專利名稱：共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸和小溝結(jié)合劑的軛合物的制作方法
共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸和小溝結(jié)合劑的軛合物1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的寡核苷酸衍生物。具體地講，本發(fā)明涉及一個(gè)或多個(gè)小溝結(jié)合 劑與寡核苷酸共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸衍生物。這種寡核苷酸-小溝結(jié)合劑共軛物(以后稱 0DN-MGB)有較強(qiáng)的雜交能力，與單鏈或雙鏈核酸的互補(bǔ)序列的結(jié)合力也較強(qiáng)。因此可用作 序列特異的探針，并作為反義核酸和反義基因(anti-gene)治療藥物。2.現(xiàn)有技術(shù)的簡(jiǎn)述與雙鏈DNA的小溝通過非共價(jià)鍵結(jié)合的小溝結(jié)合劑在本領(lǐng)域是已知的。能與雙鏈 DNA或RNA以非共價(jià)鍵結(jié)合的嵌入劑也是熟知的。這些嵌入劑一般屬于平面芳香族化合物， 它們嵌入(置身于)雙鏈DNA或RNA的嘌呤和嘧啶堿基對(duì)之間。美國(guó)專利US 4835263描 述了一種與嵌入基共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸。這種攜帶有嵌入基的寡核苷酸可用作雜交探針。本發(fā)明概述本發(fā)明涉及寡核苷酸與小溝結(jié)合基共價(jià)結(jié)合的結(jié)合物。該結(jié)合物包括具有多個(gè)核 苷酸單位、一個(gè)3'端、一個(gè)5'端的寡核苷酸和與至少一個(gè)所述的核苷酸共價(jià)結(jié)合的小溝 結(jié)合基。小溝結(jié)合劑一般通過一條含有不超過15個(gè)原子的鏈即連接基與寡核苷酸相結(jié)合。 小溝結(jié)合基是分子量為約150-2000道爾頓的分子基團(tuán)，與雙鏈DNA、RNA或雜合體的小溝以 非嵌入方式連接，其締合常數(shù)大于IO3MA另一方面，本發(fā)明還涉及某些共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸_小溝結(jié)合劑結(jié)合物的合成方 法，以及該結(jié)合物用作核酸探針的方式及為有關(guān)分析和診斷以及治療目的(作為反義核酸 和反義基因)用的方式。附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1所示的是修飾的ODN或3’-0DN-CDPI3軛合物與M13mpl9 (+)鏈DNA的狹縫印 跡雜交分析的結(jié)果。下劃線核苷酸表示與質(zhì)粒靶序列錯(cuò)誤配對(duì)的堿基。本發(fā)明的詳細(xì)描述總的實(shí)施方案本發(fā)明新結(jié)合物的顯著特征是小溝結(jié)合劑與寡核苷酸共價(jià)結(jié)合，本專利申請(qǐng)的引 言部分已經(jīng)指出小溝結(jié)合劑是結(jié)合在雙鏈DNA的小溝內(nèi)的分子。但由于這類化合物的結(jié)構(gòu) 變化大，不能用一般通式來表示所有已知小溝結(jié)合劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。能與DNA小溝結(jié)合的化 合物一般都有月牙形的三維結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)中的大多數(shù)小溝結(jié)合劑都優(yōu)先與B型雙鏈DNA 的A-T富含區(qū)結(jié)合。小溝結(jié)合劑或更準(zhǔn)確地說本發(fā)明寡核苷酸_小溝結(jié)合劑軛合物的基團(tuán) 當(dāng)然也優(yōu)先與雙鏈DNA的A-T富含區(qū)結(jié)合(本發(fā)明的寡核苷酸_小溝結(jié)合劑軛合物在下文 中存時(shí)也稱為0DN-MGB)。然而，優(yōu)先與C-G (胞嘧啶和鳥嘌呤)富含區(qū)結(jié)合的在理論上也是 可能存在的。因此含有這樣的優(yōu)先與C-G富含區(qū)結(jié)合的小溝結(jié)合基的ODN-MBG亦屬本發(fā)明 的范疇。已有的小溝結(jié)合劑優(yōu)先與A-T區(qū)結(jié)合，可解釋為鳥嘌呤(G)的2-位氨基與某些已 知的小溝結(jié)合劑之間存在立體位阻。從下文的詳述中可明顯看出，在本發(fā)明的ODN-MBG中 鳥嘌呤(G)被6-羥基嘌呤取代后，上述不利的立體位阻不復(fù)存在，ODN-MGB與互補(bǔ)鏈的結(jié) 合力可能增強(qiáng)。
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一般地講，現(xiàn)有技術(shù)中已知的小溝結(jié)合劑一般不與雙鏈RNA或DNA和RNA的雙鏈 雜合體結(jié)合。然而本發(fā)明的ODN-MGB卻能夠與單鏈RNA結(jié)合，上述性質(zhì)是本發(fā)明的另一有 趣的新方面。根據(jù)本發(fā)明，能與ODN共價(jià)結(jié)合形成ODN-MGB軛合物的現(xiàn)有的小溝結(jié)合劑是一些 天然產(chǎn)物如紡錘菌素、偏端霉素和lexitropsin、光輝霉素、色霉素A3、橄欖霉素、氨菌霉 素、西伯利亞霉素和有關(guān)抗生素與合成衍生物。另一些雙季銨雜環(huán)化合物、二芳基脒如戊烷 脒、芪脒和berenil、cc-1065與有的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst 33258,4' -6- 二脒 基-2-苯基吲哚(DAPI)及許多由天然氨基酸或合成氨基酸構(gòu)成的寡肽也是小溝結(jié)合劑。下 列化合物的結(jié)構(gòu)如下
^h 3
Netropsin
^CONH,
H
η/^=^ a “ Α Γ^==^ ^
Pertamidire
5 就本發(fā)明目的而言，如果一個(gè)分子能與雙鏈DNA的小溝結(jié)合，其間的締合常數(shù)為 IO3M-1或更高，則該化合物就是小溝結(jié)合劑。這種結(jié)合可通過現(xiàn)有的光譜分析法如紫外光譜 (U. V.)、核磁共振光譜(nmr)進(jìn)行檢測(cè)，還可利用凝膠電泳法。紫外光譜在有小溝結(jié)合劑連 接時(shí)吸收峰移動(dòng)，以及利用“奧佛赫塞”(NOSEY)效應(yīng)的核磁共振光譜均是實(shí)現(xiàn)此目的有用 技術(shù)。凝膠電泳則檢測(cè)小溝結(jié)合劑與雙鏈DNA或其片段的結(jié)合，因?yàn)樵摻Y(jié)合使雙鏈DNA的 遷移率發(fā)生了變化。嵌入分子或嵌入劑易于與小溝結(jié)合劑區(qū)別開，嵌入劑為平面芳香族(優(yōu)選多環(huán)) 分子，而小溝結(jié)合劑(MGB)則為月牙形或類似幾何結(jié)構(gòu)的分子。此外二者還可通過核磁共 振光譜(nmr)中的“奧佛赫塞”(NOSEY)效應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)區(qū)別。如上所述，就本發(fā)明目的而言，如果一個(gè)分子與雙鏈DNA的小溝相結(jié)合的締合常 數(shù)等于或大于Ι ΛΓ1，則該分子就是小溝結(jié)合劑。然而，某些小溝結(jié)合劑與雙鏈DNA的高親 和部位相結(jié)合，締合常數(shù)可高達(dá)IO7-IiAr1。根據(jù)本發(fā)明，小溝結(jié)合劑經(jīng)修飾則本質(zhì)上成為小溝結(jié)合基，與適當(dāng)?shù)墓矁r(jià)結(jié)構(gòu)或原子鏈連接，小溝結(jié)合劑通過所述共價(jià)結(jié)構(gòu)或原子鏈與寡核苷酸(ODN)相連。在某種 意義上這種原子鏈可作為并有時(shí)被認(rèn)為是小溝結(jié)合劑的一部分，因?yàn)檫@種連接并不影響 ODN-MGB分子的小溝結(jié)合性能。然而，從概念上將小溝結(jié)合劑與將它與ODN共價(jià)連接的基 團(tuán)區(qū)別開更適于本發(fā)明的描述。這個(gè)由小溝結(jié)合劑衍生形成的基團(tuán)在下文稱為“小溝結(jié)合 基”。而連接小溝結(jié)合基與ODN的共價(jià)結(jié)構(gòu)(不超過15個(gè)原子)則稱為“連接基”。這里先 描述本發(fā)明的ODN-MGB軛合物的寡核苷酸部分，然后再詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的小溝結(jié)合基 的優(yōu)選實(shí)施方案。從廣義上講，本發(fā)明的ODN-MGB軛合物的寡核苷酸含有約3_100個(gè)核苷酸單位。 根據(jù)本發(fā)明，這些可形成ODN的核苷酸單位包括天然核酸中存在的主要雜環(huán)堿基(U、C、 T、A、G)、這些堿基的天然與化學(xué)修飾物和這些堿基的類似物如6-羥基嘌呤、2-氨基腺嘌 呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶 和6-氨基-4-羥基-[3，4-d]嘧啶。5-N4亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，嘧啶和 6_氨基-4-羥基[3，4-d]嘧啶的2-脫氧核苷的各自結(jié)構(gòu)如下 2-脫氧5-N4-亞乙烯基胞苷2-脫氧4_氨基吡唑并[3，4_d]嘧啶核苷 2-脫氧6-氨基-4-羥基吡唑_[3，4-d]嘧啶核苷R = 2-脫氧-β -D-呋喃糖基此外，摻入本發(fā)明ODN-MGB軛合物中的ODN中的核苷酸單位可以具有交聯(lián)官能團(tuán) (烷化劑)，它通過連接臂與一個(gè)或多個(gè)堿基共價(jià)結(jié)合。因這類結(jié)合有交聯(lián)劑的ODN-MGB軛 合物構(gòu)成了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的重要一類，在下文下面將對(duì)這些結(jié)構(gòu)進(jìn)行更詳細(xì)的描 述。本發(fā)明ODN-MGB中的糖基或糖苷部分可以是脫氧核糖、核糖、2-氟核糖、2-0-烷 基或鏈烯基核糖，其中所述的烷基可有1-6個(gè)碳原子，鏈烯基可有2-6個(gè)碳原子。在天然 核苷酸及本文所述的修飾物和其類似物中，脫氧核糖和核糖部分形成呋喃糖環(huán)，糖苷鍵為 β-構(gòu)型，且嘌呤堿基通過9-位、嘧啶通過1-位以及吡唑并嘧啶通過1-位分別與糖環(huán)相 連。根據(jù)本發(fā)明，寡脫氧核糖核酸為優(yōu)選的，因此2-脫氧核糖為優(yōu)選的糖。ODN的核苷酸 單位通過磷酸酯骨架相互連接，這一點(diǎn)是本領(lǐng)域人員所熟知的。本發(fā)明ODN-MGB軛合物的 ODN中除了可包含天然磷酸二酯鍵外，此外還可包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯連接。
本發(fā)明的ODN-MGB軛合物的寡核苷酸部分還可含有與寡核苷酸的3'-端或 5'-端相連的較小分子量的“末端基”。在本文的上下文中應(yīng)將末端基與小溝結(jié)合基加以 區(qū)別，小溝結(jié)合基也同樣優(yōu)選與ODN的3'-端或5'-端或兩者連接。這樣，末端基如果 存在的話，則與不帶有小溝結(jié)合基的寡核苷酸的末端相連。例如，末端分子可以是磷酸鹽、 磷酸酯、烷基、氨基烷基或親脂基。關(guān)于本發(fā)明ODN-MGB的ODN中的核苷酸單位、磷酸酯骨架和末端的可能變化，請(qǐng)記 住下文。本發(fā)明的ODN-MGB軛合物的主要用途在于該軛合物中的ODN能與單鏈DNA、RNA、雙 鏈DNA及DNA-RNA雜合體的互補(bǔ)序列結(jié)合，小溝結(jié)合基摻入新形成的“雙鏈螺旋體”中，由 此則增強(qiáng)了該“雙鏈螺旋體”的結(jié)合力，也就是增高了新形成的雙鏈螺旋體的熔化溫度(增 大了締合常數(shù))。此外，本發(fā)明優(yōu)選的帶有“交聯(lián)劑”的ODN-MGB軛合物還使ODN-MGB與互 補(bǔ)DNA或RNA鏈永久地共價(jià)結(jié)合，形成永久鍵合形式。根據(jù)上文所述，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人 員容易理解，本發(fā)明ODN-MGB軛合物中的ODN的各部分的一級(jí)結(jié)構(gòu)限制僅在于ODN部分與 任何特異的靶序列形成互補(bǔ)鏈的能力；而且就其本身而論，本領(lǐng)域已知的大量的結(jié)構(gòu)修飾 有可能存在于這些結(jié)構(gòu)中。而且一般說來，制備各種雜環(huán)堿基、核苷、核苷酸和構(gòu)成本發(fā)明 ODN-MGB軛合物的ODN部分的寡核苷酸的方法已經(jīng)建立起來，并為本領(lǐng)域所熟悉。N4, N4-亞 乙基-5-甲基脫氧胞嘧啶及其核苷、核苷酸或含有該堿基的寡核苷酸可按文獻(xiàn)的教導(dǎo)進(jìn)行 合成(ffebb,T. R. ；Matteucci，Μ· D.核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1986，14，7661-7674， Webb, Τ. R. ；Mattencci，Μ· D.美國(guó)化學(xué)會(huì)志(J. Am. Chem. Soc.)，1986，108 :2764)。4_氨基吡 唑并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羥基吡唑并[3，4-d]嘧啶、及其核苷、核苷酸和含有該堿基 的寡核苷酸則可按有關(guān)文獻(xiàn)教導(dǎo)進(jìn)行合成(Kazimierczuk et al. J. Am. Chem. Soc. , 1984, 106,6379-6382)。為了制備特定的已知序列的ODN以便與靶序列互補(bǔ)，可按本領(lǐng)域的技術(shù) 狀況進(jìn)行寡聚核苷酸的合成，下文將對(duì)優(yōu)選的方法進(jìn)行描述。優(yōu)選的方法描述于1993年7 月12日申請(qǐng)、申請(qǐng)?zhí)枮?8/090，408的申請(qǐng)(該申請(qǐng)已被授權(quán)并且公開費(fèi)已繳)中。將該 08/090, 408申請(qǐng)的說明書內(nèi)容引入本文作參考。所謂“連接基”是共價(jià)連結(jié)軛合物的寡核苷酸部分與小溝結(jié)合基的一種基團(tuán)。優(yōu) 選地，該連接基是通過含有不超過15個(gè)原子的鏈進(jìn)行連接的結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明，小溝結(jié)合 基也優(yōu)選與寡核苷酸的3'或5'-端共價(jià)結(jié)合。然而，與中間位置的核苷酸、尤其與中間 位置的核苷酸的堿基相連也屬于本發(fā)明的范圍。一般而言，連接基是雙官能分子衍生物， 以便一個(gè)官能團(tuán)如氨基可與例如ODN 5'-端磷酸酯相連，另一官能團(tuán)如羰基(CO)可與小 溝結(jié)合基的氨基相連。此外，連接基也可以是氨基醇類衍生物，使羥基例如可與0DN3'端 磷酸酯相連，而氨基則與小溝結(jié)合基的羰基相連。連接基的另一方案包括與氨基酸相連的 氨基醇(通過酯鍵與3'端磷酸酯連接)，而所述的氨基酸則通過肽鍵與小溝結(jié)合劑的羰 基相接。這樣，連接基的優(yōu)選方案為具有下列通式的結(jié)構(gòu)-HN(CH2)mC0、0(CH2)mC0和(CH2) mCH(0H) (CH2)mNHCO(CH2)mNH,其中m值應(yīng)滿足使小溝結(jié)合基與ODN之間相隔不超過約15個(gè) 原子。連接基的優(yōu)選結(jié)構(gòu)是-O(CH2)6NH、-0CH2CH(OH) CH2NHC0CH2CH2NH 和-HN(CH2)5CO15 正如 上面已指出的那樣，連接基也可被認(rèn)為是小溝結(jié)合基的一部分，在那種情況下，可以認(rèn)為小 溝結(jié)合劑直接與ODN相連。小溝結(jié)合基結(jié)構(gòu)的基本限制在上面已經(jīng)指出，而且其尚難由特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)定 義。小溝結(jié)合基上除了有可與小溝結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)外，還可有另外的官能團(tuán)，只要這些官能
