專利名稱：：促進(jìn)目標(biāo)分析物附著的ifbm’s的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了用促進(jìn)目標(biāo)分析物特異性識別和附著到器件表面的界面生物材料包覆醫(yī)療器件表面的材料和方法。
背景技術(shù)：
：矯形植入物用于各種關(guān)節(jié)置換和促進(jìn)人類和動物的骨骼恢復(fù)。根據(jù)醫(yī)藥行業(yè)分析，美國現(xiàn)在每年在病人中實(shí)施超過800,000例髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)置換，另外，還有幾十萬病人在所經(jīng)歷的外科手術(shù)中用到矯形植入物，例如，治療各種骨折或減輕嚴(yán)重背痛的矯形植入物。對于所有這些措施，需要有一種可控的、直接的、快速的治療方法。進(jìn)行關(guān)節(jié)置換的患者一般經(jīng)歷無并發(fā)癥的痊愈和功能的恢復(fù)。很不幸，并發(fā)癥的比例很高，包括"晚期損壞，，。人類全關(guān)節(jié)置換術(shù)的外科修正比例在0%到20%之間(Malchau等，(2002)"全髖關(guān)節(jié)置換預(yù)后瑞典國家髖關(guān)節(jié)成形術(shù)記錄中修正和再修正的結(jié)果更新和危險率分析"，1979-2000",美國整形外科學(xué)會第69屆年會科學(xué)展覽，達(dá)拉斯，德克薩斯，2002年2月13-17日；Fitzpatrick等，(1998)HealthTechnol.Assess.2:1-64;Mahomed等，(2003)J.BoneJointSurg.Am.85-A:27-32))。大多數(shù)的修正手術(shù)是由于植入物-骨骼接合面的損壞而必須做的。矯形植入物是由相對惰性的材料C"異質(zhì)成形的"材料)制成的，代表性的材料有金屬的、陶瓷的、或塑料的材料。以前改善矯形移植手術(shù)結(jié)果的方法主要集中在植入物表面的物理變化，使其增強(qiáng)骨骼形成。這些方法包括利用具有多應(yīng)用牙科植入物的方法也包括對局部增強(qiáng)的鈦表面的利用，其表面粗糙度是通過一些方法如吹砂、酸蝕、或氧化處理而實(shí)現(xiàn)的。雖然這些技術(shù)已經(jīng)對矯形移植手術(shù)的結(jié)果有所改善，但還存在著相當(dāng)大的進(jìn)一步的改善空間。已知對異質(zhì)成形的材料的組織反應(yīng)受到材料表面的細(xì)胞粘著的影響，已有大量研究致力于提高對異質(zhì)成形的材料的細(xì)胞粘著。已知體內(nèi)細(xì)胞之間的細(xì)胞粘著主要由細(xì)胞外基質(zhì)中的短的、暴露于細(xì)胞表面受體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域單元調(diào)控(LeBaron&Athanasiou(2000)TissueEng.6:85-103;Yamada(1997)MatrixBiol.16:137-141)。值得注意的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些被稱作整聯(lián)蛋白的受體與植入物表面的細(xì)胞粘著有關(guān)。已經(jīng)證明整聯(lián)蛋白和它們的目標(biāo)配體不^L可以刺激骨形成，而且可以刺激成骨細(xì)胞粘著和增殖(例如，可參見Kantlehner等，(2000)ChemBioChem1:107-114;Sarmento等，(2004)J.Biomed.Mater.Res.69A:351-358;Hayashibara等，(2004)J.BoneMineralRes.19:455-462)。整聯(lián)蛋白對于植入物粘附到靶細(xì)胞可能是有用的，并有可能以這種方式促進(jìn)植入物整合到相鄰的骨骼中。其它的研究表明，生長因子和細(xì)胞因子的局部表達(dá)可以增強(qiáng)組織在異質(zhì)成形的植入物表面的反應(yīng)。例如，Cole等((1997)Clin.Orthop.345:219-228)已經(jīng)證明生長因子可以促進(jìn)植入物的整合到相鄰的骨骼中("骨整合")并提高植入物表面附近的骨形成速度。也可參見美國專利第5,344,654號。刺激新的骨骼產(chǎn)生的生長因子("骨誘導(dǎo)蛋白，，)包括、但是不限于，血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-P)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP),以及相關(guān)家族成員。最有效的骨誘導(dǎo)蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)。總的說來，BMPs是共有一組保守半胱氨酸殘基和高水平序列同一性的TGF-P超家族的成員。已經(jīng)鑒定出超過15種不同的BMPs,并且大多數(shù)的BMPs刺激導(dǎo)致新的骨形成的級聯(lián)事件(參見美國專利Nos.5,013,649;5,635,373;5,652,118;和5,714,589;也可見以下綜述Reddi和Cunningham(1993)J.BoneMiner.Res.8Supp.2:S499-S502;IssackandDiCesare(2003)Am.J.Orthop.32:429-436;和Sykaras&Opperman(2003)J.OralSci.45:57-73))。這些導(dǎo)致新的骨形成的級聯(lián)事件包括間質(zhì)干細(xì)胞的遷移，骨誘導(dǎo)基質(zhì)的沉積，骨祖細(xì)胞的增殖，以及祖細(xì)胞分化為造骨細(xì)胞。已經(jīng)有很多研究致力于利用植入物表面或附近的BMPs以促進(jìn)植入物的骨整合(例如，參見Friedlander等，(2001)J.BoneJointSurg.Am.83-ASuppl.1(Pt.2):S151-58;Einhorn(2003)J.BoneJointSurg.Am.85-ASuppl.3:82-88;Burkus等，(2002)J.SpinalDisord.Tech.15(5):337-49)。然而，還存在一個未解決的問題，就是把有活性的BMP或其它活性生物分子移植或固定到植入物的表面。人們已經(jīng)證明，BMPs的遞呈是在植入物器件附近產(chǎn)生符合要求的骨形成的關(guān)健。基于骨形成的自然過程，人們已經(jīng)制作出了促進(jìn)移植的方法模型。在人類骨骼中，膠原蛋白既可作為骨形成的支架，又可作為BMPs的天然的載體。去礦化骨骼已經(jīng)成功地用作骨移植材料；去礦化骨的主要組分是膠原蛋白和BMPs(參見美國專利No.5,236,456)。已有許多基質(zhì)系統(tǒng)被開發(fā)出來，目的是使在基質(zhì)降解時，可以穩(wěn)定地釋放生長因子及其他生理活性物質(zhì)分子以促使骨形成。從聚合基質(zhì)中釋放BMP的效率取決于基質(zhì)的特征，例如BMP與基質(zhì)的親合性、再吸收率、密度、以及孔徑大小。用于這種基質(zhì)系統(tǒng)的材料包括那些在體內(nèi)容易水解變成惰性單體的有機(jī)聚合物。這樣的有機(jī)聚合物包括聚交酯、聚乙交酯、聚酐，以及聚原酸酯(參見美國專利Nos.4,563,489;5,629,009;以及4,526,909)。其它記載的可用于含BMP基質(zhì)的材料包括聚交酯和聚乙交酯的共聚物、藻朊酸鹽、聚(乙二醇)、聚氧化乙烯氧化物、聚羧乙烯，聚氧化乙烯氧化物、聚羧乙烯以及聚(乙烯醇)(參見美國專利No.5,597,897)。天然基質(zhì)蛋白也已經(jīng)用于向骨骼區(qū)域輸送BMPs;這些天然蛋白包括膠原蛋白、氨基多糖，以及透明質(zhì)酸，它們在體內(nèi)發(fā)生酶促消化(參見美國專利Nos.4,394,320;4,472,840;5,366,509;5,606,019;5,645,591;以及5,683,459)。人們發(fā)現(xiàn)，即使利用聚合基質(zhì)保留修復(fù)部位的BMP，但由于生長因子從基質(zhì)中快速擴(kuò)散，需要超過生理水平的BMP水平以促進(jìn)愈合。例如，利用一種膠原蛋白海綿l命送系統(tǒng)，兩天后加入到海綿里的BMP只保留了50%(Geiger等，(2003)Adv.DrugDel.Rev.55:1613-1629)。為了在必要的時)殳內(nèi)維才爭BMP的生理水平，需要很高的BMPs的起始劑量，這使得BMP療法更加昂貴，并且可能導(dǎo)致不良副作用，例如異位的骨形成或變態(tài)反應(yīng)，或形成中和抗體。類似的問題在其它的植入物中也同樣存在，比如肌腱和韌帶置換物、皮膚置換物、血管置換物、心臟起搏器、人工心臟瓣膜、乳房填充物、陰莖埋入物、斯坦特固定模、導(dǎo)尿管、分流器、神經(jīng)生長導(dǎo)向體、眼內(nèi)透鏡、傷口敷料，以及組織封閉劑。對于矯形植入物來說，涉及這些植入物的手術(shù)經(jīng)常發(fā)生類似創(chuàng)口愈合緩慢，以及植入物不恰當(dāng)?shù)卣系街車M織中等問題。因此，需要開發(fā)一種有成本效益的方法，用于將活性生物分子移植到植入物表面或與植入物結(jié)合以促進(jìn)手術(shù)后的愈合，以及促進(jìn)植入物如期望的那樣整合到周圍組織，例如相鄰的骨骼里。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種改進(jìn)的醫(yī)療植入物表面涂層。涂層包括至少一種界面生物材料(ifbM)，界面生物材料包括至少一個結(jié)合植入物或4直入物相關(guān)材料表面的結(jié)合單元("植入物單元")和至少一個結(jié)合目標(biāo)分析物或設(shè)計(jì)為具有預(yù)期效果的結(jié)合單元("分析物單元")。單元間通過接頭連接。在一些實(shí)施例中，IFBM涂層可起到促進(jìn)目標(biāo)分析物識別和附著在器件表面的作用。IFBM涂層通過促進(jìn)植入物的骨整合而改善移植的醫(yī)療器件的性能、促進(jìn)愈合、和/或減少移植部位發(fā)炎。圖1顯示展示典型的鈦結(jié)合多肽的噬菌體與鈦珠結(jié)合的比較(參見實(shí)施例1)。圖中顯示了對于不同的噬菌體(橫軸)與鈦珠結(jié)合的檢測信號(縱軸)。圖2顯示帶有C-末端生物素殘基的肽與鈦結(jié)合的對比(參見實(shí)施例1)。圖中表現(xiàn)了吸光度(縱軸)與肽濃度(juM,橫軸)的關(guān)系。圖3顯示兩種肽與鈦結(jié)合的對比(參見實(shí)施例2)。圖中表現(xiàn)了A405nm信號(縱軸)與肽濃度的關(guān)系(uM,橫軸)。圖中自上而下的線分別連接肽AFF6007和AFF6010的數(shù)據(jù)點(diǎn)。圖4顯示各種肽與BMP-2結(jié)合的對比(參見實(shí)施例3)。圖中表現(xiàn)了各種肽(標(biāo)記在橫軸上)的信號(AP率)。圖5顯示BMP在IFBMs與膠原海綿的結(jié)合中的效果(參見實(shí)施例4)。圖中表現(xiàn)了信號(縱軸)與BMP的nM濃度(橫軸)的關(guān)系。圖6A，6B,6C,和6D顯示實(shí)施例4中所述的實(shí)-驗(yàn)結(jié)果，證明BMP通過IFBM結(jié)合到膠原上既取決于加入海綿中的BMP的量，也耳又決于IFBM呈遞的量。圖中表現(xiàn)了吸光度(縱軸)與BMP濃度(橫軸)的關(guān)系。圖7顯示結(jié)合BMP-2并且包含基元1的選自表3和4的所有肽序列的分析結(jié)果(參見實(shí)施例3)。該圖表現(xiàn)了在多肽序列分析中對于每個所分析的位置每個氨基酸在該位置上出現(xiàn)的次數(shù)；例如，位置1上"G2"表示在該位置甘氨酸出現(xiàn)了2次。圖8顯示經(jīng)設(shè)計(jì)的寡核苷酸盒，其表達(dá)一種多肽(SEQIDNO:74)，該多肽中含有核心結(jié)合基元la,多肽中還包含在序列的其它位置鑒定出的共有殘基(參見實(shí)施例3)。圖中所示的核苷酸序列也出現(xiàn)在SEQIDNO:75和SEQIDNO:76中。圖9顯示利用常規(guī)ELISA評價BMP與多肽結(jié)合的相對親合力的結(jié)果(參見實(shí)施例3)。表示在縱軸上的ELISA信號(A405nm讀數(shù))與橫軸上的噬菌體微升數(shù)有關(guān)。在對應(yīng)于0.10微升噬菌體的數(shù)據(jù)點(diǎn)，圖中自上而下的線條分別連接以下數(shù)據(jù)點(diǎn)AP02陽61，APO2-40,AP02-41,AP02-26，AP02-35,AP02-59,AP02-44,mAEK,以及無噬菌體對照。圖10顯示選自表3和5的結(jié)合BMP-2并且包含基元2的所有多肽序列分析結(jié)果。圖中顯示在肽序列分析中，各氨基酸在每個所研究的位置出現(xiàn)的次數(shù)；例如，位置1上"G7"意思指甘氨酸在那個位置出現(xiàn)七次。圖中還顯示了從選自表3和7的包含基元2(SEQIDNO:93)的多肽序列對比而衍生的共有序列。該序列表現(xiàn)了經(jīng)所有多肽對比后在每個位置占優(yōu)勢的氨基酸。在所研究的序列中，最保守的氨基酸形成一個核心結(jié)合基元，命名為"Motif2a"(SEQIDNO:94)。'圖11顯示從另一種檢測BMP-結(jié)合活性的方法中得到的有代表性的結(jié)果，在該方法中結(jié)合發(fā)生在液相中(參見實(shí)施例3)。405nm的吸光度(縱軸)顯示為隨BMP的皮摩爾數(shù)(橫軸)而變化。該結(jié)果用于計(jì)算每種BMP-結(jié)合多肽與BMP-2的親合力(參見表6)。在對應(yīng)于一皮摩爾BMP的數(shù)據(jù)點(diǎn)，圖中自上而下的線條分別連接以下數(shù)據(jù)點(diǎn)2006，2007，2008，2009,2011，以及2012。圖12顯示在一項(xiàng)試驗(yàn)中檢驗(yàn)幾種多肽結(jié)合BMP-2,BMP-4，以及BMP-7的能力的結(jié)果(參見實(shí)施例3)。多肽2007和2011首次鑒定為BMP-2結(jié)合多肽，而多肽卯01首次鑒定為與無關(guān)目標(biāo)結(jié)合。'具體實(shí)施方式發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種改進(jìn)的涂層，它用于醫(yī)療器件表面，促進(jìn)多肽，蛋白質(zhì)，藥物或細(xì)胞對器件的附著。涂層是一種包括相結(jié)合的多個結(jié)合單元的界面生物材料(IFBM)。IFBM包括至少一個與植入物或植入物相關(guān)材料表面結(jié)合的結(jié)合單元("植入物單元")和至少一個與目標(biāo)分析物結(jié)合或具有預(yù)期效果的結(jié)合單元("分析物單元，，)。示范性的結(jié)合單元包括，例如，在序列表(SEQIDNOs:1-74和77-96)中所提供的多肽序列。單元間通過接頭連接。在一些實(shí)施例中，IFBM的結(jié)合單元非共價結(jié)合到植入物表面。同樣，在一些實(shí)施例中，分析物單元非共價地結(jié)合到目標(biāo)分析物上。在一個實(shí)施例中，植入物單元和分析物單元包括兩個獨(dú)立的多肽分子，使得植入物單元與植入物材料結(jié)合，而分析物單元特異地與一種生長因子或細(xì)胞結(jié)合。在一些實(shí)施例中，植入物單元和分析物單元通過一個中間的高分子連接。典型地，這些結(jié)合單元分別非共價結(jié)合植入物材料或目標(biāo)分析物。在分析物單元不是與目標(biāo)分析物結(jié)合而是具有一種預(yù)期效果的例子中，分析物單元可以，例如，通過向移植部位募集細(xì)胞而模擬生長因子的作用。IFBM選擇方法和結(jié)構(gòu)可參見美國專利申請第10/300,694號的記載，其于2002年11月20日申請，2003年10月2日公布，公布號20030185870，本文引入作為參考。"特異地結(jié)合"或"特異的結(jié)合，，指的是植入物單元或分析物單元與選擇的植入物材料或選擇的分析物結(jié)合。在一些實(shí)施例中，特異地結(jié)合一種植入物材料或分析物的單元，與材料或分析物的結(jié)合，至少相當(dāng)于該單元與一種適當(dāng)?shù)膶φ瘴锝Y(jié)合的10%,20%,30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%,200%,300%,400%,500%,或更高百分比。