本文中所用的，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答指激活、刺激、上調(diào)、抑制、阻斷、減小、減弱、下調(diào)或 者修飾免疫應(yīng)答。多種疾病，例如，自身免疫疾病，可以通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，例如，通過調(diào)節(jié) 功能CTLA4-和/或CD28-陽性細(xì)胞與B7陽性細(xì)胞的相互作用得到治療。例如，調(diào)節(jié)免疫 應(yīng)答的方法包括將B7陽性細(xì)胞與可溶CTLA4分子，如根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的那些分子接觸，以 形成可溶性CTLA4/B7復(fù)合體，其中可溶性CTLA4分子干擾內(nèi)源CTLA4和/或⑶28分子與 B7分子的反應(yīng)。“阻斷”或“抑制”如本文中所稱作的受體、信號或分子指干擾受體、信號或 分子的活化，這可通過本領(lǐng)域中公知的試驗檢測。阻斷或者抑制可以是部分或全部的。本文中所用的，“阻斷B7相互作用”指干擾B7與其配體，如⑶28和/或CTLA4的結(jié)合，從而阻礙T細(xì)胞和B7陽性細(xì)胞相互作用。阻斷B7相互作用的試劑的實(shí)例包括，但不 限于，分子，如識別并結(jié)合CTLA4、⑶28或B7分子(例如，B7_1、B7_2)任一種的抗體(或者 其部分)；分子的可溶形式(或者其部分)，如可溶CTLA4 ；經(jīng)設(shè)計通過CTLA4/⑶28/B7介導(dǎo) 的相互作用干擾細(xì)胞信號的肽片段或者其他小分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，阻斷劑為可溶性 CTLA4 分子，如 CTLA4Ig(ATCC 68629)或 L104EA2OTIg (ATCC PTA-2104)；可溶性 CD28 分子， 如CD28Ig(ATCC68628)；可溶性B7分子，如B7_Ig (ATCC 68627)；抗_B7單克隆抗體(例如， ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCC CRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341 和如美國專 利號 6，113，898 或者 Yokochi 等人，1982，J. Immunol. ,128(2) :823_827 中描述的單克隆抗 體)；抗-CTLA4單克隆抗體(例如，ATCC HB-304，和如在參考文獻(xiàn)82-83中描述的單克隆 抗體)；和/或抗-CD28單克隆抗體(例如，ATCC HBl 1944和MAb 9. 3，如在Hansen等人， 1980，Immunogenetics，10 :247-260，或 Martin 等人，1984，J.Clin· Immunol. ,4(1) 18-22 中描述的)。通過本領(lǐng)域中公知的試驗，如確定與免疫疾病(例如，風(fēng)濕性疾病)相關(guān)的癥 狀的減輕，通過確定T細(xì)胞/B7細(xì)胞相互作用的減小，或者通過確定B7與CTLA4/CD28的相 互作用的減小可以檢測阻斷B7相互作用。阻斷可以是部分或全部的。還如本文中所用的，分子的有效量指阻斷該分子與其配體相互作用的量。例如，阻 斷B7與CTLA4和/或⑶28相互作用的分子的有效量為當(dāng)結(jié)合B7-陽性細(xì)胞上B7分子時， 抑制B7分子結(jié)合內(nèi)源配體，如CTLA4和CD28的分子的有效量。備選地，阻斷B7與CTLA4和 /或CD28相互作用的分子的有效量為當(dāng)結(jié)合T細(xì)胞上CTLA4和/或CD28分子時，抑制B7 分子結(jié)合內(nèi)源配體，如CTLA4和CD28的分子的有效量。抑制或阻斷可以是部分或全部的。對于臨床方案，優(yōu)選融合蛋白，如CTLA4Ig或突變CTLA4Ig的Ig部分不在受試 者中引起有害免疫應(yīng)答。優(yōu)選的部分是Ig恒定區(qū)域(包括人或者非人靈長類Ig恒定 區(qū))的所有或部分。適宜的區(qū)域的實(shí)例包括IgCY l(IgCgammal)、IgCY2(IgCgamma2)、 IgC γ 3(IgCgamma3)、IgC γ 4(IgCgamma4)、IgC μ (IgCmu)、IgC α 1 (IgCalphal)、 IgCa 2(IgCalpha2)、IgC δ (IgCdelta)或 IgC ε (IgC印si Ion)，包括鉸鏈、CH2 和 CH3 結(jié)構(gòu) 域、或者CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，它們與效應(yīng)物功能，如結(jié)合Fc受體、依賴補(bǔ)體的細(xì)胞 毒性(CDC)，或者依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)有關(guān)。Ig部分中可以有一個或多 個突變(例如，在CH2結(jié)構(gòu)域中以減小效應(yīng)物功能，如CDC或ADCC)，其中所述突變通過增加 或減小Ig結(jié)合Fc受體的能力調(diào)節(jié)Ig結(jié)合其受體的能力。例如，Ig部分中的突變可以包括 鉸鏈結(jié)構(gòu)域內(nèi)任何或所有其半胱氨酸殘基中的改變。例如，如圖8中所示，在+130、+136、 和+139位中的半胱氨酸殘基用絲氨酸置換。Ig部分還包括+148位脯氨酸用絲氨酸置換， 如圖8中所示。此外，Ig部分中的突變可以包括+144位亮氨酸用苯丙氨酸置換；+145位亮 氨酸用谷氨酸置換，或者+147位甘氨酸用丙氨酸置換。實(shí)施例下面的實(shí)施例陳述本發(fā)明的具體方面以闡明本發(fā)明并為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供本 發(fā)明方法的描述。不應(yīng)將這些實(shí)施例理解為限制本發(fā)明，因為這些實(shí)施例僅提供具體方法 學(xué)和例證，它們用于理解和實(shí)施本發(fā)明及其多個方面。
下面陳述的實(shí)施例1-4描述了涉及培養(yǎng)運(yùn)行期間溫度轉(zhuǎn)換的細(xì)胞培養(yǎng)方法的實(shí) 驗。實(shí)施例6-11描述涉及包括向培養(yǎng)物中延遲加入聚陰離子化合物的細(xì)胞培養(yǎng)方法的實(shí)驗。
實(shí)施例1該實(shí)施例提供了用于本發(fā)明的方法中的材料和試劑，所述方法用于培養(yǎng)產(chǎn)生如本 文實(shí)施例2-4中描述的代表性CTLA4Ig融合蛋白的重組細(xì)胞。1.細(xì)胞培養(yǎng)基用于細(xì)胞接種物生產(chǎn)所有期和用于培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器(包括5升(5L)和50升 (50L)生產(chǎn)反應(yīng)器)中生長的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為改良CD-CHO培養(yǎng)基，其含有谷氨酰胺、碳酸 氫鈉、胰島素和氨甲蝶呤(Invitrogen，Carlsbad，CA)，如表1中例證。用IN HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng) 基的PH到7.0。表 1 對于補(bǔ)料-分批方法中喂飼細(xì)胞，使用改良送料培養(yǎng)基，即，eRDF-Ι培養(yǎng)基 (Invitrogen)，其含有葡萄糖、谷氨酰胺、胰島素和 TCYeastolate (Becton-Dickinson， Franklin Lakes，NJ)，如表2中所示。加入所有組分后用IN NaOH調(diào)節(jié)送料培養(yǎng)基的pH到 7. 0。彪
2.生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)期生產(chǎn)生物反應(yīng)器最初以分批反應(yīng)器運(yùn)行，密切監(jiān)視并控制溫度、壓力、pH和溶解氧 濃度。通過測量活細(xì)胞密度和幾種關(guān)鍵代謝物的濃度評估培養(yǎng)物狀況。接種后一天啟動送 料方法。剩下的發(fā)酵以補(bǔ)料-分批方式進(jìn)行。使用5L規(guī)模生物反應(yīng)器(具有一個海洋攪拌器的玻璃反應(yīng)器)和50L規(guī)模生物反 應(yīng)器(具有兩個海洋攪拌器的不銹鋼反應(yīng)器)(見實(shí)施例4)。數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)(Intellution Fix 32)在整個運(yùn)行期間記錄溫度、pH和溶解氧(D0)。通過轉(zhuǎn)子流速計控制氣流。氣體通 過沉水frit (5 μ m孔大小)噴入反應(yīng)器，反應(yīng)器頭部空間用于CO2去除。分子氧通過相同 的frit噴射用于DO控制。CO2通過相同frit噴射用于pH控制。3.喂飼策略接種后24小時，如果葡萄糖濃度》3. Og/L，加入最小1 %培養(yǎng)物體積的改良 eRDF-I送料培養(yǎng)基。如果葡萄糖濃度低于3g/L，每天加入經(jīng)計算的大丸送料體積使葡萄糖 濃度回到3g/L。在分批表格上記錄每天送料量。4.取樣每天從反應(yīng)器取出細(xì)胞樣品。將用于細(xì)胞計數(shù)的樣品用錐蟲藍(lán)(Sigma，St. Louis, MO)染色。通過血細(xì)胞計數(shù)法使用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞生存力測量。為了分析代謝 物，將額外的樣品以2000轉(zhuǎn)/分鐘(4°C )離心20分鐘以分離細(xì)胞。用上清液分析下面的 參數(shù)滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、PH、p02, pC02、銨，和任選地，乳酸脫 氫酶(LDH)。額外的備份樣品在-20°C冷凍。實(shí)施例2該實(shí)施例描述從經(jīng)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞生產(chǎn)CTLA4Ig，其如圖3中_1到357或+1到 357所示(編碼DNA保藏為ATCC 68629)。