10團(tuán)不干擾小溝的結(jié)合能力。例如，可使信息基團(tuán)與小溝結(jié)合基共價(jià)結(jié)合，所述信息基團(tuán)可使 小溝結(jié)合劑易于通過顏色、紫外光譜或其它可見的物理或化學(xué)性質(zhì)被檢測(cè)出來。該信息基 團(tuán)的例子是偶氨苯官能基，在優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例中它通過-HN (CH2) fflC00 (CH2) mS (CH2) m-橋 與小溝結(jié)合基的羰基相連。另外，小溝結(jié)合基帶有的信息基團(tuán)或其它基團(tuán)也可看成小溝結(jié) 合基本身的一部分。優(yōu)選的ODN-MGB軛合物可用下文所列的結(jié)構(gòu)式1來定義其結(jié)構(gòu)，該定義包括根據(jù) 本發(fā)明的優(yōu)選的小溝結(jié)合基，同樣也可包括部分或全部的連接基及其它輔助基團(tuán)如上面討 論的信息基團(tuán)。
結(jié)構(gòu)式1這里X為0或S ；q為3至100之間的整數(shù)；R8是H、0H、具有1-6個(gè)碳原子的烷氧基、O-C2-C6鏈烯基或F ；B是糖苷配基，選自存在于核酸內(nèi)的天然雜環(huán)堿基和6-羥基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、 2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4-亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡咯并[3，4-d]嘧啶、6-氨 基-4-羥基吡咯并[3，4-d]嘧啶；W1是!^0(OH)2或其鹽，或者是與所述的寡核苷酸3'-或5'-端相連的小溝結(jié) 合基，該W1包括通過不超過15個(gè)原子共價(jià)連接小溝結(jié)合基和寡核苷酸的連接基；W2是無或與一個(gè)糖苷配基B相連的小溝結(jié)合基，該W2包括將小溝結(jié)合基共價(jià)連接 到所述糖苷配基B上的連接基，或者W2是含有連接臂的交聯(lián)官能團(tuán)，該連接臂使所述的交 聯(lián)官能團(tuán)與所述的糖苷配基共價(jià)連結(jié)。其中小溝結(jié)合基是分子量為150-2000道爾頓、以非嵌入方式與雙鏈DNA、RNA或雜 合體的小溝相結(jié)合的、其締合常數(shù)大于約IO3的分子基團(tuán)，條件是所述的W1和W2至少一個(gè) 為小溝結(jié)合基；包含有連接基的小溝結(jié)合基具有選自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的通式R1-(HN-Y1-CO)n-R2(a)其中Y1表示含有兩個(gè)雙鍵和0-3個(gè)雜原子(選自N、S、0)的五元環(huán)，NH和CO分別 與同環(huán)的兩個(gè)碳原子相連，這兩個(gè)碳原子被一個(gè)原子隔開，這個(gè)原子未被取代或僅被H取 代，環(huán)上的其余的原子可被1、2或3個(gè)R3基任意取代；
R1-(R6N-Y2-CO)n-R2(b)其中Y2是六元芳香環(huán)與含有一個(gè)雙鍵的五元環(huán)縮合成的稠合環(huán)，該稠合環(huán)含有 0-3個(gè)雜原子(所述雜原子選自氮、硫、氧)，R6N和CO分別與稠合環(huán)的兩個(gè)不同環(huán)上的碳原 子相連，這兩個(gè)碳原子從一個(gè)共同橋頭原子算起，CO和NR6之間在稠合環(huán)的一邊有兩個(gè)非橋 頭環(huán)原子而在另一邊有三個(gè)非橋頭環(huán)原子，所述的稠合環(huán)一邊的兩個(gè)非橋頭環(huán)原子可被R7 任意取代，另一邊的三個(gè)非橋頭環(huán)原子可被R3任意取代；Rf(CO-Y3-NH)n-R2(c)其中Y3是含有0-3個(gè)N雜原子的六元芳香環(huán)，CO和NH分別與環(huán)上相對(duì)處于1、4 位的兩個(gè)碳原子相連，六元環(huán)被連有CO或NH的兩個(gè)碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH基 團(tuán)相連的兩個(gè)環(huán)原子被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團(tuán)相連的兩個(gè)環(huán)原子被R7任意 取代；R1- (NH-Y4-NH-CO-Y4-CO) p-R2(d)其中Y4是含有0-3個(gè)N雜原子的6元芳香環(huán)，NH、CO分別與環(huán)上相對(duì)處于1、4位 的兩個(gè)碳原子相連，該六元環(huán)被環(huán)上連有CO或NH的兩個(gè)碳原子分成兩邊，一邊未與CO或 NH相連的兩個(gè)環(huán)原子可被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團(tuán)相連的兩個(gè)環(huán)原子可被R7 任意取代；R1-(Y5)n-R2(e)其中Y5是六元芳香環(huán)與含有一個(gè)雙鍵的五元環(huán)的稠合環(huán)，該稠合環(huán)有0-3個(gè)雜原 子，所述雜原子選自ISjj1和R2分別與稠合環(huán)的不同環(huán)上的環(huán)碳原子相連，它們從共同 的橋頭原子算起均是第二個(gè)環(huán)原子，在R1和R2之間該稠合環(huán)的一邊有兩個(gè)非橋頭環(huán)原子 而在另一邊則有三個(gè)非橋頭環(huán)原子，所述的稠合環(huán)一邊的兩個(gè)非橋頭環(huán)原子可被R7任意取 代，另一邊的三個(gè)非橋頭環(huán)原子可被R3任意取代；這里R1, R2 獨(dú)立地為 H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、0H、_0_、_S_、OR4, SH、SR4, COR4, CONHR4, CON (R4) 2、R4, H2N(CH2)mCO, CONH2, CONHR4, H2N(CH2)mCOO (CH2)mS (CH2) mC6H4NNC6H4、-HN(CH2)mCO, -CONH-, -CONR4, -HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4 禾Π -(CH2) mCH(0H) (CH2)mNHCO (CH2)mNH-,或者R1和R2中有一個(gè)基團(tuán)下存在；R3 為選自下列基團(tuán)的基團(tuán)F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、OR4、SH、SR4、 COR4, CONHR4, CON(R4)2和R4,或者R3是可形成與Y1環(huán)成稠合環(huán)的3、4、5或6元環(huán)的基團(tuán)；R4是含有1-20個(gè)碳原子的烷基或環(huán)烷基、含有1-20個(gè)碳原子和1_3個(gè)雙鍵的鏈烯 基或環(huán)烯基、含有不超過25個(gè)碳原子的碳環(huán)芳基、含有不超過25個(gè)碳原子的雜環(huán)芳基、含 有不多于25個(gè)碳原子的碳環(huán)或雜環(huán)芳烷基，其中R4可被1、2或3個(gè)F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、 N(R5) 2、N(R5)3+、OH、OR5, SH、SR5, COR5, CONHR5, CON(R5)2 或 R5 基團(tuán)任意取代；R5是具有1-6個(gè)碳原子的烷基，R6是H、具有1-5個(gè)碳原子的烷基，或者R6和R7共同形成一個(gè)4、5或6元環(huán)，任 意-0-、-S-、-NH-, -NCH3-或N-低級(jí)烷基是上述環(huán)的一部分；結(jié)構(gòu)式2(2)小溝結(jié)合基由通式(a)表示，其中的五元環(huán)的結(jié)構(gòu)為
結(jié)構(gòu)式3(3)小溝結(jié)合基由通式(b)表示，且其中稠合環(huán)的結(jié)構(gòu)為
結(jié)構(gòu)式4含交聯(lián)基的實(shí)施方案本發(fā)明優(yōu)選的一類ODN-MGB軛合物還包括一個(gè)或多個(gè)“交聯(lián)基”，在ODN-MGB軛合 物與互補(bǔ)DNA、RNA或其片斷的靶序列結(jié)合后，所述的交聯(lián)基即與靶序列進(jìn)行不可逆的反 應(yīng)，形成共價(jià)鍵。這種與靶序列的共價(jià)結(jié)合可用用分析、診斷如用作雜交探針，還可用于治 療用途(用作反義核酸、反義基團(tuán))。小溝結(jié)合基與ODN的共價(jià)結(jié)合增強(qiáng)了 ODN-MGB軛合物 與靶序列間初始的非共價(jià)結(jié)合力，因而有利于隨后的通過交聯(lián)基的共價(jià)結(jié)合。就摻入到這 類ODN-MGB軛合物中的交聯(lián)基而言，應(yīng)考慮下列情況。本發(fā)明的交聯(lián)基與ODN-MGB軛合物的某一部位共價(jià)結(jié)合。其長(zhǎng)度和立體取向應(yīng)符 合這樣的要求，即在ODN-MGB軛合物與靶序列雜交后，該交聯(lián)基應(yīng)到達(dá)靶DNA或RNA內(nèi)的適 當(dāng)?shù)姆磻?yīng)位點(diǎn)。就定義而言，交聯(lián)基(劑)具有與靶DNA或RNA序列的活性基團(tuán)反應(yīng)的活
CN 101914099 A^ zR10/38 頁R7 是 F、CH3-或-CH2CH3 ；-CH2-或-CH2CH2-；m是1-10之間的整數(shù)η是1-10之間的整數(shù)，以及P是1-5之間的整數(shù)。本發(fā)明更為優(yōu)選的ODN-MGB軛合物是其中的小溝結(jié)合基定義如下的那些軛合物(1)小溝結(jié)合基由上面的通式(a)表示，并且其五元環(huán)的結(jié)構(gòu)為
—HN
13性基團(tuán)。該交聯(lián)基(劑)可與ODN-MGB軛合物的一個(gè)或多個(gè)雜環(huán)堿基、與糖基或修飾的糖 基、磷酸酯基或修飾的磷酸酯共價(jià)結(jié)合。交聯(lián)基也可與小溝結(jié)合基相連，只要不影響它與小 溝的結(jié)合能力。最好交聯(lián)基(劑)與一個(gè)雜環(huán)堿基相連。簡(jiǎn)單而言，交聯(lián)劑從概念上可分成兩個(gè)基團(tuán)或部分，即反應(yīng)活性基和臂(A)，所述 的反應(yīng)活性基一般是而且最好是親電離去基(L)，所述的臂將離去基連接到ODN-MGB上的 各自位點(diǎn)上。這些離去基例如可以選自Cl、Br、I、S02R'“、或S+R' “ R"“，其中R'“、 R"“互不相干地為(C1-C6)烷基或芳基，或者R'“或R"“ —起形成Cp6亞烴基橋。其中以 Cl、Br、I為最佳。在這些基團(tuán)中，鹵乙?；?COCH2I和雙官能“氮芥”如_N_[ (CH2)2_C1]2 是優(yōu)選的。各離去基由于其離去能力(不同)而會(huì)有所變化。依據(jù)各離去基的內(nèi)在性質(zhì)和 反應(yīng)活性來選擇在每種情況下要用的離去基以得到所需的不可逆結(jié)合探針的特異性。雖然上面已指出，“臂/ (或連接臂)A從概念上可被認(rèn)為是一個(gè)實(shí)體，即使ODN-MGB 與離去基共價(jià)結(jié)合的實(shí)體，使離去基相對(duì)于ODN-MGB保持期望的距離和立體位置。實(shí)際上 臂A可在合成方案中構(gòu)建出來，其中在小溝結(jié)合基與ODN-MGB或ODN連接前，雙官能分子通 過其第一官能團(tuán)與ODN-MGB軛合物或ODN共價(jià)結(jié)合(例如通過磷酸酯鍵連于ODN的3 ‘或 5'-端、通過C-C鍵與雜環(huán)堿基相連，或通過C-N鍵與氨基取代的雜環(huán)堿基相連)，并通過 其第二官能團(tuán)(如-NH2)與烴基橋(烷基橋、烷基芳基橋或芳基橋等)連接，而這些橋上攜 帶有離去基。交聯(lián)基的一般通式為-A-L或A-L2, L為上面定義的離去基，A是與ODN-MGB共價(jià) 結(jié)合的部分。臂A本身在ODN-MGB與靶序列雜交的條件下應(yīng)無反應(yīng)活性(只有通過離去基 才表現(xiàn)反應(yīng)活性)，并應(yīng)使離去基與希望的反應(yīng)位點(diǎn)如靶序列中鳥嘌呤(G)的N-7位保持所 需的立體位置與距離。通常A的長(zhǎng)度與約有2-20個(gè)碳原子的正烷基鏈長(zhǎng)相當(dāng)。一類優(yōu)選交聯(lián)基的較為具體的示例性的通式是-(CH2) ,-Y-(CH2)m-L,其中L是離去基(定義如上)，m和q各自獨(dú)立地為0_8(包括0和8)，而Y定義 為“官能連接基”為了清楚描述起見，該官能連接基應(yīng)與連接小溝結(jié)合基和寡核苷酸(ODN) 的“連接基”區(qū)別開來，盡管此處所述的連接交聯(lián)基的“官能連接基”也可用來使小溝結(jié)合 基與ODN的任何一端或與ODN的中間位置的核苷酸相連?！肮倌苓B接基”是有兩個(gè)官能團(tuán) 如-HN2和0H、或COOH和0H、或COOH和NH2的基團(tuán)，它們能連接(CH2) q和(CH2)m成橋。末端 炔基(HC ε C-)基也是Y的一個(gè)恰當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)，因?yàn)樗芘c某些雜環(huán)偶聯(lián)，如下文所述。一類優(yōu)選交聯(lián)基的其它示例性的且較為具體的通式為- (CH2) q-NH-C0- (CH2) m_ ⑴ n_N (R1) - (CH2) P_L 和-(CH2) q 丨 _0_ (CH2) q “ -NH-CO- (CH2) ^(X)n-N(R1)-(CH2)p-L這里q、m、L的定義同上文描述交聯(lián)基時(shí)所述的定義。q'為3_7(包括3和7)， q"為1-7 (包括1和7)，X為苯基或簡(jiǎn)單取代的苯基(如Cl、Br、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基 取代的苯基)，η為0或1，ρ為1-6的整數(shù)，R1為H、低級(jí)烷基或(CH2)P_L。ρ優(yōu)選為2。本 領(lǐng)域的專業(yè)人員都清楚-N(R1)-(CH2)2-L描述的是氮芥的結(jié)構(gòu)，后者是一類潛在的烷化劑。 在ODN-MGB軛合物中，那些其中的交聯(lián)劑含有-N(R1)-(CH2)2-L這樣的官能團(tuán)的是特別優(yōu) 選的，其中L是鹵素，最好為Cl ；更為優(yōu)選的是其中的交聯(lián)劑含有N-[(CH2)2-L]2 (雙官能氮 芥)這樣基團(tuán)的那些。交聯(lián)劑的部分結(jié)構(gòu)最好含有基團(tuán)
-CO-(CH2) 3-C6H4-N[ (CH2)2C1]2在一個(gè)最優(yōu)實(shí)施方案中，剛才提到的交聯(lián)基與ODN的5'和3'-端帶有N-正己 基氨基的尾巴相連，結(jié)構(gòu)如下R1-O-(CH2)6-NH-CO-(CH2) 3_C6H4-N-[ (CH2)2C1]2其中R'表示ODN的5'或3'-端磷酸酯基。另一末端或中間的核苷酸與小溝結(jié)