對照物例如，一種用于才直入物的不同材料，一種不用于植入物的材料，或者一種特定用于某一目的的蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白。"分析物，，指的是在植入手術(shù)后改善植入物骨整合，或者促進(jìn)或加速周圍組織愈合的任何物質(zhì)或分子的某部分。作為分析物單元結(jié)合對象的適當(dāng)?shù)姆治鑫锇?、但不限于生長因子，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs，例如，BMP-7和BMP-2)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子-(3(TGF-P)，胰島素生長因子-1(IGF-1)，胰島素生長因子-2(IGF-2),成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，神經(jīng)生長因子(NGF)，和胎盤生長因子。適當(dāng)?shù)姆治鑫镆舶蛇_(dá)到本發(fā)明目的的激素、酶、細(xì)胞因子，及其它生理活性物質(zhì)或分子的某部分；也就是說，在植入手術(shù)后促進(jìn)植入物的骨整合和/或改善周圍的組織愈合。適當(dāng)?shù)姆治鑫镆舶?xì)胞，例如，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，干細(xì)胞，祖細(xì)胞，血小板，以及其它在骨整合和愈合中起作用的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，分析物單元可以包括結(jié)合細(xì)胞或通過與細(xì)胞或受體結(jié)合而具有生物活性的多肽序列，例如，多肽序列RGD，YIGSR，和IKVAV,本領(lǐng)域中已知其具有特定的生物學(xué)活性。例如，可參見Hersel等，(2003)Biomaterials24:4385-4415;Grant等，(1990)Ann.N.Y.Acad.Sci.588:61-72;Hosokawa等，(1999)Dev.GrowthDiffer.41:207-216。在一些實(shí)施例中，分析物單元包括結(jié)合BMP-2和/或摹擬BMP-2效果的多肽序列，例如示范性的序列SEQIDNOs:11—28，44-74,或77-94。與細(xì)^J吉合的分析物單元可以包括一種多肽，該多肽包含一個可與多種不同類型的細(xì)胞結(jié)合的通用細(xì)胞附著序列，或者它可以包括一種多肽，該多肽與特定類型的細(xì)胞結(jié)合，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨祖細(xì)胞，或干細(xì)月包。術(shù)語"植入物"泛指一種被引入到人體或動物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)物，用于恢復(fù)受損傷組織的功能或者提供一種新的功能。植入物器件可以如本發(fā)明所公開的那樣，用結(jié)合劑能夠特異結(jié)合的任何生物相容性材料制造。典型的植入物包括但不限于髖內(nèi)假體、人造關(guān)節(jié)、頜或面部植入物、腱和韌帶置換物、皮膚置換物、骨骼置換物和人造接骨螺釘，骨移植器件、血管修復(fù)體、心臟起搏器、人造心臟瓣膜、乳房填充物、陰莖植入物、斯坦特固定模、導(dǎo)液管、分流器、神經(jīng)生長導(dǎo)向體、眼內(nèi)透鏡、傷口敷料，以及組織封閉劑。植入物由本領(lǐng)域公知的各種材料組成，包括但不限于聚合物或聚合物的混合物，例如包括，聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚酑、聚原酸酯、聚苯乙烯聚碳酸酯、尼龍、PVC、膠原(包括，例如，經(jīng)處理的膠原，如交聯(lián)的膠原)、氨基多糖、透明質(zhì)酸、藻朊酸鹽、蠶絲、纖維蛋白、纖維素，以及橡膠；塑料，例如聚乙烯(包括，例如，高密度聚乙烯(HDPE)),PEEK(聚醚醚酮)，以及聚四氟乙烯；金屬，例如鈦、鈦合金、不銹鋼、以及鈷鉻鑄造合金；金屬氧化物；非金屬氧化物；硅樹脂；生物活性玻璃；陶瓷材料，例如，氧化鋁、氧化鋯，以及磷酸4丐；其它的適當(dāng)材料，例如去礦化骨基質(zhì)；以及它們的混合物。本發(fā)明中使用的術(shù)語"聚合物"指的是任何龐大的天然的以及合成的高分子量化合物，由高達(dá)上百萬的重復(fù)連接的單位組成，每個單位是一個相對簡單的分子。本發(fā)明中使用的術(shù)語"植入物"包括與植入物相關(guān)聯(lián)的植入物相關(guān)材料，它與植入物一起被引入到人體或動物體中。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，IFBM產(chǎn)生一個結(jié)合界面，介導(dǎo)生長因子附著到才直入物表面。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的植入物在植入物表面附著有生長因子；生長因子從植入物位點(diǎn)向外擴(kuò)散的速率依賴于分析物單元對所述生長因子的親合力而變化，因此植入物可制備成具有不同的生長因子滲透速率。在涉及生長因子附著到植入物表面的實(shí)施例中，生長因子具有積極效果，例如，加速愈合過程、減少愈合所需要的生長因子數(shù)量，以及將生長因子超生理劑量引起的副作用最小化。生長因子具有特定的重要性，或者作為分析物單元，或者作為與分析物單元結(jié)合的因子，它包括，例如，BMP-2,BMP-7,PDGF,FGF,以及TGF(3。因此本發(fā)明提供制備一種植入物的方法，該植入物通過手術(shù)置入病人體內(nèi)，其中該器件表面包覆至少包括一種IFBM的涂層。在一些實(shí)施例中，該方法包括以下步驟(a)將一種IFBM涂層包覆于植入物表面，其中IFBM包括一個與植入物特異性結(jié)合的植入物單元和一個與生長因子特異結(jié)合的分析物單元；(b)通過浸漬、噴霧，或刷涂含有生長因子的溶液，將生長因子涂于植入物表面；(c)利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的適當(dāng)?shù)氖中g(shù)方法將植入物放置到患者體內(nèi)。換言之，一種包覆植入物表面、使得該植入物器件促進(jìn)生長因子附著的方法包括以下步驟(a)在植入物表面涂上IFBM涂層，其中該IFBM包括一個特異結(jié)合植入物的植入物單元和一個在移植部位特異結(jié)合生長因子的分析物單元；以及(b)把植入物置入患者體內(nèi)的移植部位；由此宿主內(nèi)生成的生長因子通過IFBM與植入物結(jié)合。植入物位點(diǎn)遞呈的生長因子提高增強(qiáng)鄰近的組織愈合和才直入物整合到鄰近的組織里。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，IFBM介導(dǎo)細(xì)胞附著到才直入物表面。通過增強(qiáng)細(xì)胞粘著和組織整合，本發(fā)明的IFBMs可以加速愈合和改善植入物器件的功能。因此，根據(jù)本發(fā)明，一種制備通過手術(shù)置入患者體內(nèi)的植入物的方法包括(a)將IFBM包覆于植入物表面，其中IFBM包括至少一個特異結(jié)合植入物的植入物單元和至少一個特異結(jié)合至少一種類型細(xì)胞的分析物單元；以及(b)4巴纟直入物置入患者的移植部位，憑此，細(xì)胞與植入物表面的IFBM涂層結(jié)合。在一些實(shí)施例中，一種制備植入物的方法包括(a)將IFBM涂到植入物表面，其中IFBM包括至少一個特異地結(jié)合植入物的植入物單元和至少一個特異結(jié)合至少一種類型細(xì)胞的分析物單元；以及(b)將細(xì)胞涂布到植入物表面，例如，通過將植入物浸漬在包含該細(xì)胞的溶液中或在植入物表面刷涂包含該細(xì)胞的溶液。然后，可以將該一直入物置入患者體內(nèi)(也即，人類患者或患病的動物體內(nèi))。本發(fā)明中所使用的"患者"指的是人類或者動物患者。在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，一種植入物表面包覆有超過一種IFBM,目的是提供一種多功能的涂層。例如，一種植入物涂層可以包括具有結(jié)合一種細(xì)胞的分析物單元的第一種IFBM，以及具有結(jié)合一種生長因子的分析物單元的第二種IFBM。包括這些IFBMs的涂層可使細(xì)胞和生長因子兩者都結(jié)合到植入物表面。在一些實(shí)施例中，涂層中的這些IFBMs相互混合，使得結(jié)合的生長因子與結(jié)合的細(xì)胞緊密的接近。在一個實(shí)施例中，涂層包括一種與間質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合的IFBM和一種與生長因子BMP-2結(jié)合的IFBM;BMP-2將會引發(fā)干細(xì)月包分化成成骨細(xì)胞。在其它的實(shí)施例中，植入物涂層可以包括至少兩種不同的IFBMs的混合物，這些IFBMs的植入物單元和/或其分析物單元不同。在另一個實(shí)施例中，涂層包括一種多功能的IFBM,其具有兩個分析物單元，其中一種與細(xì)胞結(jié)合，另一種與生長因子結(jié)合。結(jié)合單元(也即，植入物單元和/或分析物單元)可以是多肽、抗體或抗體片段、多核普酸、寡核香酸、包括任何這些物質(zhì)的復(fù)合物，或不同的分子和/或化合物。多肽的結(jié)合單元可以如待審美國專利申請第10/300,694號中所述，該專利于2002年11月20日申請，2003年10月2日/>布，乂>開號20030185870。在一些實(shí)施例中，結(jié)合單元可以通過篩選與包括生物相容性材料(即，"生物材料，，)，例如鈦、不銹鋼、鈷-鉻合金、聚氨基曱酸酯、聚乙烯或硅樹脂的材料相結(jié)合的噬菌體展示文庫而鑒別出來。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，分析物單元是一種生物活性肽或與生物活性肽結(jié)合。如本領(lǐng)域公知，生物活性肽可以是保持天然蛋白質(zhì)生物效應(yīng)的天然蛋白質(zhì)片段。例如，TP508是一種衍生自凝血酶的合成多肽，相當(dāng)于人凝血酶氨基酸183-200，并且已被證實(shí)可加速骨折愈合(例如，參見Wang等，(2002)TransORS27:234)。人們認(rèn)為，TP508是通過該多肽內(nèi)部的RGD序列介導(dǎo)的，RGD序列與存在于細(xì)胞表面的整合素結(jié)合(例如，參見Tsopanoglou等，(2004)ThrombHaemost.92(4):846-57)。同樣，P-15是一種I型膠原:的15氨基酸多肽，相當(dāng)于膠原的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，參見Yang等，(2004)TissueEng.10(7-8):1148-59)。P-15被證實(shí)可增強(qiáng)新骨形成(例如，參見Scarano等，(2003).ImplantDent.12(4):318-24)。生物活性肽還可以是生長因子的片段。例如，Saito等，(JBiomedMaterResA.200572A(1):77-82)已證實(shí)一種相當(dāng)于BMP-2氨基酸73-92的合成多肽保持著BMP-2的生物學(xué)活性，包括與BMP-2受體結(jié)合，激活基因表達(dá)以及誘導(dǎo)異位的骨形成。任何植入物單元可以同任何分析物單元結(jié)合，以產(chǎn)生本發(fā)明的IFBM，只要能提供所期望的活性；就是說，只要IFBM特異地與一種適當(dāng)?shù)闹踩胛锝Y(jié)合并且具有分析物單元賦予的適當(dāng)?shù)男Ч?，即結(jié)合BMP-2的能力就可以。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會，可以把不同類型以及數(shù)量的植入物單元與不同類型以及數(shù)量的分析物單元結(jié)合，以產(chǎn)生本發(fā)明的IFBM。因此，舉例來說，一或多種植入物單元可以與一或多種分析物單元連接以產(chǎn)生IFBM。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)制造植入物的材料以及分析物單元(們)賦予的期望活性來選擇適當(dāng)?shù)闹踩胛飭卧?們)和分析物單元(們)。本發(fā)明中使用的術(shù)語"抗體"包括單鏈抗體。因此，用作結(jié)合單元的抗體可以是單鏈可變片段抗體(scFv)。單鏈抗體是一種包括連接在一起的可變重鏈和可變輕鏈的抗體，連接方式可以是直接連接或者通過一個多肽接頭連接，以形成連續(xù)多肽。本發(fā)明中使用的術(shù)語"單鏈抗體"包含一種免疫球蛋白或其功能部分，包括但不限于單克隆抗體、嵌合抗體、雜化抗體、誘變抗體、人源化抗體、以及包括抗原結(jié)合部位的抗體片段(例如，F(xiàn)ab和Fv抗體片段)。噬菌體展示技術(shù)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。利用噬菌體展示，可將各種多肽的文庫呈遞給目標(biāo)底物，并選擇特異結(jié)合該底物的多肽用作結(jié)合單元。也可經(jīng)過多輪系列選才奪，稱作"淘選"。如本領(lǐng)域乂>知，任何一種類型的文庫和淘選方法都可以用于鑒別出對于本發(fā)明的方法有用的結(jié)合單元。例如，抗體或抗體片段文庫可以用于鑒別出結(jié)合特定的細(xì)胞群體或病毒的抗體或片段(例如，參見美國專利Nos.6,174,708;6,057,098;5,922,254;5,840,479;5,780,225;5,702,892;以及5,667,988)。淘選方法可以包括，例如，液相篩選、固相篩選，或基于細(xì)胞的篩選。一旦鑒別出一個候選結(jié)合單元，可利用定向或隨機(jī)誘變來優(yōu)化該結(jié)合單元的結(jié)合性質(zhì)。術(shù)語"細(xì)菌噬菌體，，和"噬菌體，，同義，在本發(fā)明中可互換使用。文庫可以包括分子的隨機(jī)的集合。另外，文庫也可以是包括具有偏好某一特定序列、結(jié)構(gòu)或構(gòu)象的分子集合。例如，可參見美國專利第5,264,563號和第5,824,483號。包含數(shù)目不同的各種類型分子的文庫的制備方法對于本領(lǐng)域是已知的，并且許多文庫也是市場上可買到的。制備噬菌體文庫的方法可見于，例如,Kay等，(1996)PhageDisplayofPeptidesandProteins(圣地亞哥，Academic出版社)；Barbas(2001)PhageDisplay:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratory出版社，ColdSpringHarbor,NY)。一個多肽結(jié)合單元(即植入物單元或分析物單元)包括大約3，4，5,6，7，8，9,10，11,12,13,14，15，16,17,18，19,20，21,22，23,24,25，26，27，28，29，30,31，32,33，34，35，36，37，38，39，40，50，60,70,80,90,100,200，或高達(dá)300個氨基酸?？捎米鹘Y(jié)合單元的多肽可以是線形的、分枝的，或環(huán)狀的，并且可以包括非肽基部分。術(shù)語"多肽"泛指一種氨基酸鏈，包括天然氨基酸、合成氨基酸、基因編碼的氨基酸、非基因編碼的氨基酸，以及它們的混合。多肽可以既包括L-型又包括D-型氨基酸。用作結(jié)合單元的多肽可以進(jìn)行不同的變化，置換，插入，缺失，只要這種變化能給它的應(yīng)用提供益處。因此、術(shù)語"多肽"包括任何類型的多肽衍生物，包括，例如，酰胺、與蛋白的綴合物，環(huán)酮多肽、聚合多肽、保守替換變體、類似物、片段、化學(xué)修飾的多肽，以及多肽模擬物。任何具有期望的結(jié)合特性的多肽都可被用于本發(fā)明。典型的非基因編碼的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；P-丙氨酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基異丁酸；3-氨基異丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；鎖鏈賴氨素；2,2'-二氨基庚二酸；2,3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羥基賴氨酸；另iJ-羥基賴氨酸；3-羥脯氨酸；4-羥脯氨酸；異鎖鏈賴氨素；另'J-異亮氨酸；N-曱基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基異亮氨酸；N-曱基纈氨酸；正纈氨酸；正亮氨酸；和鳥氨酸。