該實(shí)施例還描述產(chǎn)生高質(zhì)量和高數(shù)量的CTLA4Ig蛋白質(zhì)的本發(fā)明方法，該方法包 括具有兩步或三步溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)運(yùn)行和14、21或28-30天的總運(yùn)行時間。從37°C到34°C 的溫度轉(zhuǎn)換(T-轉(zhuǎn)換)發(fā)生在第6天(對數(shù)生長期末)，從34°C到32°C的第二次T-轉(zhuǎn)換 發(fā)生在第10天。該運(yùn)行在第14、21、或28天結(jié)束，對于兩步轉(zhuǎn)換，溫度控制在第10天轉(zhuǎn)換 時的32°C直到運(yùn)行結(jié)束。對于三步轉(zhuǎn)換，溫度從轉(zhuǎn)換那天控制在30°C直到運(yùn)行結(jié)束。與一 次溫度轉(zhuǎn)換或者無溫度轉(zhuǎn)換的運(yùn)行相比，所描述的方法導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物的增加的終末滴定 度，增加的終末細(xì)胞生存力，和容積生產(chǎn)力。根據(jù)本發(fā)明，第二次和第三次T轉(zhuǎn)換將標(biāo)準(zhǔn)發(fā) 酵(培養(yǎng))方法的運(yùn)行時間延長到2到3周(或更長)，而保持高細(xì)胞生存力。在整個生產(chǎn) 期間觀察到產(chǎn)物滴定度接近線性增加。用于CTLA4Ig表達(dá)的CHO細(xì)胞在含有谷氨酰胺、碳酸氫鈉、胰島素，和氨甲蝶呤的 改良⑶-CHO培養(yǎng)基中擴(kuò)大(見實(shí)施例1)，使用T-75燒瓶(Corning，Corning, NY)和250和 500mL旋轉(zhuǎn)器(Bellco，Vineland，NJ)。T-燒瓶和旋轉(zhuǎn)器在37°C 6% CO2中孵育。產(chǎn)生足夠 接種物后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到5L (Applikon，F(xiàn)oster City, CA)或50L生物反應(yīng)器(Feldmeier， Syracuse, NY)，它們分別含有上述培養(yǎng)基的3L或30L工作體積。最初接種密度為約2 X IO5 個活細(xì)胞/mL。 5L容器為裝備一個海洋攪拌器(Applikon，F(xiàn)oster City, CA)的玻璃反應(yīng)器；50L 反應(yīng)器為裝備兩個海洋攪拌器的不銹鋼反應(yīng)器(Feldmeier，SyracUse，NY)。整個運(yùn)行期間 用數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)，其使用Intellution Fix32 (Intellution, Foxboro, ΜΑ)記錄溫度、ρΗ和 溶解氧(D0)。通過轉(zhuǎn)子流速計(Cole Parmer, Vernon Hills, IL)控制氣流。氣體通過沉 水frit(5ym孔大小)噴入反應(yīng)器，反應(yīng)器頭部空間用于CO2去除。分子氧通過相同的fr it噴射用于DO控制。CO2通過相同frit噴射用于高壓側(cè)ρΗ控制。低壓側(cè)ρΗ控制通過 加入IN NaOH實(shí)現(xiàn)。不受限制，ρΗ的可接受范圍為6-9，優(yōu)選6. 8-7. 2，摩爾滲透壓濃度為 200-500m0sm，優(yōu)選 280_340m0sm。使用如實(shí)施例1，表2中描述的改良eRDF培養(yǎng)基(Invitrogen，CA)如下對生物 反應(yīng)器中的培養(yǎng)物給予每天大丸喂飼從接種后第一天開始，加入最小培養(yǎng)物體積作 為送料培養(yǎng)基；或者如果葡萄糖水平降到3g/L以下，加入經(jīng)計算的體積使葡萄糖水平回到 3g/L。發(fā)酵過程在5L規(guī)模時持續(xù)時間為21天，在50L規(guī)模時為28天。在50L規(guī)模下培 養(yǎng)運(yùn)行的更長持續(xù)時間與該運(yùn)行所加的溫度轉(zhuǎn)換相關(guān)。每天從反應(yīng)器采集樣品用于分析。 例如，用于細(xì)胞計數(shù)的樣品用錐蟲藍(lán)(Sigma，St. Louis，M0)染色。通過血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行 細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞生存力測定，并在顯微鏡下計數(shù)活的染色細(xì)胞。為了分析代謝物，將額外的 樣品等分試樣以2000轉(zhuǎn)/分鐘(4°C )離心20分鐘以沉淀細(xì)胞。使用本領(lǐng)域中慣用的技 術(shù)和方案，用上清液分析蛋白質(zhì)滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、ΡΗ、p02、 PCO2、氨，和 LDH。實(shí)施例3該實(shí)施例描述并給出評估按照本發(fā)明的方法實(shí)施的多種培養(yǎng)方法(包括多步培 養(yǎng)方法)的比較性評價。(g/L)，如蛋白質(zhì)的終末滴定唾液酸含量一樣測定確定糖蛋白產(chǎn)物 的終末滴定度、運(yùn)行結(jié)束時細(xì)胞生存力(終末細(xì)胞生存力)和運(yùn)行結(jié)束時細(xì)胞密度(存活 終末細(xì)胞密度)。
實(shí)驗I-A、I-B 禾Π I-C ;II-A，II-B 和 II-C ；和 III-A，III-B 和 III-C 指在不同時 間評估的具有相同溫度轉(zhuǎn)換的相同細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)行，即對于I-A，II-A和III-A，在第14天后 評估產(chǎn)物和細(xì)胞參數(shù)，對于II-A，II-B和II-C在21天后評估，對于ΙΙΙ-Α，III-B和III-C 在28天后評估。這些實(shí)驗在5L反應(yīng)器中進(jìn)行，其中如下控制培養(yǎng)條件ρΗ為7. 0 ；溶解氧 為40%;攪拌為60轉(zhuǎn)/分鐘；最初溫度為37°C。根據(jù)本發(fā)明的方法從補(bǔ)料_分批細(xì)胞培養(yǎng) 發(fā)酵得到數(shù)據(jù)。
如下設(shè)計實(shí)驗I、II和III 實(shí)驗I 從第0天到第21天,細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在37°C (無溫度轉(zhuǎn)換)。實(shí)驗II 從第0天到第6天，細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在37°C ；從第6天到第21天細(xì)胞 培養(yǎng)溫度控制在34°C ( 一次溫度轉(zhuǎn)換)。實(shí)驗III 從第0天到第6天，細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在37°C;從第6天到第10天細(xì)胞 培養(yǎng)溫度控制在34°C;從第10天到第21天細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在32°C (本發(fā)明的兩步溫度 轉(zhuǎn)換方法)。實(shí)驗IV-A和V-A顯示使用最初(標(biāo)準(zhǔn))生產(chǎn)期，14天的培養(yǎng)運(yùn)行后評估的產(chǎn)物 滴定度、終末細(xì)胞生存力和存活終末細(xì)胞密度的結(jié)果。實(shí)驗IV-B和V-B顯示了使用延長的 生產(chǎn)期，21天的培養(yǎng)運(yùn)行后評估的這些結(jié)果；實(shí)驗IV-C和V-C顯示使用第二次延長的生產(chǎn) 期，28天的培養(yǎng)運(yùn)行后評估的結(jié)果。實(shí)驗IV和V在50L生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其中如下控制 培養(yǎng)條件PH為7. 0 ；溶解氧為40% ；攪拌為30轉(zhuǎn)/分鐘；最初溫度為37°C。如下設(shè)計實(shí)驗IV和V:實(shí)驗IV 從第0天到第6天，細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在37°C ；從第6天到第10天細(xì)胞 培養(yǎng)溫度控制在34°C;從第10天到第28天細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在32°C (本發(fā)明的兩步溫度 轉(zhuǎn)換方法)。實(shí)驗V 從第0天到第6天，細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在37°C ；從第6天到第10天細(xì)胞培 養(yǎng)溫度控制在34°C ；從第10天到第14天細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在32°C ；從第14天到第28天 細(xì)胞培養(yǎng)溫度控制在30°C (本發(fā)明的三步溫度轉(zhuǎn)換方法)。實(shí)驗V-A、V-B和V-C指在不同 時間評估的具有相同溫度轉(zhuǎn)換的相同細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)行，即，對于V-A，在第14天后評估產(chǎn)物和 細(xì)胞參數(shù)，對于V-B在21天后評估，對于V-C在28天后評估。實(shí)驗I-V代表如上描述的5種不同的培養(yǎng)運(yùn)行。如所描述的，將14天的運(yùn)行稱作 “A”，將21天的運(yùn)行稱作“B”，而將28天的運(yùn)行稱作“C”。表3給出了實(shí)驗結(jié)果，表明在5L反應(yīng)器規(guī)模下不同溫度轉(zhuǎn)換對培養(yǎng)物中細(xì)胞生產(chǎn) CTLA4Ig的影響。表3 使用最初(標(biāo)準(zhǔn))生產(chǎn)期，14天的運(yùn)行后評估產(chǎn)物滴定度、終末細(xì)胞生存力和存活 * :“NANA” (N-氨基_N_神經(jīng)氨酸)指唾液酸(SA)?！敖K末NANA”指培養(yǎng)結(jié)束時產(chǎn) 物的NANA。表4給出了實(shí)驗結(jié)果，表明在50L反應(yīng)器規(guī)模下不同溫度轉(zhuǎn)換對培養(yǎng)物中細(xì)胞生產(chǎn)CTLA4Ig的影響。表 4
