專利名稱：用于提高漢坦病毒融合蛋白g2s0.7表達的腺病毒高表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子生物學、免疫學及免疫應用等相關(guān)領(lǐng)域。本 發(fā)明涉及腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體的改建及其對腎綜合征出血熱(HFRS)致病原——漢坦病毒 (HV)的嵌合基因G2S0. 7的表達。
背景技術(shù)：
腎綜合征出血熱及其基因工程疫苗研究現(xiàn)狀腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由漢坦病 毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠類等傳播的一種急性病毒性傳染病，臨床上以發(fā)熱、出血和 急性腎功能損害為主要特征。中國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家，具有流行范圍廣、發(fā) 病人數(shù)多、病死率高等特點，到目前為止臨床上尚缺乏特異有效的治療藥物。為易感人群接種疫苗是預防傳染性疾病大規(guī)模流行的最有效措施。因此，針對 HFRS疫苗的研究一直是該領(lǐng)域的熱點。國內(nèi)外近年來雖已研制出HFRS的滅活疫苗，但從 部分人群試用的情況來看，該類疫苗還存在明顯不足，主要是其誘導機體產(chǎn)生中和抗體的 能力較弱，也不能有效地刺激細胞免疫應答。目前在HFRS基因工程疫苗基礎(chǔ)研究中主要 使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相對較弱，刺激機體產(chǎn)生的 抗體出現(xiàn)較晚，滴度亦不高。本發(fā)明人多年對HV中免疫原性最強的核蛋白(Nucleocapsid Protein, NP)的結(jié)構(gòu)及功能，NP與GP不同片段嵌合基因(G1S0. 7、G2S0. 7)的構(gòu)建及其表 達，以及不同融合基因(蛋白)刺激機體免疫應答的能力及其影響因素等進行了較為深入 的研究。一系列體內(nèi)、外實驗結(jié)果表明，上述嵌合基因在腺病毒表達系統(tǒng)中能有效地刺激機 體的體液免疫(包括中和抗體)應答以及細胞免疫應答，且其效果均高于非嵌合組。然而在研究中我們也發(fā)現(xiàn)了一些問題，如盡管利用各種系統(tǒng)均能表達出完整的融 合蛋白，但總的來說蛋白表達量還是偏低。此外，用融合蛋白免疫動物后雖然各表達系統(tǒng)均 能刺激機體產(chǎn)生體液及細胞免疫應答，且腺病毒表達系統(tǒng)的效果要優(yōu)于其他系統(tǒng)，但是整 體的免疫水平還不十分理想。因此，進一步選擇合適的表達載體、優(yōu)化表達系統(tǒng)對目前HFRS 基因工程疫苗的研究有著重要的意義。表達載體的優(yōu)化在HFRS基因工程疫苗研究領(lǐng)域里，如何提高外源基因的表達水平是亟待解決的難題之一。由于轉(zhuǎn)錄外源DNA序列的啟動于和增強子是最基本的真核表達組件，因此，選 擇合適的啟動子或增強子并改進其活性是提高外源基因表達首先要考慮的問題。許多 來源于病毒的增強子元件，如SV40的早期基因增強子，Rous肉瘤病毒基因組長末端重復 序列(LTR)區(qū)和人類巨細胞病毒(CMV)早期啟動子，在來自各種哺乳動物的多種型別細 胞中都有很強的活性。目前廣泛應用的CMV啟動子雖然是比較有效的表達系統(tǒng)啟動子， 但實際應用中有些基因通常不能得到滿意的表達效果。例如Garg S, et al. Thehybrid cytomegalovirus enhancer/chicken β -actin promoter along withwoodchuckhepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances theprotective efficacy of DNA vaccines. 2004 ;J Immunol. 173 :550 558 比較了 使用人 CMV 啟動 子和CAG啟動子/增強子(人CMV啟動子和雞β-actin啟動子的雜合體)的流感病毒 血凝素(haemagglutinin，HA)DNA疫苗的免疫效果，使用CMV啟動子幾乎不能誘發(fā)任何 抗HA抗體，而使用CAG啟動子/增強子可誘發(fā)較低水平的抗HA抗體。You LM, et al. A hybrid promoter-containing vectorfor direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs inmammalian cells. 2009 ；Sep 16. Mol Biol Rep.等的最新研究表 明他們設(shè)計的一個含CAG啟動子/增強子的真核載體pCAGX能在更廣泛的宿主細胞中提 高外源基因的蛋白表達水平。此外還有Yoshio Nitta, et al. A CMV-actin-globinhybrid promoter improves adeno—associated viral vector gene expression in thearterial wall in vivo.The Journal ofGene Medicine. 2005 ；7 (10) 1348 1355 和 Halbert CL, et al.High-efficiency promoter-dependent transduction by adeno—associated virus type 6vectors in mouse lung. Hum Gene Ther.2007Apr ； 18 (4) :344 354。多 項報道顯示CAG啟動子比CMV啟動子誘生抗體的水平要高。因此本專利中腺病毒轉(zhuǎn)移 載體的優(yōu)化研究采用了 CAG啟動子/增強子替換原有的CMV啟動子。此外，國內(nèi)外學者 的研究表明，選擇不同的啟動子并配合不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件有助于選擇出適用于特定基 因的表達系統(tǒng)。如前文所述的Garg等的流感病毒血凝素DNA疫苗的免疫效果的研究， 如在HA基因后加上土撥鼠肝炎病毒穩(wěn)定mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(mRNA-stabiIizingpo st—transcriptional regulatory element from the woodchuck hepatitis virus, WPRE)后，均可提高CMV啟動子和CAG啟動子誘生抗HA抗體的水平，且CAG啟動子比CMV 啟動子誘生抗體的水平高一倍。在腺病毒表達系統(tǒng)中，也有Xu ZL, et al. Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional reguIationelement enhances transgene expression from adenovirus vectors. BiochimBiophys Acta. 2003 ； 1621 (3) :266 271 和Boulos S, et al. Assessment of CMV, RSV and SYNl promoters and the woodchuck post-transcriptional regulatoryelement in adenovirus vectors for transgene expression in cortical neuronalcultures. Brain Res. 2006 ；1102 (1) :27 38 多項石if 究顯示W(wǎng)PRE可以增強不同啟動子的活性，增強基因的表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將本申請人前期構(gòu)建的含漢灘病毒76-118株的G2和SO. 7的嵌 合基因與腺病毒轉(zhuǎn)移載體的重組質(zhì)粒G2S0. 7-pShuttle進行改建，以獲得用于提高漢坦病 毒融合蛋白G2S0. 7表達的腺病毒高表達載體。本發(fā)明目的是以下述方式實現(xiàn)的一種用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7表達 的腺病毒高表達載體，對含嵌合基因G2S0. 7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pShuttle進行改 建，將其CMV啟動子替換為CAG啟動子/增強子，得到含CAG啟動子/增強子的高表達漢坦 病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體，命名為G2S0. 7-pCAG，其全基因序列為SEQ ID NO 1 所示。一種用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7表達的腺病毒高表達載體，對含嵌合基 因G2S0. 7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pShuttle進行改建，在其3，端插入WPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，得到含WPRE調(diào)控元件的高表達漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體，命名 為G2S0. 7-WPRE，其全基因序列為SEQ ID NO 2所示。一種用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7表達的腺病毒高表達載體，對含嵌合基 因G2S0. 7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pShuttle進行改建，將其CMV啟動子替換為CAG啟動 子/增強子并在其3，端插入WPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，得到含CAG啟動子/增強子和WPRE調(diào)控元 件的高表達漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體，命名為G2S0. 7-pCAG-ffPRE, 其全基因序列為SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明利用基因重組技術(shù)，將本申請人前期構(gòu)建的含漢坦病毒76-118株的G2與 SO. 7的嵌合基因與腺病毒轉(zhuǎn)移載體的重組質(zhì)粒G2S0. 7-pShuttle進行改建。本發(fā)明包括 替換重組質(zhì)粒G2S0. 7-pShuttle的啟動子(CAG)或(和)插入轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)，以 提高融合蛋白G2S0. 7的表達水平。將本發(fā)明及未改建質(zhì)粒G2S0. 7-pShuttle分別整合進 腺病毒DNA，在HEK293細胞中包裝腺病毒，比較各組重組腺病毒外源蛋白G2S0. 7的表達水 平。結(jié)果顯示本發(fā)明與原轉(zhuǎn)移載體PShuttle相比，均能有效提高外源蛋白的表達，且以替 換啟動子組效果最明顯。


