專利名稱：LE Green混合染料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈核苷酸檢測技術(shù)，具體涉及一種LE Green混合染料，本發(fā)明還涉 及采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法。
背景技術(shù)：
目前定量檢測DNA的方法有分光光度法，檢測260nm處的吸光值，DNA含量二 0D260 X 50 g/ml ，但此方法操作比較復(fù)雜，而且誤差較大；另一種常用方法是利用溴化乙 錠結(jié)合DNA分子，在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，熒光強(qiáng)度與DNA量成正比，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線， 可對(duì)進(jìn)行DNA定量分析，由于溴化乙錠是致癌物質(zhì)，不宜推廣。 目前人們改用SYBR Green I和SYBR Gold為染料的熒光定量檢測DNA。由于這兩 種熒光染料只與DNA雙鏈結(jié)合，在與DNA雙鏈結(jié)合后發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA雙鏈產(chǎn)物量 成正比，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行DNA定量分析。但由于一般染料不穩(wěn)定，高溫降解，見光易分 解，發(fā)射光的光譜寬，光穩(wěn)定性差，檢測本底高，準(zhǔn)確度較低，也不宜推廣。為此必須尋找一 種能快速、高效、安全的定量檢測DNA的方法。 LC Green是綠色熒光核酸染料，激發(fā)波長為440 470nm，發(fā)射波長為470 520nm， LC Green熒光染料特異性的與DNA雙鏈結(jié)合后，在激發(fā)波長作用下能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的 熒光，這種特性使它特別適合于常規(guī)的DNA濃度確定。在實(shí)驗(yàn)過程中，需要加入的濃度很 少，可以降低實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)，LC Green染料與DNA結(jié)合后對(duì)PCR反應(yīng)無任何抑制作用，但 其它染料，如SYBR Green I對(duì)PCR有抑制作用，所以對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有一定的影響。LC Green 在高溫條件下不易分解，熱穩(wěn)定性良好，且與DNA結(jié)合穩(wěn)定，為常規(guī)操作提供了便利。
Eva Green也是一種綠色熒光核酸染料，當(dāng)染料和DNA結(jié)合后，其激發(fā)和發(fā)射光譜 與熒光素以及LC Green相似。這使得這兩種染料可以直接采用配置了 488nm氬離子激光 器或者此光譜區(qū)域內(nèi)任何可見光激發(fā)裝置的儀器檢測。Eva Green有良好的熱穩(wěn)定性和水 解穩(wěn)定性；其本身沒有熒光，但和雙鏈DNA結(jié)合后能發(fā)出高亮度的熒光，這種特性使它非常 適合于常規(guī)DNA濃度的確定。Litron獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室(Litron Laboratories, Rochester, NY) 進(jìn)行的艾姆斯氏測試結(jié)果表明，Eva Green沒有誘變性和細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)顯示，Eva Green 完全沒有細(xì)胞膜透性，這可能是觀察到低毒性的關(guān)鍵因素。然而將Eva Green染料用于雙 鏈核酸的檢測手段仍不健全，在實(shí)際應(yīng)用中難以取得好的染色效果。為此必須尋找一種能 快速、高效、安全的定量檢測雙鏈核酸如基因組DNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述不足提供一種簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的核酸 染料，以及采用該染料定量檢測雙鏈核酸如基因組DNA的方法。 本發(fā)明將LC Green和Eva Green按比例稀釋成LE Green染料Mix利用LE Green 與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光，且熒光的強(qiáng)度與DNA的量成正相關(guān)性來定量檢測雙鏈核酸如基 因組DNA，通過將LEGreen染料Mix與待測雙鏈核苷酸溶液混合避光室溫孵育，檢測其熒光
