專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高微生物抗逆性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate或PHA)是許多種類(lèi)的細(xì)菌都能合成的一種細(xì)胞內(nèi)聚酯，在生物體內(nèi)主要是作為細(xì)胞內(nèi)碳源和能源的貯藏性物質(zhì)而存在的
(Xemoigne M. Products of dehydration and of polymerization of -hydroxybutyricacid. Bull. Soc. Chem. Biol., 1926， 8: 770-782) 。 PHA的結(jié)構(gòu)通式如
<formula>formula see original document page 3</formula>(式I)
其中n可以為l、 2、 3或4,『l時(shí)表示3—羥基脂肪酸酯；m為聚合度；R為可變的側(cè)鏈基團(tuán)，如飽和或不飽和、直鏈或含側(cè)鏈及取代基的不同鏈長(zhǎng)的烷基。根據(jù)PHA側(cè)鏈的長(zhǎng)短不同，可將PHA分為三種類(lèi)型
(1) 短鏈raA (short-chain-length PHA， scl PHA)，如聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)、羥基丁酸酯與羥基戊酸酯的共聚物[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate), PHBV]，單體含3-5個(gè)碳原子。
(2) 中長(zhǎng)鏈PHA (medium-chain-length PHA， mcl PHA)，如聚羥基己酸酯(PHHx)、聚羥基辛酸酯(PH0)，單體含6個(gè)以上碳原子。mcl PHA中可以含有多種功能基團(tuán)，如雙鍵(Huigberts GNM， Eggink G， Waard P, Huisman GW and Witholt B. Pseudomonas putitaKT2442 cultivated on glucose accumulates poly—P-hydroxyalkanoates consistingof saturated and unsaturated momnomers. 4pp7 f"Kr肌#icroW. ， 1992，58:536-544)、畚鍵、卣素(Doi Y and Abe C. Biosynthesis and characterization ofa new bacterial copolyester of 3-hydroxyalkanoates and
3-hydroxy-w-chloroalkanoates. ifecrtM7。7ec〃7e51, 1990， 23:2705-3707)、酚(FritzscheK, Lenz RW and Fuller RC. An unusual bacterial polyesters with a phenyl pendantgroup. #acro/z o7 1990, 191:1957-1968)和氰(Schulz C， Wolk S， Lenz RW and
Fuller RC. Growth and polyester production by /!sei/ob7 7o朋51 o7eorara"s on branchedoctanoic acid substrates. 飽cr。/z7oJecw7e51. 1995, 27:6358-6362)等。mcl PHA大多是兩種以上單體的隨機(jī)共聚物。
(3) 含短鏈與中長(zhǎng)鏈單體的PHA,多是兩種或兩種以上單體的隨機(jī)共聚物(UgeveenRG, Huisman GW, Preusting H， Ketelaar H， Eggink G and Witholt B. Formation ofPolyesters by尸sei/c/cyz70/ 351 aZeorara/ s: Effect of Substrates on formation andcomposition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3_ hydroxyalkenoates.^ p丄#icroW, 1988， 54:2924-2932)。
PHA對(duì)于細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境的變化及生存具有重要的意義。以PHB為例，有些細(xì)菌胞內(nèi)的PHB可以減緩細(xì)胞內(nèi)重要成分一RNA和蛋白質(zhì)在饑餓條件下的降解，從而可以增加細(xì)菌對(duì)生存逆境的抵抗能力。另外在某些芽孢桿菌屬中，盡管孢子的形成并不必需PHB，但P朋可以作為孢子形成時(shí)的能源和碳源從而增加這些菌的生存機(jī)會(huì)。此外，PHB還可以為某些固氮菌屬的包囊形成提供必要的碳源和能源。對(duì)^^zoZ^'"http://7 sp. ORS 571的固氮與PHB的形成及降解的研究表明，當(dāng)節(jié)結(jié)中的氧濃度增加時(shí)，P朋可以通過(guò)自己的降解保護(hù)固氮酶不受損傷(Anderson AJ and Dawes EA. Occurense， Metabolism, Metabolic Role,and Industrial Use of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. #/c_roZ>. /PeK. ， 1990，54:450-472)。
PHA還可以作為環(huán)境的標(biāo)記。在對(duì)河灣沉積物中的微生物進(jìn)行的研究表明，通過(guò)比較其中磷脂和PHA的合成比例，可以監(jiān)測(cè)外界因素對(duì)沉積物的影響程度。而且許多可合成PHA的細(xì)菌都是在活性污泥、及富含碳源有機(jī)物的環(huán)境中被篩選出來(lái)的。在對(duì)一些被原油污染嚴(yán)重的地方分離的嗜冷海洋微生物進(jìn)行的研究表明，其中的大多數(shù)微生物都可以在限氮的條件下在胞內(nèi)積累PHA (Alvarez HM， Pucci OH and Steinbtlchel A. Lipid storagecompounds in marine bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 47: 132-139)。這說(shuō)明在這些碳源較豐富的環(huán)境中大多數(shù)細(xì)菌都具備將過(guò)量的碳源轉(zhuǎn)化為PHA儲(chǔ)存起來(lái)的能力。
PHB是細(xì)菌胞內(nèi)的碳源和能源的儲(chǔ)備物。但近來(lái)發(fā)現(xiàn)它也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在于其原生質(zhì)膜中；而在真核生物中，則以在線粒體和微體膜中的比例為最多。相比于胞內(nèi)的高分子量的聚合物，存在于膜上的PHB分子較小，只有100—200個(gè)單體。對(duì)這種小分子量PHB的研究表明，它可能起著膜上的離子通道的作用。最近，在人的血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)較多量的這種小分子PHB。這對(duì)于利用PHB來(lái)包裹藥物進(jìn)行定向定量釋放以及PHA在醫(yī)療方面的應(yīng)用提供了理論上的依據(jù)。
PHA作為一種生態(tài)型的生物高分子材料，不僅可以在塑料工業(yè)中得以推廣和應(yīng)用，成為新型的生物可降解塑料，而且由于它的一些特殊性質(zhì)，如生物相容性、光學(xué)活性、壓電性、氣體相隔性等和其它許多尚未發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)，從而有可能在某些高附加值領(lǐng)域得以應(yīng)用。對(duì)PHA的研究已經(jīng)成為一個(gè)基礎(chǔ)理論與實(shí)踐應(yīng)用結(jié)合得非常緊密的應(yīng)用領(lǐng)域。
不同類(lèi)型PHA在細(xì)菌內(nèi)的合成途逕是不同的，目前已知的合成途徑主要有三條(Anderson AJ and Dawes EA. Occurense, Metabolism, Metabolic Role, and IndustrialUse of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. WoroZ . /Per., 1990, 54:450-472; Lee SY.Bacterial Polyhydroxyalkanoates. 歷-otec/ . 歷'oe/ g. 1996， 49:1-14):
1. 以Vai/ter57'3 ei/t/Y p力s (以前叫y a_/5^o/3J'3 ei/tr。;7/73， 也叫力7ca力^e/7e51e"tr砂/ "s)為代表的由乙酰輔酶A直接合成PHB途徑它的PHB合成酶系統(tǒng)由pha合成操縱子p/^O9(SEQIDN0:l)基因編碼，包含三種酶p-酮基硫解酶((3-ketothiolase)、 NADra依賴(lài)的乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(P朋 synthase);上述三種酶分別由p/ 6A p/ 力5和； /^C基因編碼，且位于同一個(gè)操縱子上。 細(xì)胞內(nèi)的代謝中產(chǎn)物乙酰輔酶A在l3-酮基硫解酶(p-ketothiolase， PhaA)的催化作用 下形成乙酰乙酰輔酶A，然后在NADPH依賴(lài)的還原酶(PhaB)的作用下還原為(R)-羥基丁 酰輔酶A， (R)-羥基丁酰輔酶A在PHB合成酶的作用下聚合成PHB。這個(gè)過(guò)程需要消耗 NADPH，產(chǎn)生NADP。
2. 以/^e"c^70/ asaei7^7'/70sa為代表的脂肪酸從頭合成途徑從這條途徑合成PHA 需要兩個(gè)酶的催化p力a(7編碼的3—羥?；货；D(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)酶
(3-Hydroxyacyl-ACP-CoA transferase)和p/ aC編碼的PHA合酶。脂肪酸從頭合成途 徑的中間產(chǎn)物3—羥酰基一?；D(zhuǎn)移蛋白由3—羥?；货；D(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)酶
(PhaG)催化形成PHA的前體3-羥基酯酰輔酶A，再由PHA合酶聚合成PHA。同樣的途徑 有惡臭假單胞菌(/^ew/湖o朋s/7"j'te)的合成途徑，惡臭假單胞菌(/^e"ob歷o朋sta) 的PhaG的編碼基因的Genbank檢索號(hào)是AF052507。
3. 以/^e"(/o/TO/7as a/eorara/w為代表的0—氧化途徑從這條途徑合成PHA需要 兩個(gè)酶的作用p力a/編碼的(R) —烯?；凰厦?(R) -enoyl-CoA hydratase)和 p力aC編碼的PHA合酶。脂肪酸(3-氧化的中間產(chǎn)物烯酰基一?；D(zhuǎn)移蛋白由(R) —烯酰 基一水合酶(PhaJ)催化形成PHA的前體3-羥基酯酰輔酶A，再由PHA聚合酶聚合成PHA。 同樣的途徑有嗜水氣單胞菌(力ero/z o/ as力/rfr叩力j7a)的合成途徑，嗜水氣單胞菌 "aro/770/ as Arrfro; /w'7a)的PHA合成酶操縱子(PHA synthase operon)編碼基因的Genbank 檢索號(hào)是AY093685,包括PhaJ和PhaC的編碼基因。
用13C-NMR對(duì)/^e"ob歷o朋s 的脂肪酸合成的研究表明脂肪酸的從頭合成和P
_氧化與PHA合成是獨(dú)立進(jìn)行的(Huijberts GN， De Rijk TC， De Waard P and Eggink G.. 13C nuclear magnetic resonance studies of Pseudomonas putidas fatty acids metabolic routes involved in PHA syntheses. /- fecterio7. /卯《77(5.. 76(57-7( 鄉(xiāng)， 在一種細(xì)菌中可能會(huì)同時(shí)以二種途徑來(lái)合成中長(zhǎng)鏈PHA，雖然這二種途徑并不是均等地起 作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)這兩條途徑之間也有聯(lián)系，可以將脂肪酸從頭合成途徑的中間產(chǎn) 物acyl-ACP在一個(gè)硫酯酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榻到馔緩降闹虚g產(chǎn)物acyl-CoA (Rehm BHA and Steinbtlchel A. Heterologous expression of the acyl-acyl carrier protein thioesterase gene from the plant UmbelluLaxia californica mediates polyhydroxyalkanoates biosynthesis in recombinant ￡sc/ eric/ _z'<3 co7義 4PP丄 Wcro6j'o/. A'otec/y o/. 2001, 55:205-209)。這個(gè)新發(fā)現(xiàn)表明PHA合成的單體提供途 徑是很多樣化的，而對(duì)PHA合成進(jìn)行代謝工程的研究也有更多的選擇。
在PHA的代謝途徑中，既有能量的代謝(NAD/NADH,NADP/NADPH等)，也有物質(zhì)的 代謝(乙酰輔酶A，脂肪酸等)，因此PHA的代謝過(guò)程，實(shí)際上也是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)能量和物 質(zhì)的改變過(guò)程。由于PHA可以廣泛的存在于各種細(xì)胞中，這也為將PHA合成機(jī)制作為調(diào)節(jié)手段在各種不同的微生物中調(diào)節(jié)其能量和物質(zhì)水平，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種調(diào)控微生物代謝的方法。
本發(fā)明所提供的調(diào)控微生物代謝的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。
所述代謝包括能量和物質(zhì)代謝。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因選自下述l) ， 2)和3)中的任意一種1) p力力C^基因，2) / / aC禾t];7力aC基因，3) p力a/和p力aC基因。
所述p力力C^基因優(yōu)選為具有序列表中SEQ ID N0:1的DNA序列；所述尸力aG基因優(yōu)選為AF052507，所述p力aC基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685，所述p力s/基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685。
PHA合成途徑的相關(guān)基因可以通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)手段導(dǎo)入宿主微生物中，例如，可以利用表達(dá)載體如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體等，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等手段導(dǎo)入宿主微生物中；也可以利用原生質(zhì)體融合等手段來(lái)實(shí)現(xiàn)。
所述調(diào)控微生物代謝為調(diào)控微生物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。
所述微生物為細(xì)菌，古細(xì)菌和真菌；所述發(fā)酵產(chǎn)物包括有機(jī)酸，醇類(lèi)，抗生素，氨基酸和維生素。
其中，所述微生物可為獸疫鏈球菌(5Yr印"cocc"s加oe/^Ve/w'c"s )，優(yōu)選為獸疫鏈球菌(5"tre/ Z^cocci/s zooejW'ofe肌'ci/s ) ATCC 39920，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸和透明質(zhì)酸；
所述微生物可為光滑球擬酵母(7b/Yy7叩w's ^aZ^ats)，優(yōu)選為光滑球擬酵母(7br〃7o;wis g7a6rate) CCTCCM202019，所述發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮酸；
所述微生物可為釀酒酵母(&cc力ar咖7ces cerew'siae)，優(yōu)選為釀酒酵母(5"acc力ar卿yces cerew'w'ae) IFFI 01338，所述發(fā)酵產(chǎn)物為麥角固醇；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(5a"77M sM"7is )，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌(泡"77"s s"力"7^ ) ATCC 19162,所述發(fā)酵產(chǎn)物為肌苷；
所述微生物可為嗜堿芽孢桿菌(53cW7m a7ca7op/^'7"s)，優(yōu)選為嗜堿芽孢桿菌(&cj'77"s a7ca7o; /l 7"s) Ya-B，所述發(fā)酵產(chǎn)物為彈性蛋白酶；