圖 1. G2S0. 7-pCAG Nhe I+Not I 雙酶切鑒定結(jié)果。其中Ll :G2S0. 7-pCAG ;M 500bp DNA Ladder Marker。圖 2. G2S0. 7-WPRE Kpn I+Aft II 雙酶切鑒定結(jié)果。其中L1 :G2S0. 7-ffPRE ；M :DL 2000Markero圖3.改建重組轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pCAG-WPRE示意圖。圖 4. G2S0. 7-pCAG、G2S0. 7-WPRE、G2S0. 7-pCAG-ffPRE 重組轉(zhuǎn)移載體 Nhe I+Not I 雙酶切鑒定結(jié)果。其中L1 :G2S0. 7-pCAG ；L2 :G2S0. 7-ffPRE ；L3 :G2S0. 7-pCAG-ffPRE ；M Wide Range DNA Marker。圖 5. Ad-G2S0. 7-pCAG、Ad_G2S0· 7-WPRE、Ad_G2S0· 7-pCAG-ffPRE 重組轉(zhuǎn)移載體 I-Ceu I+PI-Sce I 雙酶切鑒定結(jié)果。其中L1 :Ad_G2S0. 7-ffPRE ；L2 :Ad_G2S0. 7-pCAG ；L3 Ad-G2S0. 7-pCAG-ffPRE ；M =Wide Range DNA Marker。圖6.融合蛋白G2S0. 7在不同重組腺病毒中表達的免疫熒光檢測結(jié)果。其中A Ad-G2S0. 7 ；B :Ad_G2S0· 7-ffPRE ；C :Ad_G2S0· 7-pCAG ；D :Ad_G2S0· 7-pCAG-WPRE。E 正常 293 細胞對照。圖7.融合蛋白G2S0.7在不同重組腺病毒中表達的Western Blot結(jié)果。其 中 A :293 細胞對照；B =Adenovirus-Lac-Z 對照 C :Ad_G2S0· 7 ；D :Ad_G2S0· 7-ffPRE ；E Ad-G2S0. 7-pCAG ；F :Ad-G2S0. 7-pCAG-WPRE。
具體實施例方式本發(fā)明所用的腺病毒表達系統(tǒng)購自CL0NTECH公司的Adeno-X 系統(tǒng)(貨號 K1650-1)，其轉(zhuǎn)移載體為pShuttle，含有CMV啟動子。本發(fā)明中所采用的漢坦病毒為漢灘病毒76-118株。其基因組由L、M和S三個基因 片段組成。其中L片段編碼RNA依賴的RNA聚合酶；M片段編碼囊膜糖蛋白(GP)Gl和G2 ；S片段編碼核衣殼蛋白(NP)。本專利中所涉及的嵌合基因由其M片段的G2部分及S片段 的0. 7部分分別PCR擴增獲得，利用基因融合技術(shù)將其融合，并在其5’端設(shè)計Xba 1、3’端 設(shè)計NotI酶切位點，克隆入腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle的相應酶切位點獲得重組質(zhì)粒，命名 為 G2S0. 7-pShuttle。 本發(fā)明中所替換的CAG啟動子/增強子是人類巨細胞病毒 (humancytomegalovirus, CMV)早期啟動子與雞β-actin啟動子的雜合體。其序列是綜 合參考其他人文獻，并根據(jù)本項目要求在其5’端設(shè)計Mfe 1,3'端設(shè)計Sfi I，Nhe I酶切 位點，其中Sfi I用于后續(xù)研究克隆位點，片段大小1747bp，交由Takara公司至pMD19-T Simple載體中合成。改建后的重組轉(zhuǎn)移載體命名為G2S0. 7-pCAG。G2S0. 7-pCAG的全基因 序列為SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明中所插入WPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件全名為土撥鼠肝炎病毒穩(wěn)定mRNA轉(zhuǎn)錄后 i周節(jié) 7Π 件(mRNA-stabilizing post-transcriptional regulatory elementfrom the woodchuck hepatitis virus，WPRE)，其序列參考GENBANK序列編號 AX823860 的WPRE序列， 根據(jù)本發(fā)明要求在其5’端和3’端分別設(shè)計Kpn I和Afl II酶切位點，片段大小623bp， 交由Takara公司至pMD19-T Simple載體中合成。重組轉(zhuǎn)移載體命名為G2S0. 7-WPRE。 G2S0. 7-WPRE的全基因序列為SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明中所涉及的第三種重組轉(zhuǎn)移載體在上述G2S0. 7-pCAG基礎(chǔ)上改建獲得。利 用WPRE序列上的Kpn I和Afl II酶切位點克隆入pCAG相應的位點。改建后的重組轉(zhuǎn)移 載體命名為 G2S0. 7-pCAG-WPRE。G2S0. 7-pCAG-WPRE 的全基因序列為 SEQ ID NO :3 所示。本發(fā)明中所有重組質(zhì)粒構(gòu)建方法具體如下1)G2S0. 7-pCAG構(gòu)建方法根據(jù)腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle的酶切位點，設(shè)計各改 建片段的插入酶切位點，CAG序列5，端設(shè)計Mfe 1，3，端設(shè)計Sfi I,Nhe I，其中Sfi I用于 后續(xù)研究克隆位點。用Mfe I和Nhe I分別雙酶切pShuttle和pMD19_T Simple-CAG質(zhì)粒， 構(gòu)建pCAG重組載體。Nhe I和Not I分別雙酶切pCAG重組載體和G2S0. 7-pShuttle質(zhì)粒， 膠回收目的片段(G2S0. 7)和載體(pCAG)，T4連接酶14°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(JM109 感受態(tài))后涂布含卡那抗性的2 X YT固體培養(yǎng)基，37°C孵箱培養(yǎng)12 14小時，挑選單菌落 搖菌提質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得陽性克隆。附圖1.為G2S0. 7-pCAG陽性克隆Nhe I+Not I雙 酶切鑒定結(jié)果。2)G2S0. 7-WPRE構(gòu)建方法根據(jù)腺病毒轉(zhuǎn)移載體pShuttle的酶切位點，為WPRE序 列的5’端和3’端分別設(shè)計Kpn I和Afl II酶切位點。用Kpn I和Afl II分別雙酶切 PMD19-T Simple-WPRE和G2S0. 7-pShuttle質(zhì)粒，膠回收目的片段和載體，T4連接酶14°C 連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(JM109感受態(tài))后涂布含卡那抗性的2XYT固體培養(yǎng)基，37°C 孵箱培養(yǎng)12 14小時，挑選單菌落搖菌提質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得陽性克隆。附圖2.為 G2S0. 7-WPRE陽性克隆Kpn I+Afl II雙酶切鑒定結(jié)果。3)G2S0. 7-pCAG-ffPRE構(gòu)建方法Kpn I和Afl II雙酶切重組轉(zhuǎn)移載體 G2S0. 7-pCAG，并同樣雙酶切pMD19_T Simple-ffPRE,膠回收載體和目的片段，T4連接酶 14°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(JM109感受態(tài))后涂布含卡那抗性的2XYT固體培養(yǎng)基， 37°C孵箱培養(yǎng)12 14小時，挑選單菌落搖菌提質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得陽性克隆。附圖3.為 G2S0. 7-pCAG-ffPRE重組轉(zhuǎn)移載體示意圖。
4)含目的片段G2S0. 7轉(zhuǎn)移載體的鑒定本發(fā)明所構(gòu)建目的片段為漢灘病毒76-118株M片段G2部分和S片段0. 7部分的嵌合基因G2S0. 7，其大小約為2. 2kb。在完 成所有重組轉(zhuǎn)移載體的改建后，用Nhe I和Not I雙酶切鑒定含目的片段G2S0. 7的轉(zhuǎn)移載 體。附圖4.為G2S0. 7-pCAG、G2S0. 7-WPRE、G2S0. 7-pCAG-ffPRE重組轉(zhuǎn)移載體酶切鑒定結(jié)