合基相結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方案，交聯(lián)基與雜環(huán)堿基如與ODN-MGB軛合物中的 2_脫氧尿核苷酸的尿嘧啶共價(jià)結(jié)合。這種結(jié)合可通過氨基進(jìn)行，亦即可使”臂-離去基結(jié)合 體”(A-L)與ODN的5-氨基-2'-脫氧尿苷酸相連。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，“A-L”通過 碳-碳鍵與ODN的2'-脫氧尿苷酸的5-位相連。一般而言，5-取代的2'-脫氧尿苷可 通過改進(jìn)的 Robins 等人的方法(Can. J. Chem, 60 554(1982) ;J. Org. Chem. 48 1854 (1983) 進(jìn)行合成。根據(jù)該改進(jìn)的方法，在鈀催化下，取代的1-炔烴與5-碘-2' _脫氧尿苷偶聯(lián) 反應(yīng)得到乙炔偶合產(chǎn)物。該乙炔脫氧尿苷類似物用例如蘭尼鎳還原，得飽和化合物，然后使 后者直接轉(zhuǎn)化為用于自動(dòng)DNA合成儀的試劑?？砂凑赵摲椒ㄅc5-磺-2' _脫氧尿苷進(jìn)行 偶聯(lián)反應(yīng)的其它試劑是HC ε c CH2OCH2CH2N (CO) 2C6H4(苯二甲酰亞氨基乙氧基丙炔-1)和 HC = C CH20CH2CH2NHC0CF3 (三氟乙酰氨基乙氧基丙炔-1)。本這些實(shí)施例中，將按上述路線合成的核苷引入0DN，并僅在除去了各自的苯二甲 酰基或三氟乙?；缺Ｗo(hù)基后，使交聯(lián)劑的烷化部分與末端氨基結(jié)合。其中交聯(lián)劑與雜環(huán) 堿基相連的其它核苷酸的例子是2'-脫氧-4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物。這些化 合物可根據(jù)已公開的PCT申請(qǐng)WO =90/03370(1990年4月5日公開)的方法制備。在對(duì)本發(fā)明修飾的ODN的結(jié)構(gòu)進(jìn)行一般討論時(shí)，發(fā)現(xiàn)以球_棍模型和高分辨率計(jì) 算機(jī)圖形學(xué)對(duì)雙鏈DNA的研究表明嘌呤的7-位和嘧啶的5'-位位于雙鏈核酸B型螺旋體 的大溝上。這些位置可用較大體積的側(cè)鏈取代，而不影響堿基的雜交性質(zhì)。這些側(cè)鏈可通過 脫氧胸苷(dThd)或脫氧胸苷(dCyd)衍化引入或通過雜環(huán)堿基的直接全合成然后再進(jìn)行糖 基化而引入。這些修飾的核苷可被轉(zhuǎn)化為用自動(dòng)DNA合成儀引入到寡核酸中的適當(dāng)活化的 核苷酸。吡唑并[3，4-d]嘧啶是腺嘌呤類似物，交聯(lián)臂與其3-位(相當(dāng)于嘌呤的7-位) 相連。該交聯(lián)側(cè)鏈(臂=A)應(yīng)有足夠的長(zhǎng)度，使其能從嘌呤的7-或8-位、嘧啶的5-位、 吡咯并嘧啶的5-位或吡唑并嘧啶的3-位穿過大溝與嘌呤(最好為鳥嘌呤)的N-7位反 應(yīng)，這個(gè)嘌呤位于含有該被修飾類似物的堿基對(duì)的上方(在寡聚物的3'端)。在該雙鏈復(fù) 合體內(nèi)，當(dāng)堿基與另一堿基配對(duì)時(shí)，該交聯(lián)側(cè)鏈(臂=A)使官能團(tuán)離開這個(gè)已配對(duì)的堿基。 象上面所指出的那樣，廣義上講，臂A的長(zhǎng)度應(yīng)與含2-20碳的正烷基鏈長(zhǎng)相當(dāng)。最好臂A 為含有1-12碳原子的亞烷基、含有2-12碳原子且1或2個(gè)烯鍵的鏈烯基、含有2-12碳原 子且1或2個(gè)炔鍵的炔基，或者其末端用親核基如0、S、氨基取代的基團(tuán)或被保護(hù)的其衍生 物(例如三氟乙酰氨基、苯二甲酰亞氨基、CONR'、NR' CO、SO2NR'(這里R' = H或C1^ 烷基)取代的基團(tuán))。這些官能團(tuán)包括脂肪胺或芳香胺)表現(xiàn)出親核性且能與下面這些基 團(tuán)相連-(CH2)m-L 和-CO- (CH2) m- (X) n-N (R1) - (CH2) p_L
如上文所述，這些基團(tuán)是示例性交聯(lián)官能基的一部分。在連有交聯(lián)基(A-L)或其適當(dāng)?shù)那绑w如-((！^^^吐或-⑴吐),^，其中Y以親核 基團(tuán)如NH2為末端)的核苷或核苷酸合成后，本發(fā)明的修飾的寡核苷酸的進(jìn)一步合成可根 據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有的方法進(jìn)行。因此，為合成寡核苷酸，在核苷或核苷酸上引入保護(hù)基并使這 些化合物活化以用于寡核苷酸的合成。向被保護(hù)的、活化型核苷(酸)的轉(zhuǎn)化可參考有 關(guān)2 ‘-脫氧核苷的幾篇綜述(見Sonveaux，生物有機(jī)化學(xué)(Bioorganic Chemistry) 14 274-325(1986) Jones,寡核苷酸的合成-一種實(shí)際的途徑(“Oligonucleotide Synthesis, aPractical Approach" ), Μ. J. Gait,He$t IRL 出片反，23-34 M (1984))。將活化核苷酸引入寡核苷酸的方法與DNA和RNA的合成相似，即將正確的核苷酸 逐步連接成一條與靶DNA或RNA的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸鏈。核苷酸的引入可采用酶法 或化學(xué)合成法?？蓪⒑塑账嵝揎棾善湎鄳?yīng)的5' -0-二甲氧基三苯甲基-3' _(N，N-二異丙 基)亞磷酰胺氰乙酯衍生物，再按(Oligonucleotide Synthesis =APractical Approach) 文中的方法摻入合成的寡核苷酸。然后，N-保護(hù)基與其它保護(hù)基分別用氨解和本領(lǐng)域已知 的常規(guī)方法脫去。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，活化核苷酸可根據(jù)使用的合成儀的使用方法和操作規(guī)程 直接用于自動(dòng)DNA合成儀。采用標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)濟(jì)的亞磷酰胺或H-磷酸酯合成化學(xué)法，該寡核苷酸 可在合成儀上制備。在寡核苷酸合成及除去任何保護(hù)基后，可將含離去基如鹵乙?；?CO-(CH2) ^OOn-N(R1)-(CH2)p-U 最好是 CO-(CH2)3-C6H4-N[CH2CH2Cl]2)基團(tuán)加到末端氨基烷基或類 似末尾(-(CH2)q-Y)上。如果交聯(lián)劑(A-L)通過例如烷基氨基(其通式為-(CH2)q-L,其中Y以氨基為末 端)與寡核苷酸的3'端或5'-端相連，在這種情況下應(yīng)先合成帶有氨基烷基末端的寡核 苷酸，然后再將烷化基如上面提到的鹵酰基或-CO- (CH2) m-⑴n_N (R1) - (CH2) P_L引入其中， 來進(jìn)行寡核苷酸的合成。優(yōu)選的示例性O(shè)DN-MGB軛合物的結(jié)構(gòu)如下，該軛合物具有與核苷酸堿基之一相連 的交聯(lián)劑5' -GGTTATTTTTGAAGATACGAATTTCUCCAGAGACACAGCAGGATTTGTCA-CDPI3其中符號(hào)“U”(該50聚核苷酸中的第26位核苷酸)表示5-(3-氨基丙基)-2'-脫 氧尿苷，該尿苷具有與氨基相連的苯丁酸氮芥殘基。符號(hào)“CDPI3”表示小溝結(jié)合基(將結(jié)合 反應(yīng)路線1描述于下文)。通過采用5' -0-三苯甲基-5-三氟乙酰氨基丙基-2'-脫氧 尿苷-3'-(隊(duì)^二異丙基-氰乙基-亞磷酰胺，根據(jù)6讓8011，1(..和徹111 ^化，5..的方 法將5-(3-氨基丙基)-2'-脫氧尿苷引入寡核苷酸中(GibSOn，K. J.，&Benk0ViC，S. J.核 酸研究(Nucleic AcidRes.) 1987，15 :6455)。ODN與苯丁酸氮芥殘基和小溝結(jié)合基的連接 描述于下文的實(shí)驗(yàn)部分。小溝結(jié)合基和ODN-MGB軛合物的合成目前，最優(yōu)選的本發(fā)明小溝結(jié)合基是從1，2_二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧 酸和4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸衍生的寡肽。這些寡肽是合成肽，它們具有分別由結(jié) 構(gòu)式2和結(jié)構(gòu)式4所示的重復(fù)單元，其中聚合度m值優(yōu)選為3-5。對(duì)結(jié)構(gòu)式2所示的肽，m值以5為最佳；對(duì)結(jié)構(gòu)式4所示的肽，m值以3為最好。反應(yīng)路線1是一個(gè)三肽(簡(jiǎn)稱為 ⑶PI3)的合成路線，該肽經(jīng)修飾或不經(jīng)修飾可直接與ODN相連，得到優(yōu)選的本發(fā)明ODN-MGB 軛合物。
反應(yīng)路線〗 在反應(yīng)路線1中，起始原料為3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲 哚-7-羧酸或3-叔丁氧羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚_7_羧酸，它們可按 有關(guān)的化學(xué)文獻(xiàn)方法(D. L. Boger，R. S. Coleman和B. J. Invergo，有機(jī)化學(xué)雜志(J. Org. Che-m. )，1987，52 1521-1530)制備。起始原料以三氟乙酸四氟苯酯(TFP-TFA)處理，轉(zhuǎn)化成活性酯。在化合物Ia中，R為CONHm在Ib中，R為叔丁氧羰基(tBoc)。叔丁氧羰基 (tBoc)是熟知的可用酸除去的用于保護(hù)氨基的保護(hù)基。使所得的活化酯Ia和Ib與1， 2- 二氫-3H-吡咯吲哚-7-羧酸甲酯(亦可根據(jù)文獻(xiàn)合成，參見D. L. Boger,R. S. Coleman和 B. J. Invergo，J. Org. Chem.，1987，52 1521-1530)反應(yīng)，得二肽 2a 和 2c。再用堿處理去掉 羧基官能團(tuán)中的甲基以得到有游離羧基的二肽。該二肽用四氟苯酚再次活化得活化酯(當(dāng) R = CONH2, TFP-CDPI2 時(shí)為 2e ；當(dāng) R = tBoc, TFP-tBoc-CDPI2 時(shí)為 2f)，在經(jīng) TFP-TFA 活化 后，該二肽活化酯可與ODN結(jié)合形成ODN-MGB軛合物，其合成見三肽。該二肽的活化酯也可 與另一分子1，2- 二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯反應(yīng)，得到三肽(其羧基通過甲酯保 護(hù))3a(3-氨甲?；?1，2-二氫-3H-吡咯并[3,2-e]吲哚_7_羧酸甲酯三肽)。所述的甲 基用堿水解除去，使所得的三肽3b經(jīng)四氟苯酚活化得活化的四氟苯酯3c (3-氨甲?；?1， 2- 二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸_2，3，5，6-四氟苯酯三聚體，TFP-CDDI3)。通過 重復(fù)上述步驟，活化的四氟苯酯3c可用來進(jìn)一步使肽鏈延長(zhǎng)，即通過與1，2_ 二氫-3H-吡 咯并吲哚-7-羧酸甲酯反應(yīng)，使所得的甲酯皂化，并如果需要再與TFP-TFA反應(yīng)，得到摻入 了 4個(gè)CDPI的肽的活化四氟苯酯。因此，很容易理解，可進(jìn)一步重復(fù)這些步驟，直至得到含 有所需數(shù)目CDPI單體的寡肽。在本文所述的優(yōu)選實(shí)施方案中，三肽3c的四氟苯基活化酯用 來與ODN偶聯(lián)得ODN-MGB軛合物，或者在適當(dāng)修飾的CPG (控制孔徑的玻璃)固相載體上合 成ODN-MGB共軛物，這一過程結(jié)合反應(yīng)路線4和5描述于下文。反應(yīng)路線1表明其最后步 驟是從三肽3c的四氟苯基活化酯(TFP-OTPI3)制備羥基丙基胺衍生物的步驟。三肽3d的 羥基丙胺衍生物3d(3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3,2-e]吲哚_7_羰基-1-酰 氨基-3-丙醇三聚體，⑶PI3-3-羥基丙胺)可用來與ODN結(jié)合得到本發(fā)明的0DN-MGB。然 而，該三肽3d還可作為游離的小溝結(jié)合劑在下文描述的某些結(jié)合研究中用作對(duì)照。
反應(yīng)路線2公開了另-
反應(yīng)路線2
-優(yōu)選的小溝結(jié)合劑(肽)的合成路線，其中的單體為4-氨 基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基，而且這個(gè)肽含有信息基團(tuán)/含苯偶氮基。這樣，在N，N-二環(huán) 己基碳二亞胺存在下，6-[(叔丁氧基)甲酰氨基]己酸與2-[4-(苯偶氮基)-芐基硫]乙醇 縮合得到化合物11 (5-[(叔丁氧基)甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫)乙酯)。 用三氟乙酸(TFA)將化合物11中的保護(hù)基tBoc脫去，所得的有游離氨基的化合物與受tBoc 保護(hù)的4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸的活化酯反應(yīng)。所述的活化酯化合物(1，2，3_苯并三 唑-1-基1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸酯)可由1-甲基_4-[(叔丁氧 基)甲酰氨基]吡咯-2-羧酸制得，后者可根據(jù)文獻(xiàn)方法(L.Grehn，V.RagnarSSOn，J.0rg. Chem.，1981，46，3492-3497)得到。反應(yīng)得到的化合物12 (5_[1_甲基_4_(叔丁氧基)甲酰 氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2- [4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯)含有一個(gè)2-氨基-N-甲 基吡咯羧酸殘基，該殘基上連有含有苯偶氮基的信息基團(tuán)。用三氟乙酸除去保護(hù)基tBoc 后，再與一分子或多分子的1-甲基-4-叔丁氧基甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三 唑-1-酯進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，直至得到含所需數(shù)目殘基的寡聚肽。這樣具有η個(gè)單體殘基及1 個(gè)游離氨基的化合物在反應(yīng)路線2中如圖16a所示。16a可與受tBoc保護(hù)的6-氨基己酸 的活化酯(如1，2，3_苯并三唑-1基活化酯)反應(yīng)，得到如反應(yīng)路線2中以16b所示的寡 肽。可在酸性條件下除去16b中的tBoc保護(hù)基，并可將所得的具游離氨基的衍生物，通過 傳統(tǒng)合成方法與ODN的3'-磷或5'-磷酸相連。此外，具游離氨基的該衍生物還可通過 雙官能連接基(如上文所述)與寡核苷酸的3'或5'-羥基相連。
反應(yīng)路線3描述的是以3' _氨基或5' _氨基為末端的寡核苷酸與四氟苯基 (TFP)酯活化的小溝結(jié)合(寡)肽相偶聯(lián)的一般方法。雖然在該圖中顯示的是根據(jù)反應(yīng)路 線1得到的以TFP活化的小溝結(jié)合化合物的使用，但應(yīng)記住這個(gè)一般方法也適用于其它的 四氟苯基活化的小溝結(jié)合劑與ODN的偶連。反應(yīng)路線3中的標(biāo)號(hào)Ia 3c指的是按反應(yīng)路 線1制備的示例化合物。3'-或5'-端氨基為末端的寡核苷酸可通過常規(guī)方法合成；例如氨基己基通過 可商購的N-甲氧基三苯甲基氨基己基亞磷酰胺與ODN的任何一端連接。此外，以氨基為末 端的ODN也可根據(jù)1993年7月12日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?8/090，408 (已批準(zhǔn)授權(quán)且公布費(fèi)已 付)所公開的方法合成。該專利申請(qǐng)的說明書的內(nèi)容引入本文作參考。根據(jù)本合成路線， 將以氨基為末端的ODN轉(zhuǎn)化為十六烷基三甲銨鹽，以使其可溶于有機(jī)溶劑，再使其與四氟 苯基酯活化的小溝結(jié)合劑縮合，反應(yīng)最好以DMSO為溶劑。