典型的氨基酸衍生物包括，例如，游離氨基衍生為胺氯化物，p-甲苯磺酰基基團(tuán)，芐氧羰基基團(tuán)，t-丁基氧羰基基團(tuán)，氯乙酰基基團(tuán)或醛基基團(tuán)的分子。游離羧基可經(jīng)衍生而形成鹽、甲基和乙酯或其它類型的酯或酰肼。游離羥基可以經(jīng)衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-亞胺基-苯曱基組氨酸。術(shù)語"保守替換變體，，指的是一種多肽，其氨基酸殘基序列大體上和一個對照多肽序列相同，其中一個或多個殘基用功能類似的殘基保守地替換，使得該保守替換變體能夠以與母體變體基本上相同的親合力與相同的結(jié)合對象結(jié)合，并且可以阻止母體變體的結(jié)合。在一個實(shí)施例中，一個保守替換變體表現(xiàn)出與對照多肽類似的結(jié)合特異性。短語"保守替換變體"也包括其中一個殘基被一個化學(xué)衍生殘基替換的多肽。保守性替換的例子包括一個非極性的(疏水的)殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或曱硫氨酸替換為另一氨基酸；一個芳香殘基例如色氨酸、酪氨酸，或苯基丙氨酸替換為另一氨基酸；一個極性(親水的)殘基替換為另一氨基酸，例如在精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酰胺和天門冬酰胺之間，在甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和絲氨酸之間替換；將基本氨基酸如賴氨酸、精氨酸或組氨酸替換為另一氨基酸；或?qū)⒁粋€酸性的殘基例如天冬氨酸或谷氨酸替換為另一氨基酸。盡管本發(fā)明公開了作為本發(fā)明的IFBMs中的結(jié)合單元的示范性多肽序列(例如，在序列表的SEQIDNOs:1-74和77-96)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會，序列所帶來的結(jié)合性質(zhì)或其它性質(zhì)應(yīng)只歸因于包括在該序列中的一些氨基酸。作為本發(fā)明的結(jié)合單元的多肽也可以包括相對于本發(fā)明中公開的示范性的多肽序列具有一個或多個替換、添加和/或缺失的殘基的多肽，只要所期望的結(jié)合性質(zhì)能夠保持。因此，本發(fā)明的結(jié)合單元包括與本發(fā)明公開的示范性序列差別約1，2,3,4,5，6,7,8,9,10，11，12，13,14，15，16，17，18,19，或20個氨基酸的多肽，但其保持了其相應(yīng)的示范性的序列結(jié)合特定材料或者作為一個分析物單元的能力。利用適當(dāng)檢測方法測量，與本發(fā)明公開的示范性序列不同的本發(fā)明的結(jié)合單元保持了包括完整的本發(fā)明公開的示范性序列的結(jié)合單元活性的至少25%,50%，75%，或100%。就是說，本發(fā)明的結(jié)合單元包括與本發(fā)明公開的示范性的序列所共有同一性至少有70%,75%，80%，81%，82%，83%，84%,85%,86%,87%，88%,89%,卯％,91%,92%，93%，94%，95%,96%,97%，98%,99%,或具有更高的序列同一性。序列同一性可以人工計(jì)算或利用電腦執(zhí)行數(shù)學(xué)算法進(jìn)行計(jì)算，例如，Genetics電腦集團(tuán)的威斯康辛遺傳學(xué)程序包中的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA，和TFASTA，版本10(可購自Accelrys，9685ScrantonRoad，圣地亞哥，加利福尼亞，92121，美國)。威斯康辛遺傳學(xué)程序包的版本10中所應(yīng)用的打分矩陣是BLOSUM62(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA89:10915)。使用該程序進(jìn)行的比對可利用缺省參數(shù)進(jìn)行。多肽可以經(jīng)過修飾，例如，通過末端-NH2酰化作用(例如，乙酰化，或巰基乙酸酰胺化)或通過末端-羧基酰胺化作用(例如，與氨或曱胺)發(fā)生酰胺化作用而修飾。末端修飾作用有利于降低對蛋白酶消化的敏感性，因此延長多肽在溶液中的半壽期，特別是在存在有蛋白酶的生物液體中。'多肽環(huán)化也是一種有用的修飾作用，因?yàn)榄h(huán)化作用形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并且兼顧到該環(huán)肽所保有的生物學(xué)活性。將多肽環(huán)化的方法已有記載，例如，Schneider和Eberle(1993)Peptides.1992:1992年9月13日至19日在瑞士的因特拉肯市和荷蘭的伊斯卡姆市及萊頓市舉行的第22屆歐洲多肽研討會(ProceedingsoftheTwenty-SecondEuropeanPeptideSymposium,September13-19,1992，Interlaken，Switzerland,Escom,Leiden,TheNetherlands)。可選地，結(jié)合單元多肽可以包括一個或多個經(jīng)修飾后含有一個或多個面素，例如氟、溴，或碘的氨基酸，以促進(jìn)與接頭分子連接。本發(fā)明使用的術(shù)語"多肽"也包括其中一個或多個肽鍵被擬肽鍵取代，擬肽鍵包括但不限于carba鍵(CH2-CH2),depsi鍵(CO-O),幾基亞乙基鍵(CHOH-CH2)，亞甲基酮鍵(CO-CH2)，亞甲基-氧鍵(CH2-0),還原鍵(CHrNH),硫亞甲基鍵(CH2-S),N-修飾鍵(-NRCO-)，以及硫肽鍵(CS-NH)。例如，參見，Garbay-Jaureguiberry等，(1992)Int.J.Pept.ProteinRes.39:523-527;Tung等，(1992)Pept.Res.5:115-118;Urge等，(1992)Carbohydr.Res.235:83-93;Corringer等，(1993)J.Med.Chem.36:166-172;Pa糧e等，(1993)Int.J.Pept.ProteinRes.41:15-20。特異性結(jié)合到本發(fā)明所考慮的表面(包括鈦、不銹鋼、膠原，以及聚羥基乙酸(PGA))，并適于用作本發(fā)明的IFBMs中的結(jié)合單元的典型多肽顯示于序列表中，并在下面作進(jìn)一步說明。盡管本發(fā)明公開了示范性的多肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)'會，這些序列所帶來的結(jié)合性質(zhì)可以只歸因于包括在該序列中的一些氨基酸。因此，一個只包括本發(fā)明所/>開的示范性序列中的一部分的序列也可以與全長的示范性序列有基本相同的結(jié)合性質(zhì)。因此，還可用作結(jié)合單元的是那些只包括特定的示范性序列中的3，4,5,6,7,8,9，10，11，或12個氨基酸的序列，并且這些氨基酸在示范性序列中可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。這樣的氨基酸可以集中在示范性多肽的氨基末端(例如，4個氨基酸可以集中在該多肽的前5，6,7,8,9,10，11，或12個氨基酸中)或者它們分散于整個示范性多肽，但仍然決定著該多肽的結(jié)合性質(zhì)。例如，特異結(jié)合BMP-2的多肽可以包括全部或部分的序列基元，如實(shí)施例3的描述，且顯示在SEQIDNO:27或28。因此，特異結(jié)合BMP-2的多肽可能具有符合該序列基元的每個必需條件的序列，如SEQIDNO:27或28，也可能具有符合該序列基元中的1,2，3，4，5，6,7，8,9，或10個必需條件的序列。顯示于SEQIDNO:27中的序列基元可被稱作具有四個"必需條件"，其限定了在位置l,4，6，以及7出現(xiàn)的氨基酸。特異結(jié)合BMP-2的多肽可以具有如SEQIDNO:11所顯示的序列，它符合全部的四個必需條件，也可以具有如SEQIDNO:21所顯示的序列，它符合四個必需條件中的三個。這兩種類型的序列都在本發(fā)明提供的范圍之內(nèi)。在一些實(shí)施例中，IFBM經(jīng)過構(gòu)建使其摹擬蛋白質(zhì)生長因子的生物效應(yīng)。在這些實(shí)施例中，分析物單元包括一種多肽，其含有與BMP受體BMPRI結(jié)合的氨基酸序列，還含有與BMP受體BMPRII結(jié)合的氨基酸序列(例如，參見實(shí)施例6)。這些受體是本領(lǐng)域公知的，并且可在市場上買到(例如，R&DSystems,明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州，目錄號315-BR和811-BR)。在這些實(shí)施例中，分析物單元具有經(jīng)測量的BMP活性，例如，通過本領(lǐng)域/>知的方法以及實(shí)施例6中所描述的方法進(jìn)行測量。盡管本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，但我們相信，通過將每個BMPRI和BMPRII結(jié)合，分析物單元將會促進(jìn)這些受體的異源二聚作用，從而觸發(fā)經(jīng)由BMP-SMAD通路的信號。以這樣的方式，IFBM可被構(gòu)建并用于涂在植入物表面，以便觸發(fā)經(jīng)由BMP-SMAD通i各的信號，而不用添加BMP本身。一般來說，在天然的BMP-SMAD通路中，BMP的I型和II型受體的異源二聚體是必需的信號(例如，參見Chen等，(2004)GrowthFactors22:233-241)。二聚體形成使I型和II型受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域得以接近，使得結(jié)構(gòu)活化的II型受體激酶能磷酸化I型受體。I型受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的磷酸化激活其潛在的激酶活性，進(jìn)而激活Smad蛋白。從受體上釋放后，磷酸化的Smad蛋白與Smad4結(jié)合，該復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，與其它蛋白一起具有轉(zhuǎn)錄因子的功能并調(diào)節(jié)基因應(yīng)答(Chen等，(2004)GrowthFactors22:233-241)?？偲饋碚f，這可以稱為是下游的Smad或BMP-SMAD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且基因藉此而被激活。作為Smad或BMP-SMAD通路活化的結(jié)果而生成的蛋白可被稱為Smad活化的下游蛋白產(chǎn)物。作為本發(fā)明的結(jié)合單元的多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員7>知的任何多肽合成方法合成。例如，代表性的技術(shù)可以參見Stewart&Young(1969)固相多肽合成(SolidPhasePeptideSynthesis),(Freeman,舊金山，力口利牙畐尼亞)；Merrifield(1969)Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.32:221-296;Fields&Noble(1990)Int.J.Pept.ProteinRes.35:161-214;和Bodanszky(1993)多肽合成原理(Principle'sofPeptideSynthesis),2ndRev.Ed.(Springer-Verlag，柏才木)。典型的固相合成方法可以參見Andersson等，(2000)Biopolymers55:227-250，其中引用的參考文獻(xiàn)，以及美國專利第6,015,561號；第6,015,881號；第6,031,071號；和第4,244,946號。液相中的多肽合成記載于Schroder和Liibke(1965)多肽(ThePeptides)(Academic出版社，紐約，紐約州)。用于多肽合成中的適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)記載于上述文獻(xiàn)以及McOmie(1973)有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)(ProtectiveGroupsinOrganicChemistry)(Plenum出版社，倫敦)。多肽，包括含有非遺傳編碼氨基酸的多肽，還可以在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中生成，例如，Shimizu等，(2001)NatBiotechnol19:751-755所記載的系統(tǒng)。另外，具有指定氨基酸序列的多肽可以從商業(yè)來源購買(例如，Biopeptide公司，LLC,圣地亞哥，加利福尼亞；以及PeptidoGenics,利弗莫爾，加利福尼亞)。結(jié)合單元之間通過至少一個接頭連接以形成本發(fā)明的IFBM。在一些實(shí)施例中，組成IFBMs的粘接單元是合成的單一連續(xù)多肽；在這些實(shí)施例中，接頭只不過是多肽中的一個鍵。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，接頭可以由聚合物組成，包括合成聚合物或天然聚合物?？捎米鹘宇^的典型的合成聚合物包括但不限于聚醚(例如，聚乙二醇；PEG)、聚酯(例如,聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)、聚酰胺(例如,尼龍)、聚胺、聚丙烯酸、聚氨基曱酸酯、聚苯乙烯，及其它分子量為大約200道爾頓至大約1,000千道爾頓的合成聚合物。可用作接頭的典型的天然聚合物包括但不限于透明質(zhì)酸、藻朊酸鹽、硫酸軟骨素、纖維蛋白原、粘連蛋白、白蛋白、膠原，及其它分子量為大約200道爾頓至大約20,000千道爾頓的天然聚合物。聚合的接頭可以包括二嵌段聚合物、多嵌段共聚物、梳形聚合物、星形聚合物、枝狀聚合物、雜化的線形-枝狀聚合物，或無規(guī)共聚物。接頭還可以包括巰基(氨基)羧酸、丙烯酰胺羧酸、丙烯酰胺-胺基三乙撐羥基乙酸，及其衍生物。例如，可參見美國專利第6,280,760號。如果接頭包含多肽，該多肽可以包括公知的具有特定生物功能的序列，例如YGD和GSR。將接頭分子與結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的方法根據(jù)每個分子上存在的活性基團(tuán)而有所不同。利用活性基團(tuán)和分子連接的方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，可參見Goldman等，(1997)CancerRes.57:1447-1451;Cheng(1996)Hum.GeneTherapy7:275-282;Ned等，(1997)Nat.Biotechnol.19:958-961;Nabel(1997)CurrentProtocolsinHumanGenetics,它記錄在CD國ROM(JohnWiley&Sons，紐約)上；Park等，(1997)Adv.Pharmacol.40:399-435;Pasqualini等，(1997)Nat.Biotechnol.15:542-546;Bauminger&Wilchek(1980)Meth.Enzymol.70:151-159;美國專利第6,280,760號和第6,071,890號；以及歐洲專利第O439095號和第0712621號。包覆醫(yī)療器件表面可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行，例如，通過浸潰、噴霧，或在器件上刷涂IFBM。涂層可以經(jīng)穩(wěn)定處理，例如，通過干燥或通過冷凍干燥。但是，這些處理不是排他的，其它的涂層和穩(wěn)定方法也可應(yīng)用。適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域中是已知的。例如，可參見Harris等，(2004)Biomaterials25:4135-4148以及美國專利申請第10/644,703號，其于2003年8月19曰申請，2004年5月6日7>布，/>開號是20040087505。以上特別提到的全部出版物和專利申請是本發(fā)明所從屬的領(lǐng)域中的技術(shù)人員水平時代表。