專利名稱：：在植物中優(yōu)化聚糖生成的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于優(yōu)化含有N—聚糖的糖蛋白的細胞或生物體，特別是植物的聚糖生成方法，從而得到一種糖蛋白，其具有高甘露糖型的N—聚糖，雜合型或優(yōu)選復合型的N—聚糖，包括但不限于雙觸角N—聚糖，并在N—聚糖的至少一個臂上含有半乳糖殘基，不含有(或者減少)木糖和海藻糖殘基。本發(fā)明還涉及得到的所述溏蛋白和特別是含有該蛋白的植物宿主系統(tǒng)。
背景技術：
：N-聯(lián)聚糖(N-Linkedglycans)是連接到糖蛋白的天冬酰胺殘基上的特定寡糖結構，能夠顯著地影響蛋白質的性質，進而影響生物體的特性。植物蛋白具有N-聯(lián)聚糖，但是極其不同于哺乳動物，它們所影響的生物學過程幾乎是未知的。N-聯(lián)聚糖的生物生成起始于脂聯(lián)寡糖成分(Glc3Man9GlcNAc2-)的合成，該成分全部被轉移給內質網(wǎng)(ER)中的新生多肽鏈。通過內質網(wǎng)和順式高爾基體區(qū)室中的一系列外切糖苷酶的修剪(trimming),形成所謂的"高甘露糖"型聚糖(由Man9GlcNAc2變成Man5GlcNAc2)。隨后，由GnTI將第一個GlcNAc轉移到Man5GlcNAc2，接著通過甘露糖苷酶II(ManII)修剪來形成GlcNAcMan3GlcNAc2，開始形成復合型聚糖。當在一些其他的糖基轉移酶的作用下，通過分泌路徑在高爾基體中由GnTII將第二個GlcNAc殘基以及其他單糖殘基轉移到GlcNAcMan3GlcNAc2上，繼續(xù)復合型聚糖的生物合成。植物和哺乳動物在復合聚糖形成方面是不同的(見附圖1，比較植物和哺乳動物中的糖蛋白的糖基化路徑)。在植物中，復合型聚糖的特征在于存在連接到Man-3的P(1,2)_木糖殘基和/或連接到GlcNAc-1的a(1，3)-海藻糖殘基，不具有連接到GlcNAc-l的a(1，6)-海藻糖殘基。編碼相應的木糖基(XylT)和海藻糖基(FucT)轉移酶的基因已經(jīng)被分離[Strasser等，"擬南芥e1，2-木糖基轉移酶cDNA的分子克隆和功能性表達"，F(xiàn)EBSLett.472:105(2000);Leiter等，"從綠豆中純化、cDNA克隆和表達GDP-L-Fuc:Asn聯(lián)GlcNAca1，3-海藻糖轉移酶"，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)274:21830(1999)]。植物不能生成P(1,4)-半乳糖基轉移酶和a(2,6)唾液酸轉移酶，結果植物聚糖缺乏常見于哺乳動物聚糖的e(1，4)-半乳糖和末端的a(2，6)NeuAc殘基。最終的聚糖結構不僅僅由存在的參與聚糖生物合成和轉運的酶來決定，還在更大的范圍內由各種酶促反應的特定順序來確定。在后--種情況中，是受這些酶在整個內質網(wǎng)和高爾基中的分散隔離和相對位置來控制，這是通過轉移酶的決定因子相互作用和亞高爾基體區(qū)室無轉移,的特定特征調節(jié)的。許多采用雜合分子的研究已經(jīng)證明一些糖基轉移,的跨膜結構域在其亞高爾基分類中起主要作用，包括f3(1，4)-半乳糖基轉移酶的跨膜結構域[Gr油enhorst等，生物學化學雜志(J,Biol.Chem.)274:36107(1999);Colley，K.，糖生物學(Glycobiology)7:1(1997);M匿o，S.，細胞生物學趨勢(TrendsCellBiol.)8:11(1998);Gleeson，P.A.，組織化學細胞生物學(Histocheni.CellBiol.)109:517(1998)]。雖然植物和哺乳動物在相對較早以前就分化了，N聯(lián)糖基化似乎至少部分地保守。這山聚糖結構雖然不同但是類似以及哺乳動物的Glc.NAcTI基因染色體(complement)不具有Glc.NAcTI活性的擬南芥的突變體證實，反之亦然。聚糖結構的差異具有重要作用。例如，已知木糖和ci(1，3)-海藻糖抗原決定簇具有極高的免疫原性，并且在某些情況下可能引起過敏，這在用植物生產(chǎn)治療性糖蛋白時帶來了問題。而且，在許多敏感癥患者的血液血清中含有直接抵抗這些抗原決定簇的IgE，而且50%的非敏感癥血液供體在其血清中含有特異于核心一木糖的抗體，而25X含有特異于核心一a1，3-海藻糖的抗體(Bardor等，2002,在版，糖生物學(Glycobiology))(2002年12月17日預先Access出版)，這使得這些個體冒險采用由植物制備的含有海藻糖和/或木糖的重組蛋白處理。此外，由于有證據(jù)表明這些糖特異的IgE與致敏反應無關，在血清中指示IgE的這種糖會在使用植物提取物的體外試驗中引起假陽性反應。總之，使用植物生產(chǎn)的糖蛋白的治療失敗可能是由于加速清除具有木糖和/或海藻糖的重組糖蛋白。因此，需要更好地控制植物中的糖基化，特別是用于治療用途的糖蛋白的糖基化。定義為了方便本發(fā)明的理解，在本說明書中采用多種術語定義如下。術語"載體"是指任何遺傳元件，例如質粒、噬菌體、轉位子、粘粒、染色體、逆轉錄病毒、病毒子、或類似遺傳元件，當與恰當調控元件結合時，其能夠復制，并將基因序列轉移到細胞內和/或在細胞之間轉移。因此，該術語包括克隆載體和表達載體，以及病毒載體。