反應(yīng)路線4公開的是以5'-氨基為末端的寡核苷酸與小溝結(jié)合劑的活化酯偶聯(lián) 的另一方法。該圖中的例子是自3-氨基甲?；?1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚_7_羧 酸殘基衍生的三肽的四氟苯酯(TFP-CDPI3),但應(yīng)該明白這個(gè)結(jié)合本反應(yīng)路線公開的一般 原理也適用于其它小溝結(jié)合劑。在該方法中，ODN仍然與CPG載體相連，并且在其氨基末端有游離氨基。可通過上面提到的N-甲氧基三苯甲基氨基己基亞磷酰胺得到，在該磷酰胺偶 合后，脫去其中的甲氧基三苯甲基以得到結(jié)合在CPG上以氨基為末端的0DN。此外，這個(gè)連 有CPG的化合物還可按上文提到的專利申請(qǐng)No. 08/090，408及其引用的文獻(xiàn)所公開的方法 合成。順便總結(jié)一下，逐步合成與CPG載體偶聯(lián)的0DN，該ODN帶有末端氨基，該氨基是以 9_芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)的。當(dāng)所需的寡核苷酸合成完畢后，脫去Fmoc，這時(shí)ODN仍 然與CPG載體相連。根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)路線4，使帶有游離氨基結(jié)合在CPG上以氨基為末端 的ODN與活化酯(TFP-CDPI3, 3c)或類似的小溝結(jié)合劑活化酯縮合。此后通過常規(guī)方法(最 經(jīng)常用氨處理)，將ODN-MGB軛合物從CPG載體上脫下。
a 試劑(a)TFD-TFA、三乙胺、CH2Cl2 ;(b)3-氨基-1，2-丙二醇、CH2Cl2 ;(c)DMTrCl、 吡啶；⑷琥珀酸酐、N-甲基咪唑、CH2Cl2, TFP-TFA ； (e)烷基胺CPG、吡啶；(f)哌啶、DMF ； (g) TFP-CDPI3 (反應(yīng)路線 1 中的 3c)、DMF反應(yīng)路線5反應(yīng)路線5所示的是合成本發(fā)明的ODN-MGB軛合物的另一優(yōu)選方法。具體地講， 該法是先把連接分子與CPG載體相連，然后再把活化的小溝結(jié)合劑與連接分子相連，用自 動(dòng)ODN合成儀，以剛才述及的修飾的CPG為載體，逐步合成所需序列的寡核苷酸。僅當(dāng)完成 了所需序列的ODN部分的合成后，才從CPG載體上脫下ODN-MGB軛合物。這里的連接分子 為三官能團(tuán)，每個(gè)官能團(tuán)具有不同的反應(yīng)活性，一個(gè)與CPG載體相連，另一個(gè)與活化的小溝 結(jié)合基反應(yīng)，第三個(gè)則用于ODN的合成。有關(guān)這個(gè)合成方法和可用于該方法內(nèi)的三官能連 接分子的更一般的詳細(xì)描述見于申請(qǐng)?zhí)枮?8/090，408的申請(qǐng)中，但該申請(qǐng)未涉及小溝結(jié)合劑。在反應(yīng)路線5所示的合成方法中，以β _丙氨?；?3-氨基-1，2-丙二醇作為三官 能連接分子，以TFP-⑶PI3為活化的小溝結(jié)合劑。這樣根據(jù)反應(yīng)路線5，F(xiàn)moc保護(hù)的β -丙氨酸與三氟乙酸四氟苯酯(TFP-TFA) 反應(yīng)以得到3-[Ν-(9-芴基甲氧基羰基)]氨基丙酸2，3，5，6_四氟苯酯(4)。活化酯4 與3-氨基-1，2-丙二醇反應(yīng)得到1-[3-[Ν-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨 基_(R，S)-2，3-丙二醇(5)。此后，化合物5的伯羥基用二甲氧基三苯甲基保護(hù)，得到 1- [3- [N- (9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基_ (R，S) -2- [[二(甲氧基苯基)苯 基甲氧基]甲基]2-乙醇(6)?；衔?的仲羥基與琥珀酸酐反應(yīng)，此后將所得化合物中的 羧基轉(zhuǎn)化為活化酯1- [3- [N- (9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基_ (R，S) -2- [[二 (甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]-2-乙基丁二酸2，3，5，6-四氟苯酯(7)。然后使化合物 7與長(zhǎng)鏈氨基烷基-CPG (LCAA-CPG或烷基氨基CPG)相連(后者可自市售購得并在申請(qǐng)?zhí)枮?08/090, 408的專利申請(qǐng)中已有描述)。得到的“經(jīng)修飾的CPG”以化合物8示于反應(yīng)路線5 中。用中性堿(溶于二甲基甲酰胺中的哌啶)脫去保護(hù)基Fmoc得到經(jīng)修飾的CPG(9)，該化 合物9含有作為連接劑的一部分的游離的伯胺基。下一步，使活化的小溝結(jié)合劑(這里為 TFP-CDPI3,化合物3c)與化合物9的伯氨基反應(yīng)，得修飾的CPG (10)，后者含有小溝結(jié)合基 和用二甲氧基三苯甲基保護(hù)的連接基的伯羥基。在接下來的步驟中(雖然這些反應(yīng)步驟未 在反應(yīng)路線5中示出)，二甲氧基三苯甲基被除去，ODN的合成用自動(dòng)合成儀按現(xiàn)認(rèn)為是本 領(lǐng)域常規(guī)方法的方法進(jìn)行。合成完畢后，用氨將ODN-MGB軛合物從CPG載體上脫下。這時(shí) 連接3-氨基-1，2-丙二醇的仲羥基與CPG載體的鍵斷裂。生物學(xué)試驗(yàn)與結(jié)果討論ODN-MGB軛合物能與單鏈DNA結(jié)合。在重組酶作用下它們也能與雙鏈DNA結(jié)合，并 且在某些情況下還能與單鏈RNA及DNA和RNA的雜交體結(jié)合。但只有ODN與靶DNA或RNA 的靶序列按Watson-Crick規(guī)則互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)時(shí)，才發(fā)生這種結(jié)合。滿足這一條件后， ODN-MGB軛合物與靶序列的結(jié)合明顯強(qiáng)于無MGB與之結(jié)合的同樣的ODN與靶序列的結(jié)合。 這些可用下面的生物學(xué)試驗(yàn)來證實(shí)，這些使得本發(fā)明的ODN-MGB軛合物可作為靶DNA或RNA 序列的分析和診斷雜交探針，也可用作反義核酸和反義基因治療劑。表1(dAP)8+(dTp)8|鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)的數(shù)據(jù)a，表中雙鏈螺體寡核苷酸的 3'端連有嵌入劑或寡聚(1-甲基-2-羧基-4-氨基)吡咯殘基。
23 a參數(shù)為至少三次實(shí)驗(yàn)的平均值。雙鏈螺旋體在0. 2M NaCUO. Im MEDTA, 0. OlM(士0. I0C )Na2HPO4, ρΗ7· 0 的緩沖液中熔化，(dTP)8 · (dAP)8 的濃度為 2. 5X 10_5M。b修飾和未修飾雙鏈螺旋體的熔化溫度的差值(Δ Tffl)c偏端霉素的濃度為2. 5 X ICT5Md ODN的3'磷酸酯通過β -丙氨酸接頭與溴乙錠的8-氨基連接，方法參考文獻(xiàn) 12。
表1列出了幾種互補(bǔ)寡核苷酸所形成的復(fù)合物的熔化溫度，所述的寡核苷酸連有 小溝結(jié)合基，后者是自4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基衍生而來，該小溝結(jié)合基具體地 以表1下面的結(jié)構(gòu)式X表示。需要指出，X還包括自6-氨基己酸衍生的連接基。此處使用 的寡核苷酸為八聚2' _脫氧腺苷酸和8-聚2'-脫氧胸苷酸。小溝結(jié)合基(X)與寡核苷酸3' _磷酸酯端相連，這些ODN的5'端無磷酸酯。關(guān)于這一點(diǎn)，須指出的是本表(包括 其它表)中的寡核苷酸按本領(lǐng)域的習(xí)慣方式縮寫?；鶊F(tuán)Y表示通過“β_丙氨基”連接基與 3'-磷酯相連的溴乙錠部分。Y代表嵌入基，作為與小溝結(jié)合基比較時(shí)的對(duì)照。m表示存 在于表中的各ODN-MGB中的4-氨基-N-甲基-吡咯-2-羧酸殘基的數(shù)目。正如本領(lǐng)域所公知的，寡核苷酸或多聚核苷酸雙鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)定義 為50%的寡核苷酸或多聚核苷酸自其雙鏈螺旋體(WatsonCrick氫鍵型)解離時(shí)的溫度。 熔化溫度越高則意味著雙鏈螺旋體愈穩(wěn)定。此外，還已知寡核苷酸和多聚核苷酸的Tm還依 賴于寡核苷酸在測(cè)熔化溫度溶液中的濃度，濃度高，則測(cè)得的熔化溫度也高。這些表中所列 的Tm是在表中或?qū)嶒?yàn)部分所指出的條件下測(cè)定的。ATm表示修飾的雙鏈螺旋體的熔化溫 度與未與小溝結(jié)合基結(jié)合的(dAp)8 · (dTp)8復(fù)合物的熔化溫度的差值。從表1可以發(fā)現(xiàn)，共價(jià)結(jié)合的小溝結(jié)合基顯著增加了雙鏈復(fù)合體的穩(wěn)定性(熔化 溫度Tm升高)，這里小溝結(jié)合基(X)與((《^)8或(dAp)8寡核苷酸相連。這種情況下，當(dāng) 小溝結(jié)合基是5肽時(shí)，穩(wěn)定程度達(dá)到最大(熔化溫度最高)。在比較試驗(yàn)中，當(dāng)嵌入基Y與 (dAp) 8寡核苷酸結(jié)合時(shí)，則穩(wěn)定程度相對(duì)地小得多。在該試驗(yàn)中，甚至當(dāng)嵌入基Y與寡聚體 的兩條鏈同時(shí)連接時(shí)，熔化溫度的增加也比連有5個(gè)4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基 的小溝結(jié)合基要小。表2由十六聚或八聚胸苷酸和帶有寡聚脫氧腺苷酸的寡聚(1-甲基-2-羧基-4-氨 基)吡咯衍生物所形成的雙鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)數(shù)據(jù)，該溫度是在0.2M NaCUO. OlM Na2HP04、0· IMEDTA(pH7. 0)中測(cè)定的。X的定義與表1中的相同。
表2公開信息的方式與表1類似。在本表報(bào)導(dǎo)的試驗(yàn)中，使帶有小溝結(jié)合基(用 X表示，同表1中的X)的16-聚胸苷酸與多聚脫氧腺苷酸形成復(fù)合物。作為對(duì)照，對(duì)在其 3'-磷酸酯端與6-氨基己酸相連的16聚胸苷酸(dTp)16&進(jìn)行了測(cè)驗(yàn)。此外，還對(duì)8聚 胸苷酸(dTp)8及其與具有不同長(zhǎng)度肽鏈的小溝結(jié)合基所形成的軛合物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在這 些實(shí)驗(yàn)中，與ODN相連的小溝結(jié)合劑也顯著增加了 ODN-MGB與互補(bǔ)DNA鏈所形成的復(fù)合物 的穩(wěn)定性。當(dāng)小溝結(jié)合基內(nèi)的4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的數(shù)目為5個(gè)時(shí)，則復(fù)合 物最穩(wěn)定。相反，16聚ODN上的氨酸己酸尾巴，實(shí)際上不能增加復(fù)合物的穩(wěn)定性。表3由poly (Tp) 8或poly (rA)與末端連有配體CDPIh或BocDPI^的(Tp)8所形成的
雙鏈螺旋體的熔化溫度a。 a括號(hào)內(nèi)的數(shù)據(jù)是帶有接頭L2的該衍生物測(cè)得的。b沒觀察到熔化轉(zhuǎn)變。 Ll = -O(CH2)6NH- L2 =-OCH2CH (OH) CH2NHC0CH2CH2NH_表3公開的是熔化溫度(Tm)和熔化溫度差值(ATm)，這里寡核苷酸是八聚胸苷 酸，并有一個(gè)小溝結(jié)合基與它的5'-磷酸酯或3'-磷酸酯端相連(如表3所示)。此處 小溝結(jié)合基用X表示，Y是基于1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚_7_羧酸(⑶PI或Boc DPI)殘基的寡肽，其結(jié)構(gòu)見表3。這些小溝連接肽(基)通過連接基"L1或L2 ”與ODN相連， L1和L2的結(jié)構(gòu)見表下面。對(duì)該ODN-MGB軛合物與互補(bǔ)的均聚核苷酸或均聚脫氧核苷酸進(jìn) 行溫育。這樣對(duì)含有聚胸苷酸的ODN-MGB軛合物，使用聚腺苷酸或聚脫氧腺苷酸與之結(jié)合。 熔化溫度的變化(△ Tm)是復(fù)合物的熔化溫度相對(duì)于在ODN的相應(yīng)末端帶有連接基L1或L2 但不含小溝結(jié)合基的相應(yīng)的ODN的熔化溫度的差值。從表3可以發(fā)現(xiàn)，這些ODN-MGB復(fù)合 物再次顯示出帶有互補(bǔ)的均聚脫氧核苷酸的復(fù)合物有顯著的穩(wěn)定性。而且在這些實(shí)驗(yàn)中， 當(dāng)小溝結(jié)合基具有3個(gè)CDPI單位時(shí)，形成的復(fù)合物最穩(wěn)定。令人^C異的是甚至當(dāng)ODN-MGB 和能與之互補(bǔ)結(jié)合的均聚核苷酸保溫時(shí)，也發(fā)生復(fù)合物的穩(wěn)定作用。這種吃驚是因?yàn)楝F(xiàn)有 技術(shù)普遍認(rèn)為游離小溝結(jié)合分子并不與DNA-RNA雜交體結(jié)合之故。
Ll = -O(CH2)6NH- L2 =-OCH2CH (OH) CH2NHC0CH2CH2NH_表4公開的是兩個(gè)互補(bǔ)的八聚體衍生物(CpApTpCpCpGpCpT和ApGpCpGpGpApTpG) 之間形成雙鏈螺旋體的研究結(jié)果。每個(gè)八聚體均被修飾(如該表所示)以檢驗(yàn)相應(yīng)的寡聚 脫氧核苷酸和有硫代磷酸酯骨架的寡聚脫氧核苷酸的雜交。該ODN仍然帶有基于1，2_ 二 氫-3H-吡咯[3，2-e]吲哚-7-羧酸(⑶PI)殘基的三肽(小溝結(jié)合基X)，該X通過結(jié)構(gòu)為 L1或L2的連接基與ODN的3'-或5'-端(如圖所示)相連，(X、Lp L2的結(jié)構(gòu)同表3中 的)。為了對(duì)照，還測(cè)定了其中的ODN僅與連接基結(jié)合的雙鏈螺旋體的熔化溫度，從表中可 以發(fā)現(xiàn)，小溝結(jié)合基的存在使雙鏈螺旋體明顯得以穩(wěn)定，而且如每條鏈均共價(jià)連有小溝結(jié) 合基時(shí)，則雙鏈螺旋體更穩(wěn)定。表 5帶有3'-寡聚吡咯并吲哚甲酰胺的寡肽殘基的異源雙鏈螺旋體的Tm。
L1 = -O(CH2)5NH- L2 =-OCH2CH (OH) CH2NHC0CH2CH2NH_表5公開的是互補(bǔ)或大體互補(bǔ)的ODN進(jìn)行溫育并檢驗(yàn)雙鏈螺旋體形成時(shí)所獲得的 熔化溫度。小溝結(jié)合基X和連接基L1和L2均示于該表中，而且它們均與表3、表4中的相 同。象預(yù)料的那樣，如果沒有小溝結(jié)合基存在的話，當(dāng)ODN鏈中的鳥嘌呤(G)被次黃嘌呤 ⑴取代時(shí)，雙鏈螺旋體的結(jié)合很弱(Tm約為0°C )。然而，當(dāng)用I取代寡核苷酸中的G時(shí)， 一個(gè)共價(jià)連接的小溝結(jié)合基X的存在則使雜交體的穩(wěn)定性(Tm)增加至約50°C，而以相互平 行方向存在的兩個(gè)小溝結(jié)合基，則使穩(wěn)定性(Tm)增加至約63°C。而對(duì)含有鳥嘌呤的相同的 鏈而言，一個(gè)小溝結(jié)合基使Tm增加15°C，兩個(gè)則增加近45°C。就本案發(fā)明人所知，八聚核 苷酸的熔化溫度達(dá)到81°C是現(xiàn)有技術(shù)中從未有過的。引物延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
