專利名稱：一個胡楊nac蛋白、其基因編碼序列與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物胡楊(Populus euphratiCa)NAC蛋白、其基因編碼序列，與該 基因在培育抗逆植物中的應用。
背景技術：
干旱、鹽漬和低溫冷害對植物的生長發(fā)育過程造成影響，植物在對不同逆境反應 的過程中涉及非常復雜的信號傳導和大量相應基因的表達，但這都離不開一些關鍵的轉錄 因子的參與。而目前認為AP2/EREBP、Zinc finger、MYB、bZIP和NAC類轉錄因子家族在不 同的逆境脅迫下直接參與了對非生物逆境干旱、冷害、高鹽等應答的調(diào)控。因而認為這些轉 錄因子家族在植物對逆境的應答過程中起著非常重要的調(diào)控作用。很多報道表明將特定逆 境干旱反應相關的轉錄因子在植物中超量表達可以顯著提高轉基因植物對逆境的抗性。NAC轉錄因子是近十年來新發(fā)現(xiàn)的植物特有的轉錄調(diào)控因子.1997年Aida等首 先報道了 NAC結構域，發(fā)現(xiàn)在矮牽牛NA M基因、擬南芥A TA F1/2和⑶C2基因編碼蛋白 的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名為NAC.第一個NAC轉錄因子是由 Souer等于1996年從矮牽牛中克隆得到的，隨后在擬南芥、水稻、小麥、大豆等物種中相繼 發(fā)現(xiàn)，目前在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)了 105個NAC成員，水稻中發(fā)現(xiàn)了 75個，均有基因家族成員參 與植物的防御應答反應。研究表明，NAC轉錄因子在植物的生長發(fā)育、器官建成、激素調(diào)節(jié) 和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用.最先報道的矮牽牛NAM基因和擬南芥中⑶C1基因，它們是在花原基的邊界和子 葉原基的邊界表達，對于控制邊界細胞形成具有較重要的作用，另外，這些基因在莖尖分生 組織的形成和維持中也起非常重要作用。近期發(fā)現(xiàn)NAC蛋白也參與植物的防御應答反應， 馬鈴薯的StNAC基因和擬南芥ATAF1及ATAF2基因受傷害和病原體侵害的誘導表達，蕓苔 植物經(jīng)傷害，甲蟲喂食或冷害脅迫后，分析有9個BnNAC基因受到不同程度的誘導，說明這 9個BnNAC基因參與生物或非生物的防御應答反應(Hegedus et al.，2003)。Fujita等 (2004)對RD26 (ANAC072)進行了深入的研究，認為RD26除受干旱誘導外，還受高鹽和ABA 的誘導，將其過量表達能提高轉基因植株的ABA敏感性。Microarray實驗分析了這個蛋白 的下游調(diào)節(jié)基因，對這些基因分析發(fā)現(xiàn)主要為信號傳導的調(diào)控基因，脫毒相關的，衰老和防 御相關及其他代謝相關基因，并且只有很少基因受3個或其中的2個調(diào)控，表明不同的基因 可能調(diào)控不同的下游基因。Ohnishi等(2005)報道水稻0sNAC6基因是受低溫、高鹽、干旱 和ABA等誘導表達，同時他們發(fā)現(xiàn)0sNAC6受傷害的誘導非常強，并且也受茉莉酸的誘導，因 此他們推測0sNAC6不僅在非生物逆境的應答中發(fā)揮重要作用，同時在生物和非生物的信 號傳導結合中起作用。目前由于各種作物品種自身基因資源優(yōu)勢的缺乏，可用于作物抗逆性狀遺傳改良 的基因還很少，而一些特殊生境植物如胡楊等卻擁有極強的抗性基因資源優(yōu)勢。胡楊長期 生長在我國西北荒漠、半荒漠地區(qū)，在起到防風固沙、改善生態(tài)環(huán)境作用的同時，也形成了 極強地耐極端環(huán)境能力，其豐富的逆境基因資源也受到越來越多的研究者的關注。NAC轉錄因子在植物的生長發(fā)育、器官建成、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā) 揮著重要作用，因此，從胡楊中分離NAC轉錄因子家族基因，可以為各種農(nóng)作物的分子育種 提供更為廣闊的基因源，加快農(nóng)作物的多抗分子育種步伐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供NAC蛋白家族中與抗逆性相關的NAC轉錄因子。本發(fā)明所提供的胡楊NAC蛋白，命名為PeNACl，來源于產(chǎn)地新疆的胡楊中。它是具 有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列；2)將序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且 與具有與序列1的氨基酸殘基序列相同活性的有序列1衍生的蛋白質。