專利名稱：尋找先天性心臟病-室間隔缺損致病相關(guān)的alk3下游基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病致病相關(guān)基因的尋找方法，特別是指一種尋找先天性心臟 病-室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因的方法。
背景技術(shù)：
先天性心臟病主要是由于胎兒時期心臟發(fā)育的障礙所導(dǎo)致，近年來通過心臟發(fā)育 的研究來揭示先天性心臟病的發(fā)病機理已成為熱點之一，精確定位異?；驗榛蛑委煶?為先天性心臟病治療奠定了基礎(chǔ)，但心臟發(fā)育障礙的根本原因，尤其是室間隔缺損的發(fā)病 機理仍尚未徹底了解。根據(jù)國外近年的研究，敲除一個或數(shù)個基因的轉(zhuǎn)基因大鼠模型在不 斷地建立，其中Chisaka和C即ecchi建立了同源異型盒基因hox-l. 5敲除的大鼠模型，說 明了同源異型盒基因在胚胎發(fā)育時期的重要性及神經(jīng)嵴胚在心血管發(fā)育中的特殊作用。接 著視黃X受體(RXRs)基因無效突變大鼠模型也被建立，解剖這些死亡的大鼠發(fā)現(xiàn)兩個心 室游離壁致密肌層有明顯發(fā)育不全，并有室間隔肌性穿？L。 Genesis. 2002 ;32(2) :69-72報 導(dǎo)，Mishina Y等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子P (TGF-P )在細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中起到十分重要 的作用，骨形態(tài)形成蛋白受體IA(Bone Morphogenetic Protein IA，又名ALK3)在心臟的 發(fā)育及心肌細(xì)胞的分化中起重要作用。根據(jù)ALK3的系統(tǒng)基因敲除研究結(jié)果表明ALK3是 一種比較上游的信號傳遞分子，它表達在多種臟器和組織，而非心臟特異的信號傳遞分子。 DNA Res. 1996 ;3(2) :73-80和Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002， 99 (5) :2878-2883報導(dǎo)，美 國Baylor醫(yī)學(xué)院心臟發(fā)育中心主任Michael D. Schneider教授使用了 a-MHC Cre+lox P 系統(tǒng)，創(chuàng)建了心臟特異的ALK3基因敲除的小鼠模型，完成了心臟特異的ALK3基因敲除，并 發(fā)現(xiàn)純合子的心臟特異ALK3基因敲除的小鼠死于胚胎中期，同時有室間隔缺損，心內(nèi)膜墊 和肌小梁發(fā)育不全。因此，目前可以確定的是ALK3與心臟室間隔缺損有著很大關(guān)系，并且 ALK3是一個比較上游的與室間隔缺損相關(guān)的信號傳遞分子，但遺憾的是仍不清楚器官特異 性，尤其是心臟特異性更強的ALK3下游基因，而其中最主要的原因是下游基因難以篩選， 目前這也是國際上研究的一大難題。

發(fā)明內(nèi)容
為了剖析室間隔缺損的發(fā)病機理，進一步探索尋找室間隔缺損的特異相關(guān)及其基 因的信號傳遞途徑，并為開發(fā)室間隔缺損的基因治療藥物打下的理論基礎(chǔ)，也為探索新藥 找到新的治療靶點，本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定可靠地尋找具有心臟特異性更強的先天 性心臟病_室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為包括以下步驟 (1)、試驗組和對照組的設(shè)置，其中試驗組a -MHC Cre+/_， ALK3F/-的ALK3基因 敲除的純合子小鼠胚胎；對照組a _MHC Cre+/-， ALK3F/+的ALK3基因敲除雜合子小鼠胚 胎；
(2)、總RNA和mRNA的提取采用總RNA和mRNA試劑盒分別從試驗組和對照組中 收拾到的11. 5天胚胎心臟中提取和純化總RNA和mRNA ;
(3)、初步篩選有差異表達的候選基因 3. 1 、分別將試驗組和對照組的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用運用PCR選擇性cDNA差 異顯示法的試劑盒，比較并初步篩選出分別在試驗組和對照組有差異表達的候選基因；