ODN-MGB軛合物中的ODN部分與靶序列按Watson-Crick規(guī)則結(jié)合的序列特異性可 通過引物延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在T7DNA聚合酶的作用下，引物從模板的5'-端 開始延長(zhǎng)。將與模板鏈的靶序列按Watson-Crick互補(bǔ)的16聚核苷酸-小溝結(jié)合劑軛合物、 T7DNA聚合酶和長(zhǎng)的單鏈DNA模板一起溫度。當(dāng)小溝結(jié)合基與上述16聚ODN的5 ‘-端相 連時(shí)，則會(huì)發(fā)現(xiàn)引物延長(zhǎng)終止于ODN-MGB與模板的結(jié)合部位，所述的小溝結(jié)合劑為吡咯并 吲哚的三肽，如表5所示。但當(dāng)16聚核苷酸與靶序列有一個(gè)錯(cuò)配堿基時(shí)，引物延長(zhǎng)則不受 阻礙。當(dāng)小溝結(jié)合基與16聚ODN的3'-端相連時(shí)，也不影響引物延長(zhǎng)。此外，在序列特 異的16聚核苷酸、游離小溝結(jié)合劑(化合物3d，未與ODN共價(jià)結(jié)合)與酶和模板一起溫育 時(shí)，引物延長(zhǎng)也不受影響。這些實(shí)驗(yàn)表明=ODN-MGB的序列特異性對(duì)于形成穩(wěn)定的雜交體是 重要的，小溝結(jié)合基也不單單只作為所述ODN與另一鏈非特異性結(jié)合的穩(wěn)定劑(anchor)。 ODN-MGB軛合物抑制引物延長(zhǎng)的能力表明該ODN-MGB軛合物可作為PCR終止劑而用于診斷 (見核酸研究(Nucleic Acid Research), 1993,21 :5332_5336)。狹縫印跡雜交試驗(yàn)本發(fā)明的ODN-MGB軛合物可作為雜交探針。這可用下面的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)中使用 32P標(biāo)記的ODN-MGB軛合物作診斷探針。與沒有小溝結(jié)合基與之共價(jià)結(jié)合的同一 ODN比較， 該軛合物與互補(bǔ)鏈雜交的強(qiáng)度大，效率高，特異性高。狹縫印跡雜交試驗(yàn)是一個(gè)廣泛應(yīng)用的 DNA探針診斷試驗(yàn)。ODN-MGB軛合物的這些性質(zhì)改善了該分析的性能。具體地講，本文所述的實(shí)驗(yàn)其實(shí)驗(yàn)操作方法遵循標(biāo)準(zhǔn)的操作方法，如按Protoc als for Nucleic Acid Blotting and hybridization(1988，Amersham，United Kingdom) 所述的方法進(jìn)行。對(duì)與固定化質(zhì)粒雜交的被標(biāo)記的受試寡核苷酸(ODN)以每分鐘計(jì)數(shù)進(jìn)行 定量，對(duì)雜交溫度繪圖。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了四個(gè)與M13mp 19DNA(噬菌體DNA)互補(bǔ)的16聚寡核苷 酸探針。其中的兩個(gè)探針與噬菌體DNA某部位完全互補(bǔ)；一個(gè)含有3'共價(jià)結(jié)合的00 13而 另一個(gè)未被修飾。第二對(duì)探針也與M13mpl9DNA的同一部位配對(duì)，但各有一個(gè)錯(cuò)誤配對(duì)的堿 基(圖1中下劃線堿基)。同樣，一個(gè)ODN含有3'端結(jié)合的⑶PI3,而另一個(gè)未被修飾。狹縫雜交研究的結(jié)果如圖1所示。與未修飾但序列相同的16聚核苷酸比較，含 ⑶PI3的探針形成的雜交體熔化溫度為50°c，不含⑶PI3的則僅為33°C。這個(gè)較高的熔化 溫度使完全配對(duì)的雜交體的產(chǎn)率增加1倍多。當(dāng)探針中有錯(cuò)誤配對(duì)的堿基時(shí)，則相應(yīng)雜交 體的穩(wěn)定性降低。CDPI3修飾的探針在37-50°C之間表現(xiàn)出高的序列分辨能力。而且，在這 些雜交條件下沒有證據(jù)表明⑶PI3與靶M13mp 19DNA的預(yù)先已存在的雙鏈區(qū)結(jié)合，這意味 著這些軛合物完全的非持異性結(jié)合是不存在的。培養(yǎng)的人細(xì)胞中基因的序列特異性烷基化作用本發(fā)明的ODN-MGB軛合物(該軛合物上還共價(jià)連有烷化劑)可作為“反義基因” 試劑，也就是如果ODN-MGB軛合物與靶基因內(nèi)的靶序列互補(bǔ)，就可抑制非所需基因(致病基 因)的表達(dá)。在這種情況下，MGB可提高ODN與雙鏈DNA (gene)的結(jié)合力(在重組酶存在 下)，而烷化基則使ODN-MGB軛合物與靶序列形成持久共價(jià)結(jié)合。在驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)中，上面提到的五十聚核苷酸(經(jīng)氮芥基(苯丁酸氮芥)修飾且3' 端與CDPI3結(jié)合)序列特異性地與靶基因內(nèi)的預(yù)期部位交聯(lián)，這個(gè)靶基因(HLA DQ β 0302 等位基因)存在于活的人BSM細(xì)胞(一種人B-淋巴細(xì)胞系)中。把ODN-MGB軛合物加到 BSM細(xì)胞懸浮液中，該軛合物最終濃度為1-50 μ Μ。3. 5小時(shí)后，提取基因組DNA用熱四氫吡
30咯處理，以使任何烷基化部位產(chǎn)生缺口。在0302等位基因靶區(qū)域的下游通過LM-PCR (聚合 酶介導(dǎo)的連接鏈反應(yīng))擴(kuò)增，LM-PCR這項(xiàng)技術(shù)是可用來檢測(cè)斷裂事件、分辨率達(dá)一個(gè)堿基 的技術(shù)。產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序凝膠電泳分析表明修飾的ODN已經(jīng)與靶部位結(jié)合并烷化在一起。而 無⑶PI3的類似ODN對(duì)靶DNA的烷化效率很小。 在上面的實(shí)驗(yàn)中，ODN-MGB軛合物對(duì)同源雙鏈DNA的識(shí)別和結(jié)合可能是在核 重組酶的參與下進(jìn)行的。在類似實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用中，在其它活細(xì)胞中，內(nèi)源性重組酶能催化 ODN-⑶PI3軛合物與雙鏈基因組DNA間的序列特異性的靶向結(jié)合。當(dāng)這些ODN有與之相連 的交聯(lián)劑時(shí)，它們能烷化靶DNA。在重組酶作用下，通過穩(wěn)定所形成的D-環(huán)，CDPI3促進(jìn)交 聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)是靶基因表達(dá)的強(qiáng)抑制劑。因此，交聯(lián)的ODN-CDPIj^合物可用作反義基因 試齊LU 具體的實(shí)施方案與實(shí)驗(yàn)部分材料與方法對(duì)空氣及水敏感的反應(yīng)均在氬氣的微正壓下進(jìn)行。無水溶劑購自Aldrich公司 (Milwaukee, WI)0閃式柱層析使用硅膠(230-400目)。熔點(diǎn)未經(jīng)校正并采用Mel-Temp熔 點(diǎn)儀測(cè)定。元素分析由定量技術(shù)公司(Boundbrook，NJ)完成。在200-400nm范圍內(nèi)的紫 外-可見光吸收光譜用UV-2100 (Shimadzu)或Lambda2 (Perkin Elmer)分光光度計(jì)記錄。 核磁共振氫譜(1H NMR)用Bruker WP-200型光譜儀或Varian XL-200型分光光度計(jì)在20°C 下測(cè)定；化學(xué)位移在PPm低磁場(chǎng)下，以四甲基硅為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。3-氨基甲酰-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸2，3，5，6_四氟苯 酯(la)。將3-氨基甲酰-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸(1. 4g，6. lmmol， D. L. Boger, R. S. Coleman, B. J. Invergo, J. Org. Chem.，1987,52 :1521—1530)和三乙胺 (1.4ml,10mmol)溶解在15ml無水DMF中。向該溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯 酉旨(2. 6g, IOmmol, H. B. Gamper，Μ. W. Reed, Τ. Cox, J. S. Virosco, A. D. Adams, A. A. Gall, J. K. Scholler 和 R. B. Meyer，Jr.，Nucleic Acids Res.，1993，21 (1) :145_150)。加畢，1 小時(shí)后，減壓(0.2mm真空)濃縮反應(yīng)混合物。殘留物用無水二氯甲烷2ml研制，加入50ml 乙醚，混合物在0°C放置過夜，用多孔玻璃漏斗過濾收集沉淀，沉淀用50%乙醚/ 二氯甲烷 (IOml)，乙醚(50ml)依次洗滌，真空干燥，得黃色固體1. 8g(75% )；1H NMR (Me2S0_4，200MHz，ppm) 12. 32 (s, 1H, NH), 8. 13 (d, 1H, J = 9Hz, C4-H)， 8. 01(m，lH，C6F4H)，7. 41(s，lH，C8-H)，7. 26 (d，1H，J = 9Hz, C5-H)，6. 17(s，2H，CONH2), 3. 99 (t, 2H, J = 9Hz, NCH2CH2)，3. 30 (t, 2H, J = 9Hz, NCH2CH2). C18H11N3O3F4X 2H20 的理論值
C,50. 3 ；H, 3. 52 ；N, 9. 7.實(shí)測(cè)值C，50. 81 ；H, 3. 60 ；N, 9. 95.3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸2，3，5，6_四氟苯 酯(Ib)。將3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚_7_羧酸(1.0g，3. 7mmol,
D.L. Boger, R. S. Coleman 和 B. J. Invergo, J. Org. Chem.，1987,52 1521-1530)和三乙胺 (1.5ml,10mmol)溶解在IOml無水二氯甲烷中。向該溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯 酯(2. 6g，IOmrnol)。反應(yīng)4小時(shí)，然后減壓蒸除CH2Cl2,殘留物經(jīng)閃式柱層析(4X20cm，正 己烷-乙酸乙酯1 2)得黃色晶體(lb)1.25g(75% ):1H 匪R(Me2S0_4，200MHz，ppm) 12. 39 (d, 1H, J=L 4Hz, NH), 8. 02 (m, 1H, C6F4H)， 7. 9 (br s, 1H, C4-H)，7· 45 (d, 1H, J=L 4Hz, C8-H)，7· 33 (d, 1H, J = 9Hz, C5-H)，4· 02 (t,2H, J = 9Hz, NCH2CH2)，3. 26 (t, 2H, J = 9Hz, NCH2CH2)，1. 51 (s，9H，C (CH3) 3). C22H18N2O4F4 的理 論值:C, 58. 67 ；H, 4. 03 ；N, 6. 22. Found :C，58. 45 ；H, 4. 09 ；N, 6. 13.3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸二聚體甲酯(2a)。
I,2-二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯(0. 6g，1. 5mmol)、化合物 Ia (0. 45g，2. 25mmol)和 三乙胺(0. 2ml，1.4mm0l)溶解在IOml DMF中。使該溶液于室溫反應(yīng)24小時(shí)，然后在0°C反 應(yīng)12小時(shí)。過濾收集所得的不溶固體，并用DMF(IOml)、乙醚(20ml)洗滌，真空干燥得淺 黃色固體 2a(0. 61g，91% ) (1H NMR(Me2S0_4，200MHz，ppm) 12. 00 (d，1H，J = 1.8Hz，NH')，
II.54(s，lH，NH)，8. 28(d，lH，J = 9Hz, C4' -H)，7. 97 (d，1H，J = 9Hz，C4-H)，7. 33 (d，1H，J =9z, C5' -H)，7. 22 (d, 1H, J = 9z, C5-H)，7. 13 (d, 1H, J=L 4Hz, C8' -H )，6. 94 (d, 1H, J=L IHz, C8-H)，6.01(s，2H，CONH2)，4. 62 (t，2H，J = 8Hz, (NH2CH2) ' )，3.98(t，2H，J = 8Hz, NCH2CH2)，3. 88 (s,3H, CH3)，3. 41 (t，2H，J = 8Hz, (NCH2CH2) ' )，3. 29 (t，2H, NCH2CH2,因 水使之部分變模糊)· C24H21N5O5X IH2OX IDMF 的理論值=C, 58. 69 ；H, 5. 84 ；N, 15. 21.Found :C，58. 93 ；H, 5. 76 ；N, 15. 82.3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸二聚體甲酯(2c)。 將1，2- 二氫-3H-吡咯吲哚-7-羧酸甲酯(0. 5g，2. 5mmol)、化合物Ib (1. Og, 2. 2mmol)和三 乙胺溶解在無水二甲基甲酰胺(DMF)中。使該溶液在室溫反應(yīng)10小時(shí)，在0°C反應(yīng)12小 時(shí)。過濾收集所得的不溶固體，用DMF(5ml)、乙醚(40ml)洗滌之。真空干燥得灰白色的固 體 2c 0. 81g(74% )。1H 匪R(Me2S0_4，200MHz，ppm)12.01(s，lH，NH' ), 11. 64 (s, 1Η, NH) ,8. 28 (d, 1Η, J = 9Hz，C4' -H), 7. 8 (br s, 1Η, C4-H), 7. 32 (apparentt, 2Η, C5' -H+C5-H)，7· 13 (d，1Η， J=L 1Hz, C8 ' -H)，6. 98(d，1H，J = 1. 1Hz，C8-H)，4. 62(t，2H，J = 8Hz，(NH2CH2)')， 4. 02 (t，2H，J = 8Hz，NCH2CH2)，3. 88 (s，3H，CH3)，3. 41 (t，2H，J = 8Hz，(NCH2CH2) ' )，3. 25 (t， 2H，NCH2CH2)，1. 52(s，9H，C (CH3)). C28H28N4O5 的理論值:C，67. 19 ；H, 5. 64 ；N, 11. 19.實(shí)測(cè)值 66. 72，H, 5. 69 ；N, 11. 31.3-氨甲?；?1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸二聚體2，3，5，6_四氟 苯酯(2e)。將化合物 2b (1. 2g，2. 8mmol,D. L. Boge_r，R. S. Coleman 禾口 B. J. Invergo, J. Org. Chem. ,1987,52 :1521_1530)加入15ml無水二甲基甲酰胺(DMF)中，得懸濁液。滴加三氟乙 酸四氟苯酯(2. 0g，IOmrnol)至該懸濁液中，接著加入三乙胺(1. 4ml，IOmrnol)，對(duì)反應(yīng)混合 物攪拌3小時(shí)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓)(0. 2mm真空)濃縮反應(yīng)混合物。所得的殘留物用20ml 無水二氯甲烷研制。所得的產(chǎn)物經(jīng)過濾，依次用二氯甲烷(10ml)、乙醚(20ml)洗滌。真空 干燥得黃色固體 2e 1. 5g(93% ) (1HNMR(Me2SO-^6, 200MHz, ppm) 12. 51 (d，1H，J= 1. 8Hz, NH ' )，11. 