專利名稱：：一種簡單高效價廉的森林土壤樣品dna純化方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境微生物
技術領域：
，具體涉及到一種簡單高效價廉的森林土壤樣品總DNA純化方法。
背景技術：
：微生物在森林土壤中起著重要的作用，但使用現(xiàn)有的技術僅能培養(yǎng)少量的微生物種群。生物學中使用的分子生物學技術為我們提供了研究微生物群落的新方法，然而從微生物群落樣品中獲取的DNA的純度對后續(xù)分子操作過程卻是至關重要的。許多研究報道了進行土壤微生物群落DNA的提取方法，如基于SDS的提取方法、基于玻璃珠擊打的提取法、基于微波的提取方法，但這些方法所獲取的DNA純度不高，含有大量雜質(zhì)(如腐殖酸、富里酸)，這些雜質(zhì)會抑制酶的活性。因此，對于森林土壤，特別是對于腐殖酸含量豐富的土壤，DNA純化步驟是必需的且非常重要的。一些可能有效的純化方法采用如下處理1、在預處理試劑或者試劑盒的試劑中再添加一些化學物質(zhì)，或者增加一步凝膠電泳進行純化；2、先用PEG進行DNA過夜沉淀，再過Sepharose4B-polyvinyl-polypyrrolidone(PVPP)柱進行純化；3、連續(xù)過兩種不同的純化柱(PVPP柱與瓊脂糖凝膠柱)純化，在兩種純化柱之間需要進行再次沉淀。這些純化方法可能適合一些土壤DNA的純化，然而這些方法要么比較復雜耗時，要么成本較高。通過大量的研究，我們發(fā)明了一種簡單高效價廉的土壤DNA純化方法。該方法由兩步純化法組成。第一步純化方法可以去除大部分雜質(zhì)，同時又常常增加樣品DNA的得率。通過初步純化后的DNA，再經(jīng)過另一常規(guī)、簡單的純化方法-硅膠柱來去除殘留的少量雜質(zhì)。整個純化過程操作容易，可以在一個小時內(nèi)完成，并且成本很低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的問題是獲得一種可以用于各種土壤類型的簡單高效價廉的土壤微生物粗品總DNA的純化方法。本發(fā)明提供一種從森林土壤中純化微生物DNA的方法，步驟包括(l)采用常規(guī)方法處理土壤的微生物，獲得微生物的粗品DNA;(2)用提取緩沖液溶解粗品DNA，使用移液器抽打幾次后置于65'C水浴10分鐘，再加入等體積氯仿-戊異醇溶液抽提，離心分層。上清液在室溫下加入0.6倍體積的異丙醇，靜置幾分鐘后離心，將DNA從液相中沉淀析出，棄上清液，沉淀用預冷的70%乙醇洗滌，用100pLTE緩沖液溶解DNA沉淀；(3)將初步純化的DNA用硅膠柱進一步純化。經(jīng)初步純化獲得的DNA中加入3倍體積純化緩沖液混合，幾分鐘后，過柱，使用洗液洗滌兩次后，用100pLTE緩沖液洗脫即獲得純的DNA;其中，所述的提取緩沖液包含100mMTris-HCl、100mMsodiumEDTA[pH8.0]、100mM磷酸鈉[pH8.0]、1.5MNaCl、1%CTAB;所述的純化緩沖液主要成份是10%異硫氰酸胍，優(yōu)選QIAquickGelExtractionKit的純化緩沖液。應當指出，本發(fā)明在于根據(jù)從土壤中提取的粗品DNA，提供進一步純化DNA的方法。因此，提取粗品DNA的方法，可以采用常規(guī)的技術。在一個具體實施方案中，步驟(l)所述的提取DNA粗品的常規(guī)方法采用稍作修正的CTAB-SDS方法(Zhouetal.，1996.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,62:316~322)，包括..(1)將土壤樣品與2-3倍重量的DNA提取緩沖液和100蛋白酶K(10mg/mL)在離心管中混合、振蕩均勻；(2)加入1/10體積的20%的SDS，然后于65。C中水浴1-3小時，期間輕柔倒置均勻，而后離心；(3)吸取上清，并加入與等體積的氯仿-戊異醇(24:1(v/v))，混合抽提，離心分離上清液；(4)每份樣品在室溫下加入0.6倍體積的異丙醇混勻，靜置10分鐘，離心；(5)將沉淀使用預冷的70%乙醇或酒精洗滌，得到核酸粗品。其中，步驟(4)中為了比較每一步的純化結(jié)果可將上清液分成幾個等份，每個等份3mL;步驟(5)中將各樣品核酸沉淀溶解于100nLTE(Tris-HCl+EDTA)緩沖液中，其它幾份未用TE溶解的粗品核酸用于后續(xù)純化比較。