3. 2、并且再利用至少含25， 000小鼠基因片段的芯片比較試驗組和對照組的基因 表達水平，得到在試驗組基因表達水平上調(diào)的一組候選基因和下調(diào)的一組候選基因；
(4) 、RT-PCR的方法排除假陽性的候選基因，采用同等量試驗組和對照組總RNA被 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用每個候選基因特異的PCR引物，做不同周期的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增，并以 GAPDH基因作為RT-PCR的內(nèi)部對照基因，比較各個候選基因在不同周期的PCR的產(chǎn)物量，排 除假陽性的候選基因； (5)、采用原位雜交法對經(jīng)步驟(4)篩選后的候選基因的表達部位進行試驗組和 對照組的對照顯示，進一步驗證得到先天性心臟病-室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基 因。 本發(fā)明采用a -MHC Cre+/-， ALK3F/-(試驗組)和a -MHC Cre+/-， ALK3F/+ (對照 組)的小鼠胚胎(11.5天)，用PCR選擇性cDNA減數(shù)法和基因芯片法初篩獲得可能的ALK3 的下游候選基因，然后采用成本較低的RT-PCR排除假陽性的ALK3的下游候選基因，然后再 通過原位雜交法對經(jīng)RT-PCR法排除后余下的ALK3下游候選基因進行表達部位驗證，證實 其為先天性心臟病_室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因。 本發(fā)明所述的試驗組的a -MHC Cre+/_， ALK3F/-的ALK3基因敲除的純合子小鼠 胚胎和對照組的a-MHC Cre+/-，八0(3 /+的八0(3基因敲除雜合子小鼠胚胎是通過雌的 a -MHC Cre+/-， ALK3+/-和雄的ALK3F/F的C57小鼠交配獲得。 進一步設(shè)置是所述的步驟(4)之后還采用定量RT-PCR法進一步排除假陽性候選 基因，以36B4基因為內(nèi)部對照基因。 進一步設(shè)置是所述的步驟(5)中對試驗組和對照組的11. 5天的小鼠胚胎分別做 完整胚胎的原位雜交和胚胎切片的原位雜交，其中用于胚胎切片的原位雜交的切片用的胚 胎樣本用4%多聚甲醛固定20小時，做完整胚胎的原位雜交的胚胎樣本用含3. 7%的甲醛 的MEMFA在常溫下固定90分鐘。 本發(fā)明的優(yōu)點及其有益效果有探索并尋找ALK3的下游基因，從理論上尋找到與 室間隔缺損直接相關(guān)、心臟特異的基因，從而有助于剖析室間隔缺損的發(fā)病機理，從技術(shù)上 采用最先進的PCR選擇性cDNA差異顯示法和基因芯片法通過比較兩組基因庫找出小鼠室 間隔缺損相關(guān)的基因，比如Pax-8基因，此方法的成功將進一步可尋找室間隔缺損的基因 信號途徑，并為開發(fā)室間隔缺損的基因治療藥物打下良好的理論基礎(chǔ)，也為探索新藥找到 新的治療靶點。 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步介紹。


圖1本發(fā)明具體實施方式
工藝流程圖； 圖2本發(fā)明小鼠交配獲得ALK3基因敲除的試驗組和對照組的示意 圖3比較試驗組和對照組Pax-8， PAF和GAPDH在不同PCR擴增周期時的PCR產(chǎn) 圖4比較試驗組和對照組14-3-3， PTK和GAPDH在不同PCR擴增周期時的PCR產(chǎn) 圖5采用定量RT-PCR的方法比較轉(zhuǎn)錄因子pax-8基因表達水平對比圖； 圖6采用定量RT-PCR的方法比較PTK基因表達水平對比圖； 圖7采用原位雜交的方法顯示轉(zhuǎn)錄因子pax-8在小鼠11. 5天胚胎中的表達圖 圖8采用原位雜交的方法顯示轉(zhuǎn)錄因子pax-8在小鼠11. 5天胚胎心臟中的表達圖。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不 能理解為對本發(fā)明保護范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明 作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。 (1)、心臟特異的ALK3基因敲除小鼠的獲得雌的a -MHC Cre+/-， ALK3+/-和雄 的ALK3F/F(在ALK3基因第二外顯子兩邊插入Lox P的片段)交配可獲得a-MHC Cre+/-， 八0(3 /-和a-MHC Cre+/-，ALK3F/+的小鼠胚胎。如圖1所示，其中，黑色長方形表示ALK3 基因，白色長方形表示ALK3基因被敲除，黑色箭頭表示loxP序列。 (2)、總RNA和mRNA的提取采用總RNA和mRNA試劑盒分別從試驗組和對照組中 收拾到的11. 5天胚胎心臟中提取和純化總RNA和mRNA ;本步驟所述的總RNA和mRNA試劑 盒采用QIAGEN公司的總RNA和mRNA試劑盒，因為心臟形成是從胚胎第7. 5天-10. 5天，該 基因敲除純合子小鼠胚胎在第15. 5天就死亡了，所以，采用本實施例采用11. 5天可以觀察 心臟的畸形。 (2)、分別將試驗組和對照組的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR選擇性cDNA差異顯 示法的試劑盒，比較并初步篩選出分別在試驗組和對照組有差異表達的候選基因；本實施 例所述PCR選擇性cDNA差異顯示法的試劑盒采用Clontech公司生產(chǎn)的試劑盒，根據(jù)該公 司提供的使用方法，獲得一些候選基因，有些基因僅僅表達在試驗組，而不表達在對照組； 另一些基因僅表達在對照組，而不表達在試驗組。具體獲得的候選基因如表1所示血小板 激活因子乙酰水解酶等基因在a-MHC Cre+/-， ALK3F/-小鼠胚胎心臟中的表達是下調(diào)的。 如表2所示14-3-3蛋白13亞型等基因的表達是上調(diào)的。
表1. PCR選捧性cDNA差異顯示法獲得表達下調(diào)的ALK3的下游基因
基因名稱 克隆名稱
血小板激活因子乙酰水解酶(PAF) R-D12 [CX)31]睪丸特異的焦磷酸合成酶 R-B4 微小染色體保養(yǎng)蛋白(MCM) R-Dl EST R-A8 EST R-B2
表2. PCR選擇性cDNA差異顯示法獲得表達上調(diào)的ALK3的下游基因
基因名稱 克隆名 稱
14-3-3蛋白p亞型 F-A8絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶la F-Al
磷脂酶C-a F-G4
成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤粘附蛋白 F-H2
RuvB樣蛋白2 F-A2
EST F-H5 (3)、基因芯片的方法獲得可能的ALK3的下游基因采用25000個基因在試驗組和 對照組中的表達水平被比較，增加或減少兩倍以上為陽性。如表3所示，Pax-8及Hox-3. 5 等12個基因在a-MHC Cre+/_，八0(3 /-小鼠胚胎心臟中的表達是下調(diào)的。如表4所示， Ras相關(guān)蛋白Rab-5b及EPS-8蛋白等16個基因在a -MHC Cre+/-，ALK3F/-小鼠胚胎心臟 中的表達是上調(diào)的。 表3基因芯片的方法獲得下調(diào)的ALK3的下游基因
基因名稱下調(diào)倍數(shù)
肌紅蛋白46.2
Pax-85.7
Phospholamban10.1
普通結(jié)合酶E24.4
鋅指蛋白4.7
G-蛋白結(jié)合受體5.5
脫氧胞苷激酶 '4.0
纖溶酶原激活劑抑制劑4.1
Rabllb2.7
Hox-3.54.0
轉(zhuǎn)錄因子IIF |3亞型2.7
生長/分化因子12.7 表4基因芯片的方法獲得上調(diào)的ALK3的下游基因
6
基因名稱上調(diào)倍數(shù)
Ras相關(guān)蛋白Rab-5b7.0
EPS-8蛋白2.4
蛋白酪氨酸激酶(PTK)5.4
Galectin-94.9
K-glypican4.7
WNT-2蛋白前體4.5
Plakoglobin4.2
表皮生長因子受體激酶作用物4.0
干擾素調(diào)節(jié)因子15.7
Mdm2蛋白2.5
Ras相關(guān)蛋白RAC12.0
Ras相關(guān)蛋白Krev-l2.3
轉(zhuǎn)錄激活劑FE652.5
MIF2突變體的抑制基因2.5
延長因子l一y4.0