序列表中的SEQ ID No 1由291個氨基酸殘基組成。自序列1的氨基端第8-159 個氨基酸殘基為保守的NAC結構域，在此結構域中包含有核定位信號；序列1的C端是轉錄 激活域，代表了胡楊中的一種蛋白家族。 胡楊NAC蛋白PeNAC的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)與序列表中序列2限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋 白質的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列。所述高嚴謹條件為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65條件下雜交洗膜。其中，序列表中的SEQID No 2有873個脫氧核苷酸組成，自5’端第1位至873位 脫氧核苷酸序列為編碼序列。含有本發(fā)明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。實驗證明本發(fā)明的PeNACl基因的轉錄表達受干旱、高鹽、生長素、赤霉素的誘導。 用本發(fā)明所提供的編碼NAC蛋白基因，使用任何一種可以引導外源基因在植物表達載體中 表達的表達載體轉化植株，都可獲得對逆境脅迫耐受力增強的轉基因植株。本發(fā)明的這個 基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上包括強啟動子、誘導型啟 動子、組織特異型啟動子等在內(nèi)的任何一種啟動子；也可使用增強子，包括反以增強子或轉 錄增強子。為便于對轉基因細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加 入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或者發(fā)光化合物基因(GUS、GFP等)、具有抗 性的抗生素標記物(潮霉素、卡那霉素等)或是抗化學試劑標記基因。若從轉基因植物的生 物安全性考慮，可選擇安全性標記基因(主要包括化合物解毒酶基因和糖類代謝酶基因)， 也可以不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。使用攜帶本發(fā)明的基因的表達載體可轉化植物宿主(即可是木本植物，也可是農(nóng) 作物和草本植物)，培育具有綜合抗性的植物。


圖lnorthern雜交檢測PeNACl基因的IAA、GA誘導表達特性
圖2northern雜交檢測PeNACl基因的干旱、NaCl誘導表達特性圖3酵母雜交分析PeNACl蛋白的轉錄激活特性(a)pBD-PeNACl, pBD_PeNACl_N，pBD_PeNACl_C，pGBKT7 在 SD/His 平板生長狀況(b)pBD-PeNACl, pBD_PeNACl_N，pBD_PeNACl_C，pGBKT7 在 SD/His+lOmM 3-AT 平板 生長狀況
具體實施例方式實施例1、胡楊NAC1基因分離與序列分析采自新疆二年生的胡楊苗，水培，放置于室溫25，16小時光照的溫室中培養(yǎng)， 待其枝條抽葉后，放入250mM NaCl溶液中處理48h，取其葉片，液氮速凍。采用CTAB 法(Wang etal. 2005)提取總RNA。首先，利用cDNA_ALFP技術分析胡楊葉片在正常生 長條件下和鹽脅迫條件下基因表達譜的變化，雙鏈cDNA合成使用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Japan)試劑盒，依照試劑盒說明書的操作方法進行cDNA第一 鏈和第二鏈的合成。選取EcoR I和Mse I 二個內(nèi)切酶對雙鏈cDNA進行雙酶切，用于 AFLP 反應的接頭和引物如下EcoR Iadaptor top strand，5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，， EcoR I adaptor bottom strand,5' -AATTGGTACGCAGTC-3', Mse I adaptor top strand 5' -GACGATGAGTCCTGAG-3', Mse Iadaptor bottom strand 5' -TACTCAGGACTCAT-3', EcoR I pre amplification primer5' -GACTGCGTACCAATTC-3', Mse I pre amplification primer 5' -GATGAGTCCTGAGTAA-3', EcoRI selective amplification primer 5' -GACTGCGTACCAATTCNN-3', Mse I selectiveamplification primer 5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAANNN-3 ’。