實(shí)驗# 反應(yīng)器規(guī)模 溫度轉(zhuǎn)換終末滴定度 終末細(xì)胞生存力 存活終末細(xì)胞密度 使用最初(標(biāo)準(zhǔn))生產(chǎn)期，14天的運(yùn)行后評估產(chǎn)物滴定度、終末細(xì)胞生存力和存活
終末細(xì)胞密度
三步T轉(zhuǎn)換使用延長生產(chǎn)期，21天的運(yùn)行后評估產(chǎn)物滴定度、終末細(xì)胞生存力和存活終末細(xì)
胞密度
三步T轉(zhuǎn)換使用延長生產(chǎn)期，28天的運(yùn)行后評估產(chǎn)物滴定度、終末細(xì)胞生存力和存活終末細(xì)
胞密度 如已經(jīng)通過該實(shí)施例中實(shí)驗闡明的，發(fā)現(xiàn)多步溫度轉(zhuǎn)換在整個培養(yǎng)過程中保持高 細(xì)胞生存力。具體地，在表3中，實(shí)驗III-B表明使用定時兩步溫度轉(zhuǎn)化圖在整個21天培 養(yǎng)過程(包括延長的生產(chǎn)期)中保持高細(xì)胞生存力(也見圖1)，允許6. 5 [摩爾比]的高唾 液酸含量下滴定度達(dá)到3. 5g/L。高的“終末效價X終末唾液酸”的算術(shù)乘積值也可以證明 兩步培養(yǎng)方法的成功。相比，不包括溫度轉(zhuǎn)換(表3，實(shí)驗I-B)的培養(yǎng)方法導(dǎo)致細(xì)胞生存力提早下降。此 夕卜，發(fā)現(xiàn)與根據(jù)本發(fā)明的兩步溫度轉(zhuǎn)換和方法相比，使用一步溫度轉(zhuǎn)換(表3，實(shí)驗II-B)產(chǎn) 生較低的終末滴定度、終末唾液酸和“終末滴定度X終末唾液酸”算術(shù)乘積。此外，在表4中給出的包括50L反應(yīng)器規(guī)模下進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果表明了本發(fā) 明的多步溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。第三次溫度轉(zhuǎn)換到30°C定時在第14天發(fā)生。具體地， 三次溫度轉(zhuǎn)換對細(xì)胞生存力和使用三次轉(zhuǎn)換的終末滴定度(表4，實(shí)驗V-C，和圖2)的益處 可以從與兩次溫度轉(zhuǎn)換的比較中看到。根據(jù)本發(fā)明方法，三次溫度轉(zhuǎn)換還相對于無轉(zhuǎn)換或 一次轉(zhuǎn)換的方法延長了細(xì)胞生存力并從而延長了蛋白質(zhì)生產(chǎn)。由于細(xì)胞培養(yǎng)中常見的放大 試驗效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)50L反應(yīng)器規(guī)模下滴定度產(chǎn)生比5L規(guī)模下的低一些。然而，容易理解這種 效應(yīng)不會有損于如通過本發(fā)明提供的兩次或多次溫度轉(zhuǎn)換培養(yǎng)運(yùn)行的優(yōu)點(diǎn)。如通過實(shí)施例3中給出的結(jié)果所證明的，對于其中在第6天，即對數(shù)生長期結(jié)束時 進(jìn)行的溫度轉(zhuǎn)換運(yùn)行，與沒有溫度轉(zhuǎn)換的對照運(yùn)行相比，在終末滴定度和細(xì)胞生存力方面 得到好得多的結(jié)果。如從所述結(jié)果觀察到的，通過使用一次溫度轉(zhuǎn)換，容積生產(chǎn)力增加了 2 倍。在第10天進(jìn)行的第二次溫度轉(zhuǎn)換產(chǎn)生了更高的細(xì)胞生存力并進(jìn)一步增加了容積生產(chǎn) 力(與沒有T轉(zhuǎn)換的運(yùn)行相比約3倍)，而保持高產(chǎn)物質(zhì)量，如通過糖蛋白產(chǎn)物的唾液酸含 量確定的。實(shí)施例4該實(shí)施例給出的數(shù)據(jù)表明包括根據(jù)本發(fā)明的兩次向下溫度轉(zhuǎn)換的細(xì)胞培養(yǎng)方法 對每個細(xì)胞每單位時間產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，例如，該實(shí)施例中的CTLA4Ig的量沒有統(tǒng)計學(xué)顯著 影響。根據(jù)本發(fā)明的新近給出的細(xì)胞培養(yǎng)(發(fā)酵)方法，該方法中蛋白質(zhì)的總產(chǎn)量是直到 該方法結(jié)束時存活的更多活細(xì)胞的結(jié)果。因為對于延長的生產(chǎn)時間更多細(xì)胞存活，更多的 活細(xì)胞在產(chǎn)生在該方法結(jié)束時所希望的蛋白質(zhì)。這又在該方法或者培養(yǎng)運(yùn)行結(jié)束時產(chǎn)生更 大量的所希望的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
表5闡明本發(fā)明所包括的方法中多種時間處細(xì)胞特定生產(chǎn)率。通過如上文給出的 公式確定細(xì)胞特定生產(chǎn)率。從而為產(chǎn)生CTLA4Ig、其他可溶性CTLA4分子，和可溶性CTLA4 突變分子設(shè)計的培養(yǎng)方法是非生長相關(guān)的方法，其中蛋白質(zhì)生產(chǎn)在第6天或約第6天開始， 即，約在穩(wěn)定期開始時，在指數(shù)細(xì)胞生長之后。表5中給出的數(shù)據(jù)涉及實(shí)施例3中進(jìn)行的實(shí)驗。表 5 使用細(xì)胞密度和滴定度測量計算表5中細(xì)胞特定生產(chǎn)率，如上文所述。本領(lǐng)域中 技術(shù)人員將明白，細(xì)胞密度測量通常具有約10-20%標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即高SD，并且是不精確 的。因此，細(xì)胞特定生產(chǎn)率的測定具有相應(yīng)10-20%標(biāo)準(zhǔn)差。從而，考慮到與這些類型技術(shù) 有關(guān)的高SD，不同運(yùn)行時間每個細(xì)胞每天產(chǎn)生的產(chǎn)物的量在沒有T轉(zhuǎn)換、有一次T轉(zhuǎn)換、有 兩次T轉(zhuǎn)換的方法之間無顯著不同。通過本發(fā)明的新近提供的細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生的高質(zhì)量 蛋白質(zhì)產(chǎn)物的高水平和蛋白質(zhì)產(chǎn)量的總體增加歸因于從包括多步向下溫度轉(zhuǎn)換的整個培 養(yǎng)方法幸存下來的更高數(shù)目的活細(xì)胞。實(shí)施例5實(shí)施例5A該實(shí)施例提供了用于本發(fā)明方法中的材料和試劑，該方法用于培養(yǎng)重組細(xì)胞，所 述細(xì)胞產(chǎn)生如本文實(shí)施例5B-16中描述的代表性L104EA29YIg。1.細(xì)胞培養(yǎng)基用于細(xì)胞接種物生產(chǎn)所有期的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為改良CD-CHO培養(yǎng)基，其含有谷 氨酰胺、碳酸氫鈉、胰島素和氨甲蝶呤(Invitrogen，Carlsbad, CA)，如表6中例證。用IN HCl將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到7.0。用于生物反應(yīng)器，包括5升(5L)、10升(IOL)和50升(50L) 生產(chǎn)反應(yīng)器中培養(yǎng)物生長的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基也是表6中所示改良CD-CHO培養(yǎng)基，只是不使 用氨甲蝶呤。用IN HCl將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到7.0。
對于實(shí)施例8，送料培養(yǎng)基為上述送料培養(yǎng)基，其具有一處變動eRDF的濃度為 25. 2g/L。2.生物反應(yīng)器中生產(chǎn)相生產(chǎn)生物反應(yīng)器最初以分批反應(yīng)器運(yùn)行，密切監(jiān)視并控制溫度、壓力、pH和溶解氧 濃度。通過測量活細(xì)胞密度和幾種關(guān)鍵代謝物的濃度評估培養(yǎng)物狀況。接種后一天啟動送 料方法。剩下的發(fā)酵以補(bǔ)料-分批方式進(jìn)行。使用5L規(guī)模生物反應(yīng)器(具有一個海洋攪拌器的玻璃反應(yīng)器)、10L規(guī)模生物反 應(yīng)器(具有兩個海洋攪拌器的玻璃反應(yīng)器)和50L規(guī)模生物反應(yīng)器(具有兩個海洋攪拌器 的不銹鋼反應(yīng)器)(見實(shí)施例2)。數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)(Intellution Fix 32)在整個運(yùn)行期間記 錄溫度、PH和溶解氧(DO)。通過轉(zhuǎn)子流速計控制氣流。氣體通過沉水frit (5 μ m孔大小) 噴入反應(yīng)器，反應(yīng)器頭部空間用于CO2去除。分子氧通過相同的frit噴射用于DO控制。CO2 通過相同frit噴射用于pH控制。3.喂飼策略接種后24小時，如果葡萄糖濃度> 3. Og/L，加入最小培養(yǎng)物體積的改良 eRDF-I送料培養(yǎng)基。如果葡萄糖濃度低于3g/L，每天加入經(jīng)計算的大丸送料體積使葡萄糖 濃度回到3g/L。在分批表格上記錄每天送料量。4.取樣每天從反應(yīng)器取出細(xì)胞樣品。將用于細(xì)胞計數(shù)的樣品用錐蟲藍(lán)(Sigma，St. Louis, MO)染色。通過血細(xì)胞計數(shù)法使用顯微鏡，或者通過Cedex自動細(xì)胞計數(shù)器(Irmovatis AG，Bielefeld，德國)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞生存力測量。為了分析代謝物，將額外的樣品以 2000轉(zhuǎn)/分鐘(4°C )離心20分鐘以分離細(xì)胞。用上清液分析下面的參數(shù)滴定度、唾液 酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、p02、pC02、氨，和任選地，乳酸脫氫酶(LDH)。額外的 備份樣品在-20°C冷凍。實(shí)施例5B該實(shí)施例5B描述從經(jīng)培養(yǎng)的CHO細(xì)胞生產(chǎn)L104EA29YIg，其如圖4中_1到357或 +1到357所示(編碼DNA保藏為ATCC PTA-2104)。該實(shí)施例5B還描述本發(fā)明的一種方法，其包括向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物，更具體地，硫酸葡聚糖。用于L104EA29YIg表達(dá)的CHO細(xì)胞在含有谷氨酰胺、碳酸氫鈉、胰島素，和氨甲蝶呤的改良⑶-CHO培養(yǎng)基(Invitrogen，CA)中擴(kuò)大，使用T-75燒瓶和搖瓶。T-燒瓶和搖瓶 在37°C 6% CO2中孵育。產(chǎn)生足夠接種物后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到5L或IOL生物反應(yīng)器，使用如 上描述的經(jīng)改良的CD-CHO培養(yǎng)基。最初接種密度為200，000個活細(xì)胞/mL或IO6個細(xì)胞/
