專利名稱：：一種靶向c-myc癌基因的外指引序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及一種新的靶向外指引序列及其用途。
背景技術(shù)：
：外指引序列(ExternalGuidedSequence,以下均簡稱EGS)技術(shù)于80年代后期首先發(fā)現(xiàn)，其主要功能是體內(nèi)定向滅活功能基因，EGS為小分子RNA功能分子，因而應(yīng)該屬于廣義的RNA干擾技術(shù)(RNAi)。但與目前流行的RNAi技術(shù)不同的是，EGS采用更短的RNA分子(10mer)，即可特異作用于靶基因，從而導(dǎo)致靶基因定向滅活。目前針對EGS的國際專利己存在，但美國專利說明書US6，057,153、US6，783,981和US5，877，162等主要是針對單個(gè)EGS分子的設(shè)計(jì)。目前仍沒有實(shí)用的可用于高通量EGS的篩選的EGS文庫(簡稱LEGS),而這種文庫的產(chǎn)生將有益于針對特殊疾病如愛滋病、肝炎及癌癥等的基因新藥的開發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先是通過EGS文庫的構(gòu)建，得到了EGS文庫，然后通過此文庫進(jìn)行篩選，得到了一種新的靶向c-myc癌基因的外指引序列，通過一系列實(shí)驗(yàn)，證明此序列可以顯著地抑制c-myc癌基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，從而可以用于制備預(yù)防和/或治療c-myc癌基因高表達(dá)疾病藥物。圖1為EGS文庫設(shè)計(jì)圖，其中圖1-1:"3/4EGS"設(shè)計(jì)框架來源于大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的前體序列；圖l-2:外指引序列文庫，外指引序列識(shí)別結(jié)構(gòu)域由隨機(jī)堿基組成；為了避免"CCA"序列直接暴露給核酸酶，"UUU"序列連接在它的3'末端；圖1-3:外指引序列文庫與潛在的靶標(biāo)RNA形成的復(fù)合體，箭頭指示了核酸酶P的切割位點(diǎn)。3圖2為引物FLEGSp和RLEGSp示意圖；部分隨機(jī)化的寡聚核苷酸FLEGSp和RLEGSp由兩部分組成，一部分用于擴(kuò)增pET28a-D載體(除了不包含T7啟動(dòng)子和T7終止子之間的片段以外，可等同于pET28a載體)，另一部分用于擴(kuò)增外指引序列文庫表達(dá)框；圖3為EGS文庫構(gòu)建示意圖，其中圖3-l:pET28a-LEGS構(gòu)建的流程圖3-2:pET28a-LEGS的PCR產(chǎn)物鑒定圖，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；圖4為EGS文庫鑒定示意圖，其中圖4-1:pET28a-EGS克隆酶切鑒定模式圖，RV1泳道為含一個(gè)HincII酶切位點(diǎn)的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切示意圖，RV2泳道為含二或三個(gè)Hindi酶切位點(diǎn)的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切示意圖，V泳道為pET28a被HincII酶切后的酶切示意圖，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；圖4-2:pET28a-EGS克隆酶切鑒定圖，1到42號(hào)泳道均為含一個(gè)HincII酶切位點(diǎn)的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切圖譜，V泳道為pET28a被HincII酶切后的酶切圖譜，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；圖4-3:pET28a-EGS克隆酶切鑒定圖，1號(hào)泳道均為為含兩個(gè)或三個(gè)HincII酶切位點(diǎn)的pET28a-EGS克隆被Hindi酶切后的酶切圖譜，V泳道為pET28a被HincII酶切后的酶切圖譜，箭頭指示了大小為5-kb的DNA條帶；圖4-4:部分EGS表達(dá)框序列的多重比較結(jié)果。圖5為體外轉(zhuǎn)錄制備EGS示意圖，其中圖5-l:EGS制備流程圖5-2:EGS的體外轉(zhuǎn)錄模板鑒定圖5-3:轉(zhuǎn)錄制備的EGS產(chǎn)物；圖6為EGS文庫功能篩選意圖，其中圖6-h體外篩選功能性EGS示意圖6-2:功能性EGS體內(nèi)驗(yàn)證示意圖7為EGS-c-myc功能鑒定示意圖，其中圖7-1:為EGS-c-myc結(jié)構(gòu)示意圖7-2:為EGS-D-c-myc結(jié)構(gòu)示意圖(EGS-c-myc的陰性對照)，園形標(biāo)記標(biāo)示了堿基突變；圖7-3:為c-mycmRNA被RNaseP體外切割所產(chǎn)生的產(chǎn)物的示意圖，泳道M為RNAMarker，箭頭指示了大小為2-kb的RNA條帶，星號(hào)指示了大小為0.5-kb的RNA條帶，泳道1為c-mycmRNA被RNaseP體外切割所產(chǎn)生的產(chǎn)物；圖7-4為c-myc表達(dá)水平檢測結(jié)果，其中圖7-4-1為熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果，圖7-4-2:為Westernbiota檢測結(jié)果；圖7-5為細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果，其中圖7-5-1:為EGS-D-c-myc所導(dǎo)致的凋亡率；圖7-5-2:EGS-c-myc所導(dǎo)致的凋亡率。