專利名稱：一種雞球蟲種類快速鑒定的多重pcr方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種雞球蟲種類快速鑒定的多重PCR方 法，以及檢測(cè)用試劑盒。
背景技術(shù)：
雞球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)的一種或數(shù)種球蟲寄生于雞消化道上皮細(xì)胞 內(nèi)引起的一種原蟲病，在國內(nèi)外廣泛流行，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重大疾病。寄生于雞的球蟲 公認(rèn)的種類有7種，分別是柔嫩艾美球蟲、堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、毒害艾美球蟲、布 氏艾美球蟲、和緩艾美球蟲和早熟艾美球蟲。其中，巨型艾美球蟲、柔嫩艾美球蟲和堆型艾 美球蟲流行最廣泛。在自然情況下，雞球蟲往往混合感染。因此，雞球蟲蟲種的鑒別對(duì)該病 的診斷與防治具有重要意義。雞球蟲種類的鑒定，傳統(tǒng)方法是以卵囊形態(tài)、致病性、寄生部 位、腸道病變特征等為鑒別指標(biāo)。由于球蟲受到遺傳和環(huán)境等因素的影響，這些鑒別指標(biāo)有 時(shí)會(huì)發(fā)生變異，因而不能作為蟲種鑒別的精確指標(biāo)，且用傳統(tǒng)方法鑒別雞球蟲種類需三周 時(shí)間，鑒別者還應(yīng)熟練掌握有關(guān)雞球蟲病的背景知識(shí)。真核生物的rDNA為串聯(lián)重復(fù)序列，約100 200個(gè)拷貝，包括編碼28S RNA、 18S RNA和5. 8S RNA的基因，組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，產(chǎn)生一個(gè)前體RNA。在形成rRNA時(shí)， 有兩段RNA被剪切，第一段位于5. 8S和18S rRNA之間的片段，稱之為ITS-Kinternal transcribespacerl)即核糖體RNA第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。第二段位于5. 8S和28SrRNA之間， 被稱之謂核糖體RNA第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，即ITS-2 (internal transcribed spacer2)。ITS-1 區(qū)和ITS-2區(qū)，進(jìn)化較快，具有一定的種間特異性和種內(nèi)保守性，是進(jìn)行種間分類的極好材 料。PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。因此，可設(shè)計(jì)特異性的引物擴(kuò)增和比較ITS 序列，來快速鑒定形態(tài)學(xué)上難以區(qū)別的近緣種。雞球蟲在分類上屬于原生動(dòng)物界，為真核生物，可根據(jù)ITS序列設(shè)計(jì)種特異性引 物，用PCR方法來鑒別雞球蟲種類。用單一 PCR的方法來鑒別球蟲種類在國內(nèi)外見有報(bào)道， 但在生產(chǎn)實(shí)際中雞球蟲往往混合感染，因此，用單一 PCR方法來鑒別臨床樣品中的球蟲種 類，則需對(duì)同一樣品進(jìn)行針對(duì)不同種類的多次PCR，這既增加了成本，又耗時(shí)費(fèi)力。多重PCR 方法是將數(shù)種球蟲的種特異性引物加到同一個(gè)反應(yīng)體系中，通過優(yōu)化反應(yīng)條件如MgCl2濃 度、退火溫度、變性溫度、變性時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等，一次反應(yīng)就能檢測(cè)出 同一樣品中不同的雞球蟲種類，真正做到簡便、快速，適用于生產(chǎn)實(shí)際，為雞球蟲病的臨床 診斷、藥物防治、疫苗類型的選擇及流行病學(xué)調(diào)查等提供一種快速有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有雞球蟲種類鑒定存在的時(shí)間長，不夠準(zhǔn)確的問題。本發(fā)明應(yīng)用球蟲 ITS序列具有種間特異性和種內(nèi)保守性的特點(diǎn)，以及PCR技術(shù)具有簡便、快速、靈敏度高的 優(yōu)點(diǎn)，建立一種以ITS-I序列為靶序列的多重PCR快速鑒定雞球蟲種類的方法。本發(fā)明根據(jù)GenBank中發(fā)表的巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲ITS-I序列，設(shè)計(jì)了 3對(duì)種特異性引物，建立了這3種球蟲的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)該方法 的特異性和敏感性進(jìn)行了研究，對(duì)3種球蟲的混合卵囊與臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)，顯示該方 法能擴(kuò)增出巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲特異性條帶，其大小分別 為151bp、463bp、303bp，其最小檢測(cè)濃度為0. 