專利名稱：一種l-色氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，特別是涉及一種L-色氨酸的制備方法。
背景技術(shù)：
色氨酸屬于芳香族氨基酸，含氮13.72%， a-氨基氮6.86X。色氨酸有三種光學(xué)異構(gòu)體，L-色氨酸呈絹絲光澤、六角片狀白色晶體，無(wú)臭，有甜味。水中溶解度為1. 14g/1(25°C )，溶于稀酸或稀堿，在堿液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸中分解。微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
L-色氨酸是人和動(dòng)物的必需氨基酸之一，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起一定的制約作用。在生物體內(nèi)從L-色氨酸出發(fā)可合成激素、色素、生物堿、輔酶和多種生理活性物質(zhì)。在臨床上主要用于醫(yī)藥，如氨基酸輸液，抗悶劑，抗臭濾藥，調(diào)節(jié)腦代謝等作用。新近的研究報(bào)導(dǎo)，L-色氨酸在體內(nèi)能借助維生素Be的作用生成神經(jīng)荷爾蒙的前體5-羥基色胺，從而促進(jìn)睡眠和精神安定，已被用作保健食品和安神藥。 動(dòng)物體內(nèi)色氨酸代謝的色氨酸有兩個(gè)來(lái)源一個(gè)是組織蛋白質(zhì)分解的內(nèi)源氨基酸，約占2/3 ;另外一個(gè)是從日糧中消化吸收的外源性氨基酸，約占1/3。色氨酸代謝途徑也有兩個(gè)一個(gè)是合成組織蛋白質(zhì)，另一個(gè)則是分解代謝。色氨酸的吸收半周期為1. 73h，清除半周期為0. 73 0. 74h，其生物利用率為76%。色氨酸在代謝過(guò)程中與碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和微量元素等各種營(yíng)養(yǎng)素之間有十分密切的關(guān)系。 目前色氨酸的主要應(yīng)用是作營(yíng)養(yǎng)藥劑，人工合成膳食，必需氨基酸片，及水解蛋白質(zhì)的添加劑。色氨酸與鐵劑、維生素等合用可以提高抗貧血療效，此外，還可用作消化潰瘍組氨酸的佐藥，用于治療失眠癥、焦慮癥、精神緊張和煙癮毒癮等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種L-色氨酸的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題。 本發(fā)明提供一種L-色氨酸的制備方法，包括如下步驟菌種平板活化培養(yǎng)，種子搖瓶培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)兩級(jí)種子罐培養(yǎng)，最后接發(fā)酵罐培養(yǎng)；其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖7g/L 15g/L，硫酸胺15 25g/L，檸檬酸鈉0. 1 0. 8g/L，硫酸鎂0. 5 1. 2g/L，磷酸二氫鉀30 38g/L，磷酸氫二鉀10 20g/L和微量金屬元素2 10mg/L。 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖12g/L，硫酸胺20g/L，檸檬酸鈉0. 5g/L，硫酸鎂0. 8g/L，磷酸二氫鉀34g/L，磷酸氫二鉀16g/L和包括CoCl2 0. lmg/L， ZnS04 lmg/L，CuS04 0. lmg/L， FeS040. lmg/L， MnS04 2mg/L的微量金屬元素。 發(fā)酵培養(yǎng)中，控制pH為6. 4 6. 6，通風(fēng)比控制在0. 3VVM 1VVM，溫度在35 37t:，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源采用流加，流速為5 20L/h m 溶氧控制在20 40%，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速在400 600rpm。 發(fā)酵罐培養(yǎng)中，使用20 30g/ml的氨水和35 45g/ml的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。
優(yōu)選地，使用25g/ml的氨水和40g/ml的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。
發(fā)酵培養(yǎng)中，采取分段通風(fēng)，O 4h時(shí)的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h時(shí)的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。 發(fā)酵培養(yǎng)中，采取分段控溫，O 15h時(shí)溫度控制在36t:，然后控制在35°C。
發(fā)酵培養(yǎng)中，采取分段流加碳源，流速在開(kāi)始加碳源時(shí)為5L/h m 然后逐漸提高流速，到12 14時(shí)為20L/h m3，到20L/h m3后逐步減少到10 15L/h m3直到放罐。
所述菌種為TQ2223色氨酸工程菌。 種子搖瓶培養(yǎng)，在35 40°C，培養(yǎng)6 8h， pH5. 7 6，按1 5%。 (v/v)接種到一級(jí)種子罐；一級(jí)種子罐培養(yǎng)，在32 38。C，pH6. 8 7. 2，培養(yǎng)10 12h按5 15% (v/v)接種到二級(jí)種子罐；二級(jí)種子罐培養(yǎng)，在32 38°C，500rpm， p朋.8 7. 2，培養(yǎng)5 6h按5 15% (v/v)接種到發(fā)酵罐。 本發(fā)明L-色氨酸的制備方法具有以下有益效果 本發(fā)明利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，通過(guò)NaOH或氨水來(lái)控制合理的發(fā)酵條件，采用分段通風(fēng)、分段控溫、分段補(bǔ)料等方法來(lái)提高L-色氨酸的產(chǎn)率，提高了原料的利用率，降低了工程成本，實(shí)現(xiàn)了色氨酸的高密度發(fā)酵，使發(fā)酵法產(chǎn)L-色氨酸達(dá)到了較高的水平。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例中所用的菌種為TQ2223色氨酸工程菌；