具體實(shí)施例方式1、EGS文庫的設(shè)計(jì)1.1選擇"3/4EGS"(圖1-1)作為EGS文庫的設(shè)計(jì)框架。"3/4EGS"的一級結(jié)構(gòu)(核酸序列)和二級結(jié)構(gòu)來源于大腸桿菌(&c/ehc/z/aco/z0的酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNATyf),其已被廣泛采用并被大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。L2"3/4EGS"的靶標(biāo)配對區(qū)域由隨機(jī)堿基組成，這就是EGS的理論文庫(圖1-2)。1.3在"3/4EGS"最3'端的"CCA"序列的末端添加"UUU"序列以避免"CCA"序列直接暴露于核酸酶(RNAase)(圖1-2)。因該文庫包含了靶向任何靶標(biāo)RNA的功能性EGS(圖1-3)，故該文庫也可被稱為EGS隨機(jī)文庫。2、EGS文庫的構(gòu)建策略通過替換T7終止子和T7啟動(dòng)子之間的區(qū)域，EGS文庫的表達(dá)框被克隆至pET28a載體而構(gòu)建pET28a-LEGS。pET28a-LEGS為含有EGS文庫表達(dá)框的重組載體，其中EGS文庫表達(dá)框的轉(zhuǎn)錄受T7終止子和T7啟動(dòng)子的控制。把pET28a-LEGS轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中以篩選pET28a-EGS-clone——含有某一特定EGS表達(dá)框的重組載體，其中EGS文庫表達(dá)框的轉(zhuǎn)錄受T7終止子和T7啟動(dòng)子的控制(圖3-1)。此策略基于PCR技術(shù)直接把EGS文庫表達(dá)框克隆至目標(biāo)載體，這可避免EGS文庫中某些表達(dá)框被遺漏。53、EGS文庫的構(gòu)建方法3.1利用VectorNTI軟件設(shè)計(jì)引物FLEGSpSEQIDNO:l和RLEGSpSEQIDNO:2(圖2)，第二個(gè)引物是RLEGSp。這對引物由兩部分組成，一部分用于擴(kuò)增pET28a-D載體(除了不包含T7啟動(dòng)子和T7終止子之間的片段以外，可等同于pET28a載體)，另一部分用于擴(kuò)增外指引序列文庫表達(dá)框。這可通過PCR技術(shù)直接把EGS文庫表達(dá)框克隆至目標(biāo)載體。3.2利用9700DNAsynthesizer(Appliedbiosystem)合成FLEGSp和FLEGSp，并對它們的5'端進(jìn)行磷酸化修飾。3.3利用PhusionTMHigh-FidelityPCRKit(NEB)按照以下反應(yīng)體系和反應(yīng)程序在9700Thermalcycler(Appliedbiosystem)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖3-2)。通過PCR擴(kuò)增把EGS的理論文庫的表達(dá)框克隆至pET28a載體(MERCK公司)而制備pET28a-LEGSL。圖3-2結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小與理論預(yù)測一致。反應(yīng)體系:組分各組分所占體積(按終濃度50^1反應(yīng)體系計(jì)算)高保真性DNA聚合酶10微升lx的反應(yīng)緩沖液(5x)10mM的dNTP混合物l微升200微摩/個(gè)引物A(IO微摩)2.5微升0.5微摩引物B(IO微摩)2.5微升0.5微摩擴(kuò)增模板(1納克/微升)0.5微升0.01納克/微升高保真性DNA聚合酶0.5微升0.02個(gè)反應(yīng)單位/微升超純水33微升反應(yīng)程序反應(yīng)步驟反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)預(yù)變性98°Cl分鐘1次變性98°C5秒退火70°C15秒30次延伸72°C90秒再延伸72°C10分鐘1次3.4利用E.Z.N.A.GelExtractionKit(Omega)純化PCR產(chǎn)物(圖3)。用紫外分光光度計(jì)DU530(Beckman)測量純化的PCR產(chǎn)物的濃度。3.5利用T4DNALigase(NEB)對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子內(nèi)連接。DNA濃度越稀，越容易發(fā)生分子內(nèi)連接，參照以下計(jì)算式51.1/(DNA濃度g/l)+(分子量dalton)0.5>2，計(jì)算連接反應(yīng)體系內(nèi)PCR產(chǎn)物的濃度為lng爾l。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，取l嗎pET28a-LEGSL進(jìn)行連接，反應(yīng)體積為lml，連接反應(yīng)條件為15°C，16h。3.6連接產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀純化，純化的連接產(chǎn)物按照一定比例(小于或等于1:10)與感受態(tài)細(xì)胞(DH5a:購置于Invitrogen公司)充分混勻，冰浴30min;42°C，45S，冰浴2-3min;加入10體積LB培養(yǎng)基，37°C，225r/min，振蕩培養(yǎng)lh;取小量上述培養(yǎng)物(剩余培養(yǎng)物放置4。