5ng，對(duì)水牛梭形肉孢子蟲、有毒艾美耳球蟲、 豬源弓形蟲湯山株及其田間分離株均不起反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性和較高的敏感性。完成 檢測(cè)的時(shí)間最多需要2天。一種雞球蟲種類多重PCR快速檢測(cè)方法，是以待測(cè)樣本DNA為模板，以SEQ ID NO. 1-6的序列為引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物過瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶判定樣 本種類；其中151bp、463bp、303bp大小條帶，分別為巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆 型艾美耳球蟲檢測(cè)陽性。上述方法中所說的多重PCR反應(yīng)的具體條件是在0. 5mL的Eppendorf管中依 次加入下列試劑=IOXbuffer, MgCl2,4X dNTPs，序列分別如SEQ ID NO. 1-6所示的引物， TaqDNA聚合酶，摸板DNA，滅菌去離子水，反應(yīng)總體積為25 μ L，混勻，瞬離，加入20 μ L礦 物油；將Eppendorf管置于PCR儀中，循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性4min，94°C 45s, 55 °C 30s， 72°C lmin，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。待測(cè)樣本DNA的準(zhǔn)備是常規(guī)的，可以先從雞糞中分離純化出卵囊，再用超聲波細(xì) 胞粉碎儀裂解卵囊壁，然后提取卵囊總DNA。更為具體的待測(cè)樣品的準(zhǔn)備和前處理步驟是①分離純化卵囊在雞舍分點(diǎn)采集新鮮雞糞約250g，按常規(guī)方法分離卵囊；卵囊經(jīng) 次氯酸鈉滅菌處理后，用1. IrnM蔗糖溶液漂浮，用滅菌水洗滌6次。②提取DNA用超聲波細(xì)胞粉碎儀裂解卵囊壁，然后按商品化試劑盒或自行配置的 提取液提取DNA。本發(fā)明還提供了用于該檢測(cè)方法的試劑盒，所說的試劑盒包括巨型艾美耳球蟲、 柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲DNA陽性對(duì)照，PCR反應(yīng)液。PCR反應(yīng)液包括1號(hào)液 (IOXbuffer)、2 號(hào)液(25mM MgCl2)、3 號(hào)液(2. 5mM 4XdNTPs)、4 號(hào)液(50pmol 巨型艾美耳 球蟲上游引物)、5號(hào)液(50pmol巨型艾美耳球蟲下游引物)、6號(hào)液(50pmol柔嫩艾美耳球 蟲上游引物)、7號(hào)液(50pmol柔嫩艾美耳球蟲下游引物)、8號(hào)液(50pmol堆型艾美耳球蟲 上游引物)、9號(hào)液(50pmol堆型艾美耳球蟲下游引物)、10號(hào)液(5U/μ L TaqDNA聚合酶)、 11號(hào)液(滅菌去離子水)、12號(hào)液(礦物油)。試劑盒的操作步驟如下(1)加樣體系在0. 5mL的Eppendorf管中依次加入下列試劑1號(hào)液2. 5 μ L，2號(hào) 液 3 μ L，3 號(hào)液 1 μ L，4、5、6、7、8、9 號(hào)液各 1 μ L，10 號(hào)液 0. 5 μ L，11 號(hào)液 IlyL,提取的 DNA 摸板1 μ L0反應(yīng)總體積為25 μ L0混勻，瞬離，加入12號(hào)液20 μ L。(2)反應(yīng)程序94°C 預(yù)變性4min 72°C 延伸7min。(3)取5μ LPCR產(chǎn)物，混合1 μ L上樣緩沖液，2. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物， 以50bp DNA分子量Marker為參考。(4)結(jié)果判定出現(xiàn)151bp、463bp、303bp大小條帶，定為巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾 美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲檢測(cè)陽性，否則判為陰性。本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)鑒定雞球蟲種類的方法相比具有下列優(yōu)點(diǎn)①快速用傳統(tǒng)鑒定方法，從雞場(chǎng)采集糞樣分離出球蟲卵囊后，首先對(duì)卵囊進(jìn)行孢 子化培養(yǎng)(需3天)；其次觀察孢子化卵囊，進(jìn)行初步鑒定(需3天)；將孢子化卵囊接種無 球蟲感染的雛雞(15日齡)，80小時(shí)后每間隔數(shù)小時(shí)糞檢一次卵囊，同時(shí)每間隔12小時(shí)剖 檢雞2只，觀察其腸道病變(需7天)；對(duì)排出的卵囊進(jìn)行分離、培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察鑒定。