3強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，得到待測雙鏈核苷酸溶液的濃度。 其中，LE Green染料溶液Mix的配制方案是 Na2HP04 0 . 01 0. 03mol/L NaH2P04 0 . 01 0. 03mol/LNaCl 0. 15 0. 25mol/L EDTA 2Na 1. 5 3. 5,1/L PVP 0.05-0. 20%TritonX-100 0.05-0.15% Eva Green 2. 0 4. 0 u mol/L LC Green 1. 0 3. 0 u mol/L 甘油 3 8% 最后用磷酸調(diào)pH至7.0 7. 5 其余為雙蒸水。 所述LE Green染料溶液Mix的配制優(yōu)選方案為 Na2HP04 0 . 02mol/L NaH2P04 0 . 02mol/L NaCl 0. 20mol/L EDTA 2Na 2. 5,1/L PVP 0. 1 % TritonX-1000. 1% Eva Green 3. On mol/L LC Green 2. On mol/L 甘油 5% 最后用磷酸調(diào)pH至7. 3 其余為雙蒸水。 可采用Modulus多功能光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或?qū)崟r(shí)定量PCR儀檢測熒光信號(hào)。
本發(fā)明所述的雙鏈核苷酸包括基因組DNA或其片斷、質(zhì)粒DNA或其片斷以及人工 雙鏈序列。 以Modulus多功能光度計(jì)為例，利用LE Green混合染料對(duì)雙鏈核酸進(jìn)行精確定 量，具體可包括如下步驟 1)將DNA標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品配制成系列濃度的50 L溶液，在每個(gè)溶液中加入 50iiL LE Green Mix，充分混合。 2)在Modulus多功能光度計(jì)上選擇藍(lán)色模塊，先測DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光值，建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線。 3)然后對(duì)未知樣品DNA進(jìn)行檢測，Modulus直接得出濃度值。
將LC Green和Eva Green按比例混合稀釋為LE Green混合染料可以在Modulus 的藍(lán)色模塊中定量雙鏈核酸的濃度，兩種染料可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，應(yīng)用LE Green染料Mix能對(duì) 至少100 ii 1樣品的雙鏈DNA直接定量。Modulus多功能光度計(jì)的檢測靈敏度為100 樣 品中50pg的DNA。即使在核酸制備過程中引入了鹽、尿素、乙醇、氯仿、去污劑、蛋白或瓊脂等常見的幾種污染物，這種檢測結(jié)果的線性仍能獲得。實(shí)驗(yàn)檢測中的RNA和單鏈DNA產(chǎn)生 的熒光量極小，當(dāng)用LEGreen染料Mix和Modulus多功能光度計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)相同克分 子數(shù)的單鏈DNA和RNA對(duì)定量結(jié)果幾乎沒有什么影響。
本發(fā)明所述方法的優(yōu)點(diǎn) 1)采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法操作簡單，快速。它對(duì)所有樣品的 DNA定量具有廣泛的適應(yīng)性。 2)采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法具有較高的靈敏度，可以檢測出 pg級(jí)的DNA模板。 3)采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法操作對(duì)所有樣品的DNA定量具有 廣泛的適應(yīng)性。即使在核酸制備過程中引入了鹽、尿素、乙醇、氯仿、去污劑、蛋白或瓊脂等 常見的幾種污染物，這種檢測結(jié)果的線性仍能獲得。


圖1小牛胸腺DNA濃度與熒光值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖2小牛胸腺雙鏈核酸濃度靈敏度曲線圖。
具體實(shí)施方案 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因組DNA的制備 以植物為例，采用CTAB法提取基因組DNA，稱取200mg經(jīng)預(yù)處理的試樣，在液氮中 充分研磨后裝入液氮預(yù)冷的1. 5mL或2mL離心管中(不需研磨的試樣直接加入)。加入lmL 預(yù)冷至4°C的抽提液，劇烈搖動(dòng)混勻后，在冰上靜置5min， fC條件下10000g離心15min，棄 上清液。加入600 ii L預(yù)熱到65°C的裂解液，充分重懸沉淀，在65t:恒溫保持40min，期間顛 倒混勻5次。室溫條件下，10000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)至另一新離心管中。加入L RNaseA，37。C恒溫保持30min。分別用等體積酚氯仿異戊醇(25 : 24 : 1)，反復(fù)抽提 兩次，再用氯仿/異戊醇(24 : l)抽提一次。室溫條件下，10000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn) 至另一離心管中。加入2/3體積異戊醇，1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液(pH5. 6) ，-20。C放置 2-3h。在4t:條件下，10000g離心15min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇， 晾干沉淀。加入50 ii L TE (pH8. 0)溶解沉淀，所得溶液即為樣品DNA溶液。