C保存)進(jìn)行梯度稀釋并分別涂布于含30嗎/mlKanamycin的LB平板，37°C，哺乳動(dòng)物倒扣培養(yǎng)約14h。觀察計(jì)算上述培養(yǎng)板的克隆數(shù)。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，把剩余培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋(使每個(gè)平板長出約300個(gè)克隆)并涂布于的若干個(gè)LB平板(含30ng/mlKanamycin)。pET28a-LEGSL的理論大小為5143bp，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析——pET28a-LEGSL的片段長度均符合理論大小(圖3-2);對純化的pET28a-LEGSL進(jìn)行分子內(nèi)連接；連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5a，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含30ng/ml的LB平板上進(jìn)行克隆篩選。其轉(zhuǎn)化效率為3.72xl0々嗎。3.7利用VectorNTI軟件對pET28a-LEGS的序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析——選擇限制性內(nèi)切酶Hindi對上述質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切鑒定(圖4-2)。3.8利用VectorNTI軟件設(shè)計(jì)測序引物，用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequenceingKit(ABI)和3730DNAAnalyzer(ABI)進(jìn)行雙向測序分析(圖4)，測序結(jié)果見圖4-3。pET28a載體具有兩個(gè)歷'wdl酶切位點(diǎn)，其中一個(gè)位于被EGS文庫表達(dá)框替換的T7prometer和T7terminator之間的區(qū)域內(nèi)，但EGS表達(dá)框以不同的概率引入0，1或2個(gè)///wcll酶切位點(diǎn)。理論上，大概98%pET28a-EGS-clone只有1個(gè)/Z/"cII酶切位點(diǎn)，其幼力dl酶切圖譜為(圖4-1，laneRVl),大概2%pET28a-EGS-clone具有2個(gè)或3個(gè)歷'wcll酶切位點(diǎn)，它們的歷"cll酶切圖譜為(圖4-1，laneRV2)。為了檢驗(yàn)EGS文庫的克隆效率是否符合理論設(shè)計(jì)，隨機(jī)挑取pET28a-EGS-clone進(jìn)行限制性內(nèi)切酶(歷'"cll)分析。大概96%pET28a-EGS-clone的歷"cll酶切圖譜與理論預(yù)測一致，其中94%pET28a-EGS-clone的歷"cll酶切圖譜(圖4-2)與圖4-1，laneRVl—致，其中6%pET28a-EGS-clone的預(yù)wll酶切圖譜(圖4-3，lanel)與圖4-1，laneRV2—致。上述酶切分析表明EGS文庫克隆效率基本滿足理論設(shè)計(jì)要求。為了檢驗(yàn)EGS文庫的EGS表達(dá)框的組成是否符合理論設(shè)計(jì)，隨機(jī)挑取pET28a-EGS-clone進(jìn)行測序及比對分析。大概94%pET28a-EGS-clone具有序列玩全正確的EGS表達(dá)框。對這些EGS表達(dá)框的序列進(jìn)行比對分析(圖4-4)表明，EGS表達(dá)框的組成滿足理論設(shè)計(jì)。EGS文庫應(yīng)用實(shí)例一、EGS文庫篩選程序的建立1、以EGS克隆(pET28a-EGS-clone)為模板，對EGS表達(dá)框進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖5陽1);2、以上述純化的PCR產(chǎn)物為模板，對EGS進(jìn)行轉(zhuǎn)錄制備(圖5-1);EGS-clone的制備流程如圖5-1所示。PCR擴(kuò)增EGS-clone—IVTT。EGS-clone-IVTT理論大小為826bp。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析——EGS-clone-IVTT(圖5-2)的片段大小符合理論預(yù)測。以純化的EGS-clone-IVTT為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄制備EGS-clone。EGS-clone的理論大小為71bp，對所制備的EGS進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析——EGS-clone(圖5-3)的片段大小符合理論預(yù)測。3、把上述純化的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與靶標(biāo)RNA(愛滋病、肝癌相關(guān)的致病基因)以及RNaseP混合反應(yīng)，以體外篩選功能EGS(圖6-1);3.1RNaseP制備RNaseP由C5蛋白和MlRNA組成，參考文獻(xiàn)報(bào)道(LundbladEW,XiaoQKoJH,AltaianS.RapidselectionofaccessibleandcleavablesitesinRNAbyEscherichiacoliRNasePandrandomexternalguidesequences.