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明所采用的土壤樣品取自亞熱帶常綠闊葉林竹林表層土壤，優(yōu)選中國杭州臨安竹林0-10cm的表層土壤。本發(fā)明能夠去除提取的土壤微生物DNA粗品中的絕大部分雜質(zhì)，得到高純度的DNA，可以直接用于對抑制物非常敏感的常規(guī)PCR;本發(fā)明操作簡單，成本低，耗時少;適用范圍廣，可以用于其它已有土壤直接提取方法之后，純化各種類型的土壤DNA。圖1是來自五個樣品提取DNA的凝膠電泳結(jié)果，其中l(wèi)、2、3、4、5分別代表樣品1、2、3、4、5，M表示X-HindIIIdigestDNAMarker。A表示初始的粗品DNA;B表示步驟2純化的DNA。具體實施方式具體實施實例如下實施例h樣品取樣本研究所使用的五個土壤樣品均取自中國杭州臨安竹林0-10cm的表層土壤，其中包括三個雜質(zhì)含量高的樣品(樣2、4、5)與二個雜質(zhì)含量低的樣品(樣1、3)，所有樣品均取三個重復。實施例2:初始DNA粗品的提取步驟(l):DNA粗品采用稍作修正的CTAB-SDS方法(Zhouetal.,1996.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,62:316-322)提取5g土壤樣品與13.5mLDNA提取緩沖液(100mMTris-HCl,100mMsodiumEDTA[pH8.0]，100mM磷酸鈉[pH8.0],1.5MNaCl，1%CTAB)和100蛋白酶K(10mg/mL)在離心管中混合，然后在37。C下以225轉(zhuǎn)/分鐘的速度水平振蕩30分鐘。振蕩完畢，加入1.5mL20。/。的SDS，然后置于65'C的恒溫水浴鍋中2個小時，期間每15到20分鐘輕輕地顛倒離心管，之后將樣品在室溫下6000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。取上清液轉(zhuǎn)移到另一個新離心管中，加入與上清液等體積的氯仿-戊異醇(24:1(v/v))混合抽提，離心分離上清液。為了比較每一步的純化結(jié)果將上清液分成幾個等份，每個等份3mL。每份樣品在室溫下加入0.6倍體積的異丙醇混勻，靜置10分鐘，室溫16000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。棄上清液，沉淀使用預冷的70%酒精洗滌，得到核酸粗品。各樣品核酸沉淀溶解于100pLTE(Tris-HCl+EDTA)緩沖液中，其它幾份未用TE溶解的粗品核酸用于后續(xù)純化比較。實施例3:粗品DNA進一步提純步驟(2):用2mL提取緩沖液溶解粗品核酸沉淀，用移液管吸放幾次加速溶解，然后置于65'C水浴中IO分鐘，加入等體積的氯仿-戊異醇溶液(氯仿戊異醇=24:1)，16000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。取上清，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫靜置幾分鐘，然后在室溫下以16000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，棄上清液，用預冷的70%酒精或乙醇洗滌沉淀，干燥后得到DNA，用100pLTE緩沖液溶解。步驟(3):經(jīng)步驟(2)回收到的DNA用硅膠柱進一步純化。100的粗品DNA中加入3倍體積的QIAquickGelExtractionKit緩沖液，數(shù)分鐘后，轉(zhuǎn)移到回收柱，12000轉(zhuǎn)/分離心30s;加入500nL洗液12000轉(zhuǎn)/分離心30s;再次加入500(xL洗液12000轉(zhuǎn)/分離心30s;棄廢液，12000轉(zhuǎn)/分空離11^11.用100pLTE緩沖液回收DNA，獲得純品。實施例4:DNA產(chǎn)率與純度的估算回收DNA的純度通過測定其在340nm處吸光值和A26()/A28Q(KrsekandWellington,1999.JournalofMicrobiologicalMethods,39:1-16;Lakay，etal.,2007.JournalofAppliedMicrobiology,102:265-273)來評估。