用 本發(fā)明的方法，分離出的卵囊不需進(jìn)行孢子化培養(yǎng)，直接純化后提取DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反 應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外光下觀察結(jié)果(需2天)。②準(zhǔn)確用傳統(tǒng)鑒定方法，按上述步驟鑒定出的有些球蟲種類還不能完全確定，需 要進(jìn)一步的做同工酶分析、雞胚接種等試驗(yàn)。用本發(fā)明的方法，由于設(shè)計(jì)的引物有種特異 性，擴(kuò)增出的目的片段明顯不同，易于觀察。③敏感用傳統(tǒng)鑒定方法，當(dāng)一種球蟲占糞樣中總卵囊的比例很小時(shí)，用顯微鏡直 接觀察到的概率極小，出現(xiàn)假陰性。用本發(fā)明的方法，最小檢出的模板DNA濃度為0. 5ng,相 當(dāng)于球蟲的2個(gè)卵囊。


圖1是已知樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果，Lane 1 :50bp Marker ；Lane 2 從上至下分別 為巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲與堆型艾美耳球蟲圖2是臨床樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果，Lane 1 :50bp Marker ；Lane 2 1號(hào)樣品；Lane 3 2號(hào)樣品
具體實(shí)施例方式本發(fā)明方法中所需的試劑與器材主要試劑TaqDNA酶、10 Xbuffer、Mg2+、dNTP (均為 Sangon 產(chǎn)品)； ProteinaseK(Merck 公司產(chǎn)品)；RNAase A(Amresco /feBnn ) ；50bp DNA Ladder (MBI 產(chǎn)品)； 酚氯仿(BBI產(chǎn)品)；瓊脂糖(Promega產(chǎn)品)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器及設(shè)備臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；超凈工作臺(tái)；梯度PCR擴(kuò)增儀(美國MJ公 司)、DYY-2型電泳儀(北京六一儀器廠)、GIS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。實(shí)施例11、引物設(shè)計(jì)與合成從Genbank中獲得巨型艾美耳球蟲(EUR，AF065095)、柔嫩艾美 耳球蟲(EUR，AF026388)和堆型艾美耳球蟲(EUR，AF026384) ITSl序列，使用DNAstar3. O分 子生物學(xué)軟件分析，設(shè)計(jì)種特異性引物并由寶生物(大連)工程公司合成。巨型艾美耳球蟲上游引物5，-TTGTGGGGCATATTGTTGTG-3，(SEQID NO. 1)下游引物5，-CAATGAGGCACCACATGTCT-3，(SEQID NO. 2)
5
預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為151bp。柔嫩艾美耳球蟲上游引物5，-CGCTGCTGGTTTTACAGGTT-3，(SEQ ID NO. 3)下游引物5，-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3，(SEQ ID NO. 4)預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為463bp。堆型艾美耳球蟲上游引物5，-CTGCGAGGGAACGCTTAAT-3，(SEQ ID NO. 5)下游引物5，-AACGAACGCAATAACACACG-3，(SEQ ID NO. 6)預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為303bp。2、球蟲卵囊的分離與純化將糞樣置于干凈的燒杯中，加入少量清水?dāng)嚢杈鶆?，?0目銅篩和260目尼龍篩 兜分別過濾，棄糞渣，將濾液靜置30min后傾棄上層液，保留沉淀物；取沉淀物置于離心管， 加飽和食鹽水?dāng)嚢杈鶆颍?000rpm離心8min，吸取漂浮至液面的卵囊至另一離心管；加生理 鹽水?dāng)嚢杈鶆颍?000rpm離心8min，傾棄上層液，保留沉淀物；沉淀物中加次氯酸鈉(次氯酸 鈉卵囊液=1:4)，攪拌均勻后靜置15min，滅菌水洗滌3次，每次3000rpm離心8min ； 取沉淀物，加1. ImM蔗糖溶液攪拌均勻，3000rpm離心8min，吸取漂浮至液面的卵囊至另一 離心管中，滅菌水離洗滌6次，每次3000rpm離心8min ；純化卵囊4°C保存?zhèn)溆谩?