在此所用術語"表達載體"是指重組DNA分子，其含有期望的編碼序列一例如下文更加詳細描述的雜合酶的編碼序列一和在特定宿主細胞或生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的適宜核酸序列。原核細胞中表達所必需的核酸序列通常包括啟動子、操作子(可選擇的)和核糖體結合位點，常常還有其他序列。已知真核細胞利用啟動子、增強子、終止子和聚腺苷?；盘?。這不是將本發(fā)明限制在特定的表達載體或具有特定元件的表達載體。當用于涉及細胞時，術語"轉基因的"是指含有轉基因的細胞，或者其基因組已經(jīng)通過導入轉基因被改變。當用于涉及、組織或植物時，術語"轉基因的"分別是指包含轉基因的細胞、組織或植物，其中該組織的一個或多個細胞含有轉基因(例如編碼本發(fā)明的雜合酶的基因)，或基因組通過引入轉基因而被改變的植物。轉基因細胞、組織和植物可以通過一些方法制備，包括將包含核酸(通常DNA)的"轉基因"導入目標細胞中或者通過人為介入將轉基因整合到目標細胞的染色體中，例如通過本文描述的方法。在此所用術語"轉基因"是指任何核酸序列，其通過試驗操作被導入到細胞的基因組中。轉基因可以是"內源DNA序列"或"異源DNA序列"(即"外源DNA")。術語"內源DNA序列"是指天然存在于其被導入的細胞的核苷酸序列，只要該核苷酸序列不含有相對于天然序列的修飾(例如點突變、存在選擇性標記基因或其他類似修飾)。術語"異源DNA序列"是指被連接到或者被加工來連接到一條核酸序列上的核苷酸序列，自然條件下該核苷酸不與該核酸序列連接或者在不同位點上連接。異源DNA對于其所導入的細胞來說不是內源的，而是得自其他細胞。異源DN八還包括具有某些修飾的內源DNA序列。雖然不是必要地，但是一般地，異源DNA在細胞中被表達，編碼該細胞通常不能生產(chǎn)的RNA和蛋白質。異源DNA的例子包括報道基因、轉錄和翻譯調控序列、選擇性標記蛋白(如賦予藥物抗性的蛋白)、或其他類似元件。術語"外源基因"是指通過試驗操作被導入細胞基因組的任何核酸(如基因序列)，包括存在于該細胞中的基因序列，只要被導入的基因序列具有相對于天然序列的某些修飾(例如點突變、存在選擇性標記基因或其他類似修飾)。術語"融合蛋白"是指其中至少一部分來自第一種蛋白質和另一部分來自第二種蛋白質的蛋白質。術語"雜合酶"是指一種功能性酶的融合蛋白，其中至少一部分是來自第一種類和另一部分來自第二種類。本發(fā)明的優(yōu)選雜合酶是功能性糖基轉移酶(或其部分)，其中至少一部分來自植物和另一部分來自哺乳動物(如人類)。術語"導入細胞"或"導入宿主細胞"涉及核酸(如載體)時，是包括本領域所謂的"轉化"或"轉染"或"轉導"。細胞的轉化是穩(wěn)定的或瞬時的一和本發(fā)明提供在一定條件下導入載體，一方面可以穩(wěn)定表達，另一方面僅僅是瞬時表達。術語"瞬時轉化"或"瞬時地被轉化"是指將一個或多個轉基因導入細胞中，而不將轉基因整合導宿主細胞的基因組中。瞬時轉化可以例如通過酶聯(lián)免疫吸收分析(ELISA)來檢測，檢測是否存在由一種或多種轉基因編碼的多肽?？商娲兀矔r轉化可以通過檢測由轉基因(如抗體基因)編碼的蛋白質的活性(如抗體的抗原結合)來檢測。術語"瞬時轉化"是指瞬時并入一種或多種轉基因的細胞。相反，術語"穩(wěn)定轉化"或"穩(wěn)定地被轉化"是指將一種或多種轉基因導入或整合到細胞的基因組中。細胞的穩(wěn)定轉化可以通過細胞的基因組DNA與能夠結合到一種或多種轉基因的核酸序列的Southern印跡雜交來檢測?？商娲?，細胞的穩(wěn)定轉化還迎過細胞基因組DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增轉基因序列來檢測。術語"穩(wěn)定轉化"是指穩(wěn)定地將一個或多個轉基因整合到基因組隨A的細胞。因此，穩(wěn)定轉化區(qū)別于瞬時轉化，其中穩(wěn)定轉化的基因組l)NA含有一種或多種轉基因，瞬吋轉化的基因組DNA不含有轉基因。術語"宿主細胞"包括喃乳動物細胞(如人B細胞克隆、中國倉鼠卵巢細胞、肝細胞)和非哺乳動物細胞(如昆蟲細胞、細菌細胞、植物細胞)。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，并且導入表達本發(fā)明的雜合蛋白(如TmGtiTII-GalT)的載體抑制(或至少降低)所述哺乳動物細胞中的海藻糖基化(fucosylation)。術語"目標核苷酸序列"是指任何核苷酸序列，對于本領域技術人員來說，tfj于任何原因(如賦予提高質量、用于制備治療性蛋白質)，其處理被認為是期望的。這種核苷酸序列包括但不限于結構基因的編碼序列(如報道基因，選擇標記基因、致癌基因、抗體基因、藥物抗性基因、生長因子和其他類似基因)，和不編碼mRNA或蛋白產(chǎn)物的非編碼調控序列(如啟動子序列、聚腺苷酸序列、終止子序列、增強子序列、和其他類似序列)。本發(fā)明提供表達由目標核苷酸序列編碼的異源蛋白的宿主細胞以及一種或多種雜合酶。當用于涉及核酸時，如在"分離的核酸序列"中，術語"分離的"是指被鑒定和從一種或多種其他成分中被分離的核酸序列(如從含有該核酸的細胞中分離，或者從至少一種雜質核酸中分離，或者從一種或多種蛋白、一種或多種脂肪中分離)，在天然來源中核酸通常與這些成分結合在一起。分離的核酸是以不同于其在自然界中見到的形式或裝配(setting)存在的核酸。相反，未被分離的核酸是如以天然存在的狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)的DNA和RNA的核酸。