所述微生物可為紅酵母(^oGbto/777a ^"^'/7is)，優(yōu)選為紅酵母(y 力oobtor"hW〃""/5") NCIM 3353，所述發(fā)酵產(chǎn)物為類(lèi)胡蘿卜素；
所述微生物可為谷氨酸棒桿菌(Opr"eybacZ^r/iy/z7 ^i/ta啦'c"歷)，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌(Cbrj/7e6acteriMZ7 ^7i/ta/w'cM ) ATCC 13032，所述發(fā)酵產(chǎn)物為谷氨酰胺；
所述微生物可為乳酸發(fā)酵短桿菌(&ew'6actew'咖7acz^/kr鵬/7t鵬)，優(yōu)選為乳酸發(fā)酵短桿菌(5repa'力sc&r/湖^"o/er鵬/ z^7 ) ATCC 31269，所述發(fā)酵產(chǎn)物為賴(lài)氨酸；
所述微生物可為大腸桿菌(￡scAe_r/c/ i'a.coh')，優(yōu)選為大腸桿菌 (&c/ erj'c/n'a. coh') ATCC 31882，所述發(fā)酵產(chǎn)物為苯丙氨酸；
所述微生物可為熒光假單胞菌(/^e"ob歷o"ss/7"oresce/^)，優(yōu)選為熒光假單胞菌 (/^e〃ob/770朋s /7〃ore"e/w) AS 1.55，所述發(fā)酵產(chǎn)物為葡萄糖酸；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(Sacj7hs卯&ih's )，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌 (7feciJAAs w力ti7is ) ATCC 21556，所述發(fā)酵產(chǎn)物為a -淀粉酶；
所述微生物可為釀酒酵母(&cc力aro/^ces cerew、/ae )，優(yōu)選為釀酒酵母 (&cc/ aro歷yces cereWw'se ) ACCC 2063，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇；
所述微生物可為克魯斯假絲酵母(Ca/7力Va Ai^sw'),優(yōu)選為克魯斯假絲酵母 (C朋力Va hv/sei ) ACCC 2196，所述發(fā)酵產(chǎn)物為甘油；
所述微生物可為熱帶假絲酵母(&77W^ z^印ics"'s )，優(yōu)選為熱帶假絲酵母 z^ropicah's ) UH22248，所述發(fā)酵產(chǎn)物為十二碳二元酸；
所述微生物可為熱帶假絲酵母(&/7力'^ ^x;pi"7/s )，優(yōu)選為熱帶假絲酵母 (C朋力Va tr叩ica乃's ) TV14，所述發(fā)酵產(chǎn)物為十五碳二元酸；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(泡c^7m s^^7is )，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌 (few77"s s〃力"7is ) ATCC 19220，所述發(fā)酵產(chǎn)物為鳥(niǎo)苷；
所述微生物可為釀酒酵母(6^cc/ aro/ZLKces cerew'w'ae )，優(yōu)選為釀酒酵母 (5"acc/ aro/^ces cerew'w'ae ) KY6186，所述發(fā)酵產(chǎn)物為谷胱甘肽；
所述微生物可為球擬酵母(7brY^o/ w's sp)，優(yōu)選為球擬酵母(rar^oA^'s sp) B845， 所述發(fā)酵產(chǎn)物為赤蘚糖醇；
所述微生物可為短小芽孢桿菌(^a" 7t/spu加'7us )，優(yōu)選為短小芽孢桿菌(J5aw7"s ;^加7m ) ATCC 31095，所述發(fā)酵產(chǎn)物為D-核糖；
所述微生物可為丁酸梭芽孢桿菌(67ostriA'咖Zwfyn'ci/歷)，優(yōu)選為丁酸梭芽孢 桿菌(aostrj'rf/咖to0^j'c咖)ATCC 8260，所述發(fā)酵產(chǎn)物為1， 3-丙二醇；
所述微生物可為熒光假單胞菌(/^e"ob歷OT7as/7"oresce/^)，優(yōu)選為熒光假單胞菌 (尸se〃cto歷o朋s /7f/aresce/ s) AS 1.55，所述發(fā)酵產(chǎn)物為葡萄糖酸；
所述微生物可為枯草芽孢桿菌(5acL J^ s"&iJis ),優(yōu)選為枯草芽孢桿菌 (feci77"s s"力"'7A ) ATCC 19162，所述發(fā)酵產(chǎn)物為肌苷；
所述微生物可為移動(dòng)假單胞菌(》朋o歷o/7as歷o&'7A )，優(yōu)選為移動(dòng)假單胞菌 (^y/ro/zw;7as /zra&7^ ) NRRL B-4286，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高微生物抗逆性的方法。
本發(fā)明所提供的提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所 述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。
所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因選自下述l) ， 2)和3)中的任意一種1)p力力C^基因，2) / A^7和p/ aC基因，3)如a/和/ / aC基因。
所述/ 力Z^^基因優(yōu)選為具有序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；所述尸力a"基因優(yōu)選為AF052507，所述p力aC基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685，所述p/ a/基因優(yōu)選為來(lái)自于AY093685。
其中，所述方法中，所述微生物可為釀酒酵母(5"acc/ aroy7i7ces cereK/siae)，優(yōu)選為釀酒酵母(5"acc/ ^YM yces careKy^'ae) ACCC 2063，所述逆境脅迫為冷脅迫或熱脅迫；
所述微生物可為大腸桿菌(^^c力eric/^a coh')，優(yōu)選為大腸桿菌(E9C力eric力j'a) JM109，所述逆境脅迫為重金屬離子脅迫；所述重金屬離子可為Hg2+;
所述微生物為移動(dòng)假單胞菌(i)wo/z7朋asM^i7")，優(yōu)選為移動(dòng)假單胞菌(^>// 0歷朋35//70&7i's ) NRRL B-4286，所述逆境脅迫為低pH脅迫或高滲透壓脅迫；
所述微生物可為嗜酸乳桿菌(Zscto^^7^s aw'obp/ j7"s )，優(yōu)選為嗜酸乳桿菌"acto6acW7"s aciobp/ i7〃s ) ATCC 53671，所述逆境脅迫為低pH脅迫；
所述微生物可為芽孢桿菌，優(yōu)選為蘇云金芽孢桿菌(Aaw77"s t/ "r^^'e/ w's )，尤其優(yōu)選為蘇云金芽孢桿菌(5aci77"s t/wr//^7'e/^ys ) ACCC 10068;
所述微生物可為芽孢桿菌，優(yōu)選為芽孢桿菌(5a"'77"s sp) L-23;所述逆境脅迫為原油脅迫。
本發(fā)明通過(guò)引入PHA合成基因，使微生物本身的代謝得到調(diào)控，提高了對(duì)逆境脅迫的抗性。
所述PHA合成機(jī)制包括以Wautersia eutropha， Rhodospirillum rubrum為代表的由乙酰輔酶A直接合成PHB途徑；以Pseudomonas aeruginasa為代表的脂肪酸從頭合成途徑，以Pseudomonas oleovorans為代表的脂肪酸P—氧化途徑等。
在本發(fā)明的調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法中，可將PHA合成的相關(guān)基因克隆到針對(duì)于目的菌的質(zhì)粒載體上，將構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入到目的菌中獲得重組菌，發(fā)酵重組菌獲得所需的產(chǎn)物或提高抗逆性。PHA合成的相關(guān)基因可以在質(zhì)粒上或染色體上。
為提高轉(zhuǎn)化效率，將重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入目的菌中的方法優(yōu)選為電轉(zhuǎn)化法，但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，包括熱激法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和接合轉(zhuǎn)化法。
本發(fā)明通過(guò)在微生物重組生產(chǎn)菌中引入PHA合成途徑，調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)的NAD(P)/NAD(P)H代謝以及乙酰輔酶A，丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物的流向，為所需的發(fā)酵產(chǎn)物提供可調(diào)節(jié)的合成環(huán)境，同時(shí)PHA的積累能提高重組生產(chǎn)菌對(duì)惡劣環(huán)境的耐受力，特別是產(chǎn)物的反饋抑制，也有利于提高發(fā)酵產(chǎn)量的提高。
本發(fā)明利用PHA合成路徑調(diào)節(jié)微生物代謝，提高微生物發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)效率，進(jìn)一步提高微生物抗逆性。本發(fā)明提供的方法是構(gòu)建含有PHA合成相關(guān)基因的質(zhì)粒，在導(dǎo)入相應(yīng) 菌株中進(jìn)行表達(dá)。所述的菌株可以為各種微生物生產(chǎn)菌。將本發(fā)明的方法應(yīng)用到各種微 生物生產(chǎn)菌中，可以有效的影響生產(chǎn)菌的代謝途徑，增加菌的抗逆性，提高包括透明質(zhì) 酸、丙酮酸、麥角固醇、啤酒、肌苷、彈性蛋白酶、類(lèi)胡蘿卜素、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、 苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、蘇云金桿 菌粉劑、鳥(niǎo)苷、谷胱甘肽、赤蘚糖醇、D-核糖，1， 3-丙二醇等生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。 在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié) 上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn)，這些均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，如利用根據(jù)密碼子簡(jiǎn)并 原則或堿基互補(bǔ)原則所獲得的與本發(fā)明的聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因功能基本 相同的核酸分子，對(duì)于聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)酶，在其不起主要作用的位點(diǎn)進(jìn) 行氨基酸插入和/或缺失和/或替換所得到的功能基本相同的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因， 來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中的百分含量如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"PHA"是指由微生物合成的聚羥基脂肪酸酯，其結(jié)構(gòu)通式如 式(I)所示，包括的PHA分子式例如聚羥基丁酸(PHB) 、 3—羥基丁酸和3—徑基戊酸的 共聚物PHBV、3 —羥基丁酸和3—羥基己酸的共聚物PHB冊(cè)x以及中長(zhǎng)鏈單體如3—羥基己 酸HHx到3—羥基十二酸3-HDD的單聚物或共聚物，。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"PHA合成途徑的相關(guān)基因"是指，在PHA合成途徑中，參 與了 PHA整個(gè)合成過(guò)程的各種相關(guān)合成酶和調(diào)控蛋白所對(duì)應(yīng)的基因；例如PHA合酶基因 phaC， 3—羥酰基一?；D(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因phaG， (R)—烯酰基一水合酶基因 phaj基因等。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"抗逆性"是指微生物在偏離其最佳生長(zhǎng)條件下的環(huán)境中的 生存能力，比如較高或較低的溫度，較高或較低的pH，較高或較低的滲透壓，較高的反 饋抑制，有毒物質(zhì)的存在等。
本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"微生物"包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌(例如酵母)等。 本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵產(chǎn)物"是指一切通過(guò)微生物發(fā)酵或轉(zhuǎn)化而得到的產(chǎn)品， 比如有機(jī)酸、酒精、其他醇類(lèi)、抗生素、氨基酸、維生素等。
實(shí)施例l、在獸疫鏈球菌中表達(dá)/fei/z^rsia e"tr印力a的p/^C^基因影響乳酸及透 明質(zhì)酸產(chǎn)量菌種獸疫鏈球菌(5Yre;^ococc〃s zooepiofe/w'c〃s ) ATCC 39920
1) 在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pBHR68質(zhì)粒(Spiekermann P， Rehm BHA,Kalscheuer R， Baumeister D， Steinbllchel A. A sensitive, viable-colony stainingmethod using Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other storage compounds. Arch Microbiol 1999，171:73-80)為模板，用引物ATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC禾口GTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT擴(kuò)增出/j/ 力a5基因，然后經(jīng)過(guò)HindIII和Clal酶切處理后，插入到質(zhì)粒pEU308 (Eichenbaum Z. and Federle MJ. Use of the lactococcalnisA promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteria:comparisonof induction level and promoter strength. AppL Environ. Microbiol. 1998， 64:2763-2769)的Spac啟動(dòng)子下限制性內(nèi)切酶HindIII和Clal的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pEUHB。然后通過(guò)Sphl酶切將質(zhì)粒上的Lacl基因切除，使/ / M^9基因的表達(dá)不需要IPTG誘導(dǎo)，得到質(zhì)粒pEUHBNOI。
2) 制備獸疫鏈球菌的感受態(tài)細(xì)胞，并將質(zhì)粒pEUHBNOI用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入獸疫鏈球菌中。
感受態(tài)細(xì)胞的制備
將獸疫鏈球菌(5Yre/ tococc〃s zooeA Ve啦'c"s ) ATCC 39920在含有THYB (Todd-Hewitt broth)(從0X0ID購(gòu)買(mǎi))36. 4 g/L和酵母浸出物0. 5%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h;然后將其接種到50 mL新鮮的THYB培養(yǎng)基中，接種后D530不超過(guò)0. 05，培養(yǎng)到OD530=0. 25即可；并在培養(yǎng)結(jié)束前半小時(shí)加入透明質(zhì)酸酶0. 4 mg/mL;
4°C， 8000 g,離心10分鐘，棄上清，用20 mL 0. 5 mmol/L蔗糖溶液重懸細(xì)胞；
4°C,8000 g,離心10分鐘，棄上清，用l mL 0.5 mmol/L蔗糖溶液重懸細(xì)胞，再離心，棄上清；將細(xì)胞重懸在250uL含有10%甘油的0.5 mmol/L蔗糖溶液中，按使用體積分裝到Eppendorf管中；迅速置于-80'C保存。
獸疫鏈球菌的電轉(zhuǎn)化
在200 u L感受態(tài)細(xì)胞中加入500-5000 ng質(zhì)粒pEUHBNOI，冰浴10分鐘；將混合體系轉(zhuǎn)移到2 mm電激杯中電激，電壓設(shè)為2. 5 kv;
用lmL冰冷的THYB將混合體系轉(zhuǎn)移到10 mLTHYB中，冰浴30—60分鐘；然后37°C靜置培養(yǎng)1小時(shí)；接著在14°C， 6000 g，離心10分鐘，菌體用1 mL THYB重懸并涂于抗性平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，得到重組獸疫鏈球菌(含有pEU朋NOI的獸疫鏈球菌(5Yre/7tococc"51加o印j'c/e/w'ci;51 ) ATCC 39920)。