取1.5各步驟提取的DNA直接用全波長紫外/可見光掃描分光光度計NanoDropND-1000SpectrophotometerV3.5.2(NanoDropTechnologies,Inc.USA)進行測定。回收DNA的產(chǎn)率利用在照片中瓊脂糖凝膠帶提取物的熒光強度分析確定(使用凝膠定量軟件QuantityOnev4.4.0.36)。實施例5:聚合酶鏈式反應(PCR)聚合酶鏈式反應(PCR)被用于回收DNA的純度檢測(Zhouetal.,1996.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,62:316-322;Lakay，etal.,2007.JournalofAppliedMicrobiology,102:265-273)。以真菌ITS3和ITS4區(qū)段為引物，擴增片段長度為500bp。PCR反應體系2.510xPCR緩沖液，225mMMgCl2，dNTPslOmM0.5pL，引物10mM各0.5pL，2UTaq聚合酶(Sangon,China),模板DNA0.5pL，最后用無菌水定容至25^L。依據(jù)Casey禾口Dobson(CaseyandDobson,2004.InternationalJournalofFoodMicrobiology,91:327-335)設定擴增條件，6pL擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。實施例6:結(jié)果與分析1步驟(2)純化得到DNA的產(chǎn)率與純度步驟(2)純化得到的回收DNA的片段大小與粗品DNA的大小基本相同，約23Kb(圖1),通過相對熒光強度估計得到的相對產(chǎn)率見表l。其中，步驟(2)實驗5個樣品當中，除了樣3失掉了18%,其余4個樣品的回收DNA的產(chǎn)率明顯比最初的方法提取的DNA高，其中樣2的產(chǎn)率幾乎高出了50%。通過步驟(2)的提純后，樣品中82%~91%的腐殖酸被除去(表l)，尤其是樣2、樣4和樣5。波長340納米下的吸光值由22~26減小到2.7~4.6，顏色由深褐色持續(xù)變化到黃色。所有經(jīng)步驟(2)純化得到的DNA的A26q/A28o惶都比粗品DNA的高，尤其是樣品1(1.880)和樣品3(1.863)，這表明樣品1和樣品3的DNA中存在的腐殖酸已經(jīng)極少。表1.粗品DNA進一步純化步驟(2)之后DNA的產(chǎn)呈勺純度樣品腐殖酸(A34onm)%純度(A26。/A28())產(chǎn)量(呢g")產(chǎn)量粗品步驟(2)腐殖酸粗品步驟(2)粗品步驟(2)變化DNA純化后去除率DNA純化后DNA純化后(o/o)12.093±0.0510.244±0.06188..31.483±0.0151.880±0.0261.5951.864+16,9224.557±0.0642.664±0.01289..2—a1.647±0.0061.8572.734+47.20.743±0.3450.067±0.00891..01.573±0.0311.863±0.1021.9371,588-18.0422.645±0.1723.982±0.00882.4—1.603±0.0062.1482.387+11,1526.182±0.3174.562±0.19282..6一1.567±0.0061.4161.466+3.5雜質(zhì)含量高的粗品DNA測量值超過分光光度計的測定范圍72步驟(3)純化DNA的產(chǎn)率和純度與步驟(2)相比，所有經(jīng)過步驟(3)的樣的A34Q值明顯降低(表2)。三個雜質(zhì)含量高的樣品(樣品2、樣品4和樣品5)，大約有93%的腐殖質(zhì)被除去，但兩個低雜質(zhì)樣腐殖酸分別只除去83.6°/。和44.8%。當歩驟(2)及歩驟(3)先后純化后，二個雜質(zhì)含量商的樣品(樣品2、樣品4和樣品5)腐殖酸除去率達98.7%~99.3%,而另外兩個低雜質(zhì)樣品的腐殖酸除去率分別達到98.1°/。和95.0°/。。經(jīng)上述兩步共同純化后，所有DNA的A26l)/A280值在1.8到2.0之間。但硅膠柱提純過程中，約50。/。的DNA被損失掉，這與試劑盒的柱子的DNA結(jié)合能力有關。表2.