本發(fā)明引入全部的出版物和專利申請作為參考，其程度就好象特別指出每一個出版物或?qū)＠暾堃胱鳛閰⒖家粯?。存在于上述說明和相關(guān)附圖中的教導(dǎo)將有利于啟發(fā)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員對本文所闡迷的本發(fā)明的許多更改及其它實(shí)施例。因此，本發(fā)明應(yīng)被理解為不限于所公開的特定實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的更改以及其它實(shí)施例也包括在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。盡管本發(fā)明使用了專用名詞，但它們也可以用于一般的和描述性的意義，只是其目的不是用于限制。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施例1:分離結(jié)合鈦的多肽十種不同的噬菌體展示文庫用于篩選與鈦珠結(jié)合的多肽。用70%乙醇、40%硝酸、蒸餾水、70%乙醇，和丙酮清洗直徑約5/32英寸的鈦(Ti6ALfV)珠，以除去任何表面污染物。將每一個鈦珠放置于96-孔的聚丙烯平板(Nunc)的每個孔中。鈦上面的非特異性結(jié)合部位和聚丙烯表面用溶于磷酸鹽援沖鹽水(PBS;Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，目錄號P-3813)中的1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。平板在室溫下以50rpm搖動保溫1小時。然后將孔用300plPBS洗5遍。每個文庫稀釋在PBS+1%BSA中，以101()pfu/ml的濃度加入250|il。室溫下以50rpm搖動培養(yǎng)3小時后，用300jxl磷酸鹽援沖液-Tween20(PBS-T;Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，目錄號P-3563)清洗3次除去未結(jié)合的噬菌體。為了回收結(jié)合到鈥珠上的噬菌體，結(jié)合的噬菌體通過用50mM甘氨酸，pH2處理10分鐘，然后用100mM乙醇胺，pH12處理10分鐘而釋放出來。將洗脫的噬菌體集中，用200|il的200mMNaP04，pH7溶液中和。將洗脫的噬菌體和小珠直接加入處于2xYT培養(yǎng)基中的E.coiiDH5ctF'細(xì)胞?；旌衔镌?7。C,210rpm的搖床中保溫過夜。8500xg旋轉(zhuǎn)離心10分鐘后收集噬菌體上清液。第二輪和第三輪的選擇按照第一輪類似的方式進(jìn)行，利用笫一輪中得到的擴(kuò)增的噬菌體50jil作為進(jìn)料，用200piPBS+1%BSA稀釋。第四輪的選擇按照類似的方式進(jìn)行；但是洗滌方法改變。經(jīng)過4小時的結(jié)合反應(yīng)，珠子用PBS-T(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，目錄號P-3563)洗滌五遍，將珠子轉(zhuǎn)移到一個干+的具有2ml孔的聚丙烯平板中，向每孔中加入1mlPBS+1%BSA,并在室溫下以50rpm搖動培養(yǎng)過夜。次日早晨以第1-3輪所述的相同方法洗脫和擴(kuò)增噬菌體。然后分離單克隆噬菌體并通過對噬菌體池進(jìn)行平板稀釋檢測以獲得單個的噬菌斑。為了檢出與鈦特異結(jié)合的噬菌體，利用綴合到HRP上的抗-M13噬菌體抗體進(jìn)行常規(guī)ELISAs，然后加入顯色劑ABTS。噬菌體的相對結(jié)合強(qiáng)度通過ELISA中對與鈦結(jié)合的噬菌體連續(xù)稀釋而決定。測定編碼特異結(jié)合鈥的多肽的DNA序列。編碼多肽插入片段的序列位于噬菌體基因組內(nèi)，經(jīng)翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的展示在噬菌體表面的氨基酸序列。與鈦特異結(jié)合的典型多肽列于表I并顯示在SEQIDNOs:1-8。展示這些多肽的噬菌體與鈦珠的結(jié)合如圖l所示。表1:鈦結(jié)合多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>然后合成帶有c-末端生物素殘基的展示多肽，并測試其與鈦的結(jié)合。結(jié)果如圖2所示。簡單地說，將4分末溶于100%DMSO中配制1mM的多肽溶液作為多肽貯液。將多肽用PBS-T連續(xù)稀釋。鈦珠用溶于PBS中的1%脫脂奶粉封閉，與不同濃度的多肽在室溫下?lián)u動保溫1小時。珠子用PBS-T洗3遍。加入購自USB(美國生化試劑公司，目錄號11687)的抗生物素蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶(SA-AP)(與PBS-T1:1000)并在室溫下?lián)u動保溫1小時。珠子用PBS-T洗三遍，力口入PNPP(Sigma-Aldrich乂^司，SigmaFast片劑，目錄號N1891),并顯色大約10分鐘測定多肽SA-AP的量。將溶液轉(zhuǎn)移到一個透明的微量滴定板中，在分子動力學(xué)平板讀數(shù)器上進(jìn)行405nm吸光度讀數(shù)，通過這種方式進(jìn)行定量。多肽"9003"是本領(lǐng)域中公知的。該多肽是通過與己糖激酶結(jié)合的噬菌體展示而鑒定出來的；它作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對照(例如，可參見Hyde-DeRuyscher等，(2000)Chem.Biol.7:17-25)。實(shí)施例2:半胱氨酸殘基在鈦-結(jié)合多肽6007中的作用為了研究半胱氨酸殘基和二硫結(jié)構(gòu)在多肽6007與鈦結(jié)合中的作用，把存在于鈦-結(jié)合多肽AFF6007中的半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)換為絲氨酸殘基，從而合成AFF6010(表2)。多肽AFF6010的序列(SSSDKSHKHWYSYESKYGGSGSSGK)顯示于SEQIDNO:9,而多肽AFF6007的序列(SSSDKCHKHWYCYESKYGGSGSSGK)顯示于SEQIDNO:10。然后將多肽AFF6007和AFF6010與生物素綴合，并按下面的方法比較其與鈦珠的結(jié)合。鈦珠在室溫下用溶于PBS中的1%BSA封閉30分鐘。多肽AFF6007和AFF6010的貝i液通過將1-2mg多肽溶于水中而制備。每種多肽的最終濃度利用280nm下的吸光度和每種多肽的吸光系數(shù)而確定。AFF6007和AFF6010制備成200pM。然后對每種多肽樣品制備稀釋系列。將每種多肽用溶于PBS中的1%BSA稀釋三倍。將多肽與鈦珠在室溫下保溫1小時。接著用PBS/TweenTM20把珠子洗兩遍。然后把抗生物素蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶以1:500加入鈦J朱，在室溫下保溫30分鐘。用PBS/Tween20把珠子洗兩遍。用PNPP進(jìn)行顯色檢測，記錄405nm吸光度。結(jié)果如圖3所示，證明多肽AFF6007和AFF6010都與鈦結(jié)合。一種評價多肽與鈦時相對親合力的方法是測定能產(chǎn)生最大信號的一半時的多肽濃度(表2)。完全消除AFF6007中的半胱氨酸殘基使多肽與鈦的親合力下降了大約10倍，但沒有使親合力消失(表2)。因此，半胱氨酸不是與鈦結(jié)合所必不可少的，但它確實(shí)增強(qiáng)了多肽與鈦的親合力。表2:鈦-結(jié)合多肽的相對親合力樣品[多肽]1/2最大信號AFF60070.35|LiMAFF60103|iM實(shí)施例3:特異結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白2("BMP-2")的多肽多肽的分離和分析十種不同的噬菌體展示文庫用于篩選與BMP-2結(jié)合的多肽。BMP-2(Medtronic)用NHS-生物素(Pierce)生物素化以制備標(biāo)記蛋白，平均每個蛋白質(zhì)分子結(jié)合一個生物素。該蛋白固定在抗生物素蛋白鏈菌素(SA)包覆的平板上，作為噬菌體展示的對象。還有另一種展示蛋白的方法，根據(jù)廠家說明(Amersham-Pharmacia,參考編號18-1022-29,標(biāo)題為"CouplingthroughthePrimaryAmineofaLigandtoNHSactivatedSepharose4FastFlow"，105-108頁)利用NHS-琥珀酰亞胺化學(xué)作用，使BMP-2與瓊脂糖凝膠珠結(jié)合起來，并且珠子用作固相來分離未結(jié)合的噬菌體。經(jīng)過3輪選擇后，對于每種形式中選出的單獨(dú)的克隆測試其與SA包覆的平板上的BMP-2的結(jié)合能力，測試?yán)贸Ｒ?guī)ELISA技術(shù)進(jìn)行，利用與HRP綴合的抗-M13噬菌體抗體，然后加入顯色劑ABTS。測定編碼特異結(jié)合BMP-2的多肽的DNA序列。編碼多肽插入片段的序列位于噬菌體基因組內(nèi)，經(jīng)翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的展示在噬菌-體表面的氨基酸序列。與BMP-2特異結(jié)合的典型多肽列于表3并顯示在SEQIDNOs:11-26。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的示范性的結(jié)合單元只包括序列中以大寫字母顯示的部分。表3:特異結(jié)合BMP-2的多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>鑒定出的多肽屬于2種不同的"序列簇"。每個序列簇含有一個共有序列基元。對于BMP-結(jié)合多肽的第一個序列簇，其共有基元(命名為"基元r,并顯示于SEQIDNO:27)是芳香氨基酸-乂0<:-卩1160^"小氨基酸，，-Leu(芳香氨基酸=丁卬，Phe,或Tyr;XH壬何氨基酸；"小氨基酸"=絲氨酸，蘇氨酸，Ala，或甘氨酸)。基元1至少有一部分存在于SEQIDNOs:11-24,如上面表3所示。第二個序列簇基元(還顯示于SEQIDNO:28)包含序列(Leu或Val)陽X-Phe-Pro國Leu-(Lys或Arg)-Gly。該基元命名為基元2,存在于SEQIDNOs:25和26,如上面表3所示。示范性的結(jié)合單元還包括那些滿足本發(fā)明所鑒別出的這個和其它序列基元要求的序列(即，那些包含屬于這些基元序列的序列)。其它實(shí)驗(yàn)旨在確定與BMP-2結(jié)合的序列的附加特征。具體地說，為了確定這些基元周圍是否存在額外的優(yōu)選的氨基酸，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。設(shè)計(jì)中心文庫并克隆入mAEK噬菌體展示載體中，對于得到的噬菌體篩選與BMP-2結(jié)合的噬菌體，如下面進(jìn)一步詳述。設(shè)計(jì)基元l的中心文庫，使其表達(dá)含有下列序列的多欣X-X-X-X-X-(W/L/C/Y/F/S)-X-X-(W/L/C/Y/F/S)-X-(A/G/N/S/T)-(L/F/I/M/V)-X-X-X-X-X,其中X代表20種天然氨基酸的任何一種，括號中的位置只限于括號中所列氨基酸。這些多肽由包含序列5'KNNKNNKNNKNNKTCTAGAGCGCTACG3'的寡核苷酸編碼的(其中"N"是4種核苷酸A，G,C或T中的任何一種；"K，，是G或T;"R，，是A或G;"S，，是C或G;"B，，是C，G，或T;和"Y，，是C或T)。設(shè)計(jì)基元2的中心文庫，目的是使其表達(dá)包含下列序列的多肽X-X-X-(L/F/I/M/V)-X-(W/L/C/Y/F/S)-(P/S/T/A)-(L/F/I/M/V)-(I/M/T/N/K/S/R)-X-X-X-X-X-X-X-X。這些多肽由包含以下序列的寡核苷酸編碼KNNK麗KNNKNNKTCTAGAGCGCTACG3'。下面提供關(guān)于基元1中心文庫的示范性的文庫構(gòu)建方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會，近似的策略可用于其它文庫。為了生成基元1的中心文庫，合成包含連接有適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)的上述序列的寡核苷酸。該寡核苷酸包含序列NK麗K麗KNNKNNKTCTAGAGCGCTACG-3'。在該序列中，下劃線標(biāo)注的序列CTCGAG和TCTAGA代表用于將文庫轉(zhuǎn)入噬菌體載體的Xhol和Xbal限制酶位點(diǎn)。將該寡核苷酸與短引物退火，用DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈。得到的雙鏈DNA分手用Xhol和Xbal消化，克隆到噬菌體展示載體中。連接的DNA轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)募?xì)菌宿主并進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生噬菌體文庫。如上所述，利用固定在抗生物素蛋白鏈菌素包覆的平板上的生物素化的BMP-2篩選與BMP-2結(jié)合的基元1和基元2中心文庫。經(jīng)過兩輪的BMP-2選擇后，文庫已經(jīng)富集了結(jié)合BMP-2的噬菌體展示多肽。富集的噬菌體池在細(xì)菌細(xì)胞的菌苔上鋪板，以分離單抹噬菌體。利用ELISA-典型檢測和綴合于HRP上的抗-M13噬菌體抗體(AmershamBiosciences公司，編號27-9421-Ol)檢驗(yàn)單抹噬菌體克隆與BMP-2的結(jié)合，然后加入顯色試劑ABTS(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，目錄號A3219)。確定編碼特異結(jié)合BMP-2的多肽的DNA序列。編碼插入多肽的序列位于噬菌體基因組內(nèi)，并經(jīng)過翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸序列，展示于噬菌體表面。特異結(jié)合BMP-2的基于基元的中心文庫的典型多肽列于表4和5，并顯示于SEQIDNOs:44誦71和77-92。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的示范性的結(jié)合單元只包含序列中大寫字母所示的部分，或只包含屬于一個基元或基于這些序列所鑒別出的共有序列(即，包括一個屬于基元l,基元la,或基元2范圍之內(nèi)的序列，或包含SEQIDNO:72，74,或93所鑒別出的共有序列)。表4:來自基元1中心文庫的BMP結(jié)合多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>圖7顯示結(jié)合BMP-2并且包含基元1的選自表3和6的所有多肽序列的分析結(jié)果。從40種含有基元1的BMP-結(jié)合序列的比對中可推導(dǎo)出一個共有序列(Gly-Gly-Gly-Ala-Trp-Glu-Ala國Phe-Ser國Ser-Leu-Ser-Gly-Ser-Arg-Val;SEQIDNO:72),它代表了在所有多肽進(jìn)行比對之后在每個位置出現(xiàn)的占優(yōu)勢的氨基酸。在40種序列中，最保守的氨基酸形成一個核心結(jié)合基元，代表了含有基元l的所有序列的子集。該基元命名為"基元la"，具有序歹'JTrp-X-X-Phe-X-X-Leu(SEQIDNO:73)。盡管本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)理，但我們相信，在這些基元中，多肽中的Trp,Phe，和Leu殘基參與和BMP-2蛋白的特異性相互作用，與多肽和BMP的結(jié)合有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，我們假設(shè)其它的包含這些核心結(jié)合基元的多肽也可以結(jié)合BMP。為了檢驗(yàn)這種看法，設(shè)計(jì)一種寡核苷酸盒，使其表達(dá)包含這種核心結(jié)合基元la的多肽，在多肽序列中還包含與核心結(jié)合基元結(jié)合的、經(jīng)鑒定出來的共有殘基(參見圖8;SEQIDNO:74)。附帶地，以前通過噬菌體展示分離的BMP-結(jié)合多肽中實(shí)際上沒有一個包含一模一樣的序列(例如，參見表4)。