、提取球蟲卵囊的總DNA純化的卵囊+500yL消化液+6yL蛋白酶K(56°C溫浴過夜)一IORnase (37 °C, Ih)—加等體積水飽和的酚氯仿異戊醇(25 24 1)—振動(dòng)5min— 12000rpm, IOmin —上清轉(zhuǎn)移至另一離心管+同體積氯仿異戊醇，拌均勻，2min — 12000rpm, 5min — 上清轉(zhuǎn)移至另一離心管(約400 μ L) +40 μ L NaAc (1/10體積)+ImL冰凍無水乙醇(2. 5倍 體積)一-200C，2h — 12000rpm, IOmin —干燥(打開風(fēng)機(jī))一加TE溶解一1 %瓊脂糖電泳 分析。4、多重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件在0. 5mL 的 Eppendorf 管中依次加入下列試劑10 X buffer 2. 5 μ L, MgCl2 3yL(25mM),4XdNTPs lyL(2. 5mM each)，巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美 耳球蟲的上下游引物各1 μ L(50pmol)，TaqDNA聚合酶0. 5 yL(5U/yL)，巨型艾美耳球蟲、 柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲的DNA摸板各1 μ L，滅菌去離子水9 μ L，反應(yīng)總體積為 25 μ L。混勻，瞬離，加入 20 μ L礦物油。反應(yīng)過程94°C4min ；94°C 45s, 55°C 30s, 72°C lmin, 35個(gè)循環(huán)，72°C 7min ；PCR產(chǎn)物4°C保存。5、電泳分析反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物進(jìn)行2. 5%瓊脂糖凝膠，60V電泳lh，EB染色后后紫外光下觀察 結(jié)果。擴(kuò)增出的巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲特異性條帶大小，分別 為 151bp、463bp、303bp。6、對(duì)已知樣品樣品的檢測(cè)結(jié)果將巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲卵囊混合，提取DNA模板， 按發(fā)明的多重PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到3種球蟲的特異性條帶(圖1)。實(shí)施例2、檢測(cè)用試劑盒
試劑盒包括巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲DNA陽性對(duì) 照，PCR反應(yīng)液。PCR反應(yīng)液包括1號(hào)液(IOXbuffer)、2號(hào)液(25mM MgCl2)、3號(hào)液 (2. 5mM4XdNTPs)、4號(hào)液(50pmol巨型艾美耳球蟲上游引物)、5號(hào)液(50pmol巨型艾美耳 球蟲下游引物)、6號(hào)液(50pmol柔嫩艾美耳球蟲上游引物)、7號(hào)液(50pmol柔嫩艾美耳球 蟲下游引物)、8號(hào)液(50pmol堆型艾美耳球蟲上游引物)、9號(hào)液(50pmol堆型艾美耳球蟲 下游引物)、10號(hào)液(5U/yL TaqDNA聚合酶)、11號(hào)液(滅菌去離子水)、12號(hào)液(礦物 油)。試劑盒中三種陽性模板的制備巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲純種卵囊分別接種無球蟲雛 雞，擴(kuò)增卵囊，按常規(guī)方法分離純化后按下列步驟提取卵囊的總DNA 純化的卵囊+500yL消化液+6yL蛋白酶K(56°C溫浴過夜)一IORnase (37 °C, Ih)—加等體積水飽和的酚氯仿異戊醇(25 24 1)—振動(dòng)5min— 12000rpm, IOmin —上清轉(zhuǎn)移至另一離心管+同體積氯仿異戊醇，拌均勻，2min — 12000rpm, 5min — 上清轉(zhuǎn)移至另一離心管(約400 μ L) +40 μ L NaAc (1/10體積)+ImL冰凍無水乙醇(2. 5倍 體積)一-200C，2h — 12000rpm, IOmin —干燥(打開風(fēng)機(jī))一加TE溶解一1 %瓊脂糖電泳 分析。本發(fā)明中所說的巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲純種卵囊本 領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)傳統(tǒng)方法分離鑒定得到。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中所用的純種是發(fā)由明人分離鑒 定并保存的(陶建平，沈永林，李文超，等.巨型艾美耳球蟲(Eimeria maxima)地理株研 究I.十一株巨型艾美耳球蟲的分離與基本特征.