酵母抽提物購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。
實(shí)施例1 平板活化培養(yǎng)基在950ml去離子水中加入蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化鈉10g。搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用去離子水定容至1L，高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。
種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，硫酸胺10g/L，尿素3g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 4g/L，硫酸亞鐵2mg/L，硫酸錳2mg/L，生物素0. lmg/L，硫胺素lmg/L， pH7. 2后高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。 將TQ2223色氨酸工程菌菌種平板活化培養(yǎng)后，進(jìn)行種子搖瓶培養(yǎng)，在37t:，250rpm培養(yǎng)6h，pH5. 7 6按2%。 (v/v)接種到一級(jí)種子罐；一級(jí)種子罐36°C ， 500rpm， pH7由25g/ml氨水流加自動(dòng)控制，培養(yǎng)12h按10X (v/v)接種到二級(jí)種子罐；二級(jí)種子罐培養(yǎng)36°C，500rpm， pH7由25g/ml氨水流加自動(dòng)控制，培養(yǎng)5h后按10% (v/v)接種到發(fā)酵罐。
使用50L通用發(fā)酵罐配置20L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方葡萄糖10g/L，硫酸胺20g/L，檸檬酸鈉0. 5g/L，硫酸鎂0. 8g/L，磷酸二氫鉀34g/L，磷酸氫二鉀16g/L。微量元素含CoCl2 0. lmg/L， ZnS04lmg/L， CuS04 0. lmg/L， FeS04 0. lmg/L， MnS04 2mg/L。高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。 待發(fā)酵培養(yǎng)基溫度降至361:后，按10% (v/v)的接種量接種。攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，pH 6. 4 6. 6由25g/ml的氨水自動(dòng)流加控制0 4h的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。發(fā)酵4小時(shí)時(shí)開(kāi)始流加葡萄糖，流速為5L/h m3，以后要不斷提高流速，當(dāng)?shù)?2 14h時(shí)流速達(dá)到20L/h *m3。 20h后要逐步減小流速，維持12L/h.i^到發(fā)酵結(jié)束。溶氧控制在20% 40%。 8h以后的溫度控制為35t:。發(fā)酵33小時(shí)，生物量達(dá)到70g/L， L-色氨酸的總量為20g/L。CN 101705264 A 實(shí)施例2 平板活化培養(yǎng)基在950ml去離子水中加入蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化鈉10g。搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用去離子水定容至1L，高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。
種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，硫酸胺10g/L，尿素3g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂0. 4g/L，硫酸亞鐵2mg/L，硫酸錳2mg/L，生物素0. lmg/L，硫胺素lmg/L， pH7. 2后高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。 將TQ2223色氨酸工程菌菌種平板活化培養(yǎng)后，進(jìn)行種子搖瓶培養(yǎng)，在37t:，250rpm培養(yǎng)8h，pH6按3。； (v/v)接種到一級(jí)種子罐；一級(jí)種子罐36°C ， 500rpm， pH7由40g/ml氫氧化鈉流加自動(dòng)控制，培養(yǎng)12h按15X (v/v)接種到二級(jí)種子罐；二級(jí)種子罐培養(yǎng)36。C，500rpm， pH7由25g/ml氨水流加自動(dòng)控制，5 6h按8% (v/v)接種到發(fā)酵罐。