3) 重組獸疫鏈球菌的發(fā)酵
種子培養(yǎng)基成分為蔗糖20 g/L，酵母粉10 g/L，牛肉膏10 g/L， MgS04 7H20:2g/L， MnS04'4H20: 0. 1 g/L， KH2P04: 2 g/L,微量元素液lmL/l，種子緩沖液40mL/l。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為酵母粉20g/L， Na2HP04' 12H20: 6. 2 g/L， MgS04 7H20: 2 g/L， K2S04: 1.3g/L， FeS04.7H20: 5 mg/L，微量元素液2.5mL/l，蔗糖70 g/L。其中微量元素 液含CaCl" 2 g/L， MnS04 4H20 : 24 mg/L， ZnCl2: 46 rag/L， CuS04 5H20: 19 mg/L;種 子緩沖液含Na2,4 12H20 : 36. 76 g/L， NaH2P04 12H20: 15. 98 g/L， NaHCO" 12. 5 g/L。 用接種環(huán)分別挑取平板上的獸疫鏈球菌(5Yre/ tococciAszooeA 'ofe肌'c^ )ATCC 39920 和重組菌菌種，分別接入裝有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于200 rpm的搖 床上培養(yǎng)14一16小時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C;然后按10% (體積比)的接種量將種子接 入發(fā)酵罐(7.5升發(fā)酵罐(NBS Bioflo 3000， NJ, USA)中裝液量3升)中。發(fā)酵罐控制溫 度37'C， pH值7.0，通氣量5L/min。初始攪拌速度200 rpm，當(dāng)溶氧降到0時(shí)升高轉(zhuǎn)速 到500 rpm，溶氧再次降到0時(shí)轉(zhuǎn)速調(diào)為650 rpm，并維持到發(fā)酵結(jié)束，獸疫鏈球菌 (5Yr印tococciAS zoo印iofe肌'c"s ) ATCC 39920發(fā)酵14小時(shí)，重組菌發(fā)酵16小時(shí)。分 別測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中的透明質(zhì)酸和乳酸的含量。結(jié)果表明獸疫鏈球菌(5Yr印tococc^ zooepjVe/w'c"s ) ATCC 39920發(fā)酵14小時(shí)的透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid, HA)和乳酸產(chǎn) 量分別為5. 4g/L和65 g/L。重組菌發(fā)酵14小時(shí)的透明質(zhì)酸和乳酸產(chǎn)量為5. 6g/L和 38g/L，乳酸產(chǎn)量下降42 %; 16小時(shí)的產(chǎn)量為7.3 g/L和41 g/L，透明質(zhì)酸產(chǎn)量上升 34 %，乳酸產(chǎn)量下降37 %。乳酸合成是獸疫鏈球菌在缺氧條件下主要的獲取細(xì)胞內(nèi)氧 化力(NAD)的途徑，因此細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量的乳酸。而引入PHB合成途徑為細(xì) 胞提供了一條外源的NAD再生途徑，從而可以降低乳酸途徑的壓力，使乳酸合成大大減 少，乳酸的大量減少，使更多的的碳源能夠流向別的代謝途徑，從而使透明質(zhì)酸產(chǎn)量也 得到一定提高。
其中，透明質(zhì)酸含量測(cè)定采用Bitter-Muir氏法(Bitter T. ， Muri HM. A modified uronic acid carbazol reaction. Anal. Biochem. 1962,4:330-334)，發(fā)酵液的測(cè)量 樣品制備方法如下a)取1 mL發(fā)酵液準(zhǔn)確稀釋到4 mL， 6000轉(zhuǎn)離心10分鐘；b)取1 mL 上清加入到4 mL無(wú)水乙醇中，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；c )棄去上清，加入2 mL 0. 2mraol/L NaCl，放置，間或振蕩，直至最終溶解；d)加入4 mL無(wú)水乙醇，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5 分鐘；e)棄去上清，沉淀用2mL去離子水溶解作為HA測(cè)定的樣品。乳酸鹽濃度的測(cè)定 采用HPLC (SpectroSYSTEMP2000, Thermo Separation Products, USA)法。折光檢測(cè)器， 離子交換柱Aminex HPX-87H， 300mmX7. 8mm，流動(dòng)相為0. 005咖ol/L硫酸溶液，流速0. 50 mL/min。檢測(cè)前，取0. 2 mL發(fā)酵樣品，準(zhǔn)確稀釋到4 mL， 10000 rpm/min離心5分鐘， 去上清，0.45ym濾膜過(guò)濾后作為色譜的樣品。
實(shí)施例2、在光滑球擬酵母中表達(dá)p力6C^基因影響丙酮酸產(chǎn)量
菌種光滑球擬酵母(7ori/7opsis ^a6rate) CCTCCM202019
培養(yǎng)基斜面和種子培養(yǎng)基(U:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L， KH2P04 1 g/L， MgS04 7H20 0. 15 g/L，瓊脂20 g/L(斜面用),pH 5. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80 g/L，蛋白胨15 g/L(含氮量12%),KH2P04 5 g/L， KC1 5g/L， MgS04 7H20 0.18 g/L，煙酸4mg/L,鹽酸硫胺素20 U g/L,鹽酸吡哆醇100ug/L，生物素10lig /L，核黃素50 ug/L,pH5.0。
將質(zhì)粒pB服68用BamHI和EcoRI酶切處理后，將獲得的5. 2kb的片段插入到質(zhì)粒pPIC9K(購(gòu)于Invitrogen公司)的BamHI和EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pPICHB。這個(gè)質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到光滑球擬酵母(7br^o/^^^s6rafa) CCTCCM202019中獲得重組菌(含有pPICHB的光滑球擬酵母(7b/7/"/^A《7a力r3ta) CCTCCM202019)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取斜面培養(yǎng)的光滑球擬酵母(7bi^7opw's ^a力/^te) CCTCCM202019和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10 M(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7. 5 L發(fā)酵罐裝液量3 L ,溫度3(TC，通氣量2 L/min ，攪拌轉(zhuǎn)速700 rpm ,用5 mol/L KOH控制pH為5. 0。當(dāng)殘?zhí)墙抵?%時(shí)，按一定速率流加400 g/L的葡萄糖液進(jìn)行流加培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。
取2 mL發(fā)酵液在8000 g離心5分鐘后，上清用乳酸脫氫酶法測(cè)定丙酮酸含量(La即erecht W, Heinz F. In: Methods of enzymatic analysis, ed. Bergmeyer, H. U. VCH，Weinheim， 1984,6: pp570-577)。細(xì)胞用去離子水洗兩次后真空冰干。結(jié)果表明重組菌的丙酮酸產(chǎn)量為68 g/L，比光滑球擬酵母(7b77y7叩sis ^s力r3ts) CCTCCM202019的52g/L提高了約31 %。糖酵解產(chǎn)生丙酮酸的途徑是消耗NAD的，丙酮酸在細(xì)胞內(nèi)被代謝掉則是合成NAD的過(guò)程。因此細(xì)胞內(nèi)大量積累丙酮酸需要一個(gè)高氧化力的環(huán)境。/^力"5基因的引入，能夠?yàn)榧?xì)胞提供氧化力，從而提高了丙酮酸的產(chǎn)量。
實(shí)施例3、在釀酒酵母中表達(dá)p力6C^基因影響麥角固醇產(chǎn)量
菌種釀酒酵母(&cc/ aro/z ycescerew'w'ae) IFFI 01338 (中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種中心保藏號(hào))
斜面，種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L(斜面用)，pH 5.5。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母(5"acc力ar咖/ces cereKZ'w'ae) IFFI 01338中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母(5"acc力aro/nyces cerew'siae) IFFI 01338)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的釀酒酵母(5"acc/ aro/z^ces coreKiw'ae) IFFI 01338和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30。C、 200 rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以10 W(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7. 5 L發(fā)酵罐裝液量3 L,溫度30°C,通氣量2 L/min，溶氧自動(dòng)控制在15 %，控制pH為5. 5。發(fā)酵10小時(shí)后每隔6小時(shí)補(bǔ)料一次，加入40 g葡萄糖，重組菌培養(yǎng)基中加入遺傳霉素0. 2 g/L。發(fā)酵30小時(shí)后，終止發(fā)酵。麥角固醇含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)(許旭萍，李惠珍，佘晨興，謝華玲，林志軍。麥角固醇產(chǎn)生菌7b/7;77oAsA /a/B"a優(yōu)化發(fā)酵條件的研究。生物學(xué)雜志，2002， 19: 15-17)。
測(cè)定結(jié)果表明重組菌的麥角固醇含量為1.2 %，比釀酒酵母(&cc/ aro/^ces cerew'w'ae) IFFI 01338的0. 9 %提高了 33 %。有研究表明，麥角固醇的合成具有氧 代謝的特征，有氧條件有利于其合成。因此，A^C^基因的引入，為細(xì)胞提供了更多的 氧化力，從而促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)麥角固醇的合成。
實(shí)施例4、在釀酒酵母中表達(dá)p力力C^基因提高酵母菌的抗逆能力 菌種釀酒酵母(5"acc/ aro歷/ces cerew'w'ae) ACCC 2063 將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母 (5^cc/ aro/nyces cereWsj'ae) ACCC 2063中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母 (5"acc力ara/z yces cerei^9i'ae) ACCC 2063)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的釀酒酵母(5^cc力a/YMiKces cerew'siae) ACCC 2063和 重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培養(yǎng)12小時(shí) 后，以l(P/。(v/v)接種量接入新培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分為葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L,酵 母粉10g/L，瓊脂20g/L(斜面用)，pH5. 5。釀酒酵母(5"acc/ aro/7^cescerew'w'ae) ACCC 2063和重組菌的種子在接入新培養(yǎng)基之前，各分為三組， 一組在48。C放置1小時(shí)， 一組 在-8(TC放置48小時(shí)，另一組不做處理。然后將種子分別接入新培養(yǎng)基后，測(cè)定其生長(zhǎng) 曲線。計(jì)算未經(jīng)處理的種子與經(jīng)過(guò)處理的種子延滯期時(shí)間之差。結(jié)果表明重組菌的種子 經(jīng)過(guò)冷或熱處理后，其活性并未受到大幅降低，即延滯期時(shí)間與未經(jīng)處理的種子相差不 大。而釀酒酵母(5acc/ arayz^ces cerew'w'朋)ACCC 2063的種子活性經(jīng)過(guò)冷或熱處理 后受到較大的影響。經(jīng)過(guò)熱處理后，釀酒酵母(5"acc力3r咖/cescereWw'ae) ACCC 2063 的時(shí)間差為7小時(shí)，重組菌時(shí)間差為l小時(shí)，兩個(gè)相差6小時(shí)。即是說(shuō)積累PHA的細(xì)胞 具有更好的惡劣環(huán)境耐受性，具有更強(qiáng)的生命力。這對(duì)于釀酒工業(yè)有重要的意義，由于 發(fā)酵過(guò)程中酵母死亡會(huì)影響發(fā)酵，同時(shí)帶來(lái)不適的口味，因此強(qiáng)壯的菌株有著更好的應(yīng) 用前景。
實(shí)施例5、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)p力力C^影響肌苷的生物合成 菌種枯草芽孢桿菌(&ci77"s s"6"7A ) ATCC 19162。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米液7 g/L， 氯化鈉2.5g/L，尿素2g/L， pH值7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖140 g/L,玉米液16 g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L,硫酸銨16g/L，七水硫酸鎂4 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L， 碳酸鈣20 g/L。
按照實(shí)施例1方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(^w'W^ w6fWis ) ATCC 19162中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(SacWhs仰Z^/7A ) ATCC 19162)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(泡w77"s sM07is ) ATCC 19162和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在32°C、 200 rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5呢(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7. 5 L發(fā)酵罐裝液量3 L，自動(dòng)控制溫度35°C， pH 6. 5，攪拌速度600 rpm，通氣量1 L/min,到肌苷產(chǎn)量不再增加停止發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間68小時(shí)。肌苷含量用HPLC測(cè)定，流動(dòng)相為0. 5 %磷酸氫二鉀，流速1. 2 mL/min,色譜柱為HypersilODS C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。 HPLC測(cè)定結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(fe^77"ss"Z^7A ) ATCC 19162的苷產(chǎn)量為19 g/L，重組菌的產(chǎn)量為24 g/L，提高了 26 %。在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中，為肌苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會(huì)消耗大量的NADP,同時(shí)從6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途徑的調(diào)控酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶受到NADPH的反饋抑制，因此NADPH的減少能促進(jìn)葡萄糖向磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)化?？偟膩?lái)說(shuō)，肌苷合成是一個(gè)需要大量氧化力的生化代謝過(guò)程，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進(jìn)肌苷的合成。p力力C^基因的引入，正能實(shí)現(xiàn)這一要求，因此能夠顯著的提高肌苷的產(chǎn)量。