把寡核普酸盒克隆到mAEK噬菌體展示載體中，產(chǎn)生的噬菌體，命名為AP02-61，用來檢驗(yàn)與BMP-2的結(jié)合，并與其它展示BMP-結(jié)合多肽的噬菌體比較(一些噬菌體的結(jié)果示于圖9)。至少有一種檢驗(yàn)的噬菌體(命名為AP02-37)顯示的結(jié)合水平相當(dāng)于或低于展示載體mAEK。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的示范性的結(jié)合單元只包括序列中以大寫字母顯示的部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>對表3和7中包含基元2的多肽進(jìn)行比對可以得到一個共有序列(Gly-Gly-Ala-Leu陽Gly-Phe國Pro-Leu-Lys-GIy陽Glu-Val隱Val-Glu-Gly-Trp-Ala;SEQIDNO:93;參見圖10)，它代表著在所有的多肽進(jìn)行比對之后，在每個位置占優(yōu)勢的氨基酸。在所研究的序列中，最保守的氨基酸形成一個核心結(jié)合基元，命名為"基元2a"，具有序列Leu-X-Phe-Pro-Leu誦Lys-Gly(SEQIDNO:94)。基元2相比基元1在序列上有更多限制，表現(xiàn)在基元2在6個位置具有必需條件，而基元1只在三個位置具有必需條件?；?中的Pro和Gly殘基看來對于結(jié)合是必不可少的，因?yàn)槊總€包含基元2的BMP-結(jié)合多肽都在其核心結(jié)合基元中含有Pro和Gly殘基。利用基元2的共有序列信息，可將基元2核心結(jié)合基元合并到多肽序列中而設(shè)計(jì)BMP-結(jié)合多肽。制備合成多肽和BMP-2結(jié)合測定然后合成一套典型的具有C-末端生物素殘基的展示多肽，并4全測其與BMP-2的結(jié)合。結(jié)果顯示于圖4。簡單來說，將粉末溶于100%DMSO制備成10mM的多肽溶液作為貯液，然后加入水至最終^存濃度為溶于10%DMSO的1mM的多肽。將多肽用PBS-T連續(xù)稀釋。將濃度從100nM到0.1nM的BMP-2系列稀釋劑固定在微量滴定板(Immulon-4HBX，購自Dynex科技公司，尚蒂伊，弗吉尼亞)的孔上并用1。/。BSA封閉。這些平板與不同濃度的多肽在室溫下?lián)u動保溫1小時。珠子用PBS-T洗3遍。加入購自USB(美國生化試劑公司，抗生物素蛋白，目錄號11687)的鏈菌素-堿性磷酸酶(SA-AP)(l:1000于PBS-T中)并在室溫下?lián)u動保溫1小時。用PBS-T把平板洗3遍，加入PNPP(Sigma-Aldrich公司，SigmaFast片劑，目錄號N1891)確定多肽SA-AP的量并顯色10分鐘。在分子動力學(xué)平板讀數(shù)器上對405nm吸光度讀數(shù)進(jìn)行定量。結(jié)果總結(jié)在圖4中。為了印證這些BMP結(jié)合結(jié)果，還對這些多肽進(jìn)行另一種形式的測定，使多肽與BMP2在溶液中結(jié)合然后進(jìn)行測定。簡單來說，合成一種多肽，在該多肽的C-末端的賴氨酸殘基的氨基上結(jié)合一個生物素基團(tuán)。使生物素化的多肽(0-12皮摩爾)與BMP-2(0-25皮摩爾)在溶液中混合，并在聚丙烯平板中于37。C保溫30分鐘。將溶液轉(zhuǎn)入一個抗生物素蛋白鏈菌素包覆的平板中并在37°C保溫1小時，以俘獲生物素化的多肽。用TBS-TweenTM20洗滌平板，然后與抗-BMP抗體(1:IOOO稀釋；R&Dsystems)在室溫下保溫1小時。洗滌后，向平板中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的次級抗體，然后在室溫下保溫30分鐘。用TBS-Tween20洗滌平板，用發(fā)光的AP底物pNPP檢測結(jié)合的抗體。典型的結(jié)果示于圖11。根據(jù)該數(shù)據(jù)，估算出每種BMP-結(jié)合多肽與BMP-2的親合力(表6)。表6:估算出的BMP結(jié)合多肽與BMP-2的親合力多肽估算出的親合力(nM)20129200910200621201155200779200899BMP-2結(jié)合多肽與其它BMP蛋白的結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是TGF-P超家族的成員，包括BMPs,轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-P)和生長/分化因子(GDFs)。TGF-P超家族中的蛋白在結(jié)構(gòu)上非常類似。蛋白骨架的折疊結(jié)構(gòu)在該家族的所有成員中都基本相同。基于BMPs結(jié)構(gòu)上的類似性，我們檢測了一些BMP-2結(jié)合多肽與BMP-4和BMP-7的結(jié)合能力。用上面所述的方法檢測生物素化的多肽2007和2011與BMP-2,BMP-4，以及BMP-7的結(jié)合。2007和2011都與三種BMPs結(jié)合，而一個與無關(guān)目標(biāo)結(jié)合的多肽(AFF-9001)不與任何BMPs結(jié)合(圖12)。22實(shí)施例4:把BMP-2固定在膠原上以制備IFBM為了設(shè)計(jì)具有膠原和BMP-2結(jié)合性質(zhì)的分子，制備一類IFBM，個與膠原結(jié)合的多肽和一個與BMP-2結(jié)合的多肽。這類"雜合多肽于表7。表7:與膠原和BMP-2結(jié)合的IFBMs<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表7所示，每種IFBM在一個"雜合多肽"中包含來自AFF0016的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與一個短的接頭序列結(jié)合，然后連接有一個來自上述實(shí)施例的BMP結(jié)合序列。這些分子有兩種合成方向，以評估N-末端或C-末端位點(diǎn)對于IFBM與膠原或BMP-2結(jié)合的能力的影響。為了確定這些IFBM，s是否通過膠原海綿提高了BMP的數(shù)量，我們把IFBM與BMP混合，將混合物加入海綿，使其結(jié)合1.5小時，洗滌海綿并用抗BMP抗體檢測結(jié)合的BMP。簡單來說，稱取1-2mg多肽并溶于水中來制備IFBM貯液。分析280nm的多肽吸光度和消光系數(shù)以確定最終的多肽濃度。向聚丙烯微量滴定板的每一排的每一孔中加入20pL的多肽。然后向這些孔的每一個中加入BMP三倍稀釋劑系列，從32|aMBMP開始。使IFBM和BMP在室溫下混合30分鐘。其包括一"IFBM示向每一個孔中加入一個2/16直徑膠原海綿(Medtronic)。膠原和多肽溶液在室溫下保溫1.5小時。然后把海綿用200pL的Medtronic緩沖液在2200rpm離心1分鐘漂洗3遍上。向每一個海綿中加入抗BMP的初級抗體(l:1000,R&DSystems#MAB3552)，在室溫下保溫l小時。然后向體系中加入綴合于堿性磷酸酶(l:5000)的次級抗體，在室溫下保溫0.5小時。向體系中加入PNPP顯色，對405nm的吸光度進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果示于圖5。圖5中所示結(jié)果證明，IFBMAFF7010比沒有IFBM的海綿保留了更多的BMP。IFBMAFF7008和AFF7017相比不含IFBM提高了海綿上的BMP，但提高程度比AFF7010要差一些。加入AFF2006沒有提高在海綿上保留的BMP,AFF2006是一種不含有膠原結(jié)合序列的BMP結(jié)合多肽。為了證明這種效果不僅對于放在海綿上的BMP的數(shù)量是劑量依賴性的，而且對于所呈遞的IFBM的數(shù)量也是劑量依賴性的，制作一系列二維劑量反應(yīng)曲線，其中IFBM和BMP的濃度都發(fā)生變化。這些結(jié)果示于圖6A-6D,證明BMP與膠原海綿的結(jié)合既依賴于BMP濃度，也依賴于IFBM濃度。提高IFBM(AFF7005;AFF7006,AFF7009,或AFF7010)的濃度使得膠原上保留更大數(shù)量的BMP-2。實(shí)施例5:與不銹鋼結(jié)合的多肽對于不銹鋼結(jié)合多肽的選擇按照上述的鈦結(jié)合多肽進(jìn)行，只是用5/32英寸不銹鋼珠替代了鈦珠。分離的不銹鋼結(jié)合多肽示于表8。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的示范性的結(jié)合單元只包含序列中大寫字母部分。表8:不銹鋼結(jié)合多肽_噬菌體名稱多狀序列SEQIDNO:AP08-03ssSSYFNLGLVKHNHVRHHDSsr39AP08-02ssCHDHSNKYLKSWKHQQNCsr40AP08-01ssSCKHDSEFIKKHVHAVKKCsr41AP08-04ssSCHHLK麗THKESKMHHECsr42AP08-06ssVNK顧RLWEPLsr43實(shí)施例6:與特氟隆結(jié)合的多肽按照上面選擇鈦結(jié)合多肽的方法選擇與特氟隆(GoreTex;polytetrafuorethylene(PTFE))結(jié)合的多肽，只是用GoreTex材料代替鈦珠。分離的特氟隆結(jié)合多肽示于表9。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的示范性的結(jié)合分子包括的只有以大寫字母所示的序列。表9:特氟隆結(jié)合多肽克隆編號多肽序列SEQ.ID.NO.:API6-01ssCWSRFRLFMLFCMFYLVSsr95API6-02srCIKYPFLYCCLLSLFLFSsr9624實(shí)施例7:分離特異性結(jié)合BMPRI和/或BMPRII的多肽鑒定與BMPRI和/或BMPRII結(jié)合的多肽為了鑒別出特異結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體I(BMPRIA)和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體II("BMPRir)的多肽，篩選噬菌體展示文庫來鑒別編碼結(jié)合到每種受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多肽的噬菌體。這些受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ诒绢I(lǐng)域是公知的(Rosenweig等，(199"Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA92:7632-7636;TenDijke等，(1994)J.Biol.Chem.269:16985-16988)。對各個噬菌體文庫進(jìn)行篩選。適當(dāng)?shù)?，可對圍繞一個特定的氨基酸基元設(shè)計(jì)的，或者說產(chǎn)生特定氨基酸偏好的噬菌體文庫進(jìn)行篩選。把BMPRIA和BMPRII(R&DSystems,目錄號315-BR/CF和81l-BR)溶于碳酸鹽涂層緩沖液(100mMNaHC03，pH9.6);將100|il的這種溶液加入96孑L的Immulon-4微量滴定板(DynexTechnologies,尚蒂伊，弗吉尼亞)。將平板在4。C保溫過夜，用溶于碳酸鹽包被緩沖液中的1%牛血清白蛋白(BSA)封閉聚苯乙烯表面的非特異性結(jié)合部位。然后將平板在室溫下以50rpm搖動保溫一小時。然后用300)ilPBS-T(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，目錄號P-3563)把孔洗5遍。用PBS-T稀釋每種文庫，并以1010pfu/ml的濃度加入，總體積為100ul。平板在室溫下以50rpm搖動保溫3小時；未結(jié)合的噬菌體通過PBS-T洗5遍而除去。利用0.1M結(jié)合的噬菌體甘氨酸緩沖液pH2.2(參見PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual,1996，eds.Kay等,(Academic出版社，圣地亞哥，加利福尼亞))變性回收未結(jié)合的噬菌體。用磷酸緩沖液中和洗脫下來的的噬菌體，并加入懸浮于2xYT培養(yǎng)基中的E.coliDH5a細(xì)胞。使混合液在37。C以210rpm搖動保溫過夜。以8500xg離心10分鐘回收噬菌體上清液。第二輪和第三輪的選擇利用第一輪近似的方式進(jìn)行，以上一輪的噬菌體作為進(jìn)料噬菌體。噬菌體展示技術(shù)對于本領(lǐng)域是公知的，例如，可參見Sparks等，(1996)"Screeningphage-displayedrandompeptidelibraries"227-253頁，PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual,Kay等主編(Academic出版社,圣i也亞哥，力口利福尼亞)。為了鑒別特異結(jié)合BMPRIA或BMPRII的噬菌體，利用一種綴合于辣根過氧化酶(HRP)的抗M13噬菌體抗體進(jìn)行常規(guī)ELISAs,然后加入顯色劑ABTS(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，密蘇里州，目錄號A3219)。噬菌體的相對結(jié)合強(qiáng)度通過測定在ELISA中噬菌體的系列稀釋液與BMP受體的結(jié)合而確定。分離編碼每種所選擇的多肽的DNA并進(jìn)行測序，以確定所選擇出的多肽的氨基酸序列。然后將這些多肽連接以產(chǎn)生能與每一個BMPRI和BMPRII結(jié)合的分析物單元，形成這兩種受體的異源二聚體，以誘導(dǎo)信號。合成候選多肽并進(jìn)行生物素化，并證實(shí)其與BMP受體的結(jié)合。簡單來說，合成生物素化的多肽，多肽中帶有一個接頭，位于BMP受體結(jié)合序列與連接的生物素部分之間。接頭具有氨基酸序列GSSGK，它的作用是將生物素部分與受體結(jié)合部分分開，并且具有柔性。在RaininSymphony多肽合成儀(Rainin器械公司，Emeryville,加利福尼亞)上利25用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)法，采用固相多肽合成技術(shù)合成多肽。N-a-Fmoc-氨基酸(帶有垂直側(cè)《連<呆護(hù)基)可購自Novabiochem(Calbiochem國Novabiochem乂〉司，Laufelfingen,瑞士)。當(dāng)所有的殘基都被偶聯(lián)以后，利用三氟乙酸(TFA)混合物處理而同時裂解和對側(cè)鏈解保護(hù)。用冷的二乙醚沉淀粗肽，并利用高效液相色譜純化，純化在VydacC18二氧化硅柱(預(yù)制為10|im，250mmx22mm;GraceVydac^^司，Hesperia,力口利福尼亞)上的ShimadzuAnalytical/Semi-preparativeHPLC單位進(jìn)行，利用含有0.1%TFA線性梯度水/氰曱烷高效液相色譜純化。合成的多肽的均一性通過分析型RP-HPLC(VydacC18二氧化硅柱，10|am,250mmx4.6mm)進(jìn)行評價，并利用MALDI-TOF-MS證實(shí)多肽的均一'l"生，例如，可通過商業(yè)途徑在UNC-CHProteomics核心設(shè)備上進(jìn)才亍。制造以高親合力與BMPRI和/或BMPRII結(jié)合的多肽最早鑒定為與BMPRI和/或BMPRII結(jié)合的多肽也許只有4交弱的親合力，例如在中等或低等nM級，而在IFBM中使用具有較高的結(jié)合親合力的多肽可能更為有利，例如，在nM級。為鑒別出終樣的多肽，構(gòu)建開始鑒別出的文庫的變體并通過相對于BMPRI和/或BMPRII的親合力選沖奪進(jìn)行篩選。測定結(jié)合親合力是利用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行評價。例如，將BMPRI,BMPRII,以及適當(dāng)?shù)膶φ盏鞍兹苡谔妓猁}包被緩沖液(100mMNaHC03，pH9.6),并加入96-孔聚丙烯平板的孔中。在4'C保溫過夜后，用溶于PBS-T中的1%BSA將孔封閉。對每種受體和對照檢測其與溶于無菌的PBS(pH7.2)中的濃度從0到200jliM的多肽的結(jié)合。然后洗滌孔以除去未結(jié)合的多肽，然后向每個孔中加入抗生物素蛋白鏈菌素4咸性磷酸酶共軛溶液(SA-AP)購自USB(美國生化試劑，#11687)，對結(jié)合的多肽進(jìn)行定量。抗生物素蛋白鏈菌素-堿性磷酸酶活性通過利用顯色試劑p-磷酸硝基苯基二乙酯試劑(Sigma-Aldrich公司，SigmaFasttablets,目錄號N1891)和測量405nm的吸光度而測量。