例如，在接近于鄰近基因的宿主細胞染色體上發(fā)現(xiàn)特定的DNA序列(如基因)；RNA序列，如編碼特定蛋白質的特定raRNA被發(fā)現(xiàn)在細胞中與大量編碼許多蛋白質的其他mRNA混合在一起。但是，包含SEQIDNO:1的分離核酸序列包括，作為例子，通常含有SEQIDNO:1的細胞中這種核酸序列，其中核酸序列在區(qū)別于天然細胞的染色體的或染色體外的位置上，或者被不同天然存在的核酸序列側面連接。分離的核酸序列可能以單鏈或雙鏈形式存在。當分離的核酸序列被用于表達蛋白質時，該核酸序列將最小地至少含有有義鏈或編碼鏈的一部分(即該核酸序列可以是單鏈的)?？商娲?，可以同時含有有義鏈和反義鏈(即該核酸序列是雙鏈的)。此處所用術語"純化的"是指核酸或者氨基酸序列分子，從其天然環(huán)境中被取出，被分離或被分開。因此"分離的核酸序列"是被純化的核酸序列。"基本上純化的"分子至少60%,優(yōu)選至少70%和更加優(yōu)選的至少90%沒有該分子天然地結合的其他成分。本發(fā)明提供純化的(包括基本上純化的)和未純化的雜合酶(將在下文中更詳細描述)。在此所用術語"互補的"或"互補性"被用于指根據(jù)堿基配對原則是相關的核苷酸序列。例如，序—列5'-AGT-3'與序列5'-ACT-3'互補。互補性可以是"部分的"或"全部的"。"部分"互補性是其中一個或多個核苷酸堿基按照堿基配對原則是不匹配的。兩條核酸之間的"全部的"或者"完全的"互補性是其中每個核酸堿基依據(jù)堿基配對原則與另一個堿基匹配。兩條核酸鏈之間的互補程度顯著地影響核酸鏈之問的雜交效率和強度。在此所用的核酸序列的"互補物"是指核酸與核酸序列的核酸具有全部互補性的核苷酸序列。例如，本發(fā)明提供SEQIDNO:1，3,5，9，27，28，29，30，31，32，33，34，35，37，38，40，41和43的互補物。當用于涉及核酸時，術語"同源性"是指互補程度?？赡苁遣糠滞葱?即部分同一性)或完全同源性(即完全同一性)。部分互補的序列是至少部分地抑制完全互補的序列雜交到目標核酸的序列，參照采用功能術語"基本上同源的"?？梢栽诘蛧谰o性條件下進行雜交分析(Southern或Northern印跡、溶液雜交等)來檢測對完全互補序列與目標序列雜交的抑制。在低嚴緊條件下，基本上同源的序列或探針(即能夠雜交到另一條目標寡核苷酸的寡核苷酸)將競爭和抑制完全同源的序列結合(即雜交)到目標上；這并不是說低嚴緊條件是可以進行非特異性結合的條件；低嚴緊條件要求兩條序列相互結合是特異性的(即選擇性的)互作?？梢圆捎蒙踔敛痪哂胁糠只パa性(如小于約30%的同一性)的第二條目標序列來檢測是否存在非特異性的結合；沒有非特異性結合時，探針不會雜交到第二條非互補的目標鏈上。當被用于涉及雙鏈核酸序列如cDNA或基因組克隆時，術語"基本上同源的"是指在上文描述的低嚴緊條件下能夠雜交到雙鏈核酸的一條或兩條鏈上的任何探針。當被用于涉及單鏈核酸序列時，術語"基本上同源的"是指在上文描述的低嚴緊條件下能夠雜交到單鏈核酸序列上的任何探針。在此所用術語"雜交"包括"通過堿基配對將核酸的一條鏈結合到互補的鏈上的任何過程"[CoombsJ(1994)生物工藝學詞典(DictionaryofBiotechnology)，Stockton出版社，紐約]。雜交和雜交強度(即核酸之間的結合強度)受核酸之間的互補程度、涉及的條件的嚴緊度、形成的雜合體的Tm、核酸中的G:C比等因素的影響。此處所用術語用于指"解鏈溫度"。解鏈溫度是大量雙鏈核酸分子半數(shù)分離成單鏈時的溫度。計算核酸的L的方程在本領域是熟知的。如標準參考文獻中指出。當核酸在1MNaCl的水溶液中時，T,的簡單估計值可以通過方程T,=81.5+0.41(%G+C)計算[見如，Anderson和Young,定量濾過雜交核酸雜交(NucleicAcidHybridization)(1985)]。其他的參考文獻包括更加精確的計算，將結構特征以及序列特征考慮在內來計算T。用于涉及核酸雜交時，低嚴緊條件包含的條件等價于當采用長度約100到約l()OO個核苷酸的DNA探針吋，在68。C下在山5XSSPE(鹽、磷酸鈉、EDT八)(43.8g/1NaCl、6.9g/1眺PO.,1W)禾卩1.85g/1卜二DTA(乙二胺四乙酸),用Na.OH調節(jié)pH為7.4),0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)，5XDenhardt試劑[每500ml的50XDenharclt中含有5gFicoll(Type400，Pharmacia),5gBSA(牛血清白蛋白)(FractionV;Sigma)]和100ug/ml變性的鮭魚精子DNA組成的溶液中結合或雜交，接著室溫下在包含0.2X-2.OXSSPE和0.1%SDS的溶液中洗滌。用于涉及核酸雜交時，高嚴緊條件包含的條件等價于當采用長度約100到約1000個核苷酸的DNA探針時，在68。C下在山5XSSPE,5XDenhardt試劑和100"g/ml變性的鮭魚精子DNA組成的溶液中結合或雜交，接著在68。C下在包含0.2X-2.OXSSPE和0.1%SDS的溶液中洗滌。當用于涉及與目標雜交條件相關的雜交條件時，術語"等價于"是指雜交條件和目標雜交條件引起具有相同范圍的百分同源性的核酸序列的雜交。例如，目標雜交條件引起第一條核酸序列與另一條與第一條核酸序列具有50%—70%冋源性的核酸序列的雜交，那么，如果另一種雜交條件也引起第一條核酸序列與另一條與第一條核酸序列具有50%—70%同源性的序列雜交，這種雜交條件被認為等價于目標雜交條件。