實(shí)施例6、在嗜堿芽孢桿菌中表達(dá)/^力C^基因影響彈性蛋白酶產(chǎn)量
菌種嗜堿芽孢桿菌(5acj77"sa7ca7o; /l 7iAS) Ya-B (Takagi H， Tsai YC, NakamoriS， Yamasaki M. Improved Production and Recovery of Alkaline Elastase fromAlkalophilic Bacillus Strains by a Change of Medium Composition, ^5/osc/ 5i"ec/ A'oc力e/z , 1995， 59:1591-1592)
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，七水硫酸鎂0. 2 g/L，氯化鈉5 g/L，碳酸鈉10 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L，豆餅粉5 g/L，酵母粉2. 5 g/L，磷酸氫二鉀0. 75 g/L，七水硫酸鎂0. 2 g/L，氯化鈉20 g/L，碳酸鈉10 g/L。
將實(shí)施例1中獲得的pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到嗜堿芽孢桿菌(5s"77ma7ca7op/ /7"s)Ya-B中獲得重組菌(含有pEUHB的嗜堿芽孢桿菌(ifeci"m a7caJQ。力j7"s)Ya-B)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。獲得重組菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的嗜堿芽孢桿菌嗜堿芽孢桿菌(^sw7J"s a化a7o/ 力i7^)Ya-B和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在37。C、 250 rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以l M(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，37°C， 250 rpm培養(yǎng)48小時(shí)，停止發(fā)酵。將發(fā)酵液8000 g離心十分鐘，收集上清，用硫酸銨分級(jí)鹽析(30%-65%飽和度)，沉淀溶于0.05 mo1/1 pH 9.0硼酸緩沖液中，得到粗酶液。1 mL粗酶液中與20 mg地衣紅-彈性蛋白中分別加入1 mL 0.05 mol/L pH 9. 0硼酸緩沖液于55'C水浴保溫一小時(shí)，不時(shí)振蕩。分別以2 mL 0.7 raol/L p服.0磷酸緩沖液終止反應(yīng)，8000 g離心10分鐘，上清于590 nm測(cè)吸光度值。20 mg地衣紅-彈性蛋白完全水解后，590 nm處光吸收值的一半為10個(gè)酶活力單位。
經(jīng)過(guò)48小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)后，重組菌的酶活198 U/mL比嗜堿芽孢桿菌(Aa^77〃sWca7叩/Lz7M) 176U/mLYa-B高12.5%，重組菌具有更高的彈性蛋白酶產(chǎn)量。研究表明，高溶氧有利于彈性蛋白酶的合成，其合成是一個(gè)需要氧化力的過(guò)程。/^AC^基因的引入， 正好能夠?yàn)榧?xì)胞提供更多的氧化力，這是有利于彈性蛋白酶的合成的。 實(shí)施例7、在紅酵母中表達(dá)p力力"5基因影響類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量
菌種紅酵母(^ o^tor"^《7"";7&) NCIM 3353 (印度國(guó)家工業(yè)微生物菌種保 存中心)
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖35 g/L，麥芽提取物3 g/L，酵母粉2 g/L， KH2P04 3 g/L， K2HP04 3 g/L， MgS04.7H20 0.2 g/L，瓊脂20 g/L， pH 6.0。
液體培養(yǎng)基為葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L， KH2P042g/L， K2HP04 2 g/L， pH6.0。 將實(shí)施例2中獲得的pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到紅酵母(^70flbto/Y/h 《7"i/7J's) NCIM 3353中獲得重組菌(含有pPICHB的紅酵母(朋oo^or"7a ^7""/ is) NCIM 3353)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的紅酵母(A%oobto/7y7a ^""/7i's) NCIM 3353和重組菌 分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在28°C、 240 rpm下培養(yǎng)18小時(shí)后，以5 免(v/v)接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基(100 mL/500 mL錐形瓶)，28°C， 240 rpm培養(yǎng)72小 時(shí)。發(fā)酵液3000 rpm離心十分鐘收集菌體，用去離子水洗兩次后冰干稱(chēng)重。每克菌體加 5 mL 3 mol/L HC1，室溫下浸泡1小時(shí)，在沸水浴中煮4分鐘，迅速冷卻，3000 g離心 十五分鐘，棄去上清，沉淀用去離子水洗兩次后加3mL丙酮，室溫下振蕩三十分鐘，再 3000 g離心二十分鐘，上清即為類(lèi)胡蘿卜素提取液，將提取液稀釋后，測(cè)475 nm處吸光 度值，按下式計(jì)算胡蘿卜素含量胡蘿卜素含量(Ug/g菌體^A475 XVXD/0. 16w。 A475 為胡蘿卜素吸光度值，V為提取所用溶劑量(mL) ， D為樣品稀釋倍數(shù)，w為菌體量(g) ， 0. 16 為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。
結(jié)果表明紅酵母(朋W"ort/7agA/"/7^) NCIM3353的類(lèi)胡蘿卜素含量為76u g/g， 而重組菌的含量為92u g/g，提高了 21 %。高氧化力環(huán)境有利于類(lèi)胡蘿卜素的合成。p力6C^ 基因的導(dǎo)入，能夠?yàn)榧?xì)胞提供氧化力，從而促進(jìn)類(lèi)胡蘿卜素的合成。 實(shí)施例8、在谷氨酸棒桿菌種表達(dá)p力6^l應(yīng)響谷氨酰胺合成 菌種谷氨酸棒桿菌(Co/y/ eZ acte/"y〃/Z7 g7"te/w'c"/z ) ATCC 13032。 種子培養(yǎng)基及發(fā)酵成分為 一水葡萄糖50 g/L, (NH4)2S04 7 . 5 g/L， NaCl 2 g/L, CH3C00Na 2H20 3 g/L, CaCl2 2H20 0. 1 g/L， K2HP04 3H20 8 g/L， KH2P04 2g/L,尿素5 g/L，MgS04 7H20 0 . 5 g/L，鹽溶液10 mL/l，生物素6u g/L,維生素B1 1 mg/L，卡那霉素 20 mg/L。其中鹽溶液為MnS04 7H20 20 mg， Na2B407 跳0 2 mg, (NH4)5M07024 4H20 1 mg， FeCl2 6H20 20 mg， ZnS04 7H20 5 mg， CuS04 5H20 2 mg， FeS04 7H20 250 mg,溶于50 mL 1 mol/L HCl中。
將實(shí)施例l中獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌 (Corj77eZ acten》7/ ^7"a/7W'c"歷)ATCC 13032中獲得重組菌(含有pEUHB的谷氨酸棒桿菌(Corj77e6acz^rj'"歷《7"ta肌'c鵬)ATCC 13032)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的谷氨酸棒桿菌(Coo77e^cteri鵬^"a肌'c鵬)ATCC13032和重組菌，分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30。C、 200 rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5 %"八)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5 L發(fā)酵罐裝液量3 L,自動(dòng)控制溫度3CTC， pH 6.5,攪拌速度600 rpm，通氣量l L/min,發(fā)酵48小時(shí)，停止發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中谷氨酰胺含量。谷氨酰胺的測(cè)定用新華3號(hào)濾紙?jiān)谑覝叵掠貌伙柡头ㄕ归_(kāi)，展開(kāi)劑用體積比為5: 2的正丙醇和濃氨水的混合液，上行法展開(kāi)。稱(chēng)取谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，配成1%，1.5%， 2%， 2.5%， 3%等不同質(zhì)量濃度的溶液，每種溶液點(diǎn)樣luL，發(fā)酵液離心取上清點(diǎn)樣lyL。展析完成后風(fēng)干濾紙，用0.5g/L茚三酮丙酮溶液顯色，105。C烘干5分鐘，濾紙上出現(xiàn)紫紅色氨基酸斑點(diǎn)，剪下氨基酸斑點(diǎn)，用洗脫液(體積比為2:38的0. lg/L CuS04 5H20和75%乙醇的混合液)洗脫30分鐘，然后在520 nm處測(cè)光吸收，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得發(fā)酵液中谷氨酰胺含量。結(jié)果表明谷氨酸棒桿菌(6b/y/7e力a"e/7'湖^W柳ic湖)ATCC 13032的谷氨酰胺產(chǎn)量為ll g/L,重組菌產(chǎn)量為14 g/L，提高約27 %。 p力M^感因的引入，能夠減少丙酮酸向乳酸的代謝，促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，而谷氨酰胺的前體正是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，這樣能夠?yàn)楣劝滨０返暮铣商峁└嗟那绑w，因此產(chǎn)量得到提高。實(shí)施例9、在乳酸發(fā)酵短桿菌中表達(dá)p力力6M應(yīng)響賴(lài)氨酸產(chǎn)量菌種乳酸發(fā)酵短桿菌(^rew'力a"6^'〃歷7acZ^/"er/z7e/7Z^z ) ATCC 31269。斜面培養(yǎng)基成分為牛肉膏0.3%，蛋白胨1 %，NaC10.5 %，瓊脂2 %， pH 7. 2-7. 4。種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖2 %， KH2P04 0.1 %， (NH4)2S04 1 %， MgS04 7H20 0. 04%， FeS04*7H20 1 mg/L， MnS04 H20 0. 8 mg/L，生物素5 ix g/L， VB1 20 mg/L，豆餅水解液5 %， pH 7. 0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖14%, KH2P04 0.1 %， (NH4)2S04 4 %, MgS04 7H20 0. 04%， FeS04.7H20 1 mg/L， MnS04 H20 0. 8 mg/L，生物素5ug/L，維生素Bl 20 mg/L，豆餅水解液5 %，碳酸鈣2 %， pH 7.0。
將實(shí)施例l中獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到乳酸發(fā)酵短桿菌(5rew7 acte/7'鵬7actofei7Z7e/7t"歷)ATCC 31269中獲得重組菌(含有pEUHB的乳酸發(fā)酵短桿菌(i5re"A3"eri〃忍^3"o/"e/^67 z^7 ) ATCC 31269)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的乳酸發(fā)酵短桿菌(5rew'力acteri咖7a"ofe/y/7e/7t"歷)ATCC 31269和重組菌，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，500 mL搖瓶裝液量30 mL，于搖床上30'C， 110 rpm，培養(yǎng)12小時(shí)。接種2 mL—級(jí)種子于30 mL二級(jí)種子培養(yǎng)基中，于搖床上30°C， 110 rpm，培養(yǎng)IO-12小時(shí)。然后取l mL二級(jí)種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，500 mL搖瓶裝液量20 mL， 3CTC， 110 rpm，培養(yǎng)72小時(shí)。賴(lài)氨酸含量用茚三酮比色法測(cè)量發(fā)酵液經(jīng)3500 g離心15分鐘，取上清O. 1 mL稀釋到100 mL，取l mL稀釋液加入到4 mL茚三酮試劑(取水合茚三酮l.O g，加入乙二醇甲醚75 mL，另取1.34 g CuCl2 2H20加入pH1. 3擰檬酸緩沖液25 mL中，混合兩種溶液后，再加蒸餾水IOO mL，得到茚三酮溶液)中，沸水浴加熱 20分鐘，快速冷卻后測(cè)定478 nm處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定賴(lài)氨酸含量。
結(jié)果表明乳酸發(fā)酵短桿菌(5rew77a"e/^鵬7acto/"erme/ t"歷)ATCC 31269賴(lài)氨酸 產(chǎn)量為53g/L，而重組菌的產(chǎn)量為58 g/L，約有IO %的提高。在合成代謝中，賴(lài)氨酸的 前體物質(zhì)草酰乙酸有三條途徑合成，但都與丙酮酸和NADP/NADPH的代謝有關(guān)，因此p力/^/^ 基因的導(dǎo)入能對(duì)賴(lài)氨酸的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。
實(shí)施例10、在大腸桿菌中表達(dá)/ /^C^基因影響苯丙氨酸產(chǎn)量
菌種大腸桿菌(^sc/ aric力ia. co力')ATCC 31882。
種子培養(yǎng)基成分為蛋白胨1 %，酵母粉0.5 %， NaCl 1 %，葡萄糖2 %， pH7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為Na2HP04 12H20 : 20 g/L，檸檬酸鈉6 g/L，谷氨酸鈉0. 4 g/L， 酪氨酸0. 6 g/L，葡萄糖20 g/L。
補(bǔ)料培養(yǎng)基:CaCl2 2H20 0. 6 g/L，酪氨酸500mg/L，葡萄糖500g/L， MgS04 7H20 1 g/L，維生素Bl 500 mg/L，氨水28 %。
將pBHR68質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌(&c力erj'c力J'a coh') ATCC 31882中 獲得重組菌(含有pBHR68的大腸桿菌(^sc力eric力ia. ATCC 31882)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的大腸桿菌(v&c力en'c/w'a. co7i) ATCC 31882和重組菌， 分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在37。C、 200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以5 y。(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5 L發(fā)酵罐裝液量3 L，自動(dòng)控制溫度38.5T:， pH 7.0， 溶氧20 %，通過(guò)補(bǔ)料控制葡萄糖濃度在1.5 %，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。苯丙氨酸含量測(cè)定方 法如下取2uL發(fā)酵液上清點(diǎn)樣于濾紙上，置于層析液中單向上行展析16小時(shí)，烘干后 以茚三酮噴涂顯色，以標(biāo)準(zhǔn)氨基酸為對(duì)照，剪下層析后的著色斑點(diǎn)，置于65%的乙醇溶 液中脫色2小時(shí)，測(cè)定520 nm下光吸收，氨基酸量-標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液濃度X被測(cè)發(fā)酵液光 密度/標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液光密度。
結(jié)果表明大腸桿菌(fsc力en'c/^a co7j') ATCC 31882發(fā)酵得到苯丙氨酸濃度為8. 2 g/L，而重組菌產(chǎn)物濃度為10.6 g/L，提高了29 %。對(duì)于大腸桿菌的氨基酸合成，如果 用全局的代謝調(diào)控能夠取得較好的效果。而p/^"，因的引入， 一個(gè)有效的調(diào)控是能增 強(qiáng)磷酸戊糖途徑，有利于氨基酸的合成。
實(shí)施例11、在熒光假單胞菌中表達(dá)/^MM堪因影響葡萄糖酸產(chǎn)量