使用50L通用發(fā)酵罐配置20L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方葡萄糖15g/L，硫酸胺15g/L，檸檬酸鈉0. 8g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸二氫鉀38g/L，磷酸氫二鉀12g/L。微量元素含CoCl2 0. lmg/L， ZnS04 lmg/L， CuS04 0. lmg/L， FeS04 0. lmg/L， MnS04 2mg/L。高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。 待培養(yǎng)基溫度降至36t:后，按10% (v/v)的接種量接種。攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，pH6. 4 6. 6由25g/ml的氨水自動(dòng)流加控制0 4h的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。發(fā)酵4小時(shí)時(shí)開(kāi)始流加葡萄糖，流速為5L/h *m3，以后要不斷提高流速，當(dāng)?shù)?2 14h時(shí)流速達(dá)到20L/h m3。 20h后要逐步減小流速，維持12L/h m3到發(fā)酵結(jié)束。溶氧控制在20% 40%。 8h以后的溫度控制為35t:。發(fā)酵33小時(shí)，生物量達(dá)到70g/L， L-色氨酸的總量為20g/L。
實(shí)施例3 發(fā)酵前的培養(yǎng)過(guò)程基本同實(shí)施例1。 使用50L通用發(fā)酵罐配置20L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方葡萄糖7g/L，硫酸胺15g/L，檸檬酸鈉0. lg/L，硫酸鎂1. 2g/L，磷酸二氫鉀30g/L，磷酸氫二鉀20g/L。微量元素含CoCl2 0. 3mg/L，ZnS04 2mg/L，CuS04 0. 2mg/L， FeS04 0. 3mg/L，MnS04 lmg/L。高壓蒸汽121°C滅菌25分鐘。 待培養(yǎng)基溫度降至351:后，按5% (v/v)的接種量接種。攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm， pH6. 4 6. 6由25g/ml的氨水自動(dòng)流加控制。0 4h的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。發(fā)酵4. 5小時(shí)時(shí)開(kāi)始流加葡萄糖，流速為7L/h m3，以后要不斷提高流速，當(dāng)?shù)?2 14h時(shí)流速達(dá)到20L/h m3。 21h后要逐步發(fā)酵前的培養(yǎng)過(guò)程基本同實(shí)施例1。
實(shí)施例4 使用50L通用發(fā)酵罐配置20L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方葡萄糖7g/L，硫酸胺15g/L，檸檬酸鈉0. lg/L，硫酸鎂1. 2g/L，磷酸二氫鉀30g/L，磷酸氫二鉀20g/L。微量元素含CoCl2 0. 4mg/L，ZnS04 2mg/L，CuS04 0. 3mg/L， FeS04 0. 3mg/L，MnS04 2mg/L。高壓蒸汽121°C滅菌25分鐘。 待培養(yǎng)基溫度降至351:后，按5% (v/v)的接種量接種。攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm， pH6. 4 6. 6由28g/ml的氨水自動(dòng)流加控制。0 4h的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。發(fā)酵4. 5小時(shí)時(shí)開(kāi)始流加葡萄糖，流速為7L/h m3，以后
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要不斷提高流速，當(dāng)?shù)?2 14h時(shí)流速達(dá)到20L/h *m3。 21h后要逐步減小流速，維持14L/h'i^到發(fā)酵結(jié)束。溶氧控制在20% 40%。 10h以后的溫度控制為35°C。發(fā)酵34h生物量達(dá)到75g/L， L-色氨酸的總量為23g/L。
實(shí)施例5 采使用50L通用發(fā)酵罐配置20L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方葡萄糖12g/L，硫酸胺25g/L，檸檬酸鈉0. 8g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸二氫鉀30g/L，磷酸氫二鉀20g/L。微量元素含CoCl2 0. 2mg/L， ZnS04 2mg/L， CuS04 0 . 4mg/L， FeS04 0. 5mg/L， MnS04 lmg/L。高壓蒸汽12rC滅菌25分鐘。 待培養(yǎng)基溫度降至37t:后，按10% (v/v)的(種子液與發(fā)酵液的體積比)接種量接種。攪拌轉(zhuǎn)速為450rpm，pH 6. 4 6. 6由25g/ml的氨水自動(dòng)流加控制0 4h的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。發(fā)酵5小時(shí)時(shí)開(kāi)始流加葡萄糖，流速為7L/h m3，以后要不斷提高流速，當(dāng)?shù)?2 14h時(shí)流速達(dá)到20L/h m3。 22h后要逐步減小流速，維持15L/h'n^到發(fā)酵結(jié)束。12h以后的溫度控制為35t:。發(fā)酵35h，生物量達(dá)到78g/L， L-色氨酸的總量為25g/L。
