專利名稱：一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種利用親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用 于對目的細(xì)胞分選的方法。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)基礎(chǔ)研究以及臨床疾病的診斷都 需要從含有不同細(xì)胞的混合樣本中分離出純化細(xì)胞，現(xiàn)有的細(xì)胞分離技術(shù)主要有=Ficoll 密度梯度離心，離心洗滌，雙水相分離，這些方法都是利用細(xì)胞大小，密度，表面電荷等物理 性質(zhì)的特征加以分離，其缺點(diǎn)是難以獲得理想純度及回收率，而流式細(xì)胞儀分選雖然能獲 得很高的純度和回收率卻需要昂貴的儀器，且操作過程復(fù)雜費(fèi)時。而磁性復(fù)合微粒用于細(xì) 胞分選是近些年來迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)細(xì)胞分離的技術(shù)，就是將結(jié)合有抗體的磁性復(fù)合微 粒在混合細(xì)胞體系中利用抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物特異的結(jié)合，在外加磁場的作用下，將要 分離的目的細(xì)胞分離。但是目前的磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選也存在一些問題譬如，磁性 復(fù)合微粒存在對目的抗體外的蛋白的非特異性吸附，或者抗體結(jié)合量少等缺點(diǎn)，造成細(xì)胞 分選中分選的目的細(xì)胞純度和效率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用親和素/鏈親 和素磁性復(fù)合微粒用于對目的細(xì)胞分選的方法，該方法簡單迅速，不需昂貴的儀器，成本 低，并且對所結(jié)合細(xì)胞毒性小，不易使之失活；分選出的目的細(xì)胞純度高，并能夠用于后續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明提供的一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，包括以 下步驟(1)親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的預(yù)處理將親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中，磁性分離，棄上清；親和 素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒預(yù)處理三次為宜。(2)封閉向步驟(1)產(chǎn)物中加入封閉劑，反應(yīng)20-120分鐘，再用pH= 7.4，0.02M的磷酸鹽 緩沖液、三羥甲基氨基甲烷_鹽酸溶液或醋酸鹽緩沖液。(3)生物素化抗體與細(xì)胞的撫育取待分選的樣本細(xì)胞，加入生物素抗體，室溫反應(yīng)10-60分鐘，再以 800rpm-1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5 10分鐘，棄去上清中未結(jié)合的生物素抗體，將樣本細(xì)胞重 懸在偶聯(lián)緩沖液中；(4)細(xì)胞分選
(4. 1)目標(biāo)細(xì)胞和親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的結(jié)合將步驟(3)得到的結(jié)合有生物素抗體的待分選的樣本細(xì)胞與經(jīng)步驟(2)封閉處理 后的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微?；旌?，在20°C _35°C下孵育10-60分鐘，間隔5_10分 鐘輕輕晃動反應(yīng)管，避免磁粒的沉淀，使生物素與親和素或者鏈親和素充分的結(jié)合而將要 分離的目的細(xì)胞固定在親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的表面；(4. 2)清洗將步驟(4. 1)的反應(yīng)產(chǎn)物磁性分離，棄上清，加入清洗緩沖液，磁性分離，棄上清， 洗去未結(jié)合的細(xì)胞。上述步驟(1)平衡鹽溶液可選自PH = 7. 0-7. 6，0.02-0. 2M的三羥甲基氨基甲 烷_鹽酸溶液、PH = 7. 0-7. 6,0. 02-0. 2M的磷酸緩沖液PBS、N_2_羥乙基哌嗪-N，_2-乙磺 酸鹽溶液HEPES的一種，或者是加入了 0. 1-1. OM NaCl的上述溶液中的一種。上述步驟(2)封閉劑可選自濃度為1-10%的脫脂奶粉、1-5%的BSA、0. 2-2. 0%明 膠中的一種。上述步驟(3)偶聯(lián)緩沖液可選自pH = 7. 0-9. 0，5mM_lM的三羥甲基氨基甲烷-鹽 酸溶液 Tris-HCl、pH = 5. 0-8,0. 02-0. 