當用于涉及核酸雜交時，本領域技術人員知曉許多等價條件可被用于構成低的或高的嚴緊條件；考慮如探針的長度和性質(DNA、RNA,堿基組成)和耙點的性質(DNA、RNA，堿基組成，存在于溶液中或者是固定的)以及鹽和其他成分濃度(如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)等因素，而且可以改變雜交溶液來產(chǎn)生區(qū)別、但等價于上面所列的條件的低嚴緊的或高嚴緊的雜交條件。在此所用的術語"啟動子"、"啟動子元件"或"啟動子序列"是指DNA序列，當被連接到目標核苷酸序列時，能夠控制目標核苷酸序列轉錄為mRNA。雖然不是必須的，但是啟動子通常位于目標核苷酸序列的5'端(即上游)，該目標核苷酸序列轉錄成mRNA，啟動子控制和提供用于起始轉錄的RNA聚合酶和其他轉錄因子的特異性結合位點?！獑幼涌梢允墙M織特異性的或細胞特異性的。當應用于啟動子時，術語"組織特異性的"是指啟動子能夠指導目標核苷酸序列選擇性地表達到特定組織類型(如花瓣)，而同一目標核苷酸序列在不同組織類型中(如根)相對地不表達。啟動子的組織特異性可以被評價，如通過將報道基因可操作地連接到啟動子序列上來產(chǎn)生報道構建體，將該報道構建體導入植物的基因組中，使得該報道構建體被整合到所得到的轉基因植物的每個組織中，在轉基因植物的不同組織中檢測報道基因的表達(如檢測mRNA、蛋白質、或由報道基因編碼的蛋白質的活性)。在一個或多個組織中檢測到比其他組織中報道基因的表達水平更高的報道基因的表達水平，表明啟動子對于檢測到較高表達水平的組織來說是特異的。術語"細胞類型特異的"應用于啟動子是指啟動子能夠指導目標核苷酸序列在特定類型細胞中選擇性地表達，而同一目標核苷酸序列在相同組織的不同類型的細胞中相對地不表達。術語"細胞類型特異的"應用于啟動子還指啟動子能夠促進目標核苷酸序列在單一組織的某個區(qū)中選擇性地表達。啟動子的細胞特異性可以采用本領域熟知的方法來評價，如免疫組織化學染色。簡而言之，組織切片被包埋在石蠟中，石蠟切片與特異于目標核苷酸序列所編碼的多肽產(chǎn)物的第一抗體反應，該多肽的表達受啟動子調控。特異于第一抗體的標記(如過氧化物酶偶聯(lián))第二抗體與組織切片結合，并且通過顯微鏡檢測特異性結合(如用抗生物素蛋白/生物素)。啟動子可以是組成型的或調控型的。當術語"組成型的"用于涉及啟動子時是指缺乏刺激(如熱休克、化學藥品、光照或類似刺激)時，啟動子能夠指導被可操作連接的核酸序列的轉錄。典型地，組成型啟動子能夠在幾乎任何細胞和任何組織中指導轉基因的表達。相反，"調控型的"啟動子是在存在剌激(如熱休克、化學藥品、光照或類似刺激)時能夠指導可操作地連接的核酸序列的一定水平的轉錄，其不同于缺乏刺激時的可操作地連接的核酸序列的轉錄水平。術語用細菌"感染"(infecting)和"感染"(infection)是指目標生物樣本在一定條件下與細菌共培養(yǎng)，使得包含在細菌內的核酸序列被導入目標生物樣本的一個或多個細胞中。術語"農桿菌"是指土壤中產(chǎn)生的、革蘭氏陰性的、桿狀的致植物病細菌，其引起冠癭病。術語"農桿菌"包括但不限于根癌農桿菌(通常在被感染的植物中引起冠癭病)和毛根農桿菌(其在被感染的宿主植物中引起發(fā)根疾病)。用農桿菌感染植物細胞通常導致被感染的細胞生成冠癭堿(如胭脂堿、農桿堿、章魚堿)。因此，導致生成胭脂堿的農桿菌菌株(如菌株LBA4301、C58、A208)稱作為"胭脂堿型"農桿菌；導致生成農桿堿的農桿菌菌株(如菌株LBA4404、Ach5、B6)稱作為"農桿堿型"農桿菌；導致生成章魚堿的農桿菌菌株(如菌株EHA105、EHAIOI、A281)稱作為"章魚堿型"農桿菌。術語"轟擊"(bombarding)、"轟擊"(bombardment)禾Q"基因槍轟擊"(biolisticbombardment)是指加速粒子轟擊目標生物樣本(如細胞、組織、植物的部分如葉子或完整的植物)的方法，來實現(xiàn)創(chuàng)傷目標生物樣本的細胞的細胞膜/或使粒子進入目標生物樣本。基因槍轟擊的方法在本領域是已知的(如美國專利5,584,807和5，141，131，這兩篇專利的內容在此引入作為參考)，并且可以購買得到(如氦氣生成微發(fā)射加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。當術語"微創(chuàng)"(microwounding)用于涉及植物組織時是指在該組織中引入細微的創(chuàng)傷。微創(chuàng)可以通過例如本文描述的粒子轟擊來實現(xiàn)。本發(fā)明特別地提供采用微創(chuàng)來引入核酸的方案。在此所用的術語"生物體"是指所用的生物體，并且特別是含有具有N-聯(lián)聚糖的糖蛋白的生物體。在此所用的術語"植物"是指充分地分化為存在于植物發(fā)育的任何階段的--種結構的大量植物細胞。這種結構包括但不限于果實、芽、莖、根、葉、種子、花瓣或類似結構。術語"植物組織"包括分化的和未分化的植物組織，包括但不限于根、芽、葉、花粉、種子、瘤組織和各種類型培養(yǎng)細胞(如單細胞、原生質體、胚胎、愈傷組織、原始球莖樣體和其他類型的細胞)。植物組織可能是inpLanta的、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)中的。