mLo5L和IOL容器為分別裝備一個和兩個海洋攪拌器(Applikon，CA)的玻璃反應(yīng)器。 通過轉(zhuǎn)子流速計控制氣流。氣體通過沉水frit (5 μ m孔大小)噴入反應(yīng)器，反應(yīng)器頭部空 間用于CO2去除。分子氧通過相同的frit噴射用于DO控制。CO2通過相同frit噴射用于 高壓側(cè)PH控制。低壓側(cè)pH控制通過加入IN NaOH或Na2CO3實(shí)現(xiàn)。使用含有葡萄糖、谷氨酰胺、胰島素和TCYeastolate (BectonDickinson)的改良 eRDF培養(yǎng)基(Invitrogen，CA)如下對生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物給予每天大丸喂飼從接種后 第一天開始，加入最小培養(yǎng)物體積；或者如果葡萄糖水平降到3g/L以下，加入經(jīng)計算的 體積使葡萄糖水平回到3g/L。在除了實(shí)施例11的所有實(shí)施例中，溫度控制在從第0到第6天37°C，從第6天到 第10天34°C，第10天開始32°C。發(fā)酵過程通常的持續(xù)時間為14-19天。每天從反應(yīng)器采集樣品。用于細(xì)胞計數(shù)的 樣品用錐蟲藍(lán)(Sigma, St. Louis, MO)染色。使用Cedex自動細(xì)胞計數(shù)器(Innovatis AG, Bielefeld，德國)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞生存力測定。用上清液分析LEA29Y滴定度、葡萄糖、 乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、p02、pC02、氨。將硫酸葡聚糖(鈉鹽，來自平均分子量5000Da的葡聚糖，Sigma, M0)溶于水中或 培養(yǎng)基中。將溶液無菌過濾并加入反應(yīng)器中至50mg/L的濃度。所加入的體積組成了加入 時反應(yīng)器的工作體積的至多2%。實(shí)施例6該實(shí)施例描述并給出了接種后某一時刻加入聚陰離子化合物，更具體地，硫酸葡 聚糖的比較研究結(jié)果。5L和10L生物反應(yīng)器接種0. 2 X IO6個細(xì)胞/mL產(chǎn)生L104EA29Y的細(xì)胞。如下設(shè)計實(shí)施例6_a和6_b 實(shí)施例6-a 培養(yǎng)物中不加入硫酸葡聚糖(“對照”培養(yǎng)物4個5L生物反應(yīng)器中 培養(yǎng)，4個10L生物反應(yīng)器中培養(yǎng))。實(shí)施例6-b 在第6天向培養(yǎng)物加入50mg/L濃度的硫酸葡聚糖(“DS天6培養(yǎng)物 2個5L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，1個10L生物反應(yīng)器中培養(yǎng))。在圖6中報告實(shí)施例6-a和6_b的平均生存力、活細(xì)胞密度、和總細(xì)胞密度圖，和 它們的標(biāo)準(zhǔn)差。在對照培養(yǎng)中，在第6和7天之間觀察到活細(xì)胞密度中的平臺，相應(yīng)于穩(wěn)定期。對 于對照培養(yǎng)，在第7天后觀察到活細(xì)胞密度和生存力的下降，相應(yīng)于死亡期。當(dāng)在第6天向 培養(yǎng)物加入硫酸葡聚糖后，生長期延長到第11天?；罴?xì)胞密度達(dá)到平均5. 2 X IO6個細(xì)胞/ mL，而對照為3. 5X IO6個細(xì)胞/mL。在該延長的生長期期間生存力保持在90%以上。第11 天后，活細(xì)胞密度和總細(xì)胞密度成比例地下降，表明細(xì)胞裂解，并且結(jié)果生存力指數(shù)直到第15天都保持高于90%。圖7是活細(xì)胞密度作為加入硫酸葡聚糖的培養(yǎng)時間和對照運(yùn)行時間的函數(shù)的對 數(shù)表示。死亡率(通過圖2中活細(xì)胞密度的斜率給出)依賴于硫酸葡聚糖的存在或不存在 而不同。在硫酸葡聚糖的存在下，死亡速度在第12到第19天約為恒定，值為0. OO^r10相 比，在第8天到第12天，對照的平均死亡速度最大值為0. 00241^。從而，在第6天加入的 硫酸葡聚糖將死亡期期間細(xì)胞死亡率減慢了一半。盡管具有上述硫酸葡聚糖的有益效果，但是加入或不加入硫酸葡聚糖，產(chǎn)物 L104EA29YIg的滴定度是相似的(表8)。表8 第6天加入硫酸葡聚糖對第14天產(chǎn)物L(fēng)104EA29YIg滴定度的影響 在表9中報告了不同運(yùn)行的L104EA29YIg唾液酸化程度?？紤]相對大的運(yùn)行之間 的可變性，可以認(rèn)為L104EA29YIg唾液酸化不受在第6天加入硫酸葡聚糖的顯著影響。表9 第6天加入硫酸葡聚糖對L104EA29YIg唾液酸化的影響 實(shí)施例7該實(shí)施例顯示加入硫酸葡聚糖對死亡期中細(xì)胞培養(yǎng)物的影響。
以IO6個細(xì)胞/mL向5L生物反應(yīng)器接種產(chǎn)生L104EA29YIg的細(xì)胞，死亡期在第5 天開始。在第6天加入硫酸葡聚糖。在圖8中給出生存力、活細(xì)胞密度、和總細(xì)胞密度圖。在第6天向這種培養(yǎng)物中加 入硫酸葡聚糖可以防止活細(xì)胞密度顯著下降長達(dá)第17天。從而，當(dāng)在死亡期期間加入硫酸 葡聚糖時，可以抑制細(xì)胞死亡數(shù)天。在該運(yùn)行中，在第14天得到1. 9g/L滴定度，NANA摩爾定量為6. 6。實(shí)施例8 該實(shí)施例顯示了向處于死亡期的細(xì)胞培養(yǎng)物加入硫酸葡聚糖的影響。以0. 2X IO6個細(xì)胞/mL向IOL生物反應(yīng)器接種產(chǎn)生L104EA29YIg的細(xì)胞。在該 特定實(shí)例中，每天補(bǔ)料為更濃的制劑，結(jié)果死亡期的出現(xiàn)延長到第10天(圖9)。在第14天 之前未加入硫酸葡聚糖。在圖9中給出生存力、活細(xì)胞密度、和總細(xì)胞密度圖。在第14天加入硫酸葡聚糖 允許活細(xì)胞密度穩(wěn)定4天，之后培養(yǎng)停止。該實(shí)施例又闡明了當(dāng)向培養(yǎng)物加入硫酸葡聚糖時對死亡期期間細(xì)胞死亡的抑制。實(shí)施例9該實(shí)施例顯示了在第0天加入硫酸葡聚糖的效果。通過比較該實(shí)驗中看到的效果 與硫酸葡聚糖的加入延遲的其他實(shí)驗中看到的效果可以看到延遲加入硫酸葡聚糖的效果。以0. 2 X IO6個細(xì)胞/mL向兩個重復(fù)的5L生物反應(yīng)器接種產(chǎn)生L104EA29YIg的細(xì) 胞，在接種當(dāng)天(第0天)加入濃度為50mg/L的硫酸葡聚糖。在圖10中給出生存力、活細(xì)胞密度、和總細(xì)胞密度圖。兩個培養(yǎng)物都沒有實(shí)現(xiàn)比 沒有硫酸葡聚糖的培養(yǎng)物更高的細(xì)胞密度(比較圖6和10)。細(xì)胞在第7或8天進(jìn)入死亡 期，而當(dāng)在第6天加入硫酸葡聚糖時，細(xì)胞在第11天進(jìn)入死亡期(比較圖6和10)。此時在 這些運(yùn)行的第14天所得L104EA29YIg滴定度為0. 57g/L(運(yùn)行#1)和0. 86g/L(運(yùn)行#2)， 它們顯著小于對照方法或者第6天加入硫酸葡聚糖(見實(shí)施例6)的方法中的滴定度。這些結(jié)果表明硫酸葡聚糖的加入的時間選擇對于加入結(jié)果的重要性。不被理論束縛，我們認(rèn)為硫酸葡聚糖的加入的所觀察到的效果和它們對加入的時 間選擇的依賴性可以通過硫酸葡聚糖對多種自分泌因子的結(jié)合來解釋，所述結(jié)合類似于多 硫酸戊聚糖對肝素結(jié)合生長因子的結(jié)合(Zugmaier等人，1992)。我們認(rèn)為硫酸葡聚糖結(jié)合 到這些因子的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其變得不能被細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖利用。結(jié)果， 硫酸葡聚糖_結(jié)合因子不能在細(xì)胞表面濃縮，這極大地降低了它們結(jié)合它們的受體的可能 性。凈效果為這些因子不再發(fā)揮它們在細(xì)胞上的正常作用。在接種后的前幾天里，細(xì)胞產(chǎn) 生某些生長因子，它們的功能是信號細(xì)胞生長。在第0天加入的硫酸葡聚糖不可逆地結(jié)合 所產(chǎn)生的那些因子。然而硫酸葡聚糖與這些因子的結(jié)合不以不利地方式顯著影響細(xì)胞生 長，可能是因為細(xì)胞能夠通過增加生長因子產(chǎn)生應(yīng)答。后來，在生長期，生長因子的產(chǎn)生停 止，并且細(xì)胞開始產(chǎn)生不同類型的自分泌因子，它們在高濃度的效果是示意(signal)生長 期結(jié)束和死亡期來臨。這些因子從第0天的低濃度積累到后來的高濃度。那時，這些因子 有效示意細(xì)胞停止生長并進(jìn)入穩(wěn)定期和死亡期。我們提出硫酸葡聚糖優(yōu)先結(jié)合這些死亡示 意因子，從而使它們的信號功能失效，并允許延長生長期。通過這些因子的持續(xù)誘導(dǎo)似乎是 細(xì)胞死亡進(jìn)行所需的，結(jié)果當(dāng)死亡信號因子被硫酸葡聚糖失效時，進(jìn)入死亡期的細(xì)胞可以重新調(diào)節(jié)進(jìn)入穩(wěn)定期(實(shí)施例7和8)，甚至晚至培養(yǎng)中的第14天。