粗品DNA經(jīng)歩驟(2)純化及歩驟(3)純化之后DNA的產(chǎn)量與純度腐殖酸(A糊nm)%腐殖%腐殖酸純度(A26o/A280)產(chǎn)量(嗎g-i)產(chǎn)量變化(o/cO樣品歩驟(2)純化步驟(3)純化酸的消除率a的消除率b歩驟(2)純化歩驟(3)純化頻(2)純化!P驟(3)純化10.244±0.0610.040±0.00983.698.11.880±0.0261.820士0.0461.8640.942-49.522.664±0.0120.180士0.00493.299.31.647士0.006l細士O.0102.7341.103-59.730.067±0.0080.037±0.01244.895.01.863士0.1021.857±0.1671.5880.783-50.743.982±0.0080.285±0.01792.898.71.603±0.0061.810±0.0202.387l扁-54.454.562±0.1920.284±0.01093.898.91.567±0.0061.870±0.0201.4660.687-53.1與DNA純化步驟(2)相比較所得到的腐殖酸去除率結(jié)果與初始粗品DNA純化相比較所得到的腐殖酸去除率結(jié)果3各步聚合酶鏈式反應擴增結(jié)果各步驟聚合酶鏈式反應擴增結(jié)果參見表3，它與A260/A280的結(jié)果是非常一致的。當用5個初始粗品DNA作為模板時，沒有DNA擴增。當5個粗品DNA單獨用步驟(2)提純后，其中兩個樣(樣1和樣3)能夠觀察到500bp的DNA片段。當經(jīng)過步驟(2+3)二聯(lián)合純化后，所有模板都能很好地擴增。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>'+':瓊脂糖凝膠中可觀察到一個500bp的擴增帶'-':瓊脂糖凝膠中觀察不到500bp的擴增帶權利要求1、一種從森林土壤中純化微生物DNA的方法，步驟包括(1)采用常規(guī)方法處理土壤的微生物，獲得微生物的粗品DNA；(2)用提取緩沖液溶解粗品DNA，使用移液器抽打幾次后置于65℃水浴10分鐘，再加入等體積氯仿-戊異醇溶液抽提，離心分層。上清液在室溫下加入0.6倍體積的異丙醇，靜置幾分鐘后離心，將DNA從液相中沉淀析出，棄上清液，沉淀用預冷的70％乙醇洗滌，用TE緩沖液溶解DNA沉淀；(3)將初步純化的DNA用硅膠柱進一步純化。經(jīng)初步純化獲得的DNA中加入3倍體積純化緩沖液(一般膠回收試劑盒中的融膠液即可，優(yōu)先選用QIAquickGelExtractionKit的融膠液)混合，幾分鐘后，過柱，使用洗液洗滌兩次后，用TE緩沖液洗脫即獲得純的DNA；其中，所述的提取緩沖液包含100mMTris-HCl、100mMsodiumEDTA[pH8.0]、100mM磷酸鈉[pH8.0]、1.5MNaCl、1％CTAB；所述的純化緩沖液主要成份是10％異硫氰酸胍。2、權利要求l的方法，其中土壤樣品取自亞熱帶常綠闊葉林竹林表層土壤。3、權利要求2的方法，其中土壤樣品取自中國杭州臨安竹林0-10cm的表層土壤。4、權利要求1一4中任一項的方法，其中步驟(l)所述的常規(guī)方法包括(1)將土壤樣品與2-3倍重量的DNA提取緩沖液和100蛋白酶K(10mg/mL)在離心管中混合、振蕩均勻；(2)加入1/10體積的20%的SDS，然后于65'C中水浴1-3小時，期間輕柔倒置均勻，而后離心；(3)吸取上清，并加入等體積的氯仿-戊異醇(24:1(v/v))，混合抽提，離心分離上清液；(4)每份樣品在室溫下加入0.6倍體積的異丙醇混勻，靜置10分鐘，離心。(5)將沉淀使用預冷的70%乙醇或酒精洗滌，得到核酸粗品。全文摘要本發(fā)明提供一種從森林土壤中純化微生物DNA的方法，步驟包括(1)采用常規(guī)方法獲得微生物的粗品DNA；(2)用提取緩沖液溶解粗品DNA，通過水浴、等體積氯仿-戊異醇溶液抽提后，將上清液加入0.6倍體積的異丙醇，析出DNA沉淀，并用預冷的70％乙醇洗滌，而后溶于TE緩沖液溶中；(3)將初步純化的DNA用硅膠柱進一步純化。該方法能夠去除提取的土壤微生物DNA粗品中的絕大部分雜質(zhì)，得到高純度的DNA，可以直接用于對抑制物非常敏感的常規(guī)PCR；本發(fā)明操作簡單，成本低，耗時少；適用范圍廣，可以用于其它已有土壤直接提取方法之后，純化各種類型的土壤DNA。文檔編號C12N15/10GK101629174SQ20091016307公開日2010年1月20日申請日期2009年8月24日優(yōu)先權日2009年8月24日發(fā)明者何興兵,林永慧,肖竹平,胡文勇,韓國民申請人:何興兵