實(shí)施例2LE Green染料Mix制備與使用方法 LE Green染料Mix溶液的配方1如下Na2HP04 0 . 02mol/L ;NaH2P04 0 . 02mol/ L;NaCl 0.20mol/L ;EDTA 2Na 2.5mmol/L ;PVPO. 1 % ;TritonX-lOO 0. 1 % ;Eva Green 3. 0 ii mol/L ;LC Green 2. 0 y mol/L ;甘油5% ;最后用磷酸調(diào)pH至7. 3 ;其余為雙蒸水。
LE Green染料Mix溶液的配方2如下:Na2HP04 0. Olmol/L ;NaH2P04 0. Olmol/L ; NaCl 0.15mol/L ;EDTA 2Na 1.5mmol/L ;PVP 0. 05 % ;TritonX-lOO 0. 05 % ;Eva Green 2. 0 ii mol/L ;LC Green 1. 0 y mol/L ;甘油3% ;最后用磷酸調(diào)pH至7. 0 ;其余為雙蒸水。
LE Green染料Mix溶液的配方3如下Na2HP04 0 . 03mol/L ;NaH2P04 0 . 03mol/ L ;NaCl 0.25mol/L ;EDTA 2Na 3. 5mmol/L;PVPO. 2 % ;TritonX-lOO 0. 15 % ;Eva Green 4. 0 ii mol/L ;LC Green 3. 0 y mol/L ;甘油8% ;最后用磷酸調(diào)pH至7. 5 ;其余為雙蒸水。
LE Green濃縮染料是LC Green和Eva Green染料混合后的Mix溶液。溶液制備 需用塑料器皿不能用玻璃器皿，因?yàn)樵噭┲心承┏煞謺?huì)吸附到玻璃器皿表面。用箔金紙包 裹或放置黑暗處避光保存。 注溶液在制備后數(shù)小時(shí)內(nèi)使用檢測結(jié)果會(huì)比較好。實(shí)施例3DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白 對(duì)照液和樣品DNA溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。小牛胸腺DNA常用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備濃度為400ng/mL的溶液。 將等體積的小牛胸腺DNA儲(chǔ)存液加入到的LEGreen Mix工作液中，充分混合，標(biāo)準(zhǔn)液最終濃 度200ng/ml。 空白對(duì)照液的準(zhǔn)備。加入相同體積的樣品緩沖液到LE Green Mix工作液中，充分 混合。 樣品DNA溶液的準(zhǔn)備。加入相同體積的樣品到LE Green Mix工作液中，充分混合。
實(shí)施例4基因組DNA樣品測定
1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線將終濃度濃度為12. 5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)DNA溶
液轉(zhuǎn)到100 ill微量檢測皿中，避光室溫孵育2-5min，注意轉(zhuǎn)移過程中不要引入氣泡。點(diǎn)擊
"MeasureFluorescence"，樣品最終結(jié)果會(huì)顯示在功能機(jī)顯示屏上，圖1為小牛胸腺DNA濃
度與熒光值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 2)校準(zhǔn)Modulus多功能光度計(jì) 以Modulus多功能光度計(jì)為例，采用用150ng/ml標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行校準(zhǔn)。 注單點(diǎn)校準(zhǔn)精確度會(huì)更高，用一個(gè)和檢測樣品濃度相同或相近的標(biāo)準(zhǔn)樣優(yōu)化系
統(tǒng)，例如，若檢測樣品濃度在100ng/ml，要用一個(gè)50 150ng/ml標(biāo)準(zhǔn)DNA樣。保存這次校
準(zhǔn)以供將來使用。 3)樣品分析 樣品加入100 ii 1微量檢測皿中，點(diǎn)擊"Measure Fluorescence",樣品最終結(jié)果會(huì) 顯示在功能機(jī)顯示屏上，采用LE Green染料Mix溶液的配方1、配方2、配方3，測得基因組 DNA的濃度分別為155ng/ml， 163ng/ml， 159ng/ml。