實(shí)施例6 采使用50L通用發(fā)酵罐配置20L發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方葡萄糖15g/L，硫酸胺18g/L，檸檬酸鈉0. 5g/L，硫酸鎂1. Og/L，磷酸二氫鉀38g/L，磷酸氫二鉀10g/L。微量元素含CoCl2 0. lmg/L， ZnS04 lmg/L， CuS04 0. lmg/L， FeS04 0. lmg/L， MnS04 2mg/L。高壓蒸汽12rC滅菌21分鐘。 待培養(yǎng)基溫度降至36t:后，按10% (v/v)的接種量接種，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm， pH6. 4 6. 6由30g/ml的氨水自動(dòng)流加控制0 4h的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。發(fā)酵5. 5小時(shí)時(shí)開(kāi)始流加葡萄糖，流速為8L/h *m3，以后要不斷提高流速，當(dāng)?shù)?2 14h時(shí)流速達(dá)到20L/h *m3。 23h后要逐步減小流速，維持15L/h *m3到發(fā)酵結(jié)束。13h以后的溫度控制為35t:。發(fā)酵34h，生物量達(dá)到78g/L，L-色氨酸的總量為27g/L。
權(quán)利要求
一種L-色氨酸的制備方法，其特征在于，包括如下步驟菌種平板活化培養(yǎng)，種子搖瓶培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)兩級(jí)種子罐培養(yǎng)，最后接發(fā)酵罐培養(yǎng)；其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖7g/L～15g/L，硫酸胺15～25g/L，檸檬酸鈉0.1～0.8g/L，硫酸鎂0.5～1.2g/L，磷酸二氫鉀30～38g/L，磷酸氫二鉀10～20g/L和微量金屬元素2～10mg/L。
2. 如權(quán)利要求1所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡 萄糖12g/L，硫酸胺20g/L，檸檬酸鈉0. 5g/L，硫酸鎂0. 8g/L，磷酸二氫鉀34g/L，磷酸氫二鉀 16g/L和包括CoCl20. lmg/L， ZnS04 lmg/L， CuS04 0. lmg/L， FeS04 0. lmg/L， MnS04 2mg/L的 微量金屬元素。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)中，控制pH 為6. 4 6. 6，通風(fēng)比控制在0. 3VVM 1VVM，溫度在35 37°C ，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源采用 流加，流速為5 20L/h m 溶氧控制在20 40%。
4. 如權(quán)利要求3所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵罐培養(yǎng)中，使用20 30g/ml的氨水或35 45g/ml的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。
5. 如權(quán)利要求4所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵罐培養(yǎng)中，使用25g/ ml的氨水或40g/ml的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值。
6. 如權(quán)利要求3所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)中，采取分段通 風(fēng)，O 4h時(shí)的通風(fēng)比為0. 3VVM，4 9h時(shí)的通風(fēng)比為0. 5VVM，9h后的通風(fēng)比1VVM。
7. 如權(quán)利要求3或6所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)中，采取分段 控溫，O 15h時(shí)溫度控制在36t:，然后控制在35°C。
8. 如權(quán)利要求3、6或7任意一項(xiàng)所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng) 中，采取分段流加碳源，流速在開(kāi)始加碳源時(shí)為5L/h *!113，然后逐漸提高流速，到12 14時(shí) 為20L/h m3，到20L/h m3后逐步減少到10 15L/h m3直到放罐。
9. 如權(quán)利要求1所述的L-色氨酸的制備方法，其特征在于，所述菌種為TQ2223色氨酸 工程菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種L-色氨酸的制備方法，包括如下步驟包括如下步驟菌種平板活化培養(yǎng)，種子搖瓶培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)兩級(jí)種子罐培養(yǎng)，最后接發(fā)酵罐培養(yǎng)；其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖7g/L～15g/L，硫酸胺15～25g/L，檸檬酸鈉0.1～0.8g/L，硫酸鎂0.5～1.2g/L，磷酸二氫鉀30～38g/L，磷酸氫二鉀10～20g/L和微量金屬元素2～10mg/L。本發(fā)明利用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，通過(guò)NaOH或氨水來(lái)控制合理的發(fā)酵條件，采用分段通風(fēng)、分段控溫、分段補(bǔ)料等方法來(lái)提高L-色氨酸的產(chǎn)率，提高了原料的利用率，降低了工程成本，實(shí)現(xiàn)了TQ2223色氨酸工程菌的高密度發(fā)酵，使發(fā)酵法產(chǎn)L-色氨酸達(dá)到了較高的水平。
文檔編號(hào)C12P13/22GK101705264SQ200910210418
公開(kāi)日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者尚海濤, 崔剛, 李榮杰, 陳五九 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司