果 ο5)重組腺病毒DNA構(gòu)建、鑒定及腺病毒包裝將上述構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)移載體和腺病 毒質(zhì)粒分別用PI-Sce I和I-Ceu I雙酶切，膠回收目的片段和載體，T4連接酶14°C連接過 夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(JM109感受態(tài))后涂布含氨芐抗性的2XYT固體培養(yǎng)基，37°C孵箱培養(yǎng) 12 14小時，挑選單菌落搖菌提質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得陽性克隆。將重組腺病毒DNA用Pac I酶單切以線性化質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，待出現(xiàn)明顯CPE (Cytopathic Effect,細胞病變) 后收細胞，離心后將沉淀重懸于高壓滅菌的PBS。反復凍融該沉淀3次后離心收集上清，即 為重組腺病毒。附圖 5.為 Ad-G2S0. 7-pCAG、Ad-G2S0. 7-WPRE、Ad_G2S0. 7-pCAG-ffPRE 雙酶 切鑒定結(jié)果。6)不同重組腺病毒融合蛋白表達水平的比較測定重組腺病毒滴度(具體方法參 ICLONTECH Adeno-x Rapid Titer Kit, Cat. No. 631028)。以 lOOpfu/cell 的 MOI 感染 293細胞，同時感染本申請人前期包裝的Ad-G2S0. 7腺病毒作為對照，48小時后免疫熒光檢 測目的蛋白的表達?？捎^察到細胞膜上的特異性熒光，其中改建轉(zhuǎn)移載體重組腺病毒的熒 光顯著，尤以 Ad-G2S0. 7-pCAG 組最為明顯，Ad_G2S0. 7-pCAG-ffPRE 次之。Western blot 檢 測目的蛋白的表達，以相同的MOI感染293細胞，48小時后收樣并測定蛋白含量，確保每孔 上樣量相同。可觀察到目的蛋白的特異性表達，其中改建轉(zhuǎn)移載體重組腺病毒的目的蛋白 特異條帶比較顯著，尤以Ad-G2S0. 7-pCAG組表達最為明顯，Ad-G2S0. 7_pCAG_WPRE次之。利 用ELISA檢測蛋白表達水平，包被本申請人制備針對融合蛋白的特異性單抗1A8，檢測抗體 為出血熱抗原免疫兔血清，得到結(jié)果與上述結(jié)果相符。附圖6.為不同重組腺病毒融合蛋白 G2S0. 7表達水平的免疫熒光檢測結(jié)果；附圖7.為融合蛋白G2S0. 7在不同重組腺病毒中表 達的Western blot結(jié)果。序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學<120>用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7表達的腺病毒高表達載體<160>3<210>1<211>7456<212>DNA<213>Artificial<400>1taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctgg atctcccgat cccctatggt 60cgactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt 120gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct 180tgaccgacaa ttgtcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 240cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 300
ctggctgaccgcccaacgacccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag360taacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc420acttggcagtacatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg480gtaaatggcccgcctggcattatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc540agtacatctacgtattagtcatcgctatta ccatgggtcg aggtgagccc cacgttctgc600ttcactctccccatctcccccccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa660ttattttgtgcagcgatggg ggcggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg720gggcgaggggcggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc780getccgaaagtttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag840cgcgcggcgggcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc900gcgccgcccgccccggctctgactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg960cccttctcctccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggctcgttt cttttctgtg1020gctgcgtgaaagccttaaag ggctccggga gggccctttg tgcggggggg agcggctcgg1080ggggtgcgtgcgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggcccgcgc tgcccggcgg1140ctgtgagcgctgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcgtgtgcg cgaggggagc1200gcggccgggggcggtgccccgcggtgcggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc1260ggggtgtgtgcgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg ctgtaacccc1320cccctgcacccccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt1380gcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg1440ggcggggcggggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggccccgga1500gcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg1560agagggcgcagggacttcctttgtcccaaa tctggcggag ccgaaatctg ggaggcgccg1620ccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc1680ggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgc cgtccccttc tccatctcca gcctcggggc1740tgccgcagggggacggctgccttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc1800gtgtgaccggcggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac1860agctcctgggcaacgtgctg gttgttgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggcct1920cgacggccgctagcgtttaa acgggccctc tagaatgtgg atatttcttc ttgtcttaga1980atccttactgtgggctgcaa gtgcatcaga gacaccatta actcctgtct ggaatgacaa2040tgcccatggggtaggttctg ttcctatgca tacagattta gagcttgatc tctctttaac2100atccagttccaagtatacataccgtaggaa gttaacaaac ccacttgagg aagcacgatc2160cattgacctacatattgaaa tagaagaaca gacaattggt gttgatgtgc atgctctagg2220acactggtttgatggtcgtcttaaccttaa aacatccttt cactgttatg gtgcttgtac2280aaagtatgaatacccttggcatactgcaaa gtgccactat gaaagagatt accaatatga2340gacgagctggggttgtaatccatcagattg tcctggggtg ggcacaggct gtacagcatg2400tggtttatacctagatcaactgaaaccagt tggtagtgct tataaaatta tcacaataag2460gtacagcaggagagtctgtg ttcagtttgg ggaggaaaac ctttgtaaga taatagacat2520gaatgattgttttgtatcta ggcatgttaa ggtctgcata attggtacag tatctaaatt2580
ctctcagggtgataccttattgttttttgg accgcttgaa ggtggtggtc taatatttaa2640
acactggtgtacatccacat gtcaatttgg tgacccagga gatatcatga gtccaagaga2700caaaggttttttatgccctg agtttccagg tagtttcagg aagaaatgca actttgctac2760tacccctatttgtgagtatg atggaaatat ggtctcaggt tacaagaaag tgatggcgac2820aattgattccttccaatctt ttaatacaag cactatgcac ttcactgatg aaaggataga2880gtggaaagaccctgatggaa tgctaaggga ccatataaac attttagtaa cgaaggacat2940tgactttgataaccttggtg aaaatccttg caaaattggc ctacaaacat cttctattga3000gggggcctggggttctggtg tggggttcac attaacatgt ctggtatcac taacagaatg3060tcctacctttttgacctcaa taaaggcttg tgataaggct atctgttatg gtgcagagag3120tgtaacattgacaagaggac aaaatacagt caaggtatca gggaaaggtg gccatagtgg3180ttcaacatttaggtgttgcc atggggagga ctgttcacaa attggactcc atgctgctgc3240acctcaccttgacaaggtaa atgggatttc tgagatagaa aatagtaaag tatatgatga3300tggggcaccgcaatgtggga taaaatgttg gtttgttaaa tcaggggaat ggatttcagg3360gatattcagtggtaattgga ttgtactcat