菌種- 熒光假單胞菌(/^eiycbyz7。/73s /7〃oresce"s) AS 1.55
斜面培養(yǎng)基成分為牛肉膏0.5 %，蛋白胨1 %， NaC10.5 %，瓊脂2 %， pH7. 0。 種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖2 %，玉米漿1 %，尿素0.2 %， KH2P04 0.2 %， MgS04 7H20 0. 05 %， pH7. 0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉水解糖14%，玉米漿1.5%，輕質(zhì)碳酸鈣4%, pH6.7。 將質(zhì)粒pBHR68經(jīng)過(guò)HindlII和BamHI酶切處理后，插入到質(zhì)粒pBBRlMCS2 (KovachME，Elzer PH, Hill DS, Robertson GT，F(xiàn)arris MA， Roop RM， Peterson KM. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS， carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995,166:175-176)的HindIII和BamHI的識(shí) 別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pBBRHB。這個(gè)質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熒光假單胞菌(Fw"必歷朋as /7i;aresce/7s) AS 1. 55中獲得重組菌(含有pBBRHB的熒光假單胞菌(/^ed/ob/z 朋as /7〃oresce/^) AS 1.55)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的熒光假單胞菌(/^ew/o卿朋s /7"oresce/^) AS 1. 55和 重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 230 rpm下培養(yǎng)16小時(shí) 后，以10。"v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵瓶500mL裝液量50mL，在30'C、 230 rpm下 培養(yǎng)72小時(shí)。發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法測(cè)定發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量= 25'C下發(fā)酵液旋光度絕對(duì)值/0. 88。
熒光假單胞菌(/^e"0b忍o"ss/7"o/^sce/7s) K1005的發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量為 13.4g/L，重組菌的產(chǎn)量為16 g/L，提高了大約19 %， pM"堪因的導(dǎo)入，有利于提高 菌的的耐受力，生長(zhǎng)得更好，從而得到更高的轉(zhuǎn)化率。
實(shí)施例12、在枯草芽孢桿菌中表達(dá); /7力"堪因影響a-淀粉酶合成
菌種枯草芽孢桿菌(5aci77〃s s""/7A ) ATCC 21556。
種子培養(yǎng)基成分為(300 mL):葡萄糖1 g，牛肉膏1 g，蛋白胨1 g， NaCl 1 g， KH2P04 1 g，淀粉1 g， pH 7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(200 mL):牛肉膏l(xiāng)g，蛋白胨lg， NaCllg， KH2P041 g， NaH2P04 1 g，淀粉3 g。
將按照實(shí)施例l方法獲得的質(zhì)粒pEUHB乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌 (few7AAs犯6ti7is) ATCC 21556中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(fecW"s i"7is ) ATCC 21556)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(飽"7"s s"&i7is ) ATCC 21556和重 組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在32。C、 200rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后， 以10 W(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50mL/500mL錐形瓶)，32°C， 200 rpm培養(yǎng)72小時(shí)， 測(cè)定a-淀粉酶酶活力。酶活力測(cè)定取5mL發(fā)酵液，4000 g離心15分鐘，取上清與5-乙 縮醛-麥芽庚糖-對(duì)-硝基苯反應(yīng)，酶活力單位定義為37°C， l分鐘分解lumol淀粉為葡 萄糖即為l個(gè)酶活單位。
結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(泡w7A^sMtj7A) ATCC 21556的發(fā)酵液中酶活為67 U/L， 而重組菌酶活為76 U/L。重組菌的發(fā)酵液中有更高的淀粉酶活力，這可能是因?yàn)?^6C^ 基因?qū)е录?xì)胞內(nèi)的代謝途徑發(fā)生變化，使其傾向于有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的方向，提高了細(xì)胞 利用淀粉作為碳源的能力，即是增加了細(xì)胞的淀粉酶產(chǎn)率。
實(shí)施例13、在釀酒酵母中表達(dá); /^(^，因影響酒精產(chǎn)量菌種釀酒酵母(&cc力ai"o/z /ces cerew'w'ae ) ACCC 2063。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到釀酒酵母 (6"acc/ ar咖/ces cererisiae ) ACCC 2063中獲得重組菌(含有pPICHB的釀酒酵母 (&cc/ a濯yces cere"w'ae ) ACCC 2063)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
固體培養(yǎng)基配制量取5 Bx麥汁200 mL放入500 mL燒杯中，在沸騰狀態(tài)下加入4 g瓊 脂，不斷攪拌直至完全融化，分裝于試管中高壓滅菌，然后放斜面；液體培養(yǎng)基配制 量取5 Bx麥汁llO mL裝入250 mL三角瓶中，調(diào)pH4. 8-5. 0，然后高壓滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基配 制稱(chēng)淀粉300 g倒入1200mL4(TC溫水中，攪拌均勻，加入0.2%氯化鈣，調(diào)節(jié)pH6. 0-6. 2， 稱(chēng)取液化酶l g，于9(TC-93"溫度下液化30分鐘，直至加入碘液不變色，液化結(jié)束后將 其迅速冷卻到58'C-60'C ，并調(diào)pH值為4. 4-4. 6，加入l mL糖化酶(十萬(wàn)單位)進(jìn)行糖化， 在淀粉水解液的糖度在23 Bx時(shí)停止，加入2%的玉米漿，并煮沸1小時(shí)，冷卻過(guò)濾，然后 調(diào)pH到4.8-5.0，滅菌待用。發(fā)酵時(shí)按10% (v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，3(TC保 溫發(fā)酵72小時(shí)。乙醇濃度用高效液相色譜測(cè)量發(fā)酵液8000 g離心十分鐘，取上清過(guò)濾 后作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱，流動(dòng)相為98%的濃硫 酸H20(體積比為0.5:1000)，流速l mL/min。
結(jié)果表明釀酒酵母(5"accA3r咖/ces carew'w'ae ) ACCC 2063發(fā)酵液乙醇濃度為15 % ， 而重組酵母的乙醇濃度為20 %，提高了33%， p/ 6^遮因的引入，不僅可以改變細(xì)胞內(nèi) 的代謝流，而且PHA的合成能夠提高重組酵母對(duì)高乙醇環(huán)境的耐受性，從而提高了乙醇的 產(chǎn)量。
實(shí)施例14、在克魯斯假絲酵母中表達(dá)/ /^^應(yīng)因影響甘油產(chǎn)量 菌種克魯斯假絲酵母(C朋必ofe Ar"sei' ) ACCC 2196。
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，碳酸鈣5g/L，瓊脂20 g/L。 種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖200 g/L，尿素2 g/L，玉米漿7 g/L。 發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖200 g/L，尿素2 g/L，玉米漿6 g/L。 將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到克魯斯假絲酵母 A/Yyse2' ) ACCC 2196中獲得重組菌(含有pPICHB的克魯斯假絲酵母(Ca/7力'血 Ar"sei' ) ACCC 2196)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的克魯斯假絲酵母(Ca/7力Va A/v^ei ) ACCC 2196和重組 菌分別接種到種子培養(yǎng)基(40 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 230 rpm下培養(yǎng)12小時(shí)后，以 10y。(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，7. 5 L發(fā)酵罐裝液量3 L，自動(dòng)控制pH5.5，溫度3(TC， 通氣量0.5 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速450 rpm，殘?zhí)墙咏麿時(shí)停止發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液中甘油含量。 發(fā)酵液中甘油含量用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵液8000 g離心十分鐘，取上清過(guò)濾后作為 樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱，流動(dòng)相為98%的濃硫酸:&0(體 積比為O. 5:1000)，流速l mL/min。結(jié)果表明克魯斯假絲酵母(C朋必A々27;sei ) ACCC 2196最終甘油濃度為62 g/L， 而重組菌為75 g/L，提高了21 %。在發(fā)酵過(guò)程中，有相當(dāng)部分的碳源會(huì)流向乙醇合成， 這降低了甘油的得率。乙醇途徑是為細(xì)胞提供氧化力的一條途徑,/^力"趣因得引入， 能夠降低乙醇途徑的壓力，促進(jìn)糖酵解，使更多的碳源流向甘油合成，增加了甘油的得 率。
實(shí)施例15、在熱帶假絲酵母中表達(dá)p力6C4感因影響十二碳二元酸的合成 菌種..熱帶假絲酵母(Cs/7力W3 z^TQW'csJis ) UH22248 (任剛，陳遠(yuǎn)童，十二碳二 元酸的發(fā)酵研究，生物工程學(xué)報(bào)，2000， 16: 198-202)。 斜面培養(yǎng)基成分為10 Bx的麥芽汁，1.5 %瓊脂粉。
種子培養(yǎng)基成分為酵母膏5g，玉米漿3g，蔗糖5g， KH2P04 8 g，加水定容至1L 滅菌，接種時(shí)再加入尿素0.3 %，重臘5 %。
發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母膏2 g，玉米漿1 g，蔗糖2 g， KH2P04 8 g， NaCl 1 g，加水 定容至100mL滅菌，接種時(shí)再加正十二烷20 %，尿素0.12 %，重臘3.3 %， pH 7. 3。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熱帶假絲酵母 (Ca/ 力V/a ^roAZ'ca7is ) UH22248中獲得重組菌(含有pPICHB的熱帶假絲酵母(Cs"c/2Wa tro貝'ca7A ) UH22248)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
將斜面培養(yǎng)48小時(shí)的熱帶假絲酵母(C朋力'c/a tro/^'cs力's ) UH22248和重組菌分別 接種到種子培養(yǎng)基中(100 mL/500 mL搖瓶)，在30。C、 180 rpm下培養(yǎng)48小時(shí)后，接種3 mL 到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，3CTC、 180rpm培養(yǎng)4天，發(fā)酵結(jié)束。取15ml發(fā)酵液，用6 mol/L HCl調(diào)pH值到3.0，加入120 mL乙醚，搖動(dòng)100次，放置30分鐘，然后倒出40 mL乙醚提取 液，通風(fēng)櫥中風(fēng)干得到白色固體，然后將其用95 %的中性熱乙醇溶解，加入一滴酚酞， 用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，記錄所用的NaOH，計(jì)算十二碳二元酸產(chǎn)量。
結(jié)果表明重組菌(十二碳二元酸產(chǎn)量為92g/L)顯示出了比熱帶假絲酵母(&77Q^fe
^ MicWis) UH22248 (十二碳二元酸產(chǎn)量為78g/L)更高的十二碳二元酸產(chǎn)量，發(fā)酵液 比較粘稠，細(xì)胞處于一種低溶氧水平的環(huán)境，； /^"g因的引入能夠在這種條件下為細(xì) 胞提供氧化力，同時(shí)其可能也對(duì)脂肪酸氧化途徑有抑制作用，從而增加了發(fā)酵液中的二 元酸產(chǎn)量。
實(shí)施例16、在熱帶假絲酵母中表達(dá)p力6^盛因影響十五碳二元酸的合成 菌種熱帶假絲酵母(Ca/7力Va ti^w'ca7A) T25-14 (陳遠(yuǎn)童，郝秀珍，龐月川，十 五碳二元酸的發(fā)酵研究，微生物學(xué)報(bào)，1995， 35: 433-437)。 斜面培養(yǎng)基成分為10 Bx的麥芽汁，1.5 %瓊脂粉。
種子培養(yǎng)基成分為酵母膏5 g/L，玉米漿3 g/L,蔗糖5 g/L， KH2P04 8 g/L配好 滅菌，接種時(shí)再加入尿素0.3 %，重臘5 %。
發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母膏2g/L，玉米漿lg/L，蔗糖lg/L， KH2P04 8 g/L， NaCl lg/L加水定容至IOO mL滅菌，接種時(shí)再加正十五烷20 %，尿素0.12 %， pH 7.5。 將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熱帶假絲酵母 (Ca/K/i^ fro/^ca力's ) 1~25-14中獲得重組菌(含有pPICHB的熱帶假絲酵母(C朋力Va tro^'ca7i's ) T25-14)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
將斜面培養(yǎng)48小時(shí)的熱帶假絲酵母(Ca"力Va tr0jw'Ca^'s ) TV"和重組菌的種子分 別接種到種子培養(yǎng)基中(50mL/500mL搖瓶)，在3(TC、 220 rpm下培養(yǎng)48小時(shí)后，5 % (v/v) 接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(50mL/500mL搖瓶)，30°C、 220 rpm培養(yǎng)72小時(shí)。取15ml發(fā)酵 液，用6 mo1/1 HCl調(diào)pH值到3.0，加入120ml乙醚混勻，放置直到分層，除去水層，放出 乙醚提取液，通風(fēng)櫥中風(fēng)干得到白色固體，然后將其用95 %的中性熱乙醇溶解，加入一 滴酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，記錄所用的NaOH，計(jì)算二元酸產(chǎn)量。
結(jié)果表明熱帶假絲酵母(Ca/7力Va ^r叩J'c^j's ) T2W4的二元酸產(chǎn)量為36 g/L，重組 菌為43 g/L，提高了19 %。重組菌發(fā)酵液比較粘稠，細(xì)胞處于一種低溶氧水平的環(huán)境， p力6Q感因的引入能夠在這種條件下為細(xì)胞提供氧化力，同時(shí)其可能也對(duì)脂肪酸氧化途 徑有抑制作用，從而增加了發(fā)酵液中的二元酸產(chǎn)量。