G-蛋白信號16調(diào)節(jié)劑13.2 (4) 、 RT-PCR排除假陽性，并證實為ALK3下游候選基因，同等量試驗組和對 照組總RNA被轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用每個基因特異的PCR引物，做不同的擴增周期，比較 PCR的產(chǎn)物量。GAPDH作為RT-PCR的內(nèi)部對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血小板激活因子乙酰水解酶 (platelet-activating factor acetylhydrolase， PAF)在第21個PCR周期，轉(zhuǎn)錄因子 Pax-8在第27個PCR周期，在a -MHC Cre+/-， ALK3F/-組(試驗組)明顯少于a -MHC 06+/-^0(3 /+組(對照組)，說明在試驗組這些基因表達水平被下調(diào)。而14-3-3 |3亞型 在第23個PCR周期，蛋白酪氨酸激酶，在第21個PCR周期，在a -MHC Cre+/-， ALK3F/-組 (試驗組)明顯多于a-MHC 06+/-^0(3 /+組(對照組)，說明在試驗組這些基因表達水 平被上調(diào)。見圖3和圖4。 (6)、定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(定量RT-PCR):以步驟5得到Pax-8和PTK基 因為例，采用定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)的方法，進一步驗證其為先天性心臟病_室間隔缺 損致病相關(guān)的ALK3下游基因(轉(zhuǎn)錄因子pax-8基因)在a-MHC Cre+/_ALK3F/-組小鼠比 a -]\^(:(>6+/40(3 /+組小鼠表達水平降低7. 1倍(P < 0. 001)。而作為定量RT-PCR內(nèi)部對 照的36B4基因的表達水平在兩組間無有意義的差異，如圖5所示，其中紅色柱子為a -MHC Cre+/-ALK3F/+組小鼠；蘭色柱子為a-MHC Cre+/_ALK3F/_組小鼠；36B4為定量RT-PCR的 內(nèi)部對照基因。 采用定量RT-PCR的方法，PTK基因在a -MHC Cre+/_ALK3F/-組小鼠比a -MHC Cre+/-ALK3F/+組小鼠表達水平上升3. 7倍(P < 0. 01)。而作為定量RT-PCR內(nèi)部對 照的36B4基因的表達水平在兩組間無顯著差異，如圖6所示，其中紅色柱子為a -MHC Cre+/-ALK3F/+組小鼠；蘭色柱子為a-MHC Cre+/_ALK3F/_組小鼠；36B4為定量RT-PCR的 內(nèi)部對照基因。 (7)、采用原位雜交法對經(jīng)RT-PCR和定量RT-PCR篩選后的候選基因的表達部位
進行試驗組和對照組的對照顯示，進一步驗證得到先天性心臟病_室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因(Pax-8基因)。 1).完整胚胎的原位雜交11.5天的小鼠完整胚胎原位雜交結(jié)果顯示轉(zhuǎn) 錄因子pax-8可表達在a -MHC Cre+/_ALK3F/+ll. 5天的小鼠胚胎心臟中，卻不 能見于a -MHC Cre+/-ALK3F/-ll. 5天的小鼠胚胎心臟，如圖7所示，其中左半圖 為a -MHC Cre+/_ALK3F/+11. 5天的小鼠胚胎心臟被染成深蘭色；右半圖為a -MHC Cre+/-ALK3F/-ll. 5的小鼠胚胎。 2).胚胎切片的原位雜交11.5天的胚胎心臟四腔心切片原位雜交法顯示 轉(zhuǎn)錄因子pax-8表達在11. 5天的a -MHC Cre+/_ALK3F/+小鼠整個心臟中，但不能 在11. 5天a -MHC Cre+/_ALK3F/_小鼠心臟中顯示，如圖8所示，左半圖為a -MHC Cre+/-ALK3F/+ll. 5天的小鼠胚胎切片；右半圖為a _MHC Cre+/_ALK3F/_11. 5天的小鼠胚 胎切片。
權(quán)利要求