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24 (4) :349 351.) (陶建平，符敖齊.柔嫩艾美爾球蟲和巨型艾美爾球蟲的分離與鑒定.畜牧與獸醫(yī)，1997， 29(6) 248 249.)實(shí)施例3 對(duì)臨床樣本的檢測(cè)采集不同點(diǎn)的新鮮雞糞樣兩份，分別將糞樣置于干凈的燒杯中，加入少量清水?dāng)?拌均勻，用60目銅篩和260目尼龍篩兜分別過濾，棄糞渣，將濾液靜置30min后傾棄上層 液，保留沉淀物，得到1號(hào)樣品和2號(hào)樣品，將1號(hào)和2號(hào)樣品分成兩份，分別用本發(fā)明的試 劑盒及方法與傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行雞球蟲種類的檢測(cè)利用本發(fā)明試劑盒及方法的操作如前所述，檢測(cè)結(jié)果如圖2，從1號(hào)樣品中檢出巨 型艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲，從2號(hào)樣品中檢出堆型艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲。對(duì)兩個(gè)臨床樣品中雞球蟲種類的傳統(tǒng)鑒定方法如下(1)卵囊分離與培養(yǎng)采集新鮮糞樣，置于干凈的燒杯中，再加入適量的清水?dāng)嚢杈鶆?，分別經(jīng)60目銅 絲篩和260目尼龍篩過濾。收集濾液自然沉淀30min，傾去上清得到沉淀物。沉淀物中加入 等量的5%重鉻酸鉀，放入29°C的恒溫箱中培養(yǎng)3 5d，使卵囊進(jìn)行孢子化發(fā)育。(2)初次種類鑒定取培養(yǎng)后的卵囊液轉(zhuǎn)入離心管中，3000rpm離心Smin后傾棄上清液，沉淀物用清 水洗滌一次。隨后沉淀物中加入飽和食鹽水，攪勻，靜置3 5min，3000rpm離心8min。吸 取漂浮至液面的卵囊至另一離心管中，清水洗滌3次，每次3000rpm離心8min。取卵囊液做 一涂片鏡檢，在10X 10或10X40下詳細(xì)觀察球蟲卵囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，測(cè)量卵囊大小，參照文獻(xiàn)對(duì)球蟲種類的進(jìn)行初步鑒定。余下的卵囊進(jìn)行回歸動(dòng)物試驗(yàn)。(3)回歸動(dòng)物試驗(yàn)①卵囊接種收集的卵囊經(jīng)培養(yǎng)孢子化后，接種8羽20日齡無球蟲感染的黃羽肉雛 雞。②糞檢卵囊分別在接種后80h、90h、100h、110h、125h、140h收集糞便，用飽和鹽水
漂浮法糞檢卵囊，并觀察卵囊形態(tài)特征。③觀察腸道病變與蟲體寄生部位在接種后120h、144h與168h分別剖檢2只雛雞， 觀察腸道病變特征與蟲體的寄生部位。(4)種類判定以卵囊形態(tài)、致病性、寄生部位、腸道病變特征等為鑒別指標(biāo)①巨型艾美耳球蟲卵囊卵圓形，囊壁黃褐色，較粗糙，無卵膜孔和卵囊殘余體，有 極粒。卵囊大小為21. 5 30. 7 μ mX 16. 5 25. 0 μ m，平均大小為27. 6 μ mX 20. 2 μ m，形 狀指數(shù)平均1.37。孢子囊呈長卵圓形，有斯氏體，大小為15. 2 18. 5 μ mX 7. 5 9.8 μ m， 平均為17. 5μπιΧ8. 3μπι。感染后125h糞檢見有少量的特征性卵囊。感染后120h撲殺剖 檢撲殺可見小腸中段腸管腫大，腸壁增厚，內(nèi)容物粘稠，呈淡灰色、淡褐色或淡紅色，有時(shí)混 有很小的血凝塊。②柔嫩艾美耳球蟲卵囊多為寬卵圓形，囊壁光滑，呈淺綠色；無卵膜孔和卵囊殘余 體，有極粒。卵囊大小為19. 5 26. 0μπιΧ16. 5 12. 8μπι，平均大小為22. 0μπιΧ19. Ομπι。 形狀指數(shù)平均1. 16。孢子囊卵圓形，有斯氏體，大小為11.7 13.511111\4.5 7.811111，平 均大小為12. 5 μ mX6. 5 μ m。感染后第5 6天雞排出血便，144h糞檢見有少量卵囊，剖檢 可見雞盲腸嚴(yán)重出血和高度腫脹，其中充滿凝固的或新鮮的暗紅色血液，盲腸壁變厚，并伴 有嚴(yán)重的糜爛。③堆型艾美耳球蟲卵囊卵圓形，囊壁光滑無色；無卵膜孔和卵囊殘余體，有極 粒。卵囊大小為16 21μπιΧ11 18μπι，平均大小為18. 7 μ mX 15. 4 μ m，形狀指數(shù)為 1. 06 1. 38，平均為1. 22。孢子囊呈卵圓形，有斯氏體，大小為8 13μπιΧ4 8μπι，平 均10. 3μπιΧ6. 3μπι。感染后IlOh糞檢見有卵囊。感染后120h撲殺剖檢可見在十二指腸 和小腸前段腸管腫大，黏膜面有大量淡白色斑點(diǎn)，排列成橫行，外觀呈階梯樣。經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定，結(jié)果從1號(hào)樣品中檢出巨型艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲，從2 號(hào)樣品中檢出堆型艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲。兩種方法的符合率為100%。SEQUENCE LISTING<110>揚(yáng)州大學(xué)<120> 一種雞球蟲種類快速鑒定的多重PCR方法及試劑盒<130><160>6<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列