tgtcctctgt gtatttctat tgttctcctt3420ggttttactaagcattctct gtcccgtaag gaagcataaa aaatcagtcg acctgaatca3480cgcgtctcgactcgacatgg caactatgga ggaattacag agggaaatca atgcccatga3540gggtcaattagtgatagcca ggcagaaggt gagggatgca gaaaaacagt atgaaaagga3600tccagatgagttgaacaaga gaacattaac tgaccgagag ggcgttgcag tatctatcca3660ggcaaaaattgatgagttaa aaaggcaact ggcagatagg attgcaactg ggaaaaacct3720tgggaaggaacaagatccaa caggggtgga gcctggagac catctgaaag agaggtcaat3780gctcagttatggtaatgtgc tggatttaaa ccatttggat attgatgaac ctacaggaca3840gacagcagactggctgagca tcatcgtcta tcttacatcc tttgtcgtcc cgatacttct3900gaaagctctgtatatgttga caacaagggg gaggcaaact accaaggata ataaagggac3960ccggattcgatttaaggatg atagctcgtt cgaggatgtt aacggtatcc ggaaaccaaa4020acatctttacgtgtccttgc caaatgcaca gtcaagcatg aaggcagaag agattacacc4080tggtagatatagaacagcag tctgtgggct ctaccctgca cagattaagg cacggcagat4140gatcggtccagttatgagtg taattggttt tctagcatta gcaaaggact ggagtgatcg4200tatcgaacaatggttaattg aaccttgcaa gcttcttcca gatacagcag cagttcatca4260tcatcatcatcatgcggccg ccactgtgct ggatgatccg agctcggtac caagcttaag4320tttaaaccgctgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc4380ctcccccgtgccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa4440tgaggaaattgcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg4500gcaggacagcaagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg4560ctctatggcttctgaggcgg aaagaaccag cagatctgca gatctgaatt catctatgtc4620gggtgcggagaaagaggtaa tgaaatggca ttatgggtat tatgggtctg cattaatgaa4680tcggccaacgcgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca4740ctgactcgctgcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg4800taatacggttatccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc4860agcaaaaggccaggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc4920cccctgacgagcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac4980
tataaagataccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc5040tgccgcttaccggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat5100gctcacgctgtaggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc5160acgaaccccccgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg ta actatcgt cttgagtcca5220acccggtaagacacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag5280cgaggtatgtaggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta5340gaaggacagtatttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg5400gtagctcttgatccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc5460agcagattacgcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt5520ctgacgctcagtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa5580ggatcttcacctagatcctt ttgatcctcc ggcgttcagc ctgtgccaca gccgacagga5640tggtgaccaccatttgcccc atatcaccgt cggtactgat cccgtcgtca ataaaccgaa5700ccgctacaccctgagcatca aactctttta tcagttggat catgtcggcg gtgtcgcggc5760caagacggtcgagcttcttc accagaatga catcaccttc ctccaccttc atcctcagca5820aatccagcccttcccgatct gttgaactgc cggatgcctt gtcggtaaag atgcggttag5880cttttacccctgcatctttg agcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc5940ataccaggcctgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag6000agctttgttgtaggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc6060tgcgttgtcgggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca6120acaaagccgccgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccaattaacc6180aattctgattagaaaaactc atcgagcatc aaatgaaact gcaatttatt catatcagga6240ttatcaataccatatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg6300cagttccataggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca6360atacaacctattaatttccc ctcgtcaaaa ataaggttat caagtgagaa atcaccatga6420gtgacgactgaatccggtga gaatggcaaa agcttatgca tttctttcca gacttgttca6480acaggccagccattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt6540cgtgattgcgcctgagcgag acgaaatacg cgatcgctgt taaaaggaca attacaaaca6600ggaatcgaatgcaaccggcg caggaacact gccagcgcat caacaatatt ttcacctgaa6660tcaggatattcttctaatac ctggaatgct gttttcccgg ggatcgcagt ggtgagtaac6720catgcatcatcaggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat aaattccgtc6780agccagtttagtctgaccat ctcatctgta acatcattgg caacgctacc tttgccatgt6840ttcagaaacaactctggcgc atcgggcttc ccatacaatc gatagattgt cgcacctgat6900tgcccgacattatcgcgagc ccatttatac ccatataaat cagcatccat gttggaattt6960aatcgcggcctcgagcaaga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta7020ctgtttatgtaagcagacag ttttattgtt catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg7080taacatcagagattttgaga cacaacgtgg ctttgttgaa taaatcgaac ttttgctgag7140ttgaaggatcagatcacgca tcttcccgac aacgcagacc gttccgtggc aaagcaaaag7200ttcaaaatcaccaactggtc cacctacaac aaagctctca tcaaccgtgg ctccctcact7260ttctggctggatgatggggc gattcaggcc tggtatgagt cagcaacacc ttcttcacga7320