實(shí)施例17、在蘇云金芽孢桿菌中表達(dá); 力力"堪因?qū)ρ挎咝纬傻挠绊?菌種蘇云金芽孢桿菌(fec/77"s t/ "nV^ie/ w's ) ACCC 10068。 將按照實(shí)施例l方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到蘇云金芽孢桿菌 (5aw77"s t力"/7'/^ie/ w's ) ACCC 10068中獲得重組菌(含有pEUHB的蘇云金芽孢桿菌 (&ci^i/s ^ 〃n'/^7'e/ sis ) ACCC 10068)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的蘇云金芽孢桿菌(^3ciW^ t/ "h/^ieT7Si's ) ACCC 10068 和重組菌，分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在25'C、 220 rpm下培養(yǎng)12 小時(shí)后，以l M(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，25°C， 220 rpm發(fā)酵 36小時(shí)。培養(yǎng)基成分均為牛肉膏0.3 %,蛋白胨0.5 %， pH 7.2。發(fā)酵后用血球計(jì) 數(shù)板計(jì)量孢子含量。
通過(guò)顯微鏡觀測(cè)可以看到，重組菌的菌體量(10.2*109個(gè)/1111)以及孢子數(shù)(1.5*109 個(gè)/ml)都高于蘇云金芽孢桿菌(5aw77"s ^ "ri/^7'e/wis) ACCC 10068 (菌體量9. 1*109 個(gè)/ml,孢子數(shù)1.1*109個(gè)/!!11)。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明高溶氧是有利于孢子形成的。pMC4應(yīng)因 的引入，能夠促進(jìn)孢子形成。
實(shí)施例18、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)/^力^應(yīng)響鳥(niǎo)苷合成
菌種枯草芽孢桿菌(5a"7k ) ATCC 19220。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米液10 g/L， 氯化鈉5 g/L，尿素2 g/L，味精5 g/L， pH 7.0-7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖120g/L，豆餅水解液50g/L，酵母粉16g/L,硫酸銨15 g/L，七水硫酸鎂4g/L,磷酸氫二鉀2g/L，味精10g/L，碳酸鈣2g/L， pH 7. 0-7. 2。將按照實(shí)施例l方法獲得的質(zhì)粒pEUHB通過(guò)乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌 (5a^77"ss"力"7j's) ATCC 19220中獲得重組菌(含有pEUHB的枯草芽孢桿菌(j acW7"s s〃力^ 7is ) ATCC 19220)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(泡^72"s s"&i7is ) ATCC 19220和重 組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在36'C、 140 rpm下培養(yǎng)10小時(shí)后， 以IO y。(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，36°C、 220 rpm下培養(yǎng)60小 時(shí)，測(cè)定鳥(niǎo)苷含量。鳥(niǎo)苷含量用HPLC測(cè)定，流動(dòng)相為0.5%磷酸氫二鉀，流速1.2mL/min， 色譜柱為Hypersil ODS C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。
結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(iS3c/77i^ ^/力"7is ) ATCC 19220鳥(niǎo)苷產(chǎn)量為16 g/L，重 組菌的產(chǎn)量為20 g/L，提高了25 %。在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中，為鳥(niǎo)苷合成提供前體的單磷 酸己糖途徑會(huì)消耗大量的NADP，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進(jìn)鳥(niǎo)苷的合成。W力C45 基因的引入，正能實(shí)現(xiàn)這一要求，因此能夠顯著的提高鳥(niǎo)苷的產(chǎn)量。
實(shí)施例19、在釀酒酵母中表達(dá)p力M^，因影響谷胱甘肽產(chǎn)量
菌禾中-酉良酒酵母(5"3cc/ aro/n7ces cereFis/se )KY6186 (Sakato K， TanakaH. Advanced control of glutathione fermentation process. 5iotec力/707歷'oe恥1992， 40:904 -912)。
斜面培養(yǎng)基成分為麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L， 瓊脂20 g/L， pH 7.0-7.2。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，磷酸氫二銨3g/L，硫酸鎂0.8 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L， pH 7.0-7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖70g/L，酵母粉15g/L，麥汁60g/L，磷酸氫二銨10 g/L， 硫酸鎂5 g/L，蜜糖28 g/L，玉米漿16 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L， ZnCl210 mg/L， FeCl2 6 mg/L， CuCl2 6 mg/L， MnCl2 6 mg/L， pH 7.0-7.2。
將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到釀酒酵母 (5"acc/7aro歷/cescere[/iw'3e ) KY6186中獲得重組菌(含有的釀酒酵母(5"acc力aro/^ces carew'siae ) KY6186)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的釀酒酵母(&cc/ aro/^ces cerew'w'ae ) KY6186和重組 菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30'C、 180 rpm下培養(yǎng)24小時(shí)后，以 10呢(v/v)接種量接入發(fā) 培養(yǎng)基，7.5 L發(fā)酵罐中裝液量3 L發(fā)酵，自動(dòng)控制溫度3(TC， pH5.4，通氣量2L/min，前兩小時(shí)轉(zhuǎn)速200 rpm，之后每小時(shí)升高IOO rpm，直到600 rpm， 維持到發(fā)酵結(jié)束，36小時(shí)停止發(fā)酵。取發(fā)酵得到的新鮮酵母用蒸餾水洗三次后，在40 % 的乙醇中，3(TC萃取2小時(shí)，3000 g離心，取上清用ALLOXAN法(上海市醫(yī)藥化驗(yàn)所臨床 生化檢驗(yàn)(上冊(cè))，上海，上海科學(xué)與技術(shù)出版社，1979)測(cè)定谷胱甘肽含量。
結(jié)果表明釀酒酵母(5"acc/ arOT/cescerew'siae) KY6186發(fā)酵液谷胱甘肽濃度為1. 3g/L，而重組菌的谷胱甘肽濃度為1.6 g/L，提高了23 %。研究表明乙醇合成的降低有利
于谷胱甘肽的合成，而乙醇合成是一個(gè)消耗還原力，獲得氧化力的過(guò)程，p力力C4，因的
引入可以抑制乙醇的合成，提高谷胱甘肽產(chǎn)量。
實(shí)施例20、在球擬酵母中表達(dá)p/^C4感因?qū)Τ嗵\糖醇產(chǎn)量的影響
菌種球擬酵母(7br"Zo;^is sp) B845 (吳燕，楊曉偉，陸茂林，赤蘚糖醇產(chǎn)生
菌B845的形態(tài)，生理特征，生物技術(shù)，2002， 12: 20-21)。
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖10 %，酵母膏1 %，脲0. 1 %，瓊脂2 %， pH7.0-7.2。 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20 %，酵母膏0.5 %，脲0. 1 %， pH 7.0-7.2。 將按照實(shí)施例2方法獲得的質(zhì)粒pPICHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到球擬酵母 (7b/77ZoAsis sp ) B845中獲得重組菌(含有pPICHB的球擬酵母(7bri^o/ w's sp ) B845)
進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的球擬酵母(7b/7^叩w's sp) B845和重組菌分別接種到 種子培養(yǎng)基(40 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 180 rpm下培養(yǎng)3天后，以5義(v/v)接種量 接入發(fā)酵培養(yǎng)基中(50 mL/500 mL錐形瓶)，30°C、 180 rpm下培養(yǎng)3天，測(cè)定赤蘚醇的產(chǎn) 量。赤蘚糖醇產(chǎn)量用高碘酸氧化法測(cè)量(原野，應(yīng)向賢，范光先，諸葛健，高碘酸氧化 法直接測(cè)定發(fā)酵液中赤蘚糖醇，無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 19: 72-75)。結(jié)果表明球擬 酵母(7b/""^/^A sp) B845的赤蘚糖醇產(chǎn)量為50 g/L，重組菌為55 g/L，提高在IO % 左右，作為赤蘚糖醇生產(chǎn)菌，需要有良好的耐高滲能力和代謝碳源能力，而p力MM應(yīng)因 的引入，導(dǎo)致胞內(nèi)PHA的合成，是有利于提高上述能力的，因此對(duì)赤蘚糖醇的合成也有一 定的促進(jìn)作用。
實(shí)施例21、在短小芽孢桿菌中表達(dá)p/^"織因影響D-核糖產(chǎn)量 菌種短小芽孢桿菌(fecY77"s ;w/w'7i^ ) ATCC 31095。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L，玉米漿26 g/L，磷酸氫二鉀0.03 g/L，磷酸 二氫鉀0.01 g/L， pH 6.7。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖180g/L，玉米漿28g/L，硫酸銨13g/L，硫酸錳0.05 g/L， pH 7. 0。
將按照實(shí)施例l方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到短小芽孢桿菌 (5acj77"sp"則7"s) ATCC 31095中獲得重組菌(含有pEU朋的短小芽孢桿菌(5ac^^t/s p〃肌7"s ) ATCC 31095)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的短小芽孢桿菌(5aw77iA p^7i7"s ) ATCC 31095和重組 菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在37。C、 180 rpm下培養(yǎng)18-20小時(shí)， 以10 X(v/v)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。7.5 L發(fā)酵罐裝液量3 L，控制溫度37'C， 通氣量3 L/min，攪拌速度650 rpm，發(fā)酵72小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中的D-核糖含量。D-核糖 用地衣酚法測(cè)量發(fā)酵液5000 g離心10分鐘，上清用蒸餾水稀釋?zhuān)购颂橇靠刂圃?0-90g/3mL范圍內(nèi)；取3 mL稀釋液，依次加入O. 1 %氯化鐵濃鹽酸溶液3 mL， 0.1 %地衣酚乙 醇溶液0.3 mL，搖勻，沸水浴40分鐘，自來(lái)水冷卻后在60分鐘內(nèi)測(cè)量670 nm吸光度值， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算核糖濃度。結(jié)果表明短小芽孢桿菌(》sci"^^/w啦7^ ) ATCC 31095 的核糖濃度為55g/L，而重組菌可以達(dá)到72 g/L，上升了31 %。細(xì)胞內(nèi)核糖的合成是通 過(guò)磷酸戊糖途徑，這個(gè)途徑消耗大量的細(xì)胞內(nèi)氧化力，而通過(guò)增加溶氧滿足細(xì)胞的代謝 需求會(huì)促進(jìn)孢子的形成，這不利于通過(guò)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)生產(chǎn)核糖，因此p力力"感因的引入， 能從內(nèi)源的途徑為細(xì)胞提供一定的氧化力NADPH，從而有利于核糖的合成。
實(shí)施例22、在大腸桿菌中表達(dá)p/^C^提高細(xì)菌對(duì)重金屬離子&2+的耐受性
菌種大腸桿菌(^sc/ aric力ia coh' ) JM109。
大腸桿菌(&c力en'c/w'a )JM109的基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(g/100 mL): 蛋
白胨1.0;酵母提取物O. 5 ; NaCl 1.0， pH 7.0。
重組菌的基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素至終濃度60 wg/mL。 將質(zhì)粒pBHR68用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(^sc力eric^'aco^') JM109獲得重組
菌(含有pBHR68的大腸桿菌(￡sc/ aric/^a ) JM109)。野生型￡ coh' JM109作
為對(duì)照。
將大腸桿菌(^sc力en'c/ " coh' ) JM109和重組菌分別接入加入了 1 mg/L、 2 mg/L、 3mg/L、 4mg/L、 5 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L或10 mg/L HgCl2的各自的基本培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)條件為500 mL三角瓶裝液量lOO mL， 37°C， 200 rpm，培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液的 0D6。。。結(jié)果表明當(dāng)Hg"濃度為4 mg/L時(shí)，重組菌的生長(zhǎng)受到一定抑制，最大OD咖從2. 7降 到了1.9;當(dāng)Hg2+濃度上升到10mg/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)幾乎完全停止。實(shí)驗(yàn)還表明對(duì)于未經(jīng) 外源基因轉(zhuǎn)化的原始宿主菌Aco7yjM109，在Hg"濃度為2mg/L時(shí)就完全不能生長(zhǎng)。PHB 基因的轉(zhuǎn)入使細(xì)菌對(duì)汞的耐受力得到了增強(qiáng)。
在相同操作條件下兩種菌體從2.5 mg/L Hg2+濃度的模擬廢水中富集汞離子，重組菌 的最終富集量為5. 1 mg/g細(xì)胞干重，而原始￡ co7/ JM109則僅為1. 7 mg/g細(xì)胞干重。 其中，細(xì)胞干重用冰干法測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)表明加入PHB合成基因的重組菌與大腸桿菌(￡sc/ eric/w'3 ) JM109相比對(duì) 于Hg2+的耐受程度有了較大的提高，在相同的條件下能夠更好的在含有重金屬離子的培養(yǎng) 基中生長(zhǎng)。
實(shí)施例23、移動(dòng)單胞菌中表達(dá)p/^C^提高細(xì)菌的對(duì)高酒精環(huán)境耐受性
菌種移動(dòng)假單胞菌(Z/歷o/z70朋s歷o&7^s ) NRRL B-4286。
將按照實(shí)施例11的方法獲得的質(zhì)粒pBBRHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到移動(dòng)假單胞菌 (Z,o/w /7M ，Z^7is ) NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBR朋的移動(dòng)假單胞菌 (Z/MMro/7as /z/oZ ih's ) NRRL B-4286)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
種子培養(yǎng)基組分(g/ U:葡萄糖IOO ，蛋白胨IO ，酵母膏15， pH 6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/ U:葡萄糖150 ，蛋白胨25 ，酵母膏25， pH 4.5或pH6.0。 發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度、菌體濃度、還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定參考(Ingram LO, Gomez PF, Lai X， Moniruzzaman M, Wood BE, Yomano LP and York SW. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production. Sj.otec力/7oZ 歷oe/ 《.1998,58:204—214) 培養(yǎng)條件