一種尋找先天性心臟病-室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、試驗組和對照組的設(shè)置，其中試驗組α-MHC Cre+/-，ALK3F/-的ALK3基因敲除的純合子小鼠胚胎；對照組α-MHC Cre+/-，ALK3F/+的ALK3基因敲除雜合子小鼠胚胎；(2)、總RNA和mRNA的提取采用總RNA和mRNA試劑盒分別從試驗組和對照組中收拾到的11.5天胚胎心臟中提取和純化總RNA和mRNA；(3)、初步篩選有差異表達的ALK3的下游候選基因3.1、分別將試驗組和對照組的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR選擇性cDNA差異顯示法的試劑盒，比較并初步篩選出分別在試驗組和對照組有差異表達的候選基因；3.2、并且再利用至少含25,000小鼠基因片段的芯片比較試驗組和對照組的基因表達水平，得到在試驗組基因表達水平上調(diào)的一組候選基因和下調(diào)的一組候選基因；(4)、RT-PCR的方法排除假陽性的候選基因，采用同等量試驗組和對照組總RNA被反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用每個候選基因特異的PCR引物，做不同周期的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增，并以GAPDH基因作為RT-PCR的內(nèi)部對照基因，比較各個候選基因在不同周期的PCR的產(chǎn)物量，排除假陽性的候選基因；(5)、采用原位雜交法對經(jīng)步驟(4)篩選后的候選基因的表達部位進行試驗組和對照組的對照顯示，進一步驗證得到先天性心臟病-室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種尋找先天性心臟病_室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游 基因的方法，其特征在于所述的試驗組的a ^(:06+/-^0(3 /-的八0(3基因敲除的純合 子小鼠胚胎和對照組的a-MHC Cre+/-， ALK3F/+的ALK3基因敲除雜合子小鼠胚胎通過雌 的a -MHC Cre+/-， ALK3+/-和雄的ALK3F/F的C57小鼠交配獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種尋找先天性心臟病_室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3 下游基因的方法，其特征在于所述的步驟(4)之后還采用定量RT-PCR法進一步排出假陽 性候選基因，以36B4基因為內(nèi)部對照基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種尋找先天性心臟病_室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游 基因的方法，其特征在于所述的步驟(5)中對試驗組和對照組的11. 5天的小鼠胚胎分別 做完整胚胎的原位雜交和胚胎切片的原位雜交，其中用于胚胎切片的原位雜交的切片用的 胚胎樣本用4%多聚甲醛固定20小時，做完整胚胎的原位雜交的胚胎樣本用含3. 7%的甲 醛的MEMFA在常溫下固定90分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種尋找先天性心臟病-室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因的方法，采用α-MHC Cre+/-，ALK3F/-(試驗組)和α-MHC Cre+/-，ALK3F/+(對照組)的小鼠胚胎(11.5天)，用PCR選擇性cDNA差異顯示法和基因芯片法初篩獲得可能的ALK3下游候選基因，然后采用成本較低的RT-PCR排除假陽性的ALK3下游候選基因，然后再通過原位雜交法對經(jīng)RT-PCR法排除后余下的ALK3下游候選基因進行表達部位驗證，證實其為先天性心臟病-室間隔缺損致病相關(guān)的ALK3下游基因。本發(fā)明為開發(fā)室間隔缺損的基因治療藥物打下理論基礎(chǔ)，也為探索新藥找到新的治療靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101705282SQ200910155110
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者楊德業(yè) 申請人:楊德業(yè)