類似地，"植物細胞"可以是培養(yǎng)中的細胞或是植物的一部分。糖基轉移酶是催化決定細胞寡糖結構的加工反應的酶，包括糖蛋白上的寡糖。在此所用"糖基轉移酶"是指包括甘露糖苷酶，既便這些酶修飾聚糖而不"轉移"單糖。糖基轉移酶具有n型膜定位的特性。每種糖基轉移酶山氨基末端細胞質尾區(qū)(以下tL-l一串專門用"X"標記氨基酸組成用于說明目的一而不是表示該區(qū)的實際大小)、信號鋪定結構域(以下山一串用"H"標記的氨基酸組成表示疏水一而不是說明該結構域的實際大小，也不表示該結構域僅由疏水氨基酸組成)其跨過細胞膜(在此稱作"跨膜結構域")、接著是腔莖(以下用由一串專門用"S"標記的氨基酸組成表示一不是表示該區(qū)的實際大小)或柄區(qū)、和羧基末端的催化結構域(以下用一串專門用"C"標記的氨基組成表示一不是表示該結構域的實際大小NH廠XXXXXXHHHHHHHHSSSSSSSSCCCCCCCC總的來說，胞質尾區(qū)-跨膜一莖或"CTS"(已經(jīng)在上述示意圖中用下劃線標注來說明)(或其部分)可以被用于本發(fā)明提供的實施方案中，其中催化結構域與來自其他分子的相應催化結構域(或這種區(qū)/結構域的部分)調換或"交換"來生成雜合蛋白。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供編碼雜合酶的核酸(以及含有這種核酸的載體、含有這種載體的宿主細胞和雜合酶本身)，所述雜合酶至少包含第一個糖基轉移酶(如植物糖基轉移酶)的CTS區(qū)的一部分[如,胞質尾區(qū)("C")、跨膜結構域("T")、胞質尾區(qū)以及跨膜結構域("CT")、跨膜結構域以及莖("TS")、或者完整的CTS區(qū)]，和至少第二個糖基轉移酶(如哺乳動物糖基轉移酶)的催化區(qū)的一部分。為了建立這種實施方案，整個CTS區(qū)(或其部分)的編碼序列從編碼哺乳動物糖基轉移酶的核酸中被刪除，用植物糖基轉移酶的完整CTS區(qū)(或其部分)的編碼序列取代。另一方面，不同的方法可以被用于建立這種實施方案；例如，整個催化結構域(或其部分)的編碼序列從植物糖基轉移酶的編碼序列中刪除，并且用哺乳動物糖基轉移酶的完整催化結構域(或其部分)的編碼序列取代。在這種情況下，得到的雜合酶具有植物糖基轉移酶的氨基末端胞質尾區(qū)，其連接到以野生型植物酶的一般形式連接在植物糖基轉移酶的莖干區(qū)的植物糖基轉移酶跨膜結構域上一但是莖干區(qū)將被連接到哺乳動物糖基轉移酶的催化結構域(或其部分)上。無意將本發(fā)明僅限于上面描述的兩種方法。包括該方法屮的其他改變。例如，為了生成編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含至少植物糖基轉移酶的跨膜區(qū)的一部分和至少沾乳動物糖基轉移酶催化區(qū)的一部分，可能采用小于CTS區(qū)的整個編碼序列(如僅植物糖基轉移酶的跨膜結構域，或完整的胞質尾區(qū)以及全部或部分跨膜結構域，或完整的胞質尾區(qū)以及整個跨膜結構域以及莖干區(qū)的部分)?？梢詣h除哺乳動物的整個胞質尾區(qū)的編碼序列以及跨膜結構域的編碼序列(或其部分)一接著用相應的植物糖基轉移酶的胞質尾區(qū)和跨膜結構域(或其部分)的編碼序列取代。在這種情況下，得到的雜合酶具有連接到植物糖基轉移酶跨膜結構域(或其部分)的哺乳動物糖基轉移酶的莖干區(qū)，其接著被連接到植物糖基轉移酶的氨基末端的胞質尾區(qū)上，而莖-下區(qū)被連接到哺乳動物糖基轉移酶的催化結構域上(即四個區(qū)/結構域中的兩個是植物來源的，而另外兩個是哺乳動物來源的)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼雜合酶的核酸(以及載體、含有該載體的宿主細胞、含有該宿主細胞的植物或植物部分)，所述雜合酶包含至少植物糖基轉移酶的氨基末端的胞質尾區(qū)的一部分和至少哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分。在該實施方案中，由核酸編碼的雜合酶可能含有或不含有其他植物序列(如跨膜結構域或其部分、莖干區(qū)或其部分)。例如，為了建立該實施方案，整個胞質尾區(qū)(或其部分)的編碼序列被從編碼哺乳動物糖基轉移酶的核酸中刪除，并且用植物糖基轉移酶的整個胞質尾區(qū)結構域(或其部分)的編碼序列取代。在這種情況下，得到的雜合酶具有連接到哺乳動物糖基轉移酶跨膜結構域的植物糖基轉移酶的氨基末端的胞質尾區(qū)(或其部分)，其接著被連接到哺乳動物糖基轉移酶的莖干區(qū)上，該莖干區(qū)被連接到哺乳動物的催化結構域上。另一方面，采用不同的方法來建立該實施方案；例如，整個催化結構域(或其部分)的編碼序列從植物糖基轉移酶的編碼序列中刪除，并且用哺乳動物糖基轉移酶的整個催化結構域(或其部分)的編碼序列取代。在這種情況下，得到的雜合酶以野生型植物酶的方式，植物糖基轉移酶的氨基末端的胞質尾區(qū)被連接到植物糖基轉移酶的跨膜結構域，跨膜結構域連接到植物糖基轉移酶的莖干區(qū)，但是莖干區(qū)將被連接到哺乳動物糖基轉移酶的催化結構域(或其部分)。在上述討論中，采用用語"或其部分"特別指在特定情況下可以使用小于完整的區(qū)/結構域(如可以使用一個片段)。例如，糖基轉移酶的胞質尾區(qū)長度范圍在5—50個氨基酸，更典型的是15—30個氨基酸，這取決于特定的轉移酶。