ggcagacctc agcgctagat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat7380acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa7440aagtgccacc tgacgt7456<210>2<211>7072<212>DNA<213>Artificial<400>2taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctgg atctcccgat cccctatggt60cgactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt120gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct180tgaccgacaa ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgcgatg240tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta300cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt a cggtaaatg360gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc420ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa480ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca540atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta600cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt660acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg720acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca780actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca840gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc900actataggga gacccaagct ggctagcgtt taaacgggcc ctctagaatg tggatatttc960ttcttgtctt agaatcctta ctgtgggctg caagtgcatc agagacacca ttaactcctg1020tctggaatga caatgcccat ggggtaggtt ctgttcctat gcatacagat ttagagcttg1080atctctcttt aacatccagt tccaagtata cataccgtag gaagttaaca aacccacttg1140aggaagcacg atccattgac ctacatattg aaatagaaga acagacaatt ggtgttgatg1200tgcatgctct aggacactgg tttgatggtc gtcttaacct taaaacatcc tttcactgtt1260atggtgcttg tacaaagtat gaataccctt ggcatactgc aaagtgccac tatgaaagag1320attaccaata tgagacgagc tggggttgta atccatcaga ttgtcctggg gtgggcacag1380gctgtacagc atgtggttta tacctagatc aactgaaacc agttggtagt gcttataaaa1440ttatcacaat aaggtacagc aggagagtct gtgttcagtt tggggaggaa aacctttgta1500agataataga catgaatgat tgttttgtat ctaggcatgt taaggtctgc ataattggta1560cagtatctaa attctctcag ggtgatacct tattgttttt tggaccgctt gaaggtggtg1620gtctaatatt taaacactgg tgtacatcca catgtcaatt tggtgaccca ggagatatca1680tgagtccaag agacaaaggt tttttatgcc ctgagtttcc aggtagtttc aggaagaaat1740gcaactttgc tactacccct atttgtgagt atgatggaaa tatggtctca ggttacaaga1800aagtgatggc gacaattgat tccttccaat cttttaatac aagcactatg cacttcactg1860
atgaaaggatagagtggaaa gaccctgatg gaatgctaag ggaccatata aacattttag1920taacgaaggacattgacttt gataaccttg gtgaaaatcc ttgcaaaatt ggcctacaaa1980catcttctattgagggggcc tggggttctg gtgtggggtt cacattaaca tgtctggtat2040cactaacagaatgtcctacc tttttgacct caataaaggc ttgtgataag gctatctgtt2100atggtgcagagagtgtaaca ttgacaagag gacaaaatac agtcaaggta tcagggaaag2160gtggccatagtggttcaaca tttaggtgtt gccatgggga ggactgttca caaattggac2220tccatgctgctgcacctcac cttgacaagg taaatgggat ttctgagata gaaaatagta2280aagtatatgatgatggggca ccgcaatgtg ggataaaatg ttggtttgtt aaatcagggg2340aatggatttcagggatattc agtggtaatt ggattgtact cattgtcctc tgtgtatttc2400tattgttctccttggtttta ctaagcattc tctgtcccgt aaggaagcat aaaaaatcag2460tcgacctgaatcacgcgtct cgactcgaca tggcaactat ggaggaatta cagagggaaa2520tcaatgcccatgagggtcaa ttagtgatag ccaggcagaa ggtgagggat gcagaaaaac2580agtatgaaaaggatccagat gagttgaaca agagaacatt aactgaccga gagggcgttg2640cagtatctatccaggcaaaa attgatgagt taaaaaggca actggcagat aggattgcaa2700ctgggaaaaaccttgggaag gaacaagatc caacaggggt ggagcctgga gaccatctga2760aagagaggtcaatgctcagt tatggtaatg tgctggattt aaaccatttg gatattgatg2820aacctacaggacagacagca gactggctga gcatcatcgt ctatcttaca tcctttgtcg2880tcccgatacttctgaaagct ctgtatatgt tgacaacaag ggggaggcaa actaccaagg2940ataataaagggacccggatt cgatttaagg atgatagctc gttcgaggat gttaacggta3000tccggaaaccaaaacatctt tacgtgtcct tgccaaatgc acagtcaagc atgaaggcag3060aagagattacacctggtaga tatagaacag cagtctgtgg gctctaccct gcacagatta3120aggcacggcagatgatcggt ccagttatga gtgtaattgg ttttctagca ttagcaaagg3180actggagtgatcgtatcgaa caatggttaa ttgaaccttg caagcttctt ccagatacag3240cagcagttcatcatcatcat catcatgcgg ccgccactgt gctggatgat ccgagctcgg3300tacctaaaccgctgatcagc ctcgactgtg ccttctagta tcaacctctg gattacaaaa3360tttgtgaaagattgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg3420ctgctttaatgcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct3480tgtataaatcctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg3540gcgtggtgtgcactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct3600gtcagctcctttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg3660ccgcctgccttgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg3720tgttgtcggggaagctgacg tcctttccat ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc3780tgcgcgggacgtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc3840gcggcctgctgccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc3900ggatctccctttgggccgcc tccccgcctg cttaagttta aaccgctgat cagcctcgac3960tgtgccttctagttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct4020ggaaggtgccactcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct4080gagtaggtgtcattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg4140ggaagacaatagcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag4200