<400>1
ttgtggggca tattgttgtg
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權(quán)利要求
一種雞球蟲種類多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于，是以待測(cè)樣本DNA為模板，以SEQ ID NO.1 6的序列為引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物過瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶判定樣本種類；其中151bp、463bp、303bp大小條帶，分別為巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲檢測(cè)陽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞球蟲種類多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于，多重PCR的 具體條件是在0. 5mL的Eppendorf管中依次加入下列試劑10Xbuffer，MgCl2，4XdNTPs， 序列分別如SEQ ID NO. 1-6所示的引物，TaqDNA聚合酶，摸板DNA，滅菌去離子水，反應(yīng)總 體積為25 u L，混勻，瞬離，加入20 y L礦物油；將Eppendorf管置于PCR儀中，循環(huán)參數(shù)為 94°C預(yù)變性 4min，94°C 45s，55°C 30s，72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞球蟲種類多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于，待測(cè)樣本 DNA是通過下述步驟得到先從雞糞中分離純化出卵囊，再用超聲波細(xì)胞粉碎儀裂解卵囊 壁，然后提取卵囊總DNA。
4.一種用于權(quán)利要求1所述的雞球蟲種類多重PCR快速檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在 于，包括巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲DNA陽性對(duì)照，以及PCR反應(yīng) 液，其中PCR反應(yīng)液PCR反應(yīng)液由下列1-12號(hào)液組成1號(hào)液:10Xbuffe ；2號(hào)液25mM MgCl2 ；3號(hào)液2. 5mM 4XdNTPs ；4號(hào)液50pmol巨型艾美耳球蟲上游引物，序列如SEQ ID NO. 1所示； 5號(hào)液:50pmol巨型艾美耳球蟲下游引物，序列如SEQ ID NO. 2所示； 6號(hào)液50pmol柔嫩艾美耳球蟲上游引物，序列如SEQ ID NO. 3所示； 7號(hào)液50pmol柔嫩艾美耳球蟲下游引物，序列如SEQ ID NO. 4所示； 8號(hào)液:50pmol堆型艾美耳球蟲上游引物，序列如SEQ ID NO. 5所示； 9號(hào)液:50pmol堆型艾美耳球蟲下游引物，序列如SEQ ID NO. 6所示； 10 號(hào)液5U/ ii L TaqDNA 聚合酶； 11號(hào)液滅菌去離子水； 12號(hào)液礦物油。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種雞球蟲種類快速鑒定的多重PCR方法，以及檢測(cè)用試劑盒。所說的雞球蟲種類多重PCR快速檢測(cè)方法，是以待測(cè)樣本DNA為模板，以SEQ ID NO.1-6的序列為引物進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶判定樣本種類；其中151bp、463bp、303bp大小條帶，分別為巨型艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲檢測(cè)陽性。本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)鑒定雞球蟲種類的方法相比具有快速準(zhǔn)確敏感的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/90GK101928771SQ200910234679
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者許金俊, 辛玲, 陶建平 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)