為了確定結(jié)合曲線和近似KD，對每種多肽的吸光度與濃度的關(guān)系作圖。其它因素對于結(jié)合的影響也可評價，例如，pH，溫度，鹽濃度，緩沖液成分，以及保溫時間。為了產(chǎn)生并鑒別與BMPRI和/或BMPRII具有較高親合力的多肽，建立基于氨基酸基元的噬菌體文庫，氨基酸基元是從最初分離出的與BMPRI和/或BMPRII結(jié)合的多肽中鑒定出來的，并進(jìn)一步篩選具有改進(jìn)的結(jié)合性質(zhì)的多肽。這樣的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的(例如，可參見Hyde-DeRuyscher等，(2000)ChemBiol.7:17-25;Dalby等，(2000)ProteinSci.9:2366-2376)。鑒定包含BMPRI-結(jié)合多肽和BMPRII-結(jié)合多肽的雜化多肽的激動劑活性被化學(xué)合成的合成多肽，其既包括一個BMPRI-結(jié)合多肽，而且包括一個通過一個柔性接頭(例如，具有序列GSSGSSG序列的接頭)連接的BMPRII-結(jié)合多肽。替代地，這兩個受體-結(jié)合多肽也可以通過賴氨酸的oc和￡氨基連接(例如，參見Cwirla等，(1997)Science276:1696-1699或Wrighton等，(1997)Nat.Biotechnol.15:1261-1265所述)。這些多肽的長度大約40個氨基酸，并且4艮容易進(jìn)行合成和純化。然后測定這些多肽的BMP活性，例如，在老鼠間充質(zhì)C3H10T1/2細(xì)胞中誘導(dǎo)堿性磷酸酶活性，該誘導(dǎo)活性在本領(lǐng)域是公知的，并且可參見Cheng等，(2003)J.BoneJointSurg.Am.85-A:1544-1552和Ruppert等，(1996)Eur.J.Biochem.237:295-302的記述。簡單來說，向96孔板中與10%FBS以及適當(dāng)?shù)目贵w和抗真菌劑一起加入懸浮于GibcoMEM/EBSS培養(yǎng)基中的C3H10T1/2細(xì)胞(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞，目錄號11095-080)(每孔加入體積為200|il的3x104個細(xì)胞)，將細(xì)胞在37。C，5%(302的環(huán)境中保溫，使其貼附到平板上至少3小時。然后完全吸出培養(yǎng)基，然后將BMP-2或多肽溶于高葡萄糖GibcoDMEM(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞，目錄號11965-092)加2%FBS,以不同的濃度加入。將細(xì)胞與要測試的化合物保溫三天，期間將培養(yǎng)基吸出，并將細(xì)胞用300jul的PBS洗三遍(Gibco⑧PBS,目錄號14190-144，Invitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞)。向每個孔中加入溶于H20中的100fil的pNPP(p-NitrophenylPhosphateSigmaFastTabletSet目錄號N-1891),在37。C顯色至18小時，然后對405nm的吸光度讀H然后利用本領(lǐng)域公知的方法測定EC5。值。BMP-2測試的典型EC5()值在1pg/ml至10fig/ml之間(例如，可參見，Wiemann等，(2002)J.Biomed.Mater.Res.62:119-127)。本領(lǐng)域已知，分離自不同來源的BMP-2可以顯示出不同水平的活性，'并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以相應(yīng)地調(diào)整方法將這些差異考慮在內(nèi)，以達(dá)到期望的效果。例如，本領(lǐng)域已知，利用CHO細(xì)月包制備的重組人BMP-2("rfiBMP-2")的活性與利用E.coli制備的重組人BMP—2的活性相差5-10倍(例^口，參見ZhaoandChen(2002),"ExpressionofrhBMP-2inEscherichiacoliandItsActivityinInducingBoneFormation",AdvancesinSkeletalReconstructionUsingBoneMorphogenicProteins,T.S.Lindholm主編)。將雜化的多肽固定在膠原上合成表現(xiàn)出BMP活性的雜化多肽，其連接有能與膠原結(jié)合的多肽。簡單來說，合成一種包含膠原結(jié)合單元和BMPRI-結(jié)合單元的多肽，在單元之間的接頭中的一個氨基酸上帶有交錯保護(hù)基團(tuán)，例如Fmoc-Lys(Dde)-OH。在賴氨酸側(cè)鏈e氨基上的Dde保護(hù)基團(tuán)可以有選擇地除去，并且BMPRII-結(jié)合多肽與s氨基可以連接起來。替代地，可以合成一個線形多肽，其包含膠原-結(jié)合單元，BMPRI-結(jié)合單元，以及BMPRII-結(jié)合單元。然后檢驗(yàn)?zāi)z原-結(jié)合雜化多肽的BMP活性，例如在雜化多肽結(jié)合到膠原矩陣上時，測定其在小鼠間充質(zhì)C3H10T1/2細(xì)胞中對堿性磷酸酶活性的誘導(dǎo)。簡單來說，用PBS清洗5mm膠原片，并將其用于基于細(xì)胞的BMP活性測定。實(shí)施例8:涂有IFBMs的表面的消毒ifbm包覆的表面用電子束消毒法和y消毒法進(jìn)行處理。在消毒操作的前后對包覆的表面的結(jié)合性能進(jìn)行評價。檢測是在聚苯乙烯以及鈦表面進(jìn)行的。對于聚苯乙烯檢測，是將結(jié)合單元("AFF-0002_PS")生物素化，使結(jié)合單元接觸抗生物素蛋白鏈菌素-綴合的堿性磷酸酶來評價其相對結(jié)合活性。結(jié)果顯示，在消毒操作前后，結(jié)合到聚苯乙烯表面的生物素化的多肽的數(shù)量基本上是相同的。對于結(jié)合單元("AFF-0006-Ti")在鈦上的測試也得到近似的結(jié)果；在這些測試中，貼合表面的性能在消毒前和消毒后是近似相等的。實(shí)施例9:初步的毒性試驗(yàn)將聚乙二醇化的聚苯乙烯-結(jié)合多肽涂在各種聚苯乙烯表面上，并按如下所述測試其副作用，包括細(xì)胞毒性、溶血作用、以及凝結(jié)作用。操作是在白化的瑞士鼠(小家鼠)中進(jìn)行的。如下面進(jìn)一步的論述，沒有一種進(jìn)行測試的IFBMs顯示出任何的毒性跡象。為了測定急性全身毒性，將聚苯乙烯方塊(每個方塊4x4cm;總共60cm2)在兩種載體0.9%USP生理鹽水或棉籽油(美國藥典級)之一的20mL中于37°C保溫70-74小時。向五只小鼠中的每一只全身注射載體或載體浸出液，劑量是每公斤體重50mL浸出液。在注射后立即觀察，并在注射后的4，24，48以及72小時觀察小鼠的毒性體征。沒有一種注射了載體浸出液的動物比只接受了載體的動物顯示出更強(qiáng)的生物反應(yīng)。才艮據(jù)ISO流程10993-4(國際標(biāo)準(zhǔn)化組織，日內(nèi)瓦，瑞士)測定貼合表面的局部凝血時間。簡單來說，將新鮮的人類全血吸入含有檸檬酸鈉的真空采血管并向下旋轉(zhuǎn)以分離血漿，貯存在水上備用。然后將被包覆的聚苯乙烯方塊(如上所迷)以每毫升4cm2的比例加入血漿中，置于聚丙烯管中，以60rpm速率攪動于37。C保溫15分鐘。然后分離血漿浸出液，置于冰上，并在CascadeM-4手動凝血分析儀(HelenaLaboratories,博蒙特，德克薩斯州)上進(jìn)行測試。凝血時間與純的血漿或標(biāo)準(zhǔn)參考對照沒有顯著差異。細(xì)胞毒性是在L-929小鼠成纖維細(xì)胞中測定的，按照ISO10993-5的說明進(jìn)行。簡單來說，是將60.8cm2的聚苯乙烯-包覆的方塊浸入20.3mL的Eagle，s基本培養(yǎng)基十5%FBS,于37。C下保溫24小時。將陽性的、陰性的以及居間的細(xì)胞系測試盤放在37。C下、濕潤的、含有5%C02環(huán)境中保溫。通過在24，48，以及72小時的顯微鏡觀察來評價培養(yǎng)物的細(xì)胞毒效果。陽性對照顯示出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒反應(yīng)，得分為"4"，而測試細(xì)胞在全部時間點(diǎn)上保持正常(得分為"0")的形狀(得分為"0")。中間對照細(xì)胞在整個時間點(diǎn)中得分為"2"。溶血作用試驗(yàn)測量材料或材料浸出液促使紅細(xì)胞破裂的能力。該試驗(yàn)利用ASTMF-756直接接觸法進(jìn)行。用鹽來提取浸出的物質(zhì)。對包覆的聚苯乙烯表面進(jìn)行抽提，并加入含枸櫞酸鹽的兔血(3.2%,用PBS稀釋，使得總血紅蛋白濃度為10mg/ml)。觀察到的記數(shù)為0.4%，它處于0-2%合格的等級。陰性對照的記lt為0.1%,而陽性對照的記數(shù)為12.2%。28序歹!j表<110>小韋恩Fl拜耶羅賓海德德魯勒保羅T漢密爾頓雷愛德華本森<120>促進(jìn)目標(biāo)分析物附著的IFBM'S〈130〉A(chǔ)FF006<140>11/152,974<141>2005-06-15<150>60/580,019<151>2004-06-16<150>60/651，338<151>2005-02-09<150>60/651,747〈151〉2005-02-10<160>96〈170〉FastSEQforWindows譯文4.0<210〉1〈211〉17<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400〉1SerSerHisLysHisProValThrProArgPhePheValValGluSer151015Arg<210>2<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離〈400〉2SerSerCysAsnCysTyrValThrProAsnLeuLeuLysHisLysCys151015TyrLyslieCysSerArg20〈210〉3<211>22〈212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉3SerSerCysSerHisAsnHisHisLysLeuThrAlaLysHisGinVal151015AlaHisLysCysSerArg20<210>4<211〉22<212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>4SerSerCysAspGinAsnAspliePheTyrThrSer!>ysLysSerHis151015LysSerHisCysSerArg20<210〉5<211>22<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>5SerSerSerSerAspValTyrLeuValSerHisLysHisHisLeuThr151015ArgHisAsnSerSerArg20<210〉6<211>22<212>PRT<213>人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離〈400〉6SerSerSerAspLysCysHisLysHisTrpTyrCysTyrGluSerLys151015TyrGlyGlySerSerArg20<210>7<211〉14<212〉PRT<213〉人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離<400>7HisHisLysLeuLysHisGinMetLeuHisLeuAsnGlyGly1510<210〉8<211〉14<212〉PRT<213〉人工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離<400>8、GlyHis'HisHisLysLysAspGinLeuProGinLeuGlyGly1510〈210〉9<211>25〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉9SerSerSerAspLysSerHisLysHisTrpTyrSerTyrGluSerILys151015TyrGlyGlySerGlySerSerGlyLys2025<210〉10〈211〉25<212>PRT<213>人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400〉10SerSerSerAspLysCysHisLysHisTrpTyrCysTyrGluSerLys151015TyrGlyGlySerGlySerSerGlyLys2025<210〉11<211>21<212>PRT31<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>11SerSerA印TrpGlyValValAlaSerAlaTrpA印AlaPheGluAla151015LeuAspAlaSerArg20<210>12〈211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>12SerSerGlyAlaA印PheGlyTyrGlySerTrpValSerPheSerAla151015LeuSerAlaSerArg20〈210〉13〈211>21〈212〉PRT〈213〉人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離〈400>13SerArgGlyGluAlaSerGlyTrpGluAlaPheSerAlaLeuGluAla151015AlaValValSerArg20〈210〉14〈211〉21<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離<400>14SerArgSerSerAspSerAlaPheSerSerPheSerAlaLeuGluGly151015SerValValSerArg20<210>15<211>21<212〉PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離><400>15SerArgAspGlyAlaGlyAlaAlaAlaTrpGlyAlaPheSerAlaLeu151015AlaSerGluSerArg20〈210〉16<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離〈400〉1'6SerArgGlyGlyGluAlaAlaAlaGlyAlaTrpValSerPheSerAla151015LeuGluSerSerArg20<210>17〈211〉21<212>PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉17SerArgValSerGlyValAlaAlaTrpGluAlaPheAlaGlyLeuSer151015ValSerSerSerArg20<210>18〈211〉21<212>PRT〈213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離〈400〉18SerArgAspGlyGlySerPheSerAlaPheSerSerLeuValTrpAla151015AlaAspSerSerArg20<210>1933〈211〉21<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉從噬菌體展示文庫分離<400>19SerSerValAlaGlyAspValGlySerSerTrpAlaAlaPheAlaSer151015LeuAlaAlaSerArg20<210>20<211>21<212>PRT〈213〉人工序列<220〉，<223〉從噬菌體展示文庫分離〈400〉20SerSerTrpGluValPheSerSerLeuGluSerGlySerValGlyAla151015GlyAlaGlySerArg20<210>21<211>21<212>PRT〈213〉人工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離<400>21SerSerSerSerGlyAlaValSerSerPheGluSerLeuSerGlySer151015ValValSerSerArg20<210>22<211>21<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉22SerArgGluGlyValAlaTrpGluAlaPheGlyAlaLeuSerSerPhe151015AlaAlaAspSerArg2034<210〉23<211>21<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離〈400>23SerSerTrpGlyLeuAlaSerGluAlaSerPhePheSerPheSerAla151015LeuSerSerSerArg20<210>24<211>21<212〉PRT<213>人工序列<220>'<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>24SerArgGluGlyAlaAlaTrpAspSerPhePheAlaLeuSerGlyGly151015SerAlaAlaSerArg20〈210〉25<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>25SerSerSerValAspLeuTyrPheProLeuLysGlyAspValValSer151015Arg<210>26〈211〉17<212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>26SerSerPheGluProLeuArgPheProLeuLysGlyValProValSer151015Arg<210〉27<211>7<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列<221>變體<222〉(1)...