胞質尾區(qū)的"一部分"在此定義為不少于四個氨基酸，并且可以達到比該區(qū)/結構域全長少一個氨基酸。期望部分的功能在某種意義上類似于全長的區(qū)/結構域一但不必起到相同程度的功能。例如，在一定程度上，全長胞質尾區(qū)作為高爾基滯留區(qū)或內質網(wǎng)滯留信號，期望在上述實施方案中采用的部分還作為高爾基或內質網(wǎng)滯留區(qū)，雖然可能不如全長區(qū)一樣有效。類似地，跨膜結構域的長度典型地為15—25個氨基酸，主要由疏水氨基酸組成?？绻山Y構域的一部分在此定義為不少于IO個氨基酸，可以達到用比全長的區(qū)/結構域少一個氨基酸(對于特定轉移酶)的長度。期望部分功能在某種意義上類似于全長的區(qū)/結構域一但不必起到相同程度的功能。例如，在一定程度上，全長跨膜區(qū)作為高爾基滯留區(qū)或內質網(wǎng)滯留信號，期望在上述實施方案中采用的部分還作為高爾基或內質網(wǎng)保留區(qū)，雖然可能不如全長區(qū)一樣有效。本發(fā)明特別提供保守性取代來生成野生型跨膜結構域或其部分的變體。例如，本發(fā)明提供用一個或多個不同的氨基酸，優(yōu)選還是疏水性氨基酸，來取代一個或多個疏水性氨基酸(在上述方案中表示為"H")。催化結構域的一部分可以比該結構域的全長少一個氨基酸。雖然，催化結構域來自131，4-半乳糖基轉移酶，優(yōu)選該部分包括最小殘基345-365，一般認為其參與產(chǎn)生寡糖受體結合位點的構象(優(yōu)選該部分最小包括這個區(qū)，并且兩側有5—10個氨基酸以保證正確的構象)。本發(fā)明還提供合成的CTS區(qū)和其部分。CTS的"一部分"必須至少包括一個(可以包括一個以上)完整的結構域(如完整的跨膜結構域)，但小于整個CTS區(qū)。重要的是，使用術語"CTS區(qū)"或"跨膜結構域"并不是說僅包括野生型的序列。事實上，本發(fā)明不限于天然的糖基轉移酶和參與糖基化的酶，還包括采用具有相同或相似功能的合成酶。在一個實施方案中，野生型結構域被改變(如通過缺失、插入、取代等)。最后，當涉及特定雜合體(如"TmXy1-)時使用指示"Tm"，包括完整的跨膜/CTS結構域(改變或未改變野生型序列)以及部分(改變或未改變野生型序列)。
發(fā)明內容本發(fā)明提供編碼雜合酶(或"融合蛋白")的核酸(DNA或RNA)、含有這種核酸的載體、含有這種載體的表達雜合酶的宿主細胞(包括但不限于植物組織和整個植物中的細胞)，和分離的雜合酶本身。在一個實施方案中，所述雜合酶(或"融合蛋白")的表達導致糖基化的改變，例如，但不限于糖成分如木糖、海藻糖、Lewis一x或其他糖結構的下降，妨礙期望的糖型的沉積。在一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含糖基轉移酶(包括但不限于植物糖基轉移酶)的CTS區(qū)(或其部分)和非植物糖基轉移酶(如哺乳動物、魚、兩棲類、真菌)的糖基轉移酶的催化區(qū)(或其部分)。優(yōu)選地，當被表達時CTS區(qū)(或其部分)被(直接或間接地)可操作結合地連接到所述催化區(qū)(或其部分)。連接優(yōu)選是共價的，而結合是可操作的，其中催化區(qū)具有催化功能(即使所述催化功能相對于野生型酶降低了)。連接的方式是使得不插入氨基酸或其他區(qū)/結構域。另一方面，進行連接使得在兩者之間插入氨基酸(或其他化學基團)和/或其他區(qū)/結構域。當然，用于制備編碼上述雜合酶的核酸的核酸可以山酶促從天然序列(如基因組DNA、d)NA等)獲得或者可選擇地采用參比序列(如電子的或硬拷貝的序列)作為向導合成。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包括植物糖基轉移酶的跨膜區(qū)(如至少一個跨膜區(qū)和可選擇地C.TS區(qū)的多個區(qū))和非植物(如哺乳動物)糖基轉移酶的催化區(qū)(或其部分)。此外，優(yōu)選當被表達時，這些區(qū)域被可操作結合地(直接或問接)連接。在還有一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包括植物糖基轉移酶的跨膜結構域(或其部分)和哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)(或其部分)。另外，優(yōu)選當被表達時，這些區(qū)域以可操作結合被(直接或間接地)連接。無意將本發(fā)明限定于特定的轉移酶。在一個實施方案中，植物糖基轉移酶是木糖基轉移酶。在另一個實施方案中，植物糖基轉移酶是N—乙酰葡糖胺基轉移酶(N-acetylglLicosaminyltransferase)。在另一個實施方案中，植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。在一個優(yōu)選實施方案中，哺乳動物糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶(如由SEQIDNO:1編碼的人e1,4-半乳糖基轉移酶，其中編碼跨膜結構域的核苷酸被刪除和取代)。無意將本發(fā)明限制于使用植物來源的糖基轉移酶CTS結構域和人糖基轉移酶催化結構域，而是反之亦然，采用糖基轉移酶的任何CTS—結構域與至少另一種糖基轉移酶的催化片段結合。事實上，在一個實施方案中，本發(fā)明廣泛地包括編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含第一個糖基轉移酶的跨膜區(qū)和第二個糖基轉移酶的催化區(qū)。