相反地，在第O天加入 的已經(jīng)結(jié)合到生長因子的硫酸葡聚糖在生長期結(jié)束時仍然結(jié)合這些因子，使得不能用于結(jié) 合死亡信號分子。從而，對于在第O天加入硫酸葡聚糖的情況(實(shí)施例9)，不發(fā)生生長期延 長和細(xì)胞死亡期延遲，同樣，在生長期結(jié)束時加入硫酸葡聚糖發(fā)生生長期延長和細(xì)胞死亡 期延遲。假定在實(shí)施例6中在第6天補(bǔ)加硫酸葡聚糖導(dǎo)致培養(yǎng)物中細(xì)胞生長抑制和第11 天細(xì)胞死亡發(fā)生是由不同于硫酸葡聚糖-結(jié)合的自分泌因子的誘導(dǎo)的機(jī)理導(dǎo)致?？赡埽?1 天生長后培養(yǎng)基中特定營養(yǎng)物的耗竭是造成這些培養(yǎng)物中生長期結(jié)束的原因。實(shí)施例10 該實(shí)施例比較最初生長期期間三個不同時間加入硫酸葡聚糖的效果。以IO6個細(xì)胞/mL向5L生物反應(yīng)器接種產(chǎn)生L104EA29YIg的細(xì)胞的培養(yǎng)物。在 不同時間向培養(yǎng)物加入濃度為50mg/L的硫酸葡聚糖。在一個培養(yǎng)物中，在第3天加入硫酸 葡聚糖，另一個在第4天，第三個在第5天。在圖11中報告生存力和活細(xì)胞密度圖。在所有三種加入情況(第3、4或5天) 中都實(shí)現(xiàn)了高活細(xì)胞密度(> IO7個細(xì)胞/mL)，但是較早加入(第3或4天)不能防止生 長期后活細(xì)胞密度的立即下降。相反，第5天加入使活細(xì)胞密度在生長期后穩(wěn)定4天。在 250h后的時間點(diǎn)，第5天硫酸葡聚糖的加入中活細(xì)胞密度總是高于或等于(測量誤差內(nèi)) 第4天硫酸葡聚糖加入培養(yǎng)物中的，第4天硫酸葡聚糖的加入中活細(xì)胞密度總是高于或等 于(測量誤差內(nèi))第3天硫酸葡聚糖加入培養(yǎng)物中的。從而，從該實(shí)例似乎硫酸葡聚糖加 入的最佳時間是在最初生長期(指缺少任何硫酸葡聚糖加入時觀察到的生長期)結(jié)束時。 較早加入可以延長生長期，但是將在硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的延長的生長期后穩(wěn)定活細(xì)胞密度不 那么有效，而較晚(死亡期期間)加入將穩(wěn)定活細(xì)胞密度但是不能提供活細(xì)胞密度的充分 增加(見實(shí)施例7和8)。因此，在第14天，用第5天硫酸葡聚糖加入得到2. 7g/L的滴定 度，而用第3天或第4天硫酸葡聚糖加入得到2. 6g/L的第14天滴定度，用第6天硫酸葡聚 糖加入得到1. 9g/L的第14天滴定度(實(shí)施例7中)。在上面提到的運(yùn)行中NANA摩爾比分 別為6. 3,6. 6,6. 0和6. 6，表明用硫酸葡聚糖加入的最佳時間選擇得到的更高的滴定度伴 隨著一致的唾液酸化水平。實(shí)施例11該實(shí)施例顯示了產(chǎn)生L104EA29YIg的培養(yǎng)中一次和兩次溫度轉(zhuǎn)換的效果。還將培 養(yǎng)物進(jìn)行延遲加入硫酸葡聚糖。以200，000個細(xì)胞/mL接種5L反應(yīng)器。應(yīng)用兩次、一次或無T轉(zhuǎn)換。對于一次溫度轉(zhuǎn)換，在第6天溫度從37°C轉(zhuǎn)換到 34°C。對于兩次溫度轉(zhuǎn)換，溫度在第6天從37°C轉(zhuǎn)換到34°C，并且在第10天從34°C轉(zhuǎn)換到 32°C。在所有情況中，在第6天加入硫酸葡聚糖。兩次溫度轉(zhuǎn)換情況是三次運(yùn)行的平均值， 標(biāo)準(zhǔn)差以條線顯示。分別在圖12、13和14中報告活細(xì)胞密度、生存力和滴定度。結(jié)果表明應(yīng)用至少一次溫度轉(zhuǎn)化的益處。對于整個運(yùn)行期間溫度保持在37°C的情 況，培養(yǎng)物在第10天進(jìn)入死亡期，并且活細(xì)胞密度和生存力的降低迅速。結(jié)果，培養(yǎng)12天 后L104EA29YIg容積生產(chǎn)力明顯下降。對于14天和更長的培養(yǎng)時間，明顯具有一次或兩次溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)物關(guān)于滴定度優(yōu)于恒定溫度培養(yǎng)。對于僅進(jìn)行一次溫度轉(zhuǎn)換(在第6天，轉(zhuǎn)換到34°C )的情況，在第16天后觀察到 活細(xì)胞密度和生存力的迅速下降。除了第一次溫度轉(zhuǎn)換還進(jìn)行第二次溫度轉(zhuǎn)換(在第10 天，到32°C)的培養(yǎng)物在第16天后不表現(xiàn)處活細(xì)胞密度和生存力的那么迅速的下降。在 18天后的培養(yǎng)時間，一次T轉(zhuǎn)換培養(yǎng)的容積生產(chǎn)力明顯比兩次T轉(zhuǎn)換培養(yǎng)中的差。相反，在 第11天到第15天，具有一次T轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)物中容積生產(chǎn)力高于兩次T轉(zhuǎn)換培養(yǎng)物中的容 積生產(chǎn)力?？傊谝淮螠囟绒D(zhuǎn)換是有益的，其不依賴于所希望的收獲時間，而第二次溫度轉(zhuǎn) 換的益處依賴于計劃的收獲時間和有效下游處理的生存力要求。沒有第二次溫度轉(zhuǎn)換將允 許達(dá)到較高產(chǎn)物滴定度直到第20天，但是對于大于20天的運(yùn)行的培養(yǎng)，使用兩次溫度轉(zhuǎn)換 的培養(yǎng)將在滴定度方面優(yōu)于具有一次溫度轉(zhuǎn)換的運(yùn)行。此外，必須考慮第12天后的收獲物 在一次T轉(zhuǎn)換中比兩次T轉(zhuǎn)換中含有更高量的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，這使得下游處理復(fù)雜化。對 于一次T轉(zhuǎn)換，第12天后觀察到的活細(xì)胞密度的急劇下降可以是產(chǎn)物質(zhì)量的一種考慮，因 為相應(yīng)的細(xì)胞死亡可以向上清液釋放大量唾液酸酶，其可以降低產(chǎn)物唾液酸化。
將本文中參考或引用的所有出版和授權(quán)的專利、專利申請、公布的PCT和美國申 請、文章、書籍、參考文獻(xiàn)、參考文獻(xiàn)和指導(dǎo)手冊，和摘要都完整并入本文作為參考以更完整 地描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的現(xiàn)狀。由于可以對上述主題進(jìn)行多種改變而不背離本發(fā)明的范圍和精神，所以預(yù)期上面 說明書中所包含的或者所附權(quán)利要求書中定義的所有主題都解釋為對本發(fā)明的描述和闡 明。根據(jù)上面的教導(dǎo)可以對本發(fā)明進(jìn)行許多修飾和更改。序列表<110>Bristol-Myers Squibb Company<120>用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)方法<130>D0247 NP<140)10/742, 564<141>2003-12-18<150)60/436,101<151>2002-12-23<160>6<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>1152<212>DNA<213> 人工的<220><223>CTLA4Ig<220><221>CDS<222>(1). . (1149)
<220><221>mat_ 月太 <222> (79) · ·()<400>1atg ggt gtactg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca 48Met Gly ValLeu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala-25-20-15ctc ctg tttcca age atg gcg age atg gca atg cac gtg gcc cag cct 96Leu Leu PhePro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro-10-5-115get gtg gtactg gcc age age cga ggc ate get age ttt gtg tgt gag 144Ala Val ValLeu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu101520tat gca tctcca ggc aaa gcc act gag gtc egg gtg aca gtg ctt egg 192Tyr Ala SerPro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg253035cag get gacage cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg 240Gln Ala AspSer Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met404550ggg aat gagttg acc ttc cta gat gat tcc ate tgc acg ggc acc tcc 288Gly Asn GluLeu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser55606570agt gga aatcaa gtg aac ctc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac 336Ser Gly AsnGln Val Asn Leu Thr lie Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp758085acg gga ctctac ate tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac 384Thr Gly LeuTyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr9095100tac ctg ggcata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432Tyr Leu Glylie Gly Asn Gly Thr Gln lie Tyr Val lie Asp Pro Glu105110115ccg tgc ccagat tct gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac 480Pro Cys ProAsp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His120125130aca tcc ccaccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg ggt gga tcg tea gtc 528Thr Ser ProPro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val135140145150ttc ctc ttcccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc egg acc 576Phe Leu PhePro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr
155160165cct gag gtcaca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag 624Pro Glu ValThr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu170175180gtc aag ttcaac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 672Val Lys PheAsn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys185190195aca aag ccgegg gag gag cag tac aac age acg tac egg gtg gtc age 720Thr Lys ProArg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser200205210gtc ctc accgtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 768Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys215220225230tgc aag gtctcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate 816Cys Lys ValSer Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie235240245tcc aaa gccaaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 864Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro250255260cca tcc egggat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 912Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu265270275gtc aaa ggcttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 960Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn280285290ggg cag ccggag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1008Gly Gln ProGlu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser295300305310gac ggc tccttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg 1056Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg315320325tgg cag cagggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag get ctg 1104Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu330335340cac aac cactac acg cag aag age ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1152His Asn HisTyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys345350 355<210>2<211>383
<212>PRT<213> 人工的<220><223>CTLA4Ig
<400>2Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala-25-20-15Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro-10-5-115Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu101520Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg253035Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met404550Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser55606570Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr lie Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp758085Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr9095100Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gln lie Tyr Val lie Asp Pro Glu105110115Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His120125130Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val135140145150Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr155160165Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu170175180Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys185190195Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser200205210Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys215220225230Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie235240245
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro250255260Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu265270275Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn280285290Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser295300305310Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg315320325Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu330335340His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys345350355<210>3<211>1152<212>DNA<213> 人工的<220><223>L104EA29YIg<220><221>CDS<222>(1). . (1149)<220><221>mat_ 月太<222> (79) · ·()<400>3atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca 48Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala-25-20-15ctc ctg ttt cca age atg gcg age atg gca atg cac gtg gcc cag cct 96Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro-10-5-115get gtg gta ctg gcc age age cga ggc ate get age ttt gtg tgt gag 144Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu101520tat gca tct cca ggc aaa tat act gag gtc egg gtg aca gtg ctt egg 192Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg253035
cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg 240Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met404550
ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc ate tgc acg ggc acc tcc 288Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser55606570agt gga aat caa gtg aac ctc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac 336Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr lie Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp758085acg gga ctc tac ate tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac 384Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr9095100tac gag ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gln lie Tyr Val lie Asp Pro Glu105110115ccg tgc cca gat tct gat cag gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac 480Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His120125130aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tea gtc 528Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val135140145150ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc egg acc 576Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr155160165cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag 624Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu170175180gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 672Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys185190195aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age 720Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser200205210gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 768Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys215220225230tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate 816Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie235240245
tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 864Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro250255260cca tcc egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 912Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu265270275gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 960Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn280285290ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1008Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser295300305310gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg 1056Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg315320325tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag get ctg 1104Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu330335340cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1152His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys345350355<210>4<211>383<212>PRT<213> 人工的<220><223>L104EA29YIg<400>4Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala-25-20-15Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro-10-5-115Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu101520Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg253035Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met404550
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser
55606570Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr lie Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp758085Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr9095100Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gln lie Tyr Val lie Asp Pro Glu105110115Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His120125130Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val135140145150Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr155160165Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu170175180Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys185190195Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser200205210Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys215220225230Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie235240245Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro250255260Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu265270275Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn280285290Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser295300305310Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg315320325Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu330335340His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys345350355<210>5
<211>636
<212>DNA<213> 人<220> <221>CDS<222>(1). . (636)<220><221>mat_ 月太<222>(79)..()<400>5atg ggt gta ctg ctc aca cag agg acg ctg ctc agt ctg gtc ctt gca 48Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala-25-20-15ctc ctg ttt cca age atg gcg age atg gca atg cac gtg gcc cag cct 96Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro-10-5-115get gtg gta ctg gcc age age cga ggc ate gcc age ttt gtg tgt gag 144Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu101520tat gca tct cca ggc aaa gcc act gag gtc egg gtg aca gtg ctt egg 192Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg253035cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg 240Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met404550ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc ate tgc acg ggc acc tcc 288Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser55606570agt gga aat caa gtg aac ctc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac 336Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr lie Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp758085acg gga ctc tac ate tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac 384Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr9095100tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gln lie Tyr Val lie Asp Pro Glu105110115ccg tgc cca gat tct gac ttc ctc ctc tgg ate ctt gca gca gtt agt 480Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp lie Leu Ala Ala Val Ser120125130
Lys Met lie
Met Pro Pro
Leu
Pro
lie 185
Lys Lys Arg 155
Thr Glu Pro
170
Asn
Ser Pro Glu Cys
Leu Thr 160 Glu Lys 175
Thr Gly Gin Phe
Val Tyr
Gin Pro 180
Val 165 Tyr
Lys Phe
權(quán)利要求
細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括a)培養(yǎng)產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞；和b)在接種后某時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入聚陰離子化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中聚陰離子化合物選自硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰 肝素、硫酸甘露聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸鹽、聚(乙烯基硫酸 鹽)、k-角叉菜膠、和蘇拉明。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中聚陰離子化合物為多硫酸化化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中多硫酸化化合物為硫酸葡聚糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中聚陰離子化合物在培養(yǎng)的第一天或以后加入。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中加入聚陰離子化合物使其在培養(yǎng)物中濃度為 l-1000mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)為糖蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動物細(xì)胞為CH0細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)為可溶性CTLA4分子。
11.權(quán)利要求10的方法，其中可溶性CTLA4分子為CTLA4融合蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中可溶性CTLA4融合蛋白為CTLA4Ig。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中可溶性CTLA4融合蛋白為含有如圖3中所示-1到 357或+1到357氨基酸的CTLA4Ig。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)為可溶性CTLA4突變分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中可溶性CTLA4突變分子為含有如圖4中所示-1到 357 或 +1 到 357 氨基酸的 L104EA29YIg。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在接種后最初死亡期開始前的某一時間加入聚陰離 子化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中在接種后最初生長期期間某一時間加入聚陰離子化 合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中在最初生長期的后半期期間加入聚陰離子化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中在最初生長期結(jié)束或約結(jié)束時加入聚陰離子化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在接種后最初死亡期期間的某一時間加入聚陰離子 化合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中生長期得到延長。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中在延長的生長期期間實(shí)現(xiàn)的峰值活細(xì)胞密度高于最 初生長期期間實(shí)現(xiàn)的峰值活細(xì)胞密度。
23.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中死亡期的來臨得到延遲。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中死亡期受到遏制。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞生存力增加。
26.細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括a)培養(yǎng)產(chǎn)生可溶性CTLA4分子的CH0細(xì)胞；和b)在接種后的某時間向細(xì)胞培養(yǎng)物加入硫酸葡聚糖。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中死亡期的來臨得到延遲。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其還包括c)在允許細(xì)胞生長的條件下在37°C的溫度下培養(yǎng)宿主細(xì)胞允許該細(xì)胞生長的時間；d)然后在34°C的第二種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞；和e)然后在32°C的第三種溫度下培養(yǎng)細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其還包括c)在允許細(xì)胞生長的條件下在37°C的溫度下培養(yǎng)CH0細(xì)胞允許該細(xì)胞生長的時間；d)從培養(yǎng)的第6天開始在34°C的第二種溫度下培養(yǎng)CH0細(xì)胞；和e)從培養(yǎng)的第10天開始在32°C的第三種溫度下培養(yǎng)CH0細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明描述了通過動物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選但不限于補(bǔ)料-分批細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)，尤其糖蛋白的方法和過程。一方面，所述方法包括培養(yǎng)期期間至少兩次溫度轉(zhuǎn)換，其中在培養(yǎng)期結(jié)束時溫度低于最初細(xì)胞培養(yǎng)時溫度。在它們的整個持續(xù)時間內(nèi)，包括兩次或多次向下溫度轉(zhuǎn)換的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法維持高細(xì)胞生存力，可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的更大的終末滴定度，和高質(zhì)量蛋白質(zhì)產(chǎn)物，如通過所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的唾液酸含量所確定的。另一方面，所述方法包括在培養(yǎng)期內(nèi)延遲加入聚陰離子化合物。聚陰離子化合物的延遲加入維持所培養(yǎng)細(xì)胞的高生存力，并且可以延長生產(chǎn)期，延遲死亡期的來臨，和遏制死亡期。
文檔編號C12N5/02GK101857851SQ20091026083
公開日2010年10月13日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月23日
發(fā)明者B·M·施林, C·E·約斯滕, J·D·巴施, L·馬特洛克, S·G·澤加雷利, S·S·李, S·薩克哈穆里, W·V·小伯內(nèi)特 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司