冰箱保藏的菌種分別接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后，以10 y。(v/v)的接種量分
別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行靜止厭氧乙醇發(fā)酵。
發(fā)酵三角瓶250 mL,裝液量為100mL，發(fā)酵pH 4.5 (重組菌)，溫度35。C，發(fā)酵 時(shí)間48小時(shí)。移動(dòng)假單胞菌(ZjwMw"as歷o&7is ) NRRL B-4286的發(fā)酵pH 4. 5禾Q 6. 0 作為對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)表明，移動(dòng)假單胞菌(Zjfflo歷o/2as切o^7j's ) NRRL B-4286在pH 4. 5和6. 0的乙 醇產(chǎn)量分別為21.1 g/L和62.5 g/L，重組菌在pH 4. 5的乙醇產(chǎn)量為59. 2 g/L，接近移動(dòng) 假單胞菌(Z，oMwas卿6j7is ) NRRL B-4286在pH 6. 0時(shí)的水平，表明; / 力C4堪因的轉(zhuǎn) 入有效的提高了細(xì)菌的耐酸性，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件可以在較低的pH下實(shí)現(xiàn)乙醇的高效 生產(chǎn)。
實(shí)施例24、在移動(dòng)假單胞菌中表達(dá)p/^C^提高細(xì)菌對(duì)葡萄糖的利用能力
菌種移動(dòng)假單胞菌(^y/z o/ff朋as /z7o&'7i's ) NRRL B-4286。
將按照實(shí)施例11的方法獲得的質(zhì)粒pB服HB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到移動(dòng)假單胞菌 (Z,o啦/ as ，&7& ) NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動(dòng)假單胞菌 (Z/歷o/z o/7as歷o&7is ) NRRL B-4286)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
種子培養(yǎng)基組分(g/ U:蛋白胨10 ,酵母膏15， pH 6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/ U:蛋白胨25 ，酵母膏25， pH 6.0，葡萄糖。其中，葡萄糖 的濃度分別為120， 150， 160， 180， 210 g/L梯度。
發(fā)酵液中乙醇質(zhì)量濃度、菌體濃度、還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定參考(Ingram L0， Gomez PF, X， Moniruzzaman M， Wood BE, Yomano U3 and York SW. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, ^/otec/ "o7. A'oe"《.1998,58:204 — 214)
培養(yǎng)條件
冰箱保藏的菌種分別接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時(shí)后，以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量 分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行靜止厭氧乙醇發(fā)酵。
發(fā)酵三角瓶500mL，裝液量為100mL，發(fā)酵pH 6. 0 ，溫度35。C，發(fā)酵時(shí)間48 h。 分別在不同濃度的葡萄糖條件下培養(yǎng)移動(dòng)假單胞菌(Z/zK^^as/^^'^'s ) NRRL B-4286 和重組菌。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移動(dòng)假單胞菌Ccwas/Tzo^'l/s) NRRLB-4286在葡萄糖濃度150 g/L時(shí)，乙醇的產(chǎn)量達(dá)到最大，為65 g/L，而重組菌在葡萄糖濃度增加到210 g/L時(shí)乙醇的產(chǎn)量一直是上升趨勢(shì)，最大為95 g/L。 PHB合成途徑的導(dǎo)入使得細(xì)菌對(duì)于滲透壓的抗 性增強(qiáng)，初糖濃度很高時(shí)依然保持良好的生長(zhǎng)。移動(dòng)假單胞菌(々朋o/^"as歷o^7is ) NRRL B-4286的乙醇發(fā)酵過(guò)程有著比酵母更高的葡萄糖的利用率，但是當(dāng)初始的葡萄糖濃 度達(dá)到一定程度后，乙醇產(chǎn)量反而下降。當(dāng)轉(zhuǎn)入PHB的合成基因后，發(fā)酵達(dá)到乙醇最大產(chǎn) 量的初糖濃度比移動(dòng)假單胞菌(。7Z7oy770"asM^L^'s ) NRRL B-4286有了一定的提高。表 明/^6^順轉(zhuǎn)入有利于提高細(xì)菌對(duì)滲透壓抵抗程度。
實(shí)施例25、在丁酸梭芽孢桿菌中表達(dá)p/^C^提高從甘油發(fā)酵制備l， 3-丙二醇 (1， 3-PD0)的生產(chǎn)
菌種丁酸梭芽孢桿菌("ostrz'^/〃歷Zw;^ric"歷)ATCC 8260。
將按照實(shí)施例l方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到丁酸梭芽孢桿菌 (C7ostn'W咖ZwO^ 'cm 7 ) ATCC 8260中獲得重組菌(含有pEUHB的丁酸梭芽孢桿菌 (67ostri力'"歷力"y/7'c"歷)ATCC 8260)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
該發(fā)酵需厭氧培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油6%，葡萄糖1%，玉米漿2%， (NH4)2S04 0. 2 %。發(fā)酵溫度為34。C，初始pH為6. 5 7 。
培養(yǎng)條件
間歇發(fā)酵分為兩步進(jìn)行，首先將丁酸梭芽孢桿菌(Gostri力》/z7Z^t/ric^ )ATCC 8260 和重組菌分別接于裝液量為100mL的150mL三角瓶中，在厭氧條件下，于36。C，100rpm， 培養(yǎng)15 h ，然后以10 y。(v/v)的接種量接入裝液量為200 mL的250 mL三角瓶中，石 蠟液封，于34。C、 150rpm、初始pH6.8進(jìn)行發(fā)酵。定期取樣測(cè)定甘油殘余量和1, 3-PDO 的生成量。
發(fā)酵液中甘油和1， 3-PD0的濃度用氣相色譜法檢測(cè)，色譜柱為大口徑毛細(xì)管，0. 5 mm X20 m ，柱溫170'C、氣化室溫度26(TC， 載氣為氮?dú)?，流?0 mL/min ，采用內(nèi)標(biāo) 法(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為l ， 62己二醇)定量。
產(chǎn)物分離發(fā)酵液離心后，上清液用油浴蒸餾得到1，3-PD0產(chǎn)品。
菌體生長(zhǎng)的生物量用比色法檢測(cè)(0D腳nm)。
丁酸梭芽孢桿菌(C7o"ri^/i;/z7 Zwt/ric"/z ) ATCC 8260的1， 3-丙二醇產(chǎn)量為15. 7 g/L,而重組菌為20.4 g/L。 丁酸梭桿菌的生長(zhǎng)pH在6 7.5之間，其以甘油為底物的 發(fā)酵代謝的副產(chǎn)物主要為丁酸和乙酸，因而在發(fā)酵過(guò)程中的酸度的上升將會(huì)嚴(yán)重影響菌 體生長(zhǎng)，同時(shí)抑制1， 3-PD0生成。由此可見(jiàn)要獲得高產(chǎn)的1， 3-PD0在發(fā)酵過(guò)程中須將pH 控制在6. 5 7之間。如果將PHB的合成基因?qū)氲郊?xì)菌中，使得細(xì)菌對(duì)酸性條件的耐 受性增強(qiáng)，則可以在不用調(diào)節(jié)pH的條件下獲得較高的1, 3-PD0產(chǎn)量。
實(shí)施例26、芽孢桿菌中表達(dá)p力Z^^提高細(xì)菌厭氧條件下的對(duì)原油的分解 菌種芽孢桿菌(^a^77"ssp) L-23(李清心，康從寶，王浩，張長(zhǎng)鎧，芽孢桿菌 發(fā)酵條件的優(yōu)化及其在室內(nèi)條件下提高原油采收率的初步研究，工業(yè)微生物，2002， 32:28-31)。
重組菌的獲得將按照實(shí)施例l方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到芽 孢桿菌(few77t/ssp) L-23中獲得重組菌(含有pEUHB的芽孢桿菌(feci"ussp) L-23) 進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
種子培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖20,蛋白胨2， Na2HP04 4， KH2P04 2， MgS04 0. 5， CaCl2 0. 005 ， pH 7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖30， (NH4)2S04 15， Na2HP04 2， KH2P04 2， MgS04 0. 5 , pH 7. 2。
將芽孢桿菌(5ac/W"s sp) L-23和重組菌菌種分別接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 小時(shí)后，以體積分?jǐn)?shù)IO y。的接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵三角瓶500 mL ，裝液 量為100 mL ，溫度35'C，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。
發(fā)酵液中菌體濃度測(cè)定
取培養(yǎng)液經(jīng)6000 g離心30分鐘后，用等量蒸餾水制成菌懸液，然后稀釋?zhuān)?22 型分光光度計(jì)于660 nm處測(cè)定菌懸液的OD值，事先作好標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的方 程，然后依此測(cè)得發(fā)酵液中菌體濃度。
原油降粘實(shí)驗(yàn)將不同濃度的芽孢桿菌(^aw7^/s sp) L-23或重組菌的發(fā)酵液， 加入到來(lái)源不同的原油中，45'C培養(yǎng)24h，用離心機(jī)離心脫水后，再用粘度計(jì)測(cè)粘度的 變化，求出降粘率。對(duì)于來(lái)源不同的原油，細(xì)菌的降粘效果有所不同，可能是這些原油 的組成成分不同所致。原油中含有豐富的烴類(lèi)、膠質(zhì)、瀝青質(zhì)類(lèi)等物質(zhì)，從而使得原油 具有一定的粘度。細(xì)菌在原油中生長(zhǎng)時(shí)可以利用原油中的成分作為其生長(zhǎng)的碳源，因此， 對(duì)于其能降低原油粘度的原因分析有以下兩種可能 一是通過(guò)對(duì)原油中烴類(lèi)及其它物質(zhì) 的降解使原油的粘度下降;二是微生物利用原油產(chǎn)生了一些代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物的作用使 原油粘度下降。
通過(guò)野生菌(芽孢桿菌(^3w77"s sp) L-23)和轉(zhuǎn)入PHB合成基因的重組菌的比 較可以看出，重組菌對(duì)于原油的降粘作用更為明顯，以一種原油的結(jié)果為例，結(jié)果表明 重組菌在原油中的生長(zhǎng)情況好于芽孢桿菌(5a"77"s sp) L-23，因而對(duì)原油的降粘效 果更好。這是由于PHB合成基因的轉(zhuǎn)入使得細(xì)菌對(duì)滲透壓的抗性提高，能在原油中更好 的生長(zhǎng)。
表1野生菌和重組菌的降粘效果比較_
加入菌液占總體 ^ ， ^ r 化"t,、，， 0 0.5 1 25 積的百分比(％)_
原油粘度 210 204 196 183 151
野生菌降粘率
0 28 6.7 12.8 28.1
(%)原油粘度 210 重組菌降粘率 (%)
實(shí)施例27、在嗜酸乳桿菌中表達(dá);^MM萬(wàn)提高細(xì)菌在酸性條件下的存活率 菌種嗜酸乳桿菌"acto6aci77〃s acit/op/^z7"s ) ATCC 53671。 按照實(shí)施例1的方法獲得的質(zhì)粒pEUHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到嗜酸乳桿菌
(Za"o6aw77"s aw'&; /w'7ws ) ATCC 53671中獲得重組菌(含有pEUHB的嗜酸乳桿菌
(Za"o力ac277"s ac』Vop/ i7〃s ) ATCC 53671)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)方法如下
菌種傳代培養(yǎng)基12. 8 g脫脂奶粉溶于100 mL蒸餾水中，121。C滅菌15 min。
計(jì)數(shù)培養(yǎng)基牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.6%，葡萄糖0.5%，瓊脂L8 %， pH 6.8， 121。C滅菌20 min。
豆汁的制備將大豆室溫(20'C左右)浸泡48小時(shí)，使大豆充分溶漲，磨漿(水 豆=3 : 1)，兩層紗布過(guò)濾除去豆渣即得。115。C滅菌15 min。
不同pH值豆汁的制備以乳酸作為調(diào)節(jié)劑，將豆汁pH值分別調(diào)至4.0、 4.5、 5.0 或5.5。豆汁的自然pH值為6. 5左右，配制是在磁力攪拌器上進(jìn)行，用pH酸度計(jì)監(jiān)測(cè)。
保存實(shí)驗(yàn)嗜酸乳桿菌"actoybaciWws aci^p/L 7"s ) ATCC 53671和重組菌分別 于豆汁培養(yǎng)基(pH6. 5)中培養(yǎng)48小時(shí)，然后取菌液分別添加至不同pH值(4.0、 4.5、 5.0、 5.5)的滅菌豆汁中，使活菌數(shù)目為1 X 107-108 Cfu/ml，置于4'C冰箱中保存10周， 檢測(cè)活菌數(shù)目變化。其中，計(jì)數(shù)方法根據(jù)樣品中含菌量的不同，作10倍系列濃度稀釋?zhuān)?倒平板，37'C恒溫培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)菌落數(shù)。存活率的計(jì)算存活率=樣品的活菌數(shù)目/樣 品中起始活菌數(shù)目X100 %。
結(jié)果表明嗜酸乳桿菌aacto6acj77"s acicb; / j7iAS ) ATCC 53671在不同的pH值的 豆汁中保存，存活率不同，pH4.0下存活率最低(2%) ， pH5.0最高(llM)。在pH4. 5-pH 5.5中保存，存活率變化不明顯都在9%左右。10周保存實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，pH5.5下的存 活率(9%)僅高于pH4.5 (8.2%)下的不足一倍。從活菌數(shù)目上看，10周后pH4.0下 活菌數(shù)目仍能維持在lX106cfu/ml以上水平，pH4. 5-5. 5都在lX107cfu/ml以上水平。
重組菌的存活率在實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)pH (4.0、 4.5、 5.0、 5.5)下變化不明顯，都在20% 左右，活菌的數(shù)目較野生菌有明顯的提高，10周保存實(shí)驗(yàn)的活菌數(shù)目均在lX107cfu/ml 以上水平。表明PHB的合成提高了細(xì)菌在酸性條件下的活菌數(shù)目。
重組的嗜酸乳桿菌在較低pH值(4.0、 4.5)培養(yǎng)條件下具有較高的存活率和活菌數(shù) 目在生產(chǎn)上具有重要的意義 一方面可以提高存活率，使制劑具有較高的活菌數(shù)另一 方面，較低的PH值環(huán)境可防止雜菌污染。
實(shí)施例28、從脂肪酸e—氧化途徑合成PHA的相關(guān)基因在熒光假單胞菌中的表達(dá)影 響葡萄糖酸產(chǎn)量
202 190 171 133