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2008;105:2354-2357.)方法進(jìn)行制備。3.2耙標(biāo)RNA制備獲取耙標(biāo)RNA的體外轉(zhuǎn)錄模板(5'端含有T7啟動(dòng)子)，通過體外轉(zhuǎn)錄制備靶標(biāo)RNA。3.3RNA純化利用RNA純化試劑盒(QIAGEN)，對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化。3.4反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.5反應(yīng)產(chǎn)物分析對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(膠濃度為8%，含7M尿素)分析，以判斷靶標(biāo)RNA是否被特異性切割。上述所述實(shí)驗(yàn)步驟為EGS體外篩選策略，如圖6-l所示。4、把上述篩選到得功能性EGS轉(zhuǎn)染至相應(yīng)的細(xì)胞模型，并對其所導(dǎo)致的表型(增殖抑制、促進(jìn)凋亡、抑制病毒感染)進(jìn)行驗(yàn)證分析(圖6-2)。4.1EGS轉(zhuǎn)染利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen),被EGS轉(zhuǎn)染至靶標(biāo)細(xì)胞，詳細(xì)操作見轉(zhuǎn)染試劑說明書。4.2細(xì)胞增殖檢測利用MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Beyotime)進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，詳細(xì)操作見試劑盒說明書。4.3細(xì)胞凋亡檢測利用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，詳細(xì)操作見試劑盒說明書。4.4病毒拷貝數(shù)檢測(以HIV為例)利用慢病毒基因組RNA拷貝數(shù)檢測試劑盒:Lenti-XqRT-PCRTitrationKit對HIV基因組RNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，以評價(jià)HIV的增殖情況。上述所述實(shí)驗(yàn)步驟為EGS體內(nèi)驗(yàn)證策略，如圖6-2所示。二、EGS文庫篩選結(jié)果通過上述篩選程序，體外篩選到耙向肝癌c-myc癌基因的EGS-c-mycSEQIDN0.3;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGS-c-myc能夠有效干擾肝癌細(xì)胞系HepG2中c-myc的表達(dá)，并誘導(dǎo)HepG2發(fā)生凋亡(圖7)。1、體外篩選耙向c-myc癌基因的EGS-c-myc(圖7-1)利用上述體外篩選程序，篩選到在體外可誘導(dǎo)RNaseP對c-myc癌基因進(jìn)行有效識(shí)別切割的EGS-c-myc(圖7-1)，EGS-c-myc能夠在體外指導(dǎo)RNaseP對c-mycmRNA進(jìn)行特異性切割，其切割產(chǎn)物鑒定如圖7-3所示。2、制備EGS-c-myc的體內(nèi)陰性對照EGS-D-c-myc(圖7-2)利用制備EGS-c-myc的方法制備EGS-D-c-myc，但在對EGS-c-myc表達(dá)框進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)引入堿基突變(UUC—AAG)。EGS-D-c-myc的結(jié)構(gòu)示意圖如圖7-2所示。3、把EGS-c-myc和EGS-D-c-myc分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen),被EGS轉(zhuǎn)染至靶標(biāo)細(xì)胞，詳細(xì)操作見轉(zhuǎn)染試劑說明書。4、EGS-c-myc和EGS-D-c-myc對c-myc表達(dá)水平的影響4.1熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析(圖7-4-1)A、H印G2細(xì)胞被EGS轉(zhuǎn)染72h后，利用Trizolreagent(Invitrogen)提取總RNA，詳細(xì)操作見試劑說明書；B、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QuantiTectRev.TranscriptionKit，QIAGEN)對上述提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，詳細(xì)操作見試劑盒說明書；C、利用Q-PCR(SYBR法)試劑盒(QuantiTectSYBRGreenPCRKits，QIAGEN)對p-actin和c-myc基因進(jìn)行定量,試劑盒包含對p-actin和c-myc基因進(jìn)行定量的Q-PCR引物，P-actin作為內(nèi)參，詳細(xì)操作見試劑盒說明書。圖7-4-1結(jié)表明EGS-c-myc相比其陰性對照EGS-D-c-myc顯著地抑制c-myc癌基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。