2M 的磷酸緩沖液 PBS、pH = 9. 0-11. 0，5mM_lM 的碳 酸鹽緩沖液CBS、pH = 3. 6-5. 6，5mM_lM的醋酸鹽緩沖液、pH = 3. 0-7. 0，5mM_lM的檸檬酸 緩沖液或PH = 7. 0-9. 0，5mM-lM的TE緩沖液中的一種。上述步驟(4.2)清洗緩沖液可選自pH = 7.0-9.0，5mM_lM的三羥甲基氨基甲 烷-鹽酸溶液 Tris-HCl、pH = 5. 0-8,0. 02-0. 2M 的磷酸緩沖液 PBS、pH = 9. 0-11. 0，5mM_lM 的碳酸鹽緩沖液CBS、pH = 3. 6-5. 6，5mM_lM的醋酸鹽緩沖液、pH = 3. 0-7. 0，5mM_lM的檸 檬酸緩沖液或PH = 7. 0-9. 0，5mM-lM的TE緩沖液中的一種或者是含有0. 02-0. 2%吐溫的 上述緩沖液中的一種。上述樣本細(xì)胞可以是外周血，骨髓，臍帶血和淋巴組織液中的細(xì)胞。該方法的原理是要從混合細(xì)胞樣本中分離目的細(xì)胞，只要在實(shí)驗(yàn)體系中加入生 物素標(biāo)記的單抗，磁粒通過親和素/鏈親和素與生物素標(biāo)記的單抗結(jié)合，單抗與細(xì)胞表面 相應(yīng)抗原特異結(jié)合從而使細(xì)胞被磁粒捕獲，使用親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒便可以實(shí) 現(xiàn)對特定細(xì)胞的分離，達(dá)到純化分離細(xì)胞的目的。由于生物素_親和素，生物素_鏈親和 素具有系統(tǒng)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、適用范圍廣、實(shí)驗(yàn)成本低的特點(diǎn)，所以得到的親和素/鏈 親和素磁性復(fù)合微粒具有高生物素結(jié)合活性，在檢測技術(shù)中標(biāo)記量提高，且不易使生物分 子變性失活，進(jìn)一步提高了細(xì)胞分選的特異性。該方法操作簡便迅速，不需要大規(guī)模儀器， 且能獲很高純度和回收率。適用于分離外周血，骨髓，臍帶血和淋巴組織液中的感興趣的細(xì) 胞，并將它們用于細(xì)胞，免疫學(xué)基礎(chǔ)的研究和臨床診斷與治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、通過生物素與親和素或鏈親和素的特異結(jié)合可以減少非特異的吸附問題，能夠 高純度的分選得到目的細(xì)胞，對所結(jié)合的細(xì)胞毒性小，不影響細(xì)胞活力，能夠用于后續(xù)培養(yǎng)。2、結(jié)合磁粒的細(xì)胞可直接進(jìn)行流式檢測，或在目的細(xì)胞培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)使細(xì)胞磁珠分離，給后續(xù)的檢測分析及其培養(yǎng)提供方便。3、不需要昂貴的儀器，且操作過程簡單省時。


圖1是親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于外周血淋巴單個核細(xì)胞的陽性分選與 陰性分選經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后的結(jié)果柱狀圖，其中圖A是經(jīng)過親和素/鏈親和素磁性復(fù)合 微粒分選前的混合細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)量與光密度的的柱狀圖，圖B是經(jīng)過經(jīng)過親和素/鏈 親和素磁性復(fù)合微粒分選后的相對細(xì)胞數(shù)量與光密度的柱狀圖。圖C是分選后的上清液中 相對細(xì)胞數(shù)量與光密度的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式以下用具體實(shí)施例來對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并不是對本發(fā)明的保護(hù)范圍作限定。實(shí)施例利用親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于外周血淋巴單個核細(xì)胞(PBMC) 中的陽性分選(目的細(xì)胞是CD3)。待分選的樣本細(xì)胞是使用淋巴細(xì)胞分離液從抗凝血中提取外周血單個核細(xì)胞 (PBMC)，或者從淋巴組織中制備單細(xì)胞懸液。PBMC用加一定量的PBS(5%熱滅活胎牛血清， pH = 7. 4，0. 09% NaN3)搖勻，5000轉(zhuǎn)5min，重復(fù)上述操作洗3次，50um尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì) 胞團(tuán)塊和碎片，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1X107。(1)親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的預(yù)處理將親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中，平衡鹽溶液是pH = 7. 