3.8 9.5 18.6 36.7菌禾中- 焚光假單胞菌(/^ei/ob/Z7(m351 /7woresce/750 AS 1.55。 斜面培養(yǎng)基成分為牛肉膏0.5%，蛋白胨1%， NaC10.5%，瓊脂2 %， pH7. 0。 種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖2 %，玉米漿1 %，尿素0.2 %， KH2P04 0.2 %， MgS04 7H20 0. 05 %， pH7. 0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為淀粉水解糖14%,玉米漿1.5%,輕質(zhì)碳酸鈣4%， pH6.7。 在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以質(zhì)粒pEE32(Fukui T， Doi Y. Cloning and analysis of the poly (3-hydroxybutyrate-co_3_hydroxyhexanoate) biosynthesis gene of爿ara7 o/ as caWae. J. Bacteriol., 1997, 179:4821-4830)為禾莫板，用引物 TAAGGTACCGAAGGAGAGCACATGAGCCA和TCTAAGCTTGGCTGATTGTGCCTGCGTG擴(kuò)增出p/ aC廟因， 然后經(jīng)過(guò)A^/7l和歷/7c7J7酶切處理后，插入到質(zhì)粒pBBRlMCS2的限制性內(nèi)切酶Jp"I和 歷/^///的識(shí)別位點(diǎn)間，獲得質(zhì)粒pBBRCJ。 pBBRCJ以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到熒光假單胞菌 (尸sei/t/a7 o朋s /7"oresce/7s) AS 1. 55中獲得重組菌(含有pBBRCJ的熒光假單胞菌 (/^e〃ob歷o朋s /7〃oresce/7S) AS 1.55)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的熒光假單胞菌(尸sei/^^o/73S/7"oresce/^) AS 1. 55和 重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在30。C、 230 rpm下培養(yǎng)16小時(shí) 后，以10M(v/v)接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵瓶500 mL裝液量50 mL，在30。C、 230 rpm 下培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量。發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法 測(cè)定發(fā)酵液中酮基葡萄糖酸含量二25。C下發(fā)酵液旋光度絕對(duì)值/0. 88。
結(jié)果表明熒光假單胞菌(/^ei/ob歷朋as/7"oresce/7s) AS 1. 55的發(fā)酵液中酮基葡萄 糖酸含量為13.6 g/L，重組菌的產(chǎn)量為15.8 g/L，提高了大約16 %， p力aC廟因的導(dǎo)入， 能夠在細(xì)胞內(nèi)積累PHA，有利于提高菌的的耐受力，生長(zhǎng)得更好，從而得到更高的轉(zhuǎn)化率。 實(shí)施例29、從脂肪酸從頭合成途徑合成PHA的相關(guān)基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)影 響肌苷的生物合成
菌種枯草芽孢桿菌(5濃77"s s"Z "7is ) ATCC 19162。
種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖20 g/L，酵母粉15 g/L,蛋白胨10 g/L，玉米液7 g/L，氯化 鈉2.5 g/L，尿素2 g/L， pH值7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖140 g/L，玉米液16 g/L，酵母粉16 g/L，尿素9 g/L，硫酸銨 16 g/L，七水硫酸鎂4 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，碳酸鈣20 g/L， pH值7. 0。
在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以質(zhì)粒pQH-CG(邱遠(yuǎn)征，聚羥基丁酸羥基己酸酯生 物合成途徑的基因工程改造，清華大學(xué)，2005，博士論文。)為模板，用引物 ATACGACTCACTATAGGGC和AGTGCCAGATCTCGCAACGCAATTAATG擴(kuò)增出p/ aC"堪因，然后經(jīng)過(guò) fey^I和j5^II酶切處理后，插入到質(zhì)粒pEU308的限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI的識(shí)別位點(diǎn) 間，獲得質(zhì)粒pEUGC。 pEUGC以乙酸鋰轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌(^aw'77"s sw力^7八)ATCC 19162中獲得重組菌(含有pEUGC的枯草芽孢桿菌(萬(wàn)aci""s卯6"乃's ) ATCC 19162)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的枯草芽孢桿菌(&ci77〃s s"Z "7is ) ATCC 19162和重組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在32'C、 200 rpm下培養(yǎng)l2小時(shí)后， 以5M(v/v)接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。7.5L發(fā)酵罐裝液量3L,自動(dòng)控制溫度35。C， pH 6. 5, 攪拌速度600 rpm，通氣量l L/min,發(fā)酵時(shí)間68小時(shí)(肌苷產(chǎn)量不再增加)，測(cè)定發(fā)酵液 中肌苷含量。肌苷含量用HPLC測(cè)定，流動(dòng)相為0.5 %磷酸氫二鉀，流速1.2 mL/min,色譜 柱為Hypersil ODS C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌(fe"7Ji^ s〃6"7is ) ATCC 19162的肌苷產(chǎn)量為19.7 g/L，重組菌的產(chǎn)量為24. 9 g/L，提高了26. 4 %。在細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中，為肌苷合成提供前體的單磷酸己糖途徑會(huì)消耗大量的NADP，同 時(shí)從6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途徑的調(diào)控酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶受到NADPH的反饋抑制， 因此NADPH的減少能促進(jìn)葡萄糖向磷酸戊糖途徑的轉(zhuǎn)化?？偟膩?lái)說(shuō)，肌苷合成是一個(gè)需要 大量氧化力的生化代謝過(guò)程，高的NADP/NADPH水平能夠有效的促進(jìn)肌苷的合成。C 基因的引入，能夠促進(jìn)脂肪酸的從頭合成途徑，提高細(xì)胞內(nèi)的氧化力，因此能夠顯著的 提高肌苷的產(chǎn)量。
實(shí)施例30、在移動(dòng)假單胞菌中表達(dá)p力MM感因影響乙醇產(chǎn)量
菌種移動(dòng)假單胞菌(^moMwas歷o&'h's ) NRRL B-4286。
斜面培養(yǎng)基成分為葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉15 g/L，磷酸二氫鉀 1 g/L，硫酸銨1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L， NaCl 1 g/L，瓊脂15 g/L， pH值7. 0。 種子培養(yǎng)基成分為葡萄糖100 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨10 g/L， pH值7.0。 發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖200 g/L,酵母粉15 g/L，蛋白胨10 g/L， pH值7. 0。 將按照實(shí)施例ll的方法獲得的質(zhì)粒pBBRHB以電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到移動(dòng)假單胞菌 (》朋o歷o朋s /77oZ j7A ) NRRL B-4286中獲得重組菌(含有pBBRHB的移動(dòng)假單胞菌 (2y/z7OTO/ as歷oZ^7A ) NRRL B-4286)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
分別取培養(yǎng)在新鮮斜面上的移動(dòng)假單胞菌(Z/z/royro/^s/^Z^h's ) NRRL B-4286和重 組菌分別接種到種子培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培養(yǎng)16小時(shí)后， 以IO M(v/v)接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵瓶500 mL裝液量50 mL，在30'C、 200 rpm 下培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量。乙醇濃度用高效液相色譜測(cè)量發(fā)酵液8000 g 離心十分鐘，取上清過(guò)濾后作為樣品；色譜柱為Beckman公司L2Spherogel配合基交換柱， 流動(dòng)相為98%的濃硫酸:仏0(體積比為0. 5:1000)，流速l mL/min。
結(jié)果表明野生菌的發(fā)酵液乙醇濃度為14 %，重組菌的乙醇濃度為18 %，提高了28 %， / 力力^堪因的引入，不僅可以改變細(xì)胞內(nèi)的代謝流，而且PHA的合成能夠提高細(xì)菌對(duì) 高乙醇環(huán)境的耐受性，從而提高了乙醇的產(chǎn)量。序列表
<160〉1
<210〉1
<211>3884
〈212>DNA
〈213> feyterw'a ei/tropAg
<400>1
ataaagcttaaggaggatggcgaccggcaaaggcgcggcagcttccacgcaggaaggcaa60
gtcccaaccattcaaggtcacgccggggccattcgatccagccacatggctggaatggtc120
ccgccagtggcagggcactgaaggcaacggccacgcggccgcgtccggcattccgggcct180
ggatgcgctggcaggcgtcaagatcgcgccggcgcagctgggtgatatccagcagcgcta240
C3tg33gg3Cttctcagcgctgtggcaggccatggccgagggcaaggccgaggccaccgg300
tccgctgcacgaccggcgcttcgccggcgacgcatggcgc3CC朋CCtCCcatatcgctt360
cgctgccgcgttctacctgctcaatgcgcgcgccttgaccgagctggccgatgccgtcga420
ggccgatgccaagacccgccagcgcatccgcttcgcgatctcgcaatgggtcgatgcgat480
gtcgcccgccaacttccttgccsccastcccgaggcgcagcgcctgctgatcgagtcggg540
cggcgaatcgctgcgtgccggcgtgcgcaacatgatggasgacctgacacgcggca卿t600
ctcgcagaccgscg卿gcgcgtttgaggtcggccgcaatgtcgcggtgaccgaaggcgc660
cgtggtcttcgagaacgagtacttccagctgttgcagtacaagccgctgaccgacaaggt720
gcacgcgcgcccgctgctgatggtgccgccgtgcatcaacaagtactacatcctggacct780
gcagccggagagctcgctggtgcgccatgtggtggagcagggacatacggtgtttctggt840
gtcgtggcgcaatccggacgccagcatggccggcagcacctgggacgactacatcgagca900
cgcggccatccgcgccatcg朋gtcgcgcgcgacatcagcggccaggaca3g8tCEl3Cgt960
gctcggcttctgcgtgggcggcaccattgtctcgaccgcgctggcggtgctggccgcgcg1020
cggcgagcacccggccgccagcgtcacgctgctgaccacgctgctggactttgccgacac1080
gggcatcctcgacgtctttgtcgacgagggccatgtgcagttgcgcgaggccacgctggg1140
cggcggcgccggcgcgccgtgcgcgctgctgcgcggccttgagctggccaataccttctc1200
gttcttgcgcccgaacgacctggtgtggaactacgtggtcgacaactacctg卿ggcaa1260
cacgccggtgccgttcgacctgctgttctggaacggcgacgccacc肪cctgccggggcc1320
gtggtactgctggtacctgcgccacacctacctgcagaacgagctcaaggtaccgggcaa1380
gctgaccgtgtgcggcgtgccggtggacctggccagcatcgacgtgccgacctatatcta1440
cggctcgcgcgaagaccateitcgtgccgtggaccgcggcctatgcctcgaccgcgctgct1500
ggcgaac幼gctgcgcttcgtgctgggtgcgtcgggccatatcgccggtgtgatcaaccc1560
gccggccaagaa_c33gcgc3gccactggactaacgatgcgctgccggagtcgccgcagca1620
atggctggccggcgccatcgagcatcacggcagctggtggccggactggaccgcatggct1680ggccgggcag cgcaatcgaa ccggcgtgcg ggactacaca tggcggctcg gctggagcgc gaccgccggt gatggtgccg ggccgccaac catgagcgcc caagctggtc gggcatcacc gttcgccgtc agagatcgtc cgagttcgtg caaggccggc ggtggtgatg gagctatgcc caagcgcgcc cgaggccttt ggtcaatgtg tatcctggtg gctgtgcatc ttttccgggg gtgg織tga atttgccagc ccgcgccgcg gaaggc肌tg gtcggcgagg aagatgaccc gtcacc犯gc tcgtcggtga ggcctgcatg aacacggtct ctcgacaaga tcgatctgcg ctcaacggcg
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tCCCgCElgCg
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cgcgctatcg tgcatgagtg tccattgaaa tcggcaagtt tcaaggccgc gccaggtgct gcctgccggc ccgtgatgct gccsggaaaa tgggcgatgc agtaccacat cgcaggatga agtttgacga tcaagaccga ccgccttcga ccgccgcggt ccacgatcaa tgccggcctc tggagatcaa acacctccaa cgggctgccg gcctggcctc aaggaagggg caatc朋gg3 cggaaccgcc ccccaactcg cattgcctcg caagtccgag ggtgttccgc gctgttcaac cgtcaacatc cgccaaggcc cgtgaccgtc ccaggacgtg agagatcgcc cgacttctcg
1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 388權(quán)利要求
1、一種提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的；所述微生物為移動(dòng)假單胞菌(Zymomonas mobilis)；所述聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因?yàn)閜hbCAB基因，所述phbCAB基因的堿基序列如SEQ ID NO1所示；所述逆境脅迫為低pH脅迫或高滲透壓脅迫。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述移動(dòng)假單胞菌為移動(dòng)假單 胞菌NRRL B-4286。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法。本發(fā)明所提供的調(diào)控微生物代謝及提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羥基脂肪酸酯；所述聚羥基脂肪酸酯的合成是通過(guò)在所述微生物中引入聚羥基脂肪酸酯合成途徑的相關(guān)基因而實(shí)現(xiàn)的。將本發(fā)明的方法應(yīng)用到各種微生物生產(chǎn)菌中，可以有效的影響生產(chǎn)菌的代謝途徑，增加菌的抗逆性，提高包括透明質(zhì)酸、丙酮酸、麥角固醇、啤酒、肌苷、彈性蛋白酶、類(lèi)胡蘿卜素、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、蘇云金桿菌粉劑、鳥(niǎo)苷、谷胱甘肽、赤蘚糖醇、D-核糖，1，3-丙二醇等生物工程產(chǎn)品的生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12N15/74GK101665801SQ20091017809
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者瓊 吳, 張晉宇, 陳國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:清華大學(xué)