aaccagcagatctgcagatc tgaattcatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa4260atggcattatgggtattatg ggtctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg4320gtttgcgtattgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc4380ggctgcggcgagcggtatca gctcactcaa aggcggtaat a cggttatcc acagaatcag4440gggataacgcaggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa4500aggccgcgttgctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc4560gacgctcaagtcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc4620ctggaagctccctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg4680cctttctcccttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt4740cggtgtaggtcgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc4800gctgcgccttatccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc4860cactggcagcagccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag4920agttcttgaagtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg4980ctctgctgaagccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa5040ccaccgctggtagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag5100gatctcaagaagatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact5160cacgttaagggattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttga5220tcctccggcgttcagcctgt gccacagccg acaggatggt gaccaccatt tgccccatat5280caccgtcggtactgatcccg tcgtcaataa accgaaccgc tacaccctga gcatcaaact5340cttttatcagttggatcatg tcggcggtgt cgcggccaag acggtcgagc ttcttcacca5400
gaatgacatcaccttcctcc accttcatcc tcagcaaatc cagcccttcc cgatctgttg5460aactgccggatgccttgtcg gtaaagatgc ggttagcttt tacccctgca tctttgagcg5520ctgaggtctgcctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc5580atccagccagaaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt5640ggtgattttgaacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat5700ctgatccttcaactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc5760agcgtaatgctctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg5820agcatcaaatgaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa5880agccgtttctgtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc5940tggtatcggtctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg6000tcaaaaataaggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat6060ggcaaaagcttatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca6120tcaaaatcactcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga6180aatacgcgatcgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg6240aacactgccagcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg6300aatgctgttttcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata6360aaatgcttgatggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca6420tctgtaacatcattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg6480ggcttcccatacaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat6540
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt6600tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt6660attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca6720acgtggcttt gttgaataaa tcgaactttt gctgagttga aggatcagat cacgcatctt6780cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc6840tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc ctcactttct ggctggatga tggggcgatt6900caggcctggt atgagtcagc aacaccttct tcacgaggca gacctcagcg ctagattatt6960gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa7020ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gt7072<210>3<211>8079<212>DNA<213>Artificial<400>3taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctgg atctcccgat cccctatggt60cgactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt120gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct180tgaccgacaa ttgtcgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt240cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc300ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag360taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc420acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg480gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc540agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatgggtcg aggtgagccc cacgttctgc600ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa660ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg720gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc780getccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag840cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc900gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg960cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggctcgttt cttttctgtg1020gctgcgtgaa agccttaaag ggctccggga gggccctttg tgcggggggg agcggctcgg1080ggggtgcgtg cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggcccgcgc tgcccggcgg1140ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcgtgtgcg cgaggggagc1200gcggccgggg gcggtgcccc gcggtgcggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc1260ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg ctgtaacccc1320cccctgcacc cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt1380gcggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg1440ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggccccgga1500
gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg1560agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctggcggag ccgaaatctg ggaggcgccg1620ccgcaccccc tctagcgggc gcgggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc1680ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccatctcca gcctcggggc1740tgccgcaggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc1800gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac1860agctcctggg caacgtgctg gttgttgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggcct1920cgacggccgc tagcgtttaa acgggccctc tagaatgtgg atatttcttc ttgtcttaga1980atccttactg tgggctgcaa gtgcatcaga gacaccatta actcctgtct ggaatgacaa2040tgcccatggg gtaggttctg ttcctatgca tacagattta gagcttgatc tctctttaac2100atccagttcc aagtatacat accgtaggaa gttaacaaac ccacttgagg aagcacgatc2160cattgaccta catattgaaa tagaagaaca gacaattggt gttgatgtgc atgctctagg2220acactggttt gatggtcgtc ttaaccttaa aacatccttt cactgttatg gtgcttgtac2280aaagtatgaa tacccttggc atactgcaaa gtgccactat gaaagagatt accaatatga2340gacgagctgg ggttgtaatc catcagattg tcctggggtg ggcacaggct gtacagcatg2400tggtttatac ctagatcaac tgaaaccagt tggtagtgct tataaaatta tcacaataag2460gtacagcagg agagtctgtg ttcagtttgg ggaggaaaac ctttgtaaga taatagacat2520gaatgattgt tttgtatcta ggcatgttaa ggtctgcata attggtacag tatctaaatt2580ctctcagggt gataccttat tgttttttgg accgcttgaa ggtggtggtc taatatttaa2640acactggtgt acatccacat gtcaatttgg tgacccagga gatatcatga gtccaagaga2700caaaggtttt ttatgccctg agtttccagg tagtttcagg aagaaatgca actttgctac2760tacccctatt tgtgagtatg atggaaatat ggtctcaggt tacaagaaag tgatggcgac2820aattgattcc ttccaatctt ttaatacaag cactatgcac ttcactgatg aaaggataga2880gtggaaagac cctgatggaa tgctaaggga ccatataaac attttagtaa cgaaggacat2940tgactttgat aaccttggtg aaaatccttg caaaattggc ctacaaacat cttctattga3000gggggcctgg ggttctggtg tggggttcac attaacatgt ctggtatcac taacagaatg3060tcctaccttt ttgacctcaa taaaggcttg tgataaggct atctgttatg gtgcagagag3120tgtaacattg acaagaggac aaaatacagt caaggtatca gggaaaggtg gccatagtgg3180ttcaacattt aggtgttgcc atggggagga ctgttcacaa attggactcc atgctgctgc3240acctcacctt gacaaggtaa atgggatttc tgagatagaa aatagtaaag tatatgatga3300tggggcaccg caatgtggga taaaatgttg gtttgttaaa tcaggggaat ggatttcagg3360gatattcagt ggtaattgga ttgtactcat tgtcctctgt gtatttctat tgttctcctt3420ggttttacta agcattctct gtcccgtaag gaagcataaa aaatcagtcg acctgaatca3480cgcgtctcga ctcgacatgg caactatgga ggaattacag agggaaatca atgcccatga3540gggtcaatta gtgatagcca ggcagaaggt gagggatgca gaaaaacagt atgaaaagga3600tccagatgag ttgaacaaga gaacattaac tgaccgagag ggcgttgcag tatctatcca3660ggcaaaaatt gatgagttaa aaaggcaact ggcagatagg attgcaactg ggaaaaacct3720tgggaaggaa caagatccaa caggggtgga gcctggagac catctgaaag agaggtcaat3780gctcagttat ggtaatgtgc tggatttaaa ccatttggat attgatgaac ctacaggaca3840
gacagcagactggctgagca tcatcgtcta tcttacatcc tttgtcgtcc cgatacttct3900gaaagctctgtatatgttga caacaagggg gaggcaaact accaaggata ataaagggac3960ccggattcgatttaaggatg atagctcgtt cgaggatgtt aacggtatcc ggaaaccaaa4020acatctttacgtgtccttgc caaatgcaca gtcaagcatg aaggcagaag agattacacc4080tggtagatatagaacagcag tctgtgggct ctaccctgca cagattaagg cacggcagat4140gatcggtccagttatgagtg taattggttt tctagcatta gcaaaggact ggagtgatcg4200tatcgaacaatggttaattg aaccttgcaa gcttcttcca gatacagcag cagttcatca4260tcatcatcatcatgcggccg ccactgtgct ggatgatccg agctcggtac ctaaaccgct4320gatcagcctcgactgtgcct tctagtatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt4380gactggtattcttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc4440tttgtatcatgctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg4500gttgctgtctctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac4560tgtgtttgctgacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc4620cgggactttcgctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc4680ccgctgctggacaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa4740gctgacgtcctttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc4800cttctgctacgtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc4860ggctctgcggcctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg4920ggccgcctccccgcctgctt aagtttaaac cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt4980tgccagccatctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact5040cccactgtcctttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat5100tctattctggggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc5160aggcatgctggggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagcagatct5220gcagatctgaattcatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcattatggg5280tattatgggtctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg5340gcgctcttccgcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc5400ggtatcagctcactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg5460aaagaacatgtgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct5520ggcgtttttccataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca5580gaggtggcgaaacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct5640cgtgcgctctcctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc5700gggaagcgtggcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt5760tcgctccaagctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc5820cggtaactatcgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc5880cactggtaacaggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg5940gtggcctaactacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc6000agttaccttcggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag6060cggtggtttttttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga6120tcctttgatcttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat6180.
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttgatcc tccggcgttc 6240agcctgtgcc acagccgaca ggatggtgac caccatttgc cccatatcac cgtcggtact 6300gatcccgtcg tcaataaacc gaaccgctac accctgagca tcaaactctt ttatcagttg 6360gatcatgtcg gcggtgtcgc ggccaagacg gtcgagcttc ttcaccagaa tgacatcacc6420ttcctccacc ttcatcctca gcaaatccag cccttcccga tctgttgaac tgccggatgc6480cttgtcggta aagatgcggt tagcttttac ccctgcatct ttgagcgctg aggtctgcct6540cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa 6600gtgagggagc cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac6660ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac6720tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct6780gccagtgtta caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 6840actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 6900atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 6960cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt7020tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat7080gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 7140catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc7200tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 7260catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc7320cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 7380tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat7440tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 7500atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 7560aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat7620ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 7680atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttgtt7740gaataaatcg aacttttgct gagttgaagg atcagatcac gcatcttccc gacaacgcag 7800accgttccgt ggcaaagcaa aagttcaaaa tcaccaactg gtccacctac aacaaagctc7860tcatcaaccg tggctccctc actttctggc tggatgatgg ggcgattcag gcctggtatg 7920agtcagcaac accttcttca cgaggcagac ctcagcgcta gattattgaa gcatttatca 7980gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 8040ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgt8079
權(quán)利要求
一種用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0.7表達的腺病毒高表達載體，對含嵌合基因G2S0.7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0.7-pShuttle進行改建，將其CMV啟動子替換為CAG啟動子/增強子，得到含CAG啟動子/增強子的高表達漢坦病毒融合蛋白G2S0.7的腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體，命名為G2S0.7-pCAG，其全基因序列為SEQ ID NO1所示。
2.一種用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7表達的腺病毒高表達載體，對含嵌合基因 G2S0. 7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pShuttle進行改建，在其3，端插入WPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件， 得到含WPRE調(diào)控元件的高表達漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體，命名為 G2S0. 7-WPRE，其全基因序列為SEQ ID NO 2所示。
3.一種用于提高漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7表達的腺病毒高表達載體，對含嵌合基因 G2S0. 7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0. 7-pShuttle進行改建，將其CMV啟動子替換為CAG啟動子 /增強子，并在其3，端插入WPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，得到含CAG啟動子/增強子和WPRE調(diào)控元 件的高表達漢坦病毒融合蛋白G2S0. 7的腺病毒重組轉(zhuǎn)移載體，命名為G2S0. 7-pCAG-ffPRE, 其全基因序列為SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及腺病毒轉(zhuǎn)移載體的改建，特別是對含腎綜合征出血熱(HFRS)致病原——漢坦病毒(HV)的嵌合基因G2S0.7的pShuttle轉(zhuǎn)移載體進行改建，用于提高融合蛋白G2S0.7的表達。利用基因重組技術(shù)，將含嵌合基因G2S0.7的腺病毒轉(zhuǎn)移載體G2S0.7-pShuttle進行改建，包括將其CMV啟動子替換為CAG啟動子/增強子；或在其3’端插入WPRE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；或替換啟動子并插入WPRE調(diào)控元件。用本發(fā)明分別表達漢坦病毒融合蛋白G2S0.7，比較各組重組腺病毒中外源蛋白的表達水平。結(jié)果顯示本發(fā)明與原轉(zhuǎn)移載體pShuttle相比，均能有效提高融合蛋白G2S0.7的表達，且以替換啟動子組效果最明顯。
文檔編號C12N15/861GK101812479SQ20091025456
公開日2010年8月25日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者吳興安, 張芳琳, 徐志凱, 李凱, 李璞媛, 白文濤, 胡剛 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學