58 (s，1H, NH)，8. 39 (d, 1H, J = 8. 9Hz, C4 ' -H)，8. 04 (m, 1H, C6F4H)，7. 98 (d, 1H, J = 8. 8Hz, C4-H)，7. 58 (s, 1H, C8' )，7. 42 (d, 1H, J = 9Hz, C5' -H)，7. 22 (d, 1H, J = 9Hz，C5-H)，6. 98 (s，1H，C8-H)，6. 11 (s，2H，CONH2)，4. 66 (t，2H，J = 7. 8Hz，(NCH2CH2)‘)， 3. 94 (t，2H，J = 9. IHz，NCH2CH2)，3. 47 (t，2H，J = 8Hz，(NCH2CH2) ‘ )，3. 29 (t，2H，J = 9. IHz， NCH2CH2) ·C29H19N5O4F4Xl. 5H20 的理論值C，57. 62 ；H, 3. 67 ；N, 11. 59.實(shí)測(cè)值=C, 57. 18 ；H, 3. 31 ；N, 11. 54.3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸二聚體2，3，5，6-四氟苯酯(2f)。將化合物 2d(0. 25g，0. 5mmol,D. C. Boger,R. S. Coleman 和 B. J. Invergo, J. Org. Chem. , 1987, 52 1521-1530)和三乙胺(0. 5ml, 3. 5mmol)加入 8ml 無水二氯甲燒和 2ml 二甲基甲酰胺的混合物中，得懸浮液。向該懸浮液中滴加三氟乙酸2，3，5，6_四氟苯酯 (0. 75g，2. 9mmol)。對(duì)混合物攪拌20小時(shí)，所得透明溶液在真空中濃縮，并將殘余物滴加 至40ml IM乙酸鈉(pH 7.5)中。對(duì)沉淀物離心，并依次用水(2X40ml)、10%甲醇/乙醚 2X40ml)、乙醚(40ml)、正己烷(40ml)洗滌。最后真空干燥得淺黃色固體2f0. 2g(91 % )。 (1H 匪R (Me2SO-^6, 200MHz，ppm) 12. 51 (s，1H，NH ‘ )，11. 66 (s，1H，NH)，8. 37 (d，1H，J = 8. 8Hz,C4' -H)，8. 03 (m, 1H, C6F4H), 7. 8 (brs, 1Η，C4-H)，7. 58 (s, 1H,C8' -H)，7. 40 (d, 1H, J =9. IHz, C5' -H)，7. 27 (d, 1H, J = 8. 6Hz, C5-H)，7. l(s, 1H, C8-H)，4. 65(t，2H，J = 8Hz, (NCH2CH2) ' )，4. 02 (t，2H，J = 9Hz，NCH2CH2)，3. 46 (t，2H，J = 8Hz，(NCH2CH2) ' )，3. 25 (t， 2H, J = 8. 9Hz, NCH2CH2)，1. 51 (s，9H，C (CH3) 3) · C33H26N4O5F4X 0. 5H20 的理論值:C，61. 59 ；H, 4. 23 ；Ν，8· 71.實(shí)測(cè)值:C,61. 73 ；Η，4· 12 ；Ν，8· 61.3-氨基甲?；?1，2_ 二氫-3Η-吡咯并[3，2_e ]吲哚_7_羧酸三聚體甲酯(3a)。 將1，2- 二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯(1. 0g, 5mmol)、化合物2e (1. 2g，2. lmmol)和三 乙胺(0. lml,mmol)溶于15ml無水DMF中。使該溶液于室溫反應(yīng)24小時(shí)，在0°C反應(yīng)12小 時(shí)。過濾收集所得的不溶固體，并依次用DMF(10ml)、CH2Cl2 (20ml)和乙醚(20ml)洗滌之。 真空干燥得淺黃色固體3al. lg(83% )。(1H WR(Me2S0_4，200MHz，ppm) 12. 02(s，1H，NH〃)，11. 75 (s，1H，NH' ), 11. 56(s, 1H，NH)，8. 28(apparent t，2H，J = 8. 3Hz，C4_H〃 +C4' -H)，7. 98(d，1H，J = 9. 4Hz，C4-H)，
7.98 (d, 1H, J = 9Hz，C4-H)，7. 39-7. 33 (2d, 2H, C5 “ -H+C5' -H)，7. 23 (d, 1H, J = 8. 7Hz， C5-H), 7. 14 (d, 1H, J = 1. 6Hz，C8 “ -H)，7. 10 (d，1H，J = IHz, C8 ' -H)，6. 97 (s，1H， C8-H)，6. 11 (s，2H，CONH2)，4. 65 (t，4H，(NCH2CH2) “ + (NCH2CH2) ‘ )，3. 98 (t，2H，J = 8. 7Hz， NCH2CH2)，3. 88 (s, 3H, CH3)，3. 48-3. 25 (m, 6H, (NCH2CH2) “ + (NCH2CH2) ‘ +NCH2CH2,因水使之 部分變模糊).C35H29N7O5 X 4. 5H20的理論值C，59. 32 ；H, 5. 0 ；N, 13. 03.實(shí)測(cè)值C，58. 9 ；N, 5. 06 ；N, 13. 77.3-氨基甲?；?1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸三聚體2，3，5，6_四 氟苯酯(3c)。化合物3b(l. lg，1.8mmol)在15ml無水MDF和三乙胺(1. 4ml, IOmmol)中形 成懸浮液。向該懸浮液中滴加三氟乙酸2，3，5，6_四氟苯酯(2. 6g，IOmrnol)。對(duì)所得的混 合物攪拌3小時(shí)?；旌衔餃p壓(0.2mm真空)濃縮。用無水二氯甲烷(20ml)和甲醇(2ml) 的混合物研制所得的殘留物。過濾收集所得的產(chǎn)物，用CH2Cl2 (20ml)、乙醚(20ml)洗滌之。 真空干燥得黃綠色固體3c 1.3g(95% )0(1HwR(Me2So-^6JooMHzjpm)U-SMdaHJ=IHzJH" ), 11. 79(s, ΙΗ,ΝΗ')， 11.56(s，lH，ΝΗ)，8. 41(d，lH，J = 9. 3Hz，C4—H “ )，8. 27(d，lH，J = 9. 4Hz，C4 ‘ -H)，
8.03 (m, 1H, C6F4H)，7. 98 (d, 1H, J = 9Hz, C4-H)，7. 56 (s, 1H, C8 “ -H)，7. 45-7. 35 (m, 2H, C5〃 -H+C5 ‘ -H) ,7. 23 (d, 1H, J = 9. 2Hz, C5-H), 7. 13 (s, 1H, C8' -H)，6. 97 (s，1H，C8-H)， 6· 11 (s，2H，CONH2)，4.65 (m，4H，(NCH2CH2) “ + (NCH2CH2) ‘ )，3. 98 (t，2H，J = 8. 7Hz， NCH2CH2)，3. 45 (m, 4H, (NCH2CH2) “ + (NCH2CH2) ‘ )，3. 25 (t，2H，J = 8. 7Hz, NCH2CH2). C40H27N7O5F4X 2H20 的理論值:C,61. 59 ；H, 4. 23 ；N, 8. 71.實(shí)測(cè)值=C, 61. 73 ；H, 4. 12 ；N, 8. 61.[3-氨基甲?；?1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羰基]酰氨基_3_丙醇三聚體(3d)。對(duì)3-氨基-1-丙醇(70μ l，L4mmol)、化合物3c(75mg，0. Immol)和三乙 胺(0. lml, mmol)溶于2. 5ml無水DMF所得的溶液在室溫?cái)嚢?0小時(shí)。所得的不溶固體 過濾取集，并依次用DMF(2ml) CH2Cl2 (IOml)和乙醚(20ml)洗滌。真空干燥得淺黃色固體 3d(55mg,89% )。(1H WR(Me2S0_d6，200MHz，ppm) 11. 76(s，1H，NH “ )，11. 65 (s，1H，NH ‘)， 11. 57(s，1H，NH)，8. 47(m，1H，C4-H)，8. 24(m，1H，C4-H)，7. 99(d，1H，J = 8. 4Hz，C4_H)， 7. 40-7. 32(2d，2H，C5 “ -H+C5 ' -H)，7. 23 (d，1H，J = 8. 9Hz，C5-H)，7. 12 (s，1H， C8 “ -H)，7. 10 (s，1H, C8 ' -H)，6. 99 (s, 1H, C8-H)，6. 12 (s, 3H, C0NH2+NHC0)，4. 66 (t,4H, (NCH2CH2) “ + (NCH2CH2) ‘ )，3· 98 (t，2H，J = 8. 7Hz, NCH2CH2)，3. 51-3. 25 (m, 10H, (NCH2CH 2) “ + (NCH2CH2) ‘ +NCH2CH2+NHCH2+CH2OH,因水使之部分變模糊)，1. 70 (p，2H, J = 6. 6Hz, CH2CH2CH2).3- [N- (9-芴基甲氧羰基)]氨基丙酸2，3，5，6-四氟苯酯(4)。Fmoc-丙氨酸(2. Og,
6.4mmol)和三乙胺(1. 0ml,7mmol)用20ml無水CH2Cl2溶解。向所得溶液中滴加三氟乙酸 2，3，5，6-四氟苯酯(1.7g，6. 5mmol)。1小時(shí)后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去CH2Cl2，殘余物用30ml 乙酸乙酯/正己烷(1 1)重新溶解。用閃式柱層析(4X20cm，正乙烷/乙酸乙酯，3 1) 得到白色固體狀的粗品4。該粗品用己烷/乙酸乙酯重結(jié)晶，得白色晶體4(2. 3g，78%)。1H NMR(CDCl3, 200MHz，ppm) 7. 73 (d，2H，J = 7. 1Hz,芳香質(zhì)子)，7.75(d，2H， J = 7. 7Hz,芳香質(zhì)子)，7. 24-7. 42(m，4H，芳香質(zhì)子)，7. 01 (m，1H，C6F4H), 5. 21 (br s， 1Η, -C0NH-)，4. 38 (d, 2H, J = 7. IHz，-CH2OCO-)，4. 20 (m, 1H,芐基質(zhì)子),3. 58 (m, 2H, NCH2)，
2.93 (t, 2H, J = 5. 4Hz, -CH2CO-) ·C24H17NO4F4 的理論值:C，62. 75 ；H, 3. 73 ；N, 3. 05.實(shí)測(cè)值:C,62.52 ；H, 3. 59 ；N, 3. 01.1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S] _2，3_丙二醇(5)。 3_氨基-1，2-丙二醇(0.6g)用IOml甲醇溶解，攪拌該溶液。向該攪拌過的溶液中加入化 合物4 (2. Og, 4. 35mmol)溶于無水CH2Cl2 (20ml)所得的溶液。10分鐘后，加入乙酸(3ml)，蒸 發(fā)濃縮至干。殘余物用IOOml水研制，過濾收集所得的固體，并用水洗滌。在減壓下與甲苯 共蒸發(fā)除水。然后用50ml乙酸乙酯洗滌，接著真空干燥過夜，得白色晶體5(1. 65g，99%)。 1H NMR (CDCl3+MeOD_M，200MHz，ppm, Me4Si) 7. 77(d，2H，J = 7. 7Hz, aromatic protons),
7.61 (d, 2H, J = 7. 3Hz,芳香質(zhì)子 protons), 7. 45-7. 29 (m, 4H, aromatic protons), 4. 35 (d, 2H, J = 7. IHz，-CH2OCO-)，4. 22 (m, 1H,芐基質(zhì)子)，3· 72 (m, 1H, -CH-來自 NHCH2CH0HCH20H)，
3.52-3. 27 (m, 6H, OCONHCH^C^CHOHC^OH)，2. 44 (t, 2H, J = 6. 6Hz,-CH2CO-) ；C21H24N2O5 的理 論值:C,5. 61 ；H, 6. 29 ；N, 7. 29% ·實(shí)測(cè)值C，65. 43 ；H, 6. 28 ；N, 7. 21.l-[3-[N_(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]_2_[[二(甲氧 基苯基)苯基甲氧基]甲基-2-乙醇(6)。將化合物5(1.6g，4. 2mmol)溶于30ml無水吡啶 中，攪拌所得的溶液。向上述攪拌過的溶液中加入4，4' -二甲氨基三苯基甲基氯(DMTrCl) (1. 6g，4. 7mmol)。在氬氣保護(hù)下攪拌3小時(shí)后，將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，剩余的吡啶與甲苯 共沸除去。殘余物用100ml CH2Cl2溶解，并用水(2X 100ml)洗滌，以Na2SO4干燥，蒸發(fā)至 干。以乙酸乙酯作洗脫劑，用閃式柱層析(4X20cm)純化所得的殘余物得無色泡沫6(1. 9g， 66% )。
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1H NMR (CDCl3, 200MHz，ppm, Me4Si) 7. 72 (d，2H，J = 7. 2Hz，芳香質(zhì)子)，7. 56 (d, 2H, J = 7Hz, aromatic protons)，7. 40-7. 20 (m, 13H,芳香質(zhì)子 protons)，6. 80 (d, 4H, J = 9Hz，DMTr 質(zhì)子)，5. 76(brs, ΙΗ,ΝΗ) ,5. 42 (br s, 1Η，ΝΗ)，4· 35(d，2H，J = 6. 6Hz，-CH2OCO-)， 4. 17 (m, 1H,芐基質(zhì)子)，3. 83 (m, 1H, -CH-from NHCH2CH0HCH20H)，3. 75 (s,6H, OCH3)， 3. 60-3. 30 (m, 4H, 0C0NHC迅+C迅CH0HCH20H)，3. 13 (d, 2H, J = 5. 4Hz, CH2ODMTr)，2. 30 (t, 2H, J = 5. 4Hz，-CH2CO-) ；C42H42N2O7 的理論值=C, 73. 45 ；H, 6. 16 ；N, 4. 08.實(shí)測(cè)值=C, 65. 43 ；H,
6.28 ；N, 7. 21.l-[3-[N_(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]_2_[[二(甲氧 基苯基)苯基甲氧基]甲基]-2-乙基丁二酸2，3，5，6_四氟苯酯(7)。將化合物6(1. 2g， 1. 75mmol)、三乙胺(0. 2g，2mmol)、l-甲基咪唑(20 μ 1)溶于IOml無水CH2Cl2中，向該溶液 中加入琥珀酸酐(0.2g，2mmol)。攪拌該溶液20小時(shí)。向該溶液中加入三乙胺(60 μ 1)，接 著加入三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(0.6g，2.2mmol)。1小時(shí)后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下除 去CH2Cl2,然后殘留物用15ml乙酸乙酯/己烷(1 2)溶解。閃式柱層析((4X 20cm)，正 己烷/乙酸乙酯(2 1)作洗脫劑))純化，得淺黃色泡沫lb(1.2g，73%)。1H NMR(⑶Cl3， 300MHz, ppm, Me4Si) 7. 71(d，2H，J = 7. 2Hz，芳香質(zhì)子)，7· 54(d，2H，J = 7Hz，芳香質(zhì)子)，