選擇性擴增的產(chǎn)物在6 %的聚丙烯酰胺凝膠上分離，二次擴 增后亞克隆到PM18-T vector (TaKaRa，Japan)，并行測序(上海生工)。從測序的表達片 斷中得到一個283bp的基因片斷，經(jīng)BLAST比較后，與擬南芥中的ATAF1基因有較高的同源 性，初步鑒定獲得了胡楊NAC基因的部分片斷(自序列1中第409位-第692位脫氧核苷 酸)。用此片段與楊樹基因庫比較后，根據(jù)與楊樹基因庫中同源的氨基酸序列設計引物，從 胡楊總RNA中通過RT-PCR方法分離得到NAC基因的全長。經(jīng)測序分析，得到具有序列表1 的序列，將具有序列表中序列1的基因命名為PeNACl。該基因的cDNA序列長為873bp，開 放閱讀框起始于lbp，中止于873bp，編碼有291個氨基酸殘基組成的PeNACl蛋白。實施例2、PeNACl基因的誘導表達分析將二年生胡楊苗分別進行以下脅迫處理干旱、250mM NaClUOOuM IAAU00 u M GA，具體處理方法如下鹽處理將二年生胡楊苗水培于250mM NaCl水溶液中，于0h、30min、lh、3h、5h后 取葉片，液氮速凍。干旱處理將二年生胡楊苗經(jīng)水洗凈后置于無菌濾紙上在22室溫下脫水Oh、 30min、lh、3h、5h后取葉片，液氮速凍。100 uM IAA處理將二年生胡楊苗盆栽于濕潤的營養(yǎng)土(草炭蛭石=7 3) 中，22°C，12h光照培養(yǎng)至葉片展開，將整株胡楊苗從土中移到100 yM IAA溶液中，分別在 處理后0h、30min、lh、3h、5h取完全展開的葉片。樣品裝入50ml離心管，液氮速凍。100 u M GA處理將二年生胡楊苗盆栽于濕潤的營養(yǎng)土(草炭蛭石=7 3)中，22°C，12h光照培養(yǎng)至葉片展開，將整株胡楊苗從土中移到100 yM GA溶液中，分別在處理 后0h、30min、lh、3h、5h取完全展開的葉片。樣品裝入50ml離心管，液氮速凍。采用CTAB法從胡楊葉片中提取總RNA，cDNA合成使用mRNA selective PCR Ver. 1. lkit(TaKaRa)試劑盒。以PeNACl基因cDNA序列的3，端為探針，探針長度218bp， 按照分子克隆方法進行northern雜交。結果表明PeNACl基因的轉錄表達受干旱、高鹽、生 長素、赤霉素的誘導，在正常條件下，PeNACl基因的表達量較低，在干旱、鹽處理1小時后， PeNACl基因的表達量快速增加，在處理3小時達到最高值，隨后開始下降(圖2)；在生長素 處理3小時后，PeNACl基因的表達量達到最高值，隨后開始下降(圖1)；在赤霉素處理30 分鐘后，PeNACl基因的表達量快速增加，在處理1小時達到最高值，隨后開始下降(圖1)。實例三、胡楊PeNACl蛋白的轉錄激活特性經(jīng)PCR 反應獲得帶 Ndel-Xmal 雙酶切位點的 PeNAClcDNA 全長(873bp)，PeNACl-N 端(bp)，PeNACl-C端(bp)，分別將這些片斷插入到酵母表達載體PGBKT7中GAL4DNA結合域 的下游，獲得融合載體pBD-PeNACl，pBD-PeNACl-N*pBD-PeNACl-C。以載體pGBKT7為對照， 將上述四種表達載體質粒分別轉化含有HIS3報告子的酵母菌株AH109，具體實驗方法依照 Matchmaker One-Hybrid Library Construction & Screening Kit i式劑盒說明書進行。 將轉化的細胞分別涂布在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基His_/SD和含有l(wèi)OyM 3-AT(HIS3基因產(chǎn)物競 爭抑制劑)的His_/SD平板上，30度培養(yǎng)3-4天，通過它們的生長狀況分析各個蛋白的轉錄 激活活性。如圖所示含有pGBKT7，pBD-PeNACl, pBD-PeNACl-N和pBD-PeNACl_C質粒的酵 母轉化子均能在單一缺失His的SD平板上生長，在含有10 ii M 3-AT的His_/SD平板上只有 含pBD-PeNACl和pBD_PeNACl_C質粒的酵母轉化子能夠生長，而含pGBKT7和pBD_PeNACl_N 質粒的酵母轉化子不能夠生長，說明PeNACl編碼的蛋白含有轉錄激活域，能夠與載體中的 GAL4DNA結合域結合激活報告基因的轉錄，并且通過對基因全長N端或C端的缺失確定了 PeNACl基因的激活域在C端。序列表