(1)<223>在這個位置的Xaa可被Trp，Phe，或Tyr<221〉變體<222〉②…③<223>Xaa^被任何氨基酸<221>變體〈222〉(5)…(5)<223>X&a可被任何氨基酸<221>變體<222〉(6)…(6)〈223〉在這個位置的Xaa可被Ser，Thr，Ala,或Gly<柳〉27XaaXaaXaaPheXaaXaaLeu15<210>28<211〉7<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列<221>變體<222〉(l),..(1)〈223〉在這個位置的Xaa可被Leu或Val<221>變體<222>(2)...(2)<223>Xaa可被任何氨基酸〈221〉變體<222〉(6)…(6)<223〉在這個位置的Xaa可被Lys或Arg<400>28X肪XaaPheProLeuX朋Gly15<210>29<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>IFBM<400>29SerSerPheGluProLeuArgPheProLeuLysGlyValProValSer151015ArgGlySerSerGlyLysAspValAsnSerlieTrpMetSerArgVal202530lieGluTrpThrTyrAspSer35〈210〉30<211〉39<212>PRT<213〉人工序列<220><223>I、FBM<400〉30AspValAsnSerlieTrpMetSerArgVallieGluTrpThrTyrAsp151015SerGlySerSerGlyLysSerSerPheGluProLeuArgPheProLeu202530LysGlyValProValSerArg35<210>31〈211〉43<212>PRT<213>人工序列<220><223〉IFBM<400>31SerArgSerSerAspSerAlaPheSerSerPheSerAlaLeuGluGly151015SerValValSerArgGlySerSerGlyLysAspValAsnSerlieTrp202530MetSerArgVallieGluTrpThrTyrAspSer3540<210>32<211>43<212〉PRT<213〉人工序列<220><223〉IFBM<400〉32AspValAsnSerlieTrpMetSerArgVallieGluTrpThrTyrAsp151015SerGlySerSerGlyLysSerArgSerSerAspSerAlaPheSerSer202530PheSerAlaLeuGluGlySerValValSerArg3540<210>33<211>39〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223>IFBM<400>33ProLeuLysGlyAspValValSer1015AsnSerlieTrpMetSerArgVal253035SerSerSerValAspLeuTyrPhe15ArgGlySerSerGlyLysAspVal20lieGluTrpThrTyrAspSer〈210〉34<211>39<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>IFBM〈400〉34AspValAsn1SerGlySerLysGlyAsp35SerlieTrpMetSerArgVallieGluTrpThrTyrAsp51015SerGlyLysSerSerSerValAspLeuTyrPheProLeu202530ValValSerArg<210>35<211〉43<212>PRT<213〉人工序列<220><223>IFBM<400〉35SerArgGlyGlyGluAlaAlaAlaGlyAlaTrpValSerPheSerAla151015LeuGluSerSerArgGlySerSerGlyLysAspValAsnSerlieTrp202530MetSerArgVallieGluTrpThrTyrAspSer3540<210>36說明書第36/51頁<211>43<212>PRT<213>人工序列<220><223>I歷<400>36AspValAsnSerlieTrpMetSerArgVallieGluTrpThrTyrAsp151015SerGlySerSerGlyLysSerArgGlyGlyGluAlaAlaAlaGlyAla202530TrpValSerPheSerAlaLeuGluSerSerArg3540<210>37<211>43〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223〉IFBM<400>37SerSerAspTrpGlyValValAlaSerAlaTrpAspAlaPheGluAla151015LeuAspAlaSerArgGlySerSerGlyLysAspValAsnSerlieTrp202530MetSerArgVallieGluTrpThrTyrAspSer3540<210〉38<211>43<212>PRT<213>人工序列<220><223>IFBM<400>38AspValAsnSerlieTrpMetSerArgVallieGluTrpThrTyrAsp151015SerGlySerSerGlyLysSerSerAspTrpGlyValValAlaSerAla202530TrpAspAlaPheGluAlaLeuAspAlaSerArg3540<210>39<211>23<212>PRT〈213>人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離〈400〉39SerSerSerSerTyrPheAsnLeuGlyLeuValLysHisAsnHisVal151015ArgHisHisAspSerSerArg20〈210>40<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>40SerSerCysHisAspHisSerAsnLysTyrLeuLysSerTrpLysHis151015GinGinAsnCysSerArg20<210>4i<211〉23〈212〉PRT〈213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>41SerSerSerCysLysHisAspSerGluPhelieLysLysHisValHis151015AlaValLysLysCysSerArg20〈210〉42〈211>23<212〉PRT<213〉人工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離<400>42SerSerSerCysHisHisLeuLysHisAsnThrHisLysGluSerLys151015MetHisHisGluCysSerArg20<210〉43<211〉15<212>PRT〈213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離40<400>43SerSerValAsnLysMetAsnArgLeuTrpGluProLeuSerArg151015<210>44<211>21<212>PRT<213〉人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離〈400>44SerSerAlaProLeuThrGluSerGluAlaTrpArgGlyPheSerLys151015LeuGluValSerArg20<210〉45〈211〉21<212〉PRT〈213>入工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離〈400〉45SerSerSerMetProValGlyTrpAspSerTrpArgGlyLeuGluTrp151015SerAspArgSerArg20<210>46〈211〉21〈212〉PRT〈213〉人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離<400>46SerSerGluGlyArgGlyGlyTrpAsnSerTrpGluAlaPheArgGlu151015LeuValValSerArg20<210>47<211>21〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>47SerSerGlyGlyGlyGlyAlaTrpGluSerTrpArgGlyLeuSerGly151015ValGluLeuSerArg20<210>48<211〉21<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>48SerArgAsnValGluGlySerTrpGluSerPheAlaGlyLeuSerHis151015ValArgGluSerArg20<210>49<211〉21〈212〉PRT<213>人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>49SerArgGluAspGlyGlyArgTrpGluSerPheLeuGlyLeuSerAla151015ValGluValSerArg20<210>50<211>21<212>PRT<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>50SerSerValGluGlySerAlaTrpSerAlaPheLysSerLeuSerSer151015GluGlyValSerArg20<210>51〈211>21<212>PRT<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉51SerArgValGluGlyGlyAlaTrpGinAlaLeuAlaGlyLeuThrVal151015GluArgValSerArg20<210>52〈211〉21<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離<400〉52SerSerProProLysHisAlaTrpGlySerPheAspAlaLeuGlyGly151015GinValValSerArg20〈210〉53〈211〉21<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>53SerSerGluArgGlyValGlyTrpGluValPheLeuAlaMetGluGly151015AlaArgMetSerArg20〈210〉54<211〉21<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉54SerSerSerSerSerGlyThrTrpGinAlaPheThrGlyLeuSerGly151015GluArgValSerArg20<210〉55<211〉21〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>55SerSerSerProGlyGlyGlySerGlyGlyTrpA印AlaPheTyrSer151015LeuVaJGlySerArg20<210>56<211〉21<212>PRT<213>人工序列<220>一<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>56SerSerGlyGlyGlyGlyGlyGlyGluGlyPheSerSerLeuSerGly151015AsnGlyArgSerArg'20<210>57<211>21<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉57SerSerThrGlyGlyGlySerTrpGluGluPheLysAlaMetThrPro151015SerTrpThrSerArg20<210>58<211>21<212>PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>58SerSerGluGlySer'GlyLeuTrpAspSerPheSerSerLeuSerVal151015HisGluValSerArg20<210〉59〈211〉21<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉59SerSerGlyValThrGinGluSerAlaSerTrpSerSerPheArgThr151015LeuAlaValSerArg20<210〉60<211>21〈212〉PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉60SerSerSerLysValAlaProSerGlyGluTrpArgSerPheAlaThr151015LeuGluValSerArg.'20〈210〉61<211>21<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離〈400〉61SerSerGluAlaGlyArgGlyTrpGluGlyPheLysAlaLeuGluGly151015TyrGinValSerArg20〈210〉62<211>21<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>62SerSerLeuGlyGinThrGlyTrpGluAlaPheGluSerLeuSerGly151015ThrArgGlySerArg20<210〉63<211〉21<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>63SerSerValAlaTrpAspAlaPheThrValPheGluSerLeuGluGly151015ValAlaThrSerArg20<210>64<211>21<212>PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>64SerSerGluValValGluProTrpGluTrpTrpValAlaLeuGluArg1、5■1015AlaGlyGlySerArg20<210>65<211>21<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉65SerArgValAlaAlaValSerTrpGluPhePheGlySerLeuSerSer151015AlaGlyValSerArg20<210>66<211〉21〈212〉PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>66SerSerAlaAspLeuGlyValSerGlySerTrpGluGlyPheAlaLeu151015MetArgGlySerArg20〈210>67<211>21<212>PRT<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉67SerSerValGlyGinMetGlyTrpGluAlaPheGluSerLeuSerGly151015ThrGlyGlySerArg20<210>68〈211〉21<212>PRT<213>人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離〈400>68SerSerQlyGinGlyGluThrTrpGluTrpPheAlaGlyMetArgGly1''51015SerValAlaSerArg20<210>69<211〉21<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>69SerSerTyrPheA印ValPheSerSerMetThrGlyThrArgAlaAla151015GlySerTrpSerArg20<210〉70<211〉21〈212〉PRT<213>人工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離<400>70SerSerAlaTyrSerValPheSerSerLeuArgAlaAspAsnSerGly151015GlyAlaValSerArg20<210〉71〈211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>71SerSerGlyGlylieAlaSerLeuLysTyrAspValValLysThrTrp151015GluSerArg<210〉72<211〉16<212>PRT<213>人工序列<220〉、<223〉從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列〈400〉72GlyGlyGlyAlaTrpGluAlaPheSerSerLeuSerGlySerArgVal151015〈210〉73<211〉7<212〉PRT〈213〉人工序列<220>〈223〉從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列〈221〉變體<222>(O)...