7.40-7. 20 (m, 13H,芳香質(zhì)子)，7. 00 (m, 1H, C6F4H)，6. 78 (d, 4H, J = 7Hz, DMTr 質(zhì)子),5. 71 (br s, 1H, NH)，5. 42 (br s, 1H, NH)，5. 15 (m, 1H, -CH-來自 NHCH2CH0HCH20H)，4. 31 (d, 2H, J = 6. 2Hz, -CH2OCO-)，4. 16 (d, 5. 5Hz, 1H,節(jié)基質(zhì)子)，3. 74(s，6H，OCH3)，3. 60-3. 30(m，4H， 0C0NHCH2+CH2CH0HCH20H)，3. 20 (br s, 2H, CH2ODMTr)，2. 98 (br s, 2H, COCH2CH2CO)，2. 72 (br s, 2H, COCH2CH2CO)，2. 20 (br s, 2H, -CH2CO-) ；C42H42N2O7 的理論值C，66. 80 ；H, 4. 96 ；N, 3. 00. 實(shí)測(cè)值:C, 66. 18 ；H, 4. 98 ；N, 2. 86.CPG衍生物⑶的制備。將5. Og長(zhǎng)鏈氨基烷基-CPG (LCAA-CPG)、0. 5ml 1-甲基咪 唑和溶于20ml無水吡啶的0. 45g(0. 5mmol)化合物7的混合物在100ml燒瓶中渦旋，3小時(shí) 后，所述的CPG用多孔玻璃漏斗過濾，并依次用DMF、丙酮和乙醚各100ml洗滌。所述的CPG 真空干燥，再用20ml吡啶、2ml乙酸酐和2ml的1-甲基咪唑的混合物處理。渦旋30分鐘 后，依次用吡啶、甲醇、乙醚洗滌所述的CPG，然后真空干燥之。根據(jù)文獻(xiàn)方法(T.Atkinson 禾口 M. Smith, in Μ· Gait(ed. ), Oligo-nucleotide Synt-hesis, A Practical Approach, IRLPress, 1984，Oxford, UK, pp. 35-81)，發(fā)現(xiàn)其載容量為 28 μ mol/g。 CPG衍生物(9)的制備。3. Og CPG衍生物(8)用溶于無水DMF中的20 %哌啶溶液 (20ml)處理兩次，每次5分鐘。該CPG依次用二甲基甲酰胺、甲醇和乙醚各100ml洗滌，然 后真空干燥之。CPG衍生物(10)的制備。將2. 5g的化合物9、7. 5ml三乙胺和溶于7. 5ml無水 DMSO中的0. 38g (0. 5mmol)化合物3c的混合物在50ml燒瓶(軌道混合器，150漏斗rpm)中 渦旋。2天后，CPG用多孔玻璃漏斗過濾，并用DMS0、丙酮和乙醚各100ml洗滌，真空干燥所 得的CPG，再用IOml吡啶、Iml乙酸酐和Iml 1-甲基咪唑的混合物處理。渦旋30分鐘后， CPG衍生物用DMS0、吡啶、甲醇和乙醚洗滌，然后真空干燥。5-[(叔丁氧基)甲酰氨基]戊基羧酸2-[4_(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(11)。 6_[(叔丁氧基)甲酰氨基]己酸(4. 16g、18mmol)通過與無水DMF共蒸發(fā)(70°C )而干燥 之。殘留物用無水DMF (25ml)重新溶解，在0°C下加入2-[4-(苯偶氮基)-·芐基硫]-乙醇(4. 08g，15mmol)、N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺(3. 71g，18mmol)、4_ 二 甲氨基吡啶(1. 83g， 15mmol)。在0°C攪拌2小時(shí)、20°C攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)混合物通過與乙酸丁酯共沸蒸餾 至干。再加入乙酸乙酯(150ml)。所得溶液依次用0.7M HCl (1 X 30ml)、5 % NaHCO3和 H2O(2X 50ml)萃取。有機(jī)層以Na2SO4干燥，并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。用20ml乙醚洗滌過濾 得化合物 ll(6.91g，89% )。1H NMR (CDCl3, 200MHz, ppm) :7. 91 (m，4H)，7. 52 (m，5H)，4. 48 (t，2H)，4. 34 (s，2H)，
3.20 (t, 2H)，3. 08 (m, 2H)，2. 35 (t, 2H)，1. 64-1. 2 (m, 7H)，1. 41 (s,9H).1-甲基-4_(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯。將 N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺(1. Ig, 5. 3mmol)加入1-甲基_4_[(叔丁氧基)甲酰氨基]吡 咯-2-羧酸(1. 2g，5. 2mmol)和1-羥基苯并三唑(0. 63g，4. 7mmol)的混合物中。攪拌1小 時(shí)后，該混合物用多孔玻璃漏斗過濾，分離析出的N，N' - 二環(huán)己基碳二亞胺。將濾液蒸發(fā) 至干，將殘留物再溶解在氯仿-戊烷(1 1)的混合物中。將所得溶液上樣到硅膠柱上，合 并含純產(chǎn)物的級(jí)分，并將之蒸發(fā)至干，得1. 45g為白色固體的目的產(chǎn)物，產(chǎn)率為80%。mp = 138-138. S0C51H WR(CDC13，200MHz)8. 04 (d, 1H)，7. 49-7. 40 (m, 4H), 7. 09 (d, 1H), 3. 87(s，3H)，1. 50(s,9H).5-[l-甲基-4_(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4_(苯偶 氮基)芐基硫]乙酯(12)。在0°C下將三氟乙酸(5ml)加入化合物11(0. 73g，1.5mm0l) 中。于0°C攪拌20分鐘后，使反應(yīng)混合物與氯仿共蒸發(fā)至干，。將殘留物溶解在無水二氯甲 烷(15ml)中，然后加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三 唑-1-酯(0. 59g, 1. 65mmol)和無水三乙胺(0. 23g，2. 3mmol)。于室溫?cái)嚢?5分鐘后，加入 IOOml氯仿。反應(yīng)混合物用5% NaHCO3(2X20ml)、H2O(2X20ml)萃取。有機(jī)相以Na2SO4干 燥，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。經(jīng)硅膠柱層析(用01(13作洗脫劑)得12(0.88g，91.8%)。1H 匪R(CDCl3, 200MHz，ppm) 7. 88 (m, 4H), 7. 46 (m，5H)，6. 74 (s，1H)，6· 38 (s, 1H)，6· 26 (s, 1H)，
5.87 (t, 1H)，4. 18 (t, 2H, J = 6Hz)，3. 82 (s, 3H)，3. 79 (s, 2H)，3. 3 (m, 2H)，2. 63 (t, 2H, J = 6Hz)，2. 30 (t, 2H, J = 6Hz)，1. 64-1. 2 (m, 6H)，1. 46 (s,9H) ·5-[l-甲基-4_[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯_2_甲酰氨基]吡咯_2_甲 酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(13)?；衔?2(2.43g，4mmol)用 CH2Cl2(Sml)溶解，使該溶液于0°C下，用三氟乙酸(4ml)處理。將所得溶液于室溫在燒瓶中 放置1小時(shí)，然后使之在30ml 30%的K2COyK溶液和30ml CH2Cl2之間分配。收集下層。水 相用CH2Cl2 (2 X 20ml)萃取，合并有機(jī)層。用水(lX20ml)洗滌后，以Na2SO4干燥，并濃縮。 殘留物溶解在CH2Cl2 (IOml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯_2_羧酸1，2， 3-苯并三唑-1-酯(1.43g,4mmol)和無水三乙胺(0. 8g，Smmol)。室溫?cái)嚢?0分鐘后，加入 IOOml氯仿。該反應(yīng)混合物用5% NaHCO3(2X20ml)、H2O(2X20ml)萃取。有機(jī)層以Na2SO4 干燥，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。硅膠(IOOg)柱層析(以CHCldt洗脫劑)后得13(1.95g， 66. 8% )。1H 匪R(CDCl3, 200MHz，ppm) :7· 87 (m，4H)，7. 46 (m，5H)，7. 04 (d，1H，J = 1. 5Hz)，
6.77 (br s, 1H) ,6. 52 (br s，1H)，6. 50 (d，1H，J = 1. 5Hz), 6. 31 (br s，1H)，5. 95 (t，1H)，
4.19 (t, 2H, J = 6Hz)，3. 85 (s,6H)，3. 78 (s, 2H)，3. 32 (m, 2H)，2. 64 (t, 2H, J = 6Hz)，2. 31 (t， 2H, J = 6Hz)，1. 64-1. 2 (m, 6H)，1. 48 (s,9H) ·
5-[1-甲基-4-[l-甲基-4_[1-甲基_4_(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯_2_甲酰氨基] 吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(14)?；衔?13 (1. 90g, 2. 6mmol)溶于無水CH2Cl2 (6ml)所得的溶液在0°C下用3ml三氟乙酸處理。將所 得的溶液在燒瓶中于室溫放置1小時(shí)，然后使之在30% K2CO3 (30ml)和CH2Cl2 (30ml)之間分 配。收集下層，水相用二氯甲烷(2X20ml)萃取，合并有機(jī)層并用水(lX20ml)洗滌。然后以 Na2SO4干燥，并蒸發(fā)干燥。將殘留物溶在CH2Cl2 (2. 5ml)中，加入1_甲基_4_ (叔丁氧基)甲 酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(1. 4g，3. 9mmol)、無水三乙胺(0. 8g，8mmol)。 室溫?cái)嚢?小時(shí)后，加入CHCl3 100ml。反應(yīng)混合物用5% NaHCO3(2X20ml)、H2O(2X20ml) 萃取。有機(jī)層以Na2SO4干燥，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。用硅膠(IOOg)柱層析(以0 1. 5% 甲醇的氯仿溶液作洗脫劑)得 14(1. 56g，70. 5% )0 1H NMR (CDCl3, 200MHz, ppm) :7· 87 (m， 4Η)，7. 68 (br s，1H)，7. 60 (br s，1H)，7. 46 (m, 5H)，7. 08 (br s，2H)，6. 78 (br s，1H)，6. 56 (d, 1H, J = 1. 5Hz) ,6. 60 (br s, 1H) ,6. 55 (d, 1H, J = 1. 5Hz)，6· 03 (t，1H)，4· 18 (t，2H，J = 6Ηζ)，3. 86 (m, 9Η)，3. 78 (s, 2H)，3. 32 (m, 2H)，2. 63 (t, 2H, J = 6Hz)，2. 30 (t, 2H, J = 6Hz)，
1.64-1. 2(m，6H)，1. 48(s,9H).2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙基-5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲 基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基] 吡咯-2-甲酰氨基]戊酸酯(15)?；衔?4(0. 32g，0. 32mmol)溶于5ml無水CH2Cl2所得 的溶液于0°C用2. 5ml三氟乙酸處理。將所得的溶液在燒瓶中于室溫放置1小時(shí)，然后使 之在30% K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之間分配。收集下層，水相用二氯甲烷(2X20ml) 萃取，合并有機(jī)層并用水(lX20ml)洗滌。然后以Na2SO4干燥，并蒸發(fā)干燥。將殘留物溶 在CH2Cl2(Iml)中，加入1-甲基_4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯_2_羧酸1，2，3-苯并三 唑-1-酯(0. llg，0. 32mmol)、無水三乙胺(0. 06g，0. 03mmol)。室溫?cái)嚢?. 5小時(shí)后，加入 CHCl3 IOOml0 反應(yīng)混合物用 5% NaHCO3(2X 20ml)、H20(2X 20ml)萃取。有機(jī)層以 Na2SO4 干 燥，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。用硅膠(IOOg)柱層析(以0 1. 5%甲醇的氯仿溶液作洗脫 劑)得0. 25g化合物15(80% )01H NMR(CDCl3, 200MHz, ppm) 8. 17 (br s, 1H), 7. 98 (br s, ), 7. 96 (br s，)，IH 7. 85 (m, 4H)，7. 44 (m, 5H)，7. 09 (brs,2H)，7. 02 (s, 1H)，6. 78 (br s，1H)，6. 74 (br s，1H)， 6. 66 (s，1H)，6. 58 (s, 3H)，6. 29 (t, 1H)，4. 18 (t, 2H, J = 6Hz)，3. 78 (m, 14H)，3. 28 (m, 2H)，
2.60 (t, 2H, J = 6Hz)，2. 26 (t, 2H, J = 6Hz)，1. 64-1. 2 (m, 6H)，1. 48 (s,9H) ·5-[l-甲基-4_[1-甲基-4_[1-甲基-4_[1_ 甲基-4_[1_ 甲基 _4_(叔丁氧基) 甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨 基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(16)。化合物15(0. 65g， 0. 67mmol)溶于無水CH2Cl2(IOml)所得的溶液在0°C下用5ml三氟乙酸處理。將所得的黃 色溶液在燒瓶中于室溫放置1小時(shí)，然后使之在30% K2CO3(30ml)和CH2Cl2 (30ml)之間分 配。收集下層，水相用二氯甲烷(2X20ml)萃取，合并有機(jī)層并用水(lX20ml)洗滌。然后 以Na2SO4干燥，并蒸發(fā)干燥。將殘留物溶在CH2Cl2(Iml)中，加入1_甲基_4_ (叔丁氧基) 甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3_苯并三唑-1-酯(0. 24g，0.67mmol)、無水三乙胺(0. 13g, 0.67mmol)。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，反應(yīng)混合物與乙酸丁酯共蒸發(fā)至干。將殘余物溶解在3m 12. 5% DMF的CHCl3溶液中。用硅膠(IOOg)柱層析(以0 2. 5%甲醇的氯仿溶液作洗