0，IM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(Tris-HCl)、磁性分離，棄上清；(2)封閉加入1 %的脫脂奶粉，反應(yīng)60min，再用PH = 7. 4，濃度為0. 02M的磷酸鹽緩沖液清 洗3次；(3)生物素化⑶3+抗體與細(xì)胞的撫育取上述待分選的樣本細(xì)胞中的外周血單個核細(xì)胞(IX IO7PBMC),加入適量生物素 化CD3+抗體，(1 X IO7PBMC中加入Iug抗體)，室溫反應(yīng)30min，再以IOOOrpm離心5min,棄 去上清中未結(jié)合的生物素抗體，加入Iml pH = 7. 4,0. 02M的磷酸緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞， IOOOrpm離心5min，棄上清，清洗2次；(4)細(xì)胞分選(4. 1)目的細(xì)胞和親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的結(jié)合將步驟(3)得到的結(jié)合有生物素抗體的待分選的樣本細(xì)胞與經(jīng)步驟(2)封閉處理 后的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微?；旌希?5°C下孵育30min，間隔5min輕輕晃動反應(yīng) 管，避免磁粒的沉淀，使生物素與親和素或者鏈親和素充分的結(jié)合而將目的細(xì)胞固定在親 和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的表面；(4. 2)清洗將步驟(4. 1)的反應(yīng)產(chǎn)物磁性分離5min，收集未被親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微 粒結(jié)合的細(xì)胞懸液至另一干凈的反應(yīng)管中，加入Iml pH = 7. 4,0. 02M的磷酸緩沖液(PBS) 重懸細(xì)胞，用移液器反復(fù)吹打磁粒。結(jié)合在磁粒上的細(xì)胞即為分選出的目的細(xì)胞，即表面表達(dá)⑶3+的細(xì)胞。
為了提高產(chǎn)率，可以將步驟(4.2)收集的未被親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒結(jié) 合的細(xì)胞懸液，加入Iml pH = 7. 4磷酸緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞，用移液器反復(fù)吹打磁粒后再 重復(fù)步驟(4.1)，合并兩次收集的細(xì)胞懸液，可直接上流式細(xì)胞檢測。用親和素/鏈親和素 磁性復(fù)合微粒對淋巴細(xì)胞中表達(dá)CD3的細(xì)胞分選前后用流式細(xì)胞儀的測定的結(jié)果如圖1所 示，其中圖A是經(jīng)過親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒分選前的混合細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)量與 光密度的的柱狀圖，圖B是經(jīng)過經(jīng)過親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒分選后的相對細(xì)胞數(shù) 量與光密度的柱狀圖。圖C是分選后的上清液中相對細(xì)胞數(shù)量與光密度的柱狀圖。從中可 以看出親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒對CD3的細(xì)胞分選是非常明顯的可以到達(dá)97.5%。 該方法中不需要大規(guī)模的儀器，成本低且操作簡便快捷。
權(quán)利要求
一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，該方法包括以下步驟(1)親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的預(yù)處理將親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中，磁性分離，棄上清；(2)封閉向步驟(1)產(chǎn)物中加入封閉劑，反應(yīng)20-120分鐘，再用pH＝7.4，0.02M的磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液或醋酸鹽緩沖液清洗；(3)生物素化抗體與細(xì)胞的孵育取待分選的樣本細(xì)胞，加入生物素抗體，室溫反應(yīng)10-60分鐘，再以800rpm-1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5～10分鐘，棄去上清中未結(jié)合的生物素抗體，將樣本細(xì)胞重懸在偶聯(lián)緩沖液中；(4)細(xì)胞分選(4.1)目的細(xì)胞和親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的結(jié)合將步驟(3)得到的結(jié)合有生物素抗體的待分選的樣本細(xì)胞與經(jīng)步驟(2)封閉處理后的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微?