4.2Westernblot分析(圖7-4-2)A、HepG2細(xì)胞被EGS轉(zhuǎn)染72h后，利用Western及IP細(xì)胞裂解液(Beyotime)制備蛋白質(zhì)樣品，詳細(xì)操作見試劑盒說明書；B、利用BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime)對上述蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行濃度測定，詳細(xì)操作見試劑盒說明書；C、對上述蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，上樣量為IO嗎；D、印跡分析印跡膜為硝酸纖維素膜，一抗為p-Actin(9):sc-130301,mousemonoclonal,SantaCruz,1:500，用于檢測P-Actin;c-Myc(A-14):sc-789，rabbitpolyclonalSantaCruz,1:500，用于檢測c-Myc，二抗HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG(sc-2004,SantaCruz,1:2000)、HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG(sc-2005,SantaCruz,1:5000);化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒BeyoECLPlus(Beyotime)，詳細(xì)操作見試劑說明書。圖7-4-2結(jié)果表明EGS-c-myc相比其陰性對照EGS-D-c-myc顯著地抑制c-myc癌基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。5、EGS-c-myc和EGS-D-c-myc誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果利用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime)檢測EGS-c-myc(圖7-5-1)和EGS-D-c-myc(圖7-5-2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，詳細(xì)操作見試劑盒說明書。結(jié)果表明EGS-c-myc(圖7-5-1)相比其陰性對照EGS-D-c-myc(圖7-5-2)顯著地促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的EGS-c-myc可以用于制備預(yù)防和/或治療c-myc癌基因高表達(dá)疾病藥物，c-myc癌基因高表達(dá)疾病包括但不限于成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤，肝癌。11SEQUENCELISTING<110>廣州金琪基因技術(shù)研究發(fā)展中心<120>—種新的外指引序列(EGS)文庫(LEGS)構(gòu)建技術(shù)<130>US6057153<160>2<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<222>(31)..(37)<223>nisa,c，g,ort<400>1tctccggggttccccaatacgattttaccannruinnncttcctaagcttggaagcttc58<210>2<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<222>(27)..(29)<223>nisa，c，g，ort<400>2tcgatgacggcagatttagagtcgctnnntttggctatagtgagtcgtattaatttcg58<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>3ccagccagcggtcc1權(quán)利要求1.一種靶向c-myc癌基因的外指引序列EGS-c-myc，如SEQIDNO3所示。2.權(quán)利要求1所述的靶向c-myc癌基因的外指引序列EGS-c-myc在制備預(yù)防和/或治療c-myc癌基因高表達(dá)疾病藥物中的用途。3.權(quán)利要求2所述的用途，其中c-myc癌基因高表達(dá)疾病為成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤之一。4.權(quán)利要求3所述的用途，其中c-myc癌基因高表達(dá)疾病為脂肪肉瘤。5.權(quán)利要求4所述的用途，其中c-myc癌基因高表達(dá)疾病為橫紋肌肉瘤。6.權(quán)利要求2所述的用途，其中c-myc癌基因高表達(dá)疾病為肝癌。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的靶向c-myc癌基因的外指引序列EGS-c-mycSEQIDNO.1，本發(fā)明公開的序列可以顯著地抑制c-myc癌基因在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，從而用于制備預(yù)防和/或治療c-myc癌基因高表達(dá)疾病藥物。文檔編號(hào)C12N15/11GK101624596SQ20091016232公開日2010年1月13日申請日期2009年8月12日優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日發(fā)明者嚴(yán)啟滔,劉媛媛,鄭文嶺,馬文麗申請人:廣州金琪基因技術(shù)研究發(fā)展中心