<160>2
<210>1
<211>291
<212>PRT
<213> 古月楊(Populus euphratica)
<400>1
Met Thr AlaAlaThrLeuGluLeuProProGlyPheArgPheHisPro
151015
Thr Asp GluGluLeuValLeuHisTyrLeuCysArgLysCysSerSer
202530
Gin Pro lieAlaValProlielieAlaGlulieAspLeuTyrLysPhe
354045
Asp Pro TrpAspLeuProGlylieAlaLeuTyrGlyGluLysGluTrp
505560
Tyr Phe PheThrProArgAspArgLysTyrProAsnGlySerArgPro
ccgaagacagttggaatcaagaaagctttggtcttttacgcggggaaagctcctaaggga360
gagaaaaccaactggattatgcacgagtatcgtctagcagacgtggatcgctcggctcgc420
aagaagaacagcttaaggctggatgattgggtactctgtcgcatatacaacaagaaaggt480
acagttgagaagcaagaacagcatcttagcgtcaagaaagcgaatccgacggagattgag540
gaggatgagaagaagcaggttgttttgctgccgccgcaaccagctccgtcctcggcgaca600
ggaacggtgaatgattacatgcactttgacacgtcagactccgtgccgaggctgcacacg660
gattcgagctgctcggagtatgtggtgtcgccggaattcacgtgcgaggtgcagagtgaa720
cctaggtggaaggaatggggaaacgtaaatgccctcgataatccttacaattacctggat780
gccacaatggatattccatttgcgtctcagttgcagggggttaatcagatgtcgcctctt840
caggatatatttatgcacctgcagaagccgttt
權利要求
胡楊NAC蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中SEQ ID No1的氨基酸殘基序列；2)將序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與序列1的氨基酸殘基序列相同活性的有序列1衍生的蛋白質。
2.胡楊NAC蛋白PeNAC的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質 的DNA序列；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所 述高嚴謹條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65條件下雜交洗膜。
3.含有權利要求2或3所述胡楊NAC蛋白PeNAC的編碼基因全部或部分序列構建的植 物表達載體。
4.含有權利要求2或3所述胡楊NAC蛋白PeNAC的編碼基因全部或部分序列的細胞系。
5.含有權利要求2或3所述胡楊NAC蛋白PeNAC的編碼基因全部或部分序列的宿主菌。
6.權利要求1所述的胡楊NAC蛋白及其編碼基因在改良植物生長發(fā)育及抗逆性中的應
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胡楊NAC蛋白及其編碼基因。該胡楊的NAC蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中SEQ ID No1的氨基酸殘基序列；2)將序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與序列1的氨基酸殘基序列相同活性的有序列1衍生的蛋白質。編碼該NAC蛋白的基因的轉錄表達受干旱、高鹽，激素GA、IAA的誘導。從胡楊中分離的NAC蛋白家族基因，可以為闡明木本植物調(diào)控其抗逆性的分子機制奠定基礎；可以為各種植物、農(nóng)作物的分子育種提供更為廣闊的基因源。
文檔編號C12N1/00GK101955518SQ20091015816
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權日2009年7月14日
發(fā)明者劉景輝, 尹偉倫, 王俊平, 王俊英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所