實(shí)施例5準(zhǔn)確度測定 制備小牛胸腺DNA濃度為300ng/ml的溶液。將等體積的小牛胸腺DNA儲(chǔ)存液加 入到的LE Green Mix工作液中，充分混合，標(biāo)準(zhǔn)液最終濃度150ng/ml。采用上述方法測定， 最終測得濃度(三次平均值)為149.8ng/ml。
實(shí)施例6靈敏度測定 制備小牛胸腺DNA濃度為6. 4ng/ml的溶液。梯度稀釋成濃度為3. 2ng/ml、l. 6ng/ ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml的溶液，將等體積的小牛胸腺DNA儲(chǔ)存液加入到的LE Green Mix 工作液中，充分混合，終濃度為3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml。經(jīng) Modulus多功能光度計(jì)測定，得到圖2小牛胸腺雙鏈核酸濃度靈敏度曲線圖，靈敏度可達(dá)到 0. 4ng/ml (低于0. 4ng/ml，讀數(shù)接近于0)。
權(quán)利要求
一種LE Green染料溶液Mix，其含有下列組分Na2HPO4 0.01～0.03mol/LNaH2PO4 0.01～0.03mol/LNaCl 0.15～0.25mol/LEDTA·2Na 1.5～3.5mmol/LPVP 0.05-0.20％TritonX-100 0.05-0.15％Eva Green 2.0～4.0μmol/LLC Green 1.0～3.0μmol/L甘油 3～8％最后用磷酸調(diào)pH至7.0～7.5其余為雙蒸水。
2. 如權(quán)利要求1所述的LE Green染料溶液Mix,其含有下列組分 Na2HP04 0 . 02mol/LNaH2P04 0 . 02mol/LNaCl 0. 20mol/LEDTA 2Na2. 5,1/L PVP 0. 1 %TritonX-100 0.1% Eva Green3. Oumol/L LC Green 2. O踐ol/L甘油 5% 最后用磷酸調(diào)pH至7.3 其余為雙蒸水。
3. 權(quán)利要求1或2所述LE Green染料溶液Mix在雙鏈核苷酸定量檢測中的應(yīng)用。
4. 一種雙鏈核苷酸定量檢測的方法，其包括步驟用權(quán)利要求1或2所述的采用LE Green染料Mix與待測雙鏈核苷酸溶液混合避光室溫孵育，檢測其熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲 線進(jìn)行比對(duì)，得到待測雙鏈核苷酸溶液的濃度。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，孵育時(shí)間為2 5min。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，還包括將所述待測雙鏈核苷酸溶液配制 成系列濃度的樣品，然后分別與LE Green染料溶液Mix混合孵育。
7. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是以小牛胸腺DNA為標(biāo)準(zhǔn) 物建立。
8. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，采用Modulus多功能光度計(jì)、熒光酶標(biāo) 儀或?qū)崟r(shí)定量PCR儀檢測熒光信號(hào)。
9. 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述雙鏈核苷酸為基因組DNA或其片 斷、質(zhì)粒DNA或其片斷或人工雙鏈序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了LE Green混合染料及其在雙鏈核酸檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明核酸染料是由LC Green和Eva Green與適當(dāng)?shù)南♂屢号渲枚伞㈦p鏈核酸模板(基因組DNA，質(zhì)粒DNA等)與合適濃度的熒光染料LE Green Mix混合，利用Modulus分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀等熒光檢測儀器對(duì)染料與純化的雙鏈核酸結(jié)合后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明和傳統(tǒng)的雙鏈核酸紫外測定法相比更快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定。且較一般的雙鏈核酸熒光測定方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，能夠快速對(duì)雙鏈核酸如基因組DNA進(jìn)行定量檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101724295SQ20091024148
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月3日
發(fā)明者商穎, 張南, 白衛(wèi)濱, 石慧, 羅云波, 許文濤, 黃昆侖 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)