；旌希?0℃-35℃下孵育10-60分鐘，間隔5-10分鐘輕輕晃動反應(yīng)管，使生物素與親和素或者鏈親和素充分的結(jié)合而將要分離的目的細(xì)胞固定在親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的表面；(4.2)清洗將步驟(4.1)的反應(yīng)產(chǎn)物磁性分離，棄上清，加入清洗緩沖液，磁性分離，棄上清，洗去未結(jié)合的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，其特征 在于所述步驟(1)平衡鹽溶液是PH = 7. 0-7. 6,0. 02-0. 2M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶 液、pH = 7. 0-7. 6,0. 02-0. 2M的磷酸緩沖液、N-2-羥乙基哌嗪-N’ -2-乙磺酸鹽溶液，或者 是加入了 0. 1-1. OMNaCl的上述溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，其特征 在于所述步驟(2)封閉劑是濃度為1-10%的脫脂奶粉、1-5%的BSA或0.2-2.0%明膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，其特征 在于所述步驟⑶偶聯(lián)緩沖液是pH = 7.0-9.0，5福-說的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶 液、pH = 5. 0-8,0. 02-0. 2M的磷酸緩沖液、pH = 9. 0-11. 0，5mM_lM的碳酸鹽緩沖液、pH = 3. 6-5. 6，5mM-lM的醋酸鹽緩沖液、pH = 3. 0-7. 0，5mM_lM的檸檬酸緩沖液或pH = 7. 0-9. 0， 5mM-lM的TE緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，其特征 在于所述步驟(4. 2)清洗緩沖液是pH = 7. 0-9.0，5Mm-lM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶 液、pH = 5. 0-8,0. 02-0. 2M的磷酸緩沖液、pH = 9. 0-11. 0，5mM_lM的碳酸鹽緩沖液、pH = 3. 6-5. 6，5mM-lM的醋酸鹽緩沖液、pH = 3. 0-7. 0，5mM_lM的檸檬酸緩沖液或pH = 7. 0-9. 0， 5mM-lM的TE緩沖液或者是含有0. 02-0. 2%吐溫的上述緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，其特征 在于所述步驟(1)親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒預(yù)處理三次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于細(xì)胞分選的方法，其特征 在于所述樣本細(xì)胞是外周血，骨髓，臍帶血和淋巴組織液中的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于對目的細(xì)胞分選的方法。該方法是在實(shí)驗(yàn)體系中加入生物素標(biāo)記的單抗，磁粒通過親和素/鏈親和素與生物素標(biāo)記的單抗結(jié)合，單抗與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原特異結(jié)合從而使細(xì)胞被磁粒捕獲，達(dá)到純化分離細(xì)胞的目的。由于生物素-親和素，生物素-鏈親和素具有系統(tǒng)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、適用范圍廣、實(shí)驗(yàn)成本低的特點(diǎn)，所以得到的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒具有高生物素結(jié)合活性，在檢測技術(shù)中標(biāo)記量提高，且不易使生物分子變性失活，進(jìn)一步提高了細(xì)胞分選的特異性。通過生物素與親和素或鏈親和素的特異結(jié)合能夠高純度的分選得到目的細(xì)胞，該方法不需要昂貴的儀器，且操作過程簡單省時。
文檔編號C12N5/0786GK101845417SQ200910254488
公開日2010年9月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者丁海琴, 崔亞麗, 楊柳, 石峰, 陳超, 高啟祥 申請人:陜西北美基因股份有限公司