(0)<223>Xaa可被任何氨基酸<400>73TrpXaaXaaPheXaaXaaLeu15<210>74〈211〉15<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列<400>74SerSerGlyAlaTrpGluSerPheSerSerLeuSerGlySerSer151015<210>75<211〉40<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉編碼共有序列<400>75tcgagtggtgcttgggagtctttttcgtcactgagtggat40<210>76<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQIDNO:75的部分補(bǔ)充<400>76caccacgaaccctcaga犯aagcagtgactcacctagatc40<210>77<211〉21<212>PRT〈213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉77SerSerGluGlyValGlyGlyPheProLeuLysGlylieProGinGlu151015AlaTrpAlaSerArg20<210>78〈211〉21<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離<221>變體<222〉(18)..(0)<223〉Xaa可被任何氨基酸<400>78SerSerProSerGlyValValPheProLeuArgGlyGluLeuLeuGly151015ValXaaLysSerArg20<210>79<211>21<212>PRT<213〉人工序列<220>〈223>從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列<400>79SerSerGlyGlyPheValProPheProLeuArgGlyGluValTrpAsp151015GlyValHisSerArg20<210>80<<211>21、<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400>80SerSerGluGlySerLeuSerPheProLeuLysGlyGinValTyrSer151015GlyTrpGlySerArg20<210>81<211>21〈212〉PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉81SerSerGlyLysProLeuGluPheProLeuArgGlyThrLeuAlaGlu151015TrpProValSerArg20<210>82〈211〉21<212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離〈400>82SerArgGlyGluAlaLeuGlyPheProLeuThrGlyGinLeuMetGlu151015AlaAlaGluSerArg20<210>83<211>21<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離〈400>83SerSerMetTrpAspValGlyPheProLeuLysGlyArgTrplieAsp151015GlyAlaAsp'SerArg20<210>84<211〉21<212〉PRT'<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離〈400>84SerSerSerAsnSerLeuTrpPheProLeuArgGlySerThrValGlu151015ValGlyAlaSerArg20〈210>85<211〉21<212〉PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離〈400>85SerSerGlyProAlaLeuArgLeuProLeuArgGlyThrValValSer151015AspValProSerArg20〈210〉86<211>21<212>PRT<213>人工序列〈220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>86SerSerAlaAspArgValAlaTrpProLeuLysGlyAlaProValTrp151015ValLysGluSerArg20〈210〉87<211>21<212>PRT〈213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400〉87SerSerGlyLeuAlaLeuGlyLeuProlieLysGlyTrpThrValSer151015GlyLysAspSerArg20<210〉88<211〉21<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<223〉從噬菌體展示文庫分離<400>88SerSerGlyTyrThrLeuGlyPheProLeuSerGlyGinThrlieLys151015AspTrpProSerArg20〈210〉89〈211〉21<212>PRT〈213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離<400〉89SerSerGluGlyTrpValHisPheProLeuLysGlyAspValMetGly151015GlyProPheSerArg20<210>90<211〉21<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉從噬菌體展示文庫分離<400>90SerSerGlyArgTyrValSerLeuProLeuLysGlyGluValValPro151015GinThrAlaSerArg20<210>91<211〉21<212〉PRT〈213〉人工序列<220〉<223>從噬菌體展示文庫分離<400>91SerSerGluGlyGlyValGlyPheProLeuLysGlylieProGinGlu151015AlaTrpAlaSerArg20<210>92<211〉21〈212〉PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離〈400〉92SerArgValAspSerValAsnPheProLeuArgGlyGluThrValThr151015SerMetValSerArg20<210>93<211>17<212>PRT<213〉人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列<400〉93GlyGlyAlaLeuGlyPheProLeuLysGlyGluValValGluGlyTrp151015Ala<210>94〈211〉7<212>PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉從噬菌體展示文庫分離的多肽對比共有序列〈221>變體<222〉(2)…(0)<223>Xaa可被任何氨基酸<400〉94LeuX肌PheProLeuLysGly15<210>95<211>22〈212>PRT<213>人工序列<220><223>從噬菌體展示文庫分離〈400〉95SerSer,CysTrpSerArgPheArgLeuPheMetLeuPheCysMetPhe151015TyrLeuValSerSerArg20<210>96<211>22<212〉PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉從噬菌體展示文庫分離<400>96SerArgCyslieLysTyrProPheLeuTyrCysCysLeuLeuSerLeu151015PheLeuPheSerSerArg20權(quán)利要求1、一種結(jié)合單元，包含具有如SEQIDNO27或SEQIDNO28所定義的序列基元的多肽，其中該結(jié)合單元與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合。2、如權(quán)利要求l所述的結(jié)合單元，其中SEQIDNO:27是從SEQIDNOs:11-20、22-24、48-50、52、54-55、58-63、67、70和72-74中選出的。3、如權(quán)利要求1所述的結(jié)合單元，其中SEQIDNO:28是從SEQIDNOs:25-26、78-81、83-84、89和91-94中選出的。4、如權(quán)利要求1所述的結(jié)合單元，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。5、'如權(quán)利要求1所迷的結(jié)合單元，其中該結(jié)合單元由7~60個氨基酸構(gòu)成。6、一種分離的核酸，包含編碼如SEQIDNO:27或SEQIDNO:28所定義的氨基酸序列的核普酸序列，其中所述氨基酸序列是一種與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合的結(jié)合單元。7、一種用于植入物的界面生物涂層，該涂層包括a.至少一種與植入物表面結(jié)合的結(jié)合單元；和b.至少一種與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合的結(jié)合單元，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合單元包含具有如SEQIDNO:27或SEQIDNO:28所定義的序列基元的多肽，其中，該表面結(jié)合單元和該骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合單元連接在一起，并且能夠被修飾以包含一個或多個末端修飾以及促進(jìn)所述連接的修飾。8、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中該植入物包含一種從聚合物、塑料、金屬、陶瓷、去礦化骨基質(zhì)和它們的混合物中選出的材料。9、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中如SEQIDNO:27所定義的序列基元是從SEQIDNOs:11-20、22-24、48-50、52、54-55、58-63、67、70和72-74中選出的。10、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中如SEQIDNO:28所定義的序列基元是從SEQIDNOs:25-26、78-81、83-84、89和91-94中選出的。11、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合單元由7~60個氨基酸構(gòu)成。12、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。13、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中該植入物包含膠原，并且該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。14、如權(quán)利要求7所述的涂層，其中該植入物包含去礦化骨基質(zhì)，并且該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。15、一種對植入物進(jìn)行涂布的方法，該方法包括讓涂層與該植入物接觸，該涂層包括a.至少一種與植入物表面結(jié)合的結(jié)合單元；和b.至少一種與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合的結(jié)合單元，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合單元包含具有如SEQIDNO:27或SEQIDNO:28所定義的序列基元的多肽，其中，該表面結(jié)合單元和該骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合單元連接在一起，并且能夠被修飾以包含一個或多個末端修飾以及促進(jìn)所述連接的修飾。16、如權(quán)利要求15所述的方法，其中該植入物包含一種從聚合物、塑料、金屬、陶瓷、去礦化骨基質(zhì)和它們的混合物中選出的材料。17、如權(quán)利要求15所述的方法，其中如SEQIDNO:27所定義的序列基元是從SEQIDNOs:11-20、22-24、48-50、52、54-55、58-63、67、70和72-74中選出的。18、如權(quán)利要求15所述的方法，其中如SEQIDNO:28所定義的序列基元是從SEQIDNOs:25-26、78-81、83-84、89和91-94中選出的。19、如權(quán)利要求15所述的方法，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合單元由7~60個氨基酸構(gòu)成。20、如權(quán)利要求15所述的方法，其中該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。21、如權(quán)利要求15所述的方法，其中該植入物包含膠原，并且該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。22、如權(quán)利要求15所述的方法，其中該植入物包含去礦化骨基質(zhì)，并且該骨形態(tài)發(fā)生蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。23、一種涂布的植入物，其中該植入物的至少一部分由權(quán)利要求714中任一項(xiàng)所述的界面生物涂層所涂布。全文摘要本發(fā)明提供一種改進(jìn)的醫(yī)療植入物表面涂層。涂層包括至少一種界面生物材料(IFBM)，界面生物材料包括至少一個結(jié)合植入物或植入物相關(guān)材料表面的結(jié)合單元(“植入物單元”)和至少一個結(jié)合目標(biāo)分析物或設(shè)計(jì)為具有預(yù)期效果的結(jié)合單元(“分析物單元”)組成。單元間通過接頭連接。在一些實(shí)施例中，IFBM涂層可起到促進(jìn)目標(biāo)分析物識別和附著在器件表面的作用。IFBM涂層改善了移植的醫(yī)療器件的性能，例如，促進(jìn)植入物的骨整合。文檔編號C12N15/11GK101585865SQ20091014992公開日2009年11月25日申請日期2005年6月15日優(yōu)先權(quán)日2004年6月16日發(fā)明者丹尼爾·J·凱南,保羅·T·漢密爾頓,小韋恩·Fl·拜耶,戴爾·J·克里斯滕森,羅賓·海德·德魯勒,雷·愛德華·本森,馬克·W·格林斯塔夫申請人:阿費(fèi)內(nèi)基有限公司