37脫劑)得0. 67g化合物16 (45% )04' _[二(2-氯乙基)氨基]苯基丁酸-2，3，5，6-四氟苯酯(苯丁酸氮芥2，3，5， 6_四氟苯酯)。向苯丁酸氮芥0.25g(0.82mmol) (Fluka A. G.提供)、三氟乙酸2，3，5，6-四 氟苯酯0. 3g(l. lmmol)溶于5ml無水CH2Cl2所得的溶液中加入0. 2ml無水三乙胺。在氬 氣氛下，于室溫對(duì)反應(yīng)混合物攪拌0. 5小時(shí)，并蒸發(fā)之。殘留的油用硅膠柱層析，洗脫劑為 正己烷/氯仿(2 1)，得油狀的酯0.28g(75%)。硅膠薄層層析(CHCl3),保留值(Rf)為 0. 6 ；IR(CHCl3)為 3010U780U613U521U485cm_1o苯丁酸氮芥基與寡核苷酸的伯氨基的連接寡核苷酸十六烷基三甲基銨鹽的制備將100μ 1寡核苷酸(50-500μ g)水溶液 (通常為三乙胺鹽)注射到Dowex 50wx8(十六烷基三甲銨型)柱表面(柱由50%乙醇水 溶液預(yù)洗)，用50%乙醇水溶液洗脫(0. lml/min)該柱。含有寡核苷酸的級(jí)分用speedvac 干燥2小時(shí)，并直接用于下列反應(yīng)。將寡核苷酸十六烷基三甲銨鹽(50-100 μ g)的乙醇溶液(50 μ 1)與0. 08Μ 4' _[二(2-氯乙基)氨基]苯丁酸2，3，5，6_四氟苯酯的乙腈溶液(50μ1)和3 μ 1 二異 丙基乙胺混合。室溫振搖3小時(shí)后，產(chǎn)物用2% LiClO4的丙酮溶液(1. 5ml)沉淀。產(chǎn)物用 2% LiClO4的丙酮溶液從水中再沉淀3次。最后寡核苷酸苯丁酸氮芥衍生物用反相層析純 化，產(chǎn)率為約50-80%。含產(chǎn)物的級(jí)分用丁醇濃縮。使分離得到的寡核苷酸苯丁酸氮芥衍生 物在LiClO4的丙酮溶液中沉淀。用丙酮洗滌，在油泵產(chǎn)生的真空下干燥。所有涉及活潑寡 核苷酸的操作要盡可能地快地進(jìn)行，自收集層析組分后，將產(chǎn)物置于水浴溶液中。寡核苷酸的合成所有寡核苷酸均用1 μ mol適當(dāng)?shù)腃PG載體，在ABB394合成儀上制備，實(shí)驗(yàn)操 作按儀器制造商提供的實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。-氰乙基氨基亞磷酸酯偶合化學(xué)法的標(biāo)準(zhǔn)試劑從 Glen Research購買。5'-氨基己基修飾通過N-MMT-己醇胺亞磷酰胺接頭(購自Glen Research)引入。3'-氨基己基修飾則用CPG載體引入，方法見以前的描述。(C.R.Petrie， Reed, A. D. Adams, R. B. Meyer, Jr. ；Bioconjugate Chemistry,1992,3,85-87)。軛合物的制備(反應(yīng)路線3)向氨基己基修飾的寡苷酸十六烷基三甲基銨鹽(30-50nmol，Jost, J. -P.， Jiricny, J.,禾口 Saluz,H. Quantitative Precipitation ofShort Oligonucleotides with IOw Concentrations ofCetyltrimethyl ammonium bromide. Nucleic Acids Res. 1989, 17 2143)和1. 5 μ 1 N，N- 二異丙基乙胺溶于40 μ 1無水DMSO的溶液中，加入4mM TFP酯 (la，lb，2e，2f或3c)溶液(40 μ 1)。反應(yīng)混合物在室溫保溫12小時(shí)。通過加入2% LiClO4 丙酮溶液(1.5ml)將寡核苷酸相關(guān)物質(zhì)沉淀出來。沉淀用丙酮洗滌，真空干燥。沉淀重溶 在50% DMF的水溶液(60 μ 1)中，并按上述操作用2%的LiClO4丙酮溶液再沉淀。重復(fù)該 操作兩次。在50mM LiClO4存在下，采用20-75%的乙腈溶液梯度，用HPLC (4. 6 X 250mm， C-18，Dynamax-300A, Rainin)純化所得的殘留物。含有純產(chǎn)物的級(jí)分用speedvac真空干 燥。將殘留物再溶于60-80 μ 1 H2O中，再用2% LiClO4丙酮溶液(1.5ml)沉淀。用丙酮洗 滌(2X1. 5ml)后，真空干燥，將產(chǎn)物溶于IOOyl H2O中，終產(chǎn)物的產(chǎn)率為20-50%。用 Godovikova 等的改進(jìn)方法(Τ. S. Godovikova, V. F. Za-rytova, Τ. V. Maltzeva, L. Μ. Khalimskaya, Bioorgan. Khim.，1989，15 1246-1259)合成帶有 4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的寡核苷酸軛合物。使含3'-磷酸酯的寡核苷酸十六烷基三甲基銨鹽 (50-100nmol)、三苯膦(IOmg) ,2,2' -二吡啶基二硫醚(IOmg)、N，N-二甲氨基吡啶(IOmg) 和一種選自化合物11-16的化合物溶于100 μ 1無水DMF中，所得溶液在室溫反應(yīng)20分鐘。 寡核苷酸類物質(zhì)通過加入2% LiClO4丙酮溶液而沉淀出來。沉淀用丙酮洗滌，真空干燥。在 50mM LiClO4存在下，采用20-75%乙腈溶液梯度，用HPLC純化所得的殘留物。含純產(chǎn)物的 級(jí)分用speedvac真空干燥。將殘留物再溶于60-80 μ 1 H2O中，并用2% LiClO4丙酮溶液 (1.5ml)沉淀。用丙酮(2X1. 5ml)洗滌后，真空干燥。最后，將殘留物溶于100 μ 1 H2O中， 最終產(chǎn)率為30-50%。軛合物的制備(反應(yīng)路線4)含5'-氨基己基的CPG-寡核苷酸衍生物自Ιμπιο 規(guī)模合成實(shí)驗(yàn)得到。用2% 二 氯乙酸的二氯甲烷溶液處理之，以從氨基上脫除保護(hù)基9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，然后用 乙腈洗滌，用氬氣流干燥。將CPG-寡核苷酸轉(zhuǎn)入1.5ml塑料試管中，再加入50mM四氟苯酯 的無水DMSO溶液(100 μ 1)。振蕩試管24小時(shí)，然后用DMSO (3 X 1.5ml)、丙酮(2X1. 5ml) 洗滌，再真空干燥。采用標(biāo)準(zhǔn)的條件，CPG載體-寡核苷酸用濃氨水處理以使寡核苷酸去保 護(hù)。所得的反應(yīng)混合物采用上文所述的反相HPLC分離，一般產(chǎn)率為約50%。熱變性研究帶有4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的寡核苷酸復(fù)合物的光學(xué)熔化曲線是 在 200nM NaClUOnM Na2HPO4、0. IMM EDTA(pH 7.0)溶液中，用 Milichrom 液相色譜的紫 外檢測(cè)器檢測(cè)，在專為此目的而設(shè)計(jì)的熱控槽中測(cè)得的。采集數(shù)據(jù)并按S. G. Lokhov等人 的文獻(xiàn)方法用計(jì)算機(jī)處理(S. G. Lokhov, M. A. Podyminogin, D. S. Sergeev, V. N. Silnikov, I. V. Kutyavin, G. V. Shishkin, V. F. Zarytova,Bioconjugate Chem. 1992,3 414)。帶有1，2_ 二氫-3H-吡咯并[3，2_e]吲哚_7_羧酸(CDPI)殘基的寡核苷酸復(fù)合 物在 140mM KClUOmM MgCl2、20mMHEPES_HCl (pH 7. 2)溶液中熔化，用帶有 PTP-6 自動(dòng)多池 溫度控制程序的Lambda2 (Perkin Elmer)分光光度計(jì)測(cè)定得到熔化溫度。復(fù)合物的熔化溫 度(Tm)由得到的最大值確定。引物延長(zhǎng)反應(yīng)引物延長(zhǎng)反應(yīng)按Lee等描述的方法進(jìn)行(Biochemistry，1994，33 :6024_6030)，模 板、引物和被保護(hù)的寡核苷酸的最后濃度分別為5X IO-uiMdX 10、和10_9M。在45°C引物 延長(zhǎng)15分鐘，參考Lee等的文獻(xiàn)，產(chǎn)物用凝膠電泳分析。如無任何被保護(hù)的寡核苷酸存在，引物延長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)生出高分子量的產(chǎn)物，該產(chǎn)物 在測(cè)序膠上顯示為不可分辨的帶。對(duì)應(yīng)于暫停位點(diǎn)或自發(fā)終止事件的弱帶在所有反應(yīng)混合 物中均可反復(fù)觀察到。與靶完全互補(bǔ)的未修飾的十六聚和三十二聚核苷酸不阻止引物延 長(zhǎng)。3'端連有CDPI3、與靶序列互補(bǔ)的八聚和十六聚核苷酸同樣也無抑制活性。只有與靶 序列完全互補(bǔ)且5'端連有⑶PI3的十六聚核苷酸可抑制引物在T7DNA聚合酶作用下的延 長(zhǎng)。相應(yīng)的5'端連有CDPI3的八聚核苷酸僅產(chǎn)生痕量的抑制產(chǎn)物。對(duì)照寡核苷酸證實(shí) 引物延長(zhǎng)的抑制需要互補(bǔ)的寡核苷酸和與之共價(jià)連接的MGB。有一個(gè)錯(cuò)誤配對(duì)堿基且5' 端連有CDPI3的兩個(gè)十六聚核苷酸與完全互補(bǔ)的ODN-MGB軛合物比較，其抑制活性要低得 多。同時(shí)加入未修飾的十六聚核苷酸與等摩爾量的游離的CDPI3，不影響引物延長(zhǎng)，這突出 表明MGB與ODN共價(jià)結(jié)合對(duì)其抑制引物延長(zhǎng)具有重要意義。當(dāng)與靶序列完全互補(bǔ)的十六聚寡核苷酸5'連有吖啶基而不是MGB時(shí)，則觀察到抑制活性喪失。細(xì)胞培養(yǎng)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)ODN-MGB軛合物與DQ β 1等位基因模板鏈的第815-864位核苷酸互補(bǔ)(Proc. Natl. Acad. Sci，USA (1983)，80 :7313_7317)，這里使用的人BSM B細(xì)胞對(duì)該等位基因是純 合的并能組成性地表達(dá)它。在加ODN之前，BSM細(xì)胞在25ml燒瓶中培養(yǎng)至密度為4. 5 X IO6 細(xì)胞/ml培養(yǎng)基。對(duì)于每次處理，將2ml培養(yǎng)液中的細(xì)胞離心后重新懸浮在無血清的培養(yǎng) 基中，所述培養(yǎng)基含有與苯丁酸氮芥連接的五十聚核苷酸(濃度為0、1、10或50 μ M)(同樣 濃度的兩份血清中，一份ODN的3'端與⑶PI3相連，另一份則不與⑶PI3相連)。每個(gè)試樣 在37°C與5% CO2中，用48-孔微滴定板培養(yǎng)3. 5小時(shí)。然后把細(xì)胞轉(zhuǎn)至0. 5ml Eppendorf 離心管中，以2000rpm離心5分鐘，用500 μ 1磷酸鹽(PBS)緩沖液洗二次，于37°C用蛋白 酶K/SDS脫蛋白一晚上。苯酚/氯抽提和RnaseA消化后，DNA在90°C用IM四氫吡咯處理 30分鐘。四氫吡咯通過乙醇沉淀除去，LM-PCR按Lee等的方法進(jìn)行(Biochemistry，1994， 33 =6024-6030)。擴(kuò)增的DNA用測(cè)序膠分析，以觀察序列特異性的任何缺裂，所述缺裂可能 是由含苯丁酸氮芥的ODN對(duì)靶DNA的烷化產(chǎn)生的。結(jié)果表明靶中核苷酸斷裂發(fā)生在ODN的 交聯(lián)基附近；此外，含CDPI3的五十聚核苷酸在序列特異性地烷化0302等位基因方面較無 MGB的同一 ODN強(qiáng)10倍。由下列各組分制備完全培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基不含HI-FCS) :500ml含L-谷氨酸 (2mM)的 RPMI 1640 (Gibco BRLCat. No. 11875-036)50ml HI-FCS (Gibco BRL Cat. No. 26140，55°C 熱滅活 30 分鐘)50ml 100X 青霉素 / 鏈霉素(Gibco BRL Cat. No. 15070-022)5ml 200mM L-谷氨酸(Gibco BRL Cat. No 25030-024)5ml 100X 丙酮酸鈉(llmg/ml ；從 Gibco BRL Cat. No. 11840-030 制得)5ml IM HEPES, ρΗ 7.3 (Gibco BRL Cat No. 15630-023)序列表(1)總的資料(i) ^itA :Microprobe Corporation, BothellffA 98021(ii)發(fā)明的題目共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸和小溝結(jié)合劑的軛合物(iii)序列數(shù)目2(iv)通信地址(A)收信人Klin & Szekeres(B)街道4199 Campus Drive, Suite 700(C)城市歐文(D)州加利福尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼92715(ν)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)工具類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-D0S/MS-D0S
40
(D)軟件=Patent In Releas e#l. 0，#1. 25 版(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)柮绹?guó) 08/415，370(B)遞交日期1995年4月3日(C)特征(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)資料(A)姓名:Szekeres, Fabor L.(B)登記號(hào)28，675(C)檔案號(hào)49l-09_pa8(ix)電訊資料(A)電話714-854-5502(B)電傳714-854-5502(2) SEQ ID NO 1 的資料⑴序列特征(A)長(zhǎng)度50個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(xi)序列描述:SEQ ID NO 1GGTTATTTTT GAAGATACGA ATTTCUCCAG AGACACAGCA GGATTTGTCA 50(2) SEQ ID NO 2 的資料⑴序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述:SEQ ID NO 2TTTTTTTTTTTTTTTT
權(quán)利要求
一種具有如下通式的化合物其中R是CONH2或t 丁基氧 羰基，并且R1是2，3，5，6 四氟苯氧基。F2009101732576C00011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R是CONH2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R是t-丁基氧-羰基。
4.一種具有如下通式的化合物其中 R是CONH2或t- 丁基氧-羰基，并且R1是2，3，5，6-四氟苯氧基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R是CONH2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中R是t-丁基氧-羰基。
7.一種具有如下通式的化合物 其中隊(duì)是2，3，5，6_四氟苯氧基。
8. 一種具有如下通式的化合物 其中CPG表示一種固相支持物，以及Tr表示三苯甲基或取代的三苯甲基。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的化合物，其中Tr表示三甲氧基三苯甲基。
10.一種具有如下通式的化合物 其中η是1-5之間的整數(shù)；R1是H，t- 丁基氧羰基或者tBoc-NH (CH2)6CO,其中tBoc表示t_ 丁基氧羰基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中η=1。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中η=5。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中R1是t-丁基氧-羰基。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中R1是H0
15.根據(jù)權(quán)利要求10的化合物，其中R1是 t-B。c-NH (CH2) 6C0-。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中R1是H0
17.根據(jù)權(quán)利要求12的化合物，其中R1是 tB。c-NH (CH2)6CO0
全文摘要
小溝結(jié)合劑與寡核苷酸通過共價(jià)鍵結(jié)合，寡核苷酸的堿基序列與單鏈或雙鏈DNA、RNA或雜合體的靶序列互補(bǔ)。共價(jià)結(jié)合的寡核苷酸-小溝結(jié)合劑共軛物能增強(qiáng)與互補(bǔ)鏈靶序列的結(jié)合力。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101914099SQ20091017325
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期1996年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月3日
發(fā)明者伊戈?duì)枴·庫佳溫, 小里奇·B·邁耶, 歐亨尼·A·盧克坦諾夫, 霍華德·B·岡佩爾 申請(qǐng)人:埃利泰克控股有限公司