優(yōu)選地，所述第一個和第二個糖基轉移酶是來自不同種類(可以來自不同屬或甚至來自不同的門)。在一個實施方案中，所述第一個糖基轉移酶包含植物糖基轉移酶。在另一個實施方案中，所述植物糖基轉移酶是木糖基轉移酶。在還有一個實施方案中，所述植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述第二個糖基轉移酶包含哺乳動物糖基轉移酶。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶。無意將本發(fā)明限制在第一和第二個糖基轉移酶分別是植物的和非植物的情況。在一個實施方案中，所述第一個糖基轉移酶包含第一個哺乳動物糖基轉移酶和所述第二個糖基轉移酶包含第二個哺乳動物糖基轉移酶。在優(yōu)選實施方案中，所述第一個哺乳動物糖基轉移酶是非人類的糖基轉移酶，所述第二個哺乳動物的糖基轉移酶是人糖基轉移酶。無意將本發(fā)明限制在載體類型。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼上述雜合酶的核酸的表達載體。也無意將本發(fā)明限制于宿主細胞的類型。各種原核的和真核的宿主細胞可以購買到，用于表達蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明提供含有包含編碼上述雜合酶的核酸的載體的宿主細胞(含有或不含有其他載體或其他編碼其他雜合酶或糖基轉移酶的核酸)。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是植物細胞。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種包含這種宿主細胞的植物。無意將本發(fā)明限制在使宿主細胞表達本發(fā)明的雜合酶的方法。在一個實施方案屮，本發(fā)明提供一種方法包含a)提供.i)一種宿主細胞(如植物細胞，或者是培養(yǎng)的或是植物組織的部分或甚至是完整生長植物的部分)，和ii)一種包含編碼雜合酶的核酸的表達載體，所述雜合酶包含至少植物糖基轉移酶的CTS區(qū)的一部分(如跨膜結構域)和至少哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分；和b)在一定條件下，將所述表達載體導入所述植物細胞中，使得所述雜合酶被表達。此外，無意將本發(fā)明限定于特定的轉移酶。在一個實施方案中，用于上述方法中的植物糖基轉移酶是木糖基轉移酶。在另一個實施方案中，植物糖基轉移酶是N—乙酰葡糖胺基轉移酶。在另一個實施方案中，植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。在一個優(yōu)選實施方案中，被用于實施方法的哺乳動物糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶(如山SEQIDNO:l編碼的人ei,4-半乳糖基轉移酶，其中編碼跨膜結構域的核苷酸被刪除和取代)(或簡而言之，其中SEQIDNO:1中編碼催化結構域或其部分的核苷酸被取出并連接到編碼植物糖基轉移酶的CTS區(qū)或其部分的核苷酸上)。無意將本發(fā)明限制在用上述雜合酶控制異源蛋白的糖基化的特定方案中。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，包含a)提供i)一種宿主細胞(如植物細胞)，ii)包含編碼雜合酶的核酸的第一種表達載體，所述雜合酶包含至少第一個(如植物)糖基轉移酶的CTS區(qū)的一部分(如至少跨膜結構域)和至少第二個(如哺乳動物)糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分；和iii)包含編碼異源糖蛋白(或其部分)的核酸的第二個表達載體；和b)在一定條件下，將所述第一個和第二個表達載體導入所述植物細胞中，使得所述雜合酶和所述異源蛋白被表達。可選擇地，采用具有編碼雜合酶(或多種雜合酶)和異源糖蛋白的核酸的單一載體。無論采用何種方法，在一個實施方案中，本發(fā)明包括分離異源蛋白以及被分離的蛋白本身作為一種組合物的額外步驟(c)。另一方面，本發(fā)明還包括將不同載體導入不同植物細胞(無論是培養(yǎng)中的細胞、植物組織的部分、或甚至是完整生長植物的部分)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，包括a)提供i)包含第一種表達載體的第一種植物，所述第一個載體包含編碼雜合酶(或編碼兩種或兩種以上雜合酶)的核酸，所述雜合酶包含至少植物糖基轉移酶的CTS區(qū)的一部分(如約N—末端的前40—60個氨基酸)和至少喃乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分，和ii)包含第二個表達載體的第二種植物，所述第二個載體包含編碼異源蛋白(或其部分)的核酸；和雜交所述第一種植物和第二種植物來制備表達所述雜合酶和所述異源蛋白的子代。當然，這種子代可以被分離、生長和分析是否存在各種(或兩種)蛋白。事實上，異源蛋白(典型地首先被純化，基本上不含有植物細胞物質)可被治療性地(如施用給人或動物，無論通過口服、靜脈內、經(jīng)皮膚或者其他施用路徑)用于治療或預防疾病。無意將本發(fā)明限制在特定的異源蛋白。在一個實施方案中，提供任何對宿主細胞(或生物體)來說不是內源的肽或蛋白。在一個實施方案中，異源蛋白是抗體或抗體片段。在特別優(yōu)選實施方案中，抗體是在植物中高產(chǎn)量地表達的人抗體或"人源化的"抗體。"人源化的"抗體通常從非人抗體(如嚙齒類抗體)中制備，將非人類的抗體的超變區(qū)(也稱作CDRs)取出，并將它們"移植"到人的構架中。整個操作可以是人工的(假設序列是己知的)，可以從共同的人的構架的數(shù)據(jù)庫中選擇構架。多數(shù)情況下，除非架構序列被修飾或CDRs被修飾，否則制備過程中會損失親合性。實際上，當CDRs被系統(tǒng)地突變(例如，通過隨機化操作)和試驗時，可以反映親合性升高。本發(fā)明上下文中的異源蛋白是特別有用的，在一個實施方案中，本發(fā)明的雜合酶可用于改變內源性蛋白的糖基化，即通常由宿主細胞或生物體表達的蛋白。本發(fā)明特別包括植物本身。在一個實施方案中，本發(fā)明提供包含第一個和第二個表達載體的植物，所述第一個載體包含編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含至少植物糖基轉移酶的CTS區(qū)的一部分(如胞質尾區(qū)以及至少跨膜結構域的一部分)和至少哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分，所述第二個表達載體包含編碼異源蛋白(或其部分)的核酸。在一個優(yōu)選實施方案中，通過與本發(fā)明的雜合酶(或多種雜合酶)一起表達，異源蛋白與在缺乏雜合酶(或多種雜合酶)的植物中異源蛋白的表達相比，表現(xiàn)為al，3-海藻糖基化下降(10%—99%)(甚至無海藻糖基化)。在一個優(yōu)選實施方案中，通過與本發(fā)明的雜合酶(或多種雜合酶)一起表達，異源蛋白與在缺乏雜合酶(或多種雜合酶)的植物中異源蛋白的表達相比，表現(xiàn)為木糖基化下降(10%_99%)(甚至無木糖基化)。在一個優(yōu)選實施方案中，通過與本發(fā)明的雜合酶(或多種雜合酶)一起表達，異源蛋白與在缺乏雜合酶(或多種雜合酶)的植物中異源蛋白的表達相比，表現(xiàn)為海藻糖和木糖都下降。無意將本發(fā)明限制在實現(xiàn)降低海藻糖和/或木糖的特定理論中。關于植物中的亞高爾基分類機制知道得極少。由于哺乳動物特異的e(1,4)-半乳糖基轉移酶(GaIT)產(chǎn)生通常未見于植物中的聚糖結構，其已經(jīng)被用作最佳第一標記來研究這種表型(見下文實施例)。表達半乳糖基轉移酶的植物的聚糖結構己經(jīng)與來自表達嵌合半乳糖基轉移酶的植物的聚糖結構比較，其CTS結構域換成了植物木糖基轉移酶的CTS結構域(或其部分)。觀察到的聚糖結構的變化表明半乳糖基轉移酶在哺乳動物中局限在植物高爾基的亞區(qū)室。不將本發(fā)明限制于任何特定機制，植物和哺乳動物的分類機制在某種程度上顯然是保守的，植物不識別的糖基轉移酶被運載到高爾基中的特定類似位置上。該位置在內源性木糖基、海藻糖基和GlcNAcTII(GnTII)轉移酶的位置之后。這些表達再定位的GalT變體的植物中的N—聚糖含有極少的木糖和海藻糖，這種發(fā)現(xiàn)也是具有生物技術相關性的。對于用于在哺乳動物如人中的治療用途的糖蛋白，本發(fā)明的一些實施方案中的方法提供用于在植物中控制糖蛋白的N聯(lián)糖基化的方法和組合物，使得可以得到一種糖蛋白，其基本上不含有木糖和海藻糖，而含有至少一個雙觸角N—聚糖(但不限于雙觸角，還包括三觸角等)和在N—聚糖的至少一個臂上的(至少一個)半乳糖殘基。因此，無意將本發(fā)明限制在雙觸角N—聚糖，而是包括平分的雙觸角N—聚糖、三觸角N—聚糖等。此外，本發(fā)明不限于復合型的N—聚糖，還包括雜合型的N—聚糖以及其他類型的N—聚糖。本發(fā)明包括這種生成的糖蛋白。此外，本發(fā)明的方法和組合物可以被應用于植物和非植物系統(tǒng)，其中除了木糖、海藻糖之外，Lewis"'x類型的N—聚糖修飾物((5卜3-GalT、ca-4-FucT等)或其他糖類干擾期望的糖型的沉積。在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過調節(jié)參與高爾基體中聚糖生物合成的酶的定位來控制植物的N聯(lián)糖基化。特別地，本發(fā)明的實施方案是在植物宿主體系中制備糖蛋白的方法，包括(a)阻止(或抑制)在所述糖蛋白的聚糖核心中增加木糖和海藻糖和(b)在所述臂上添加一個，優(yōu)選兩個半乳糖殘基。該糖蛋白具有雙觸角聚糖，在至少一個臂上含有至少一個半乳糖殘基，不含有(或降低)木糖和海藻糖。'通過將編碼雜合酶的核酸導入到所述植物宿主系統(tǒng)中，可以減少或甚至阻止向所述異源糖蛋白中添加木糖和海藻糖，該雜合酶包含一種蛋白特別是一種酶如植物木糖基轉移酶的CTS區(qū)(或其部分)和通常不存在于植物的半乳糖基轉移酶或者其中跨膜部分被去除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的半乳糖基轉移酶的催化區(qū)(或其部分)，其中所述蛋白質或酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)中的植物細胞的高爾基體中起作用，而不是作為所述半乳糖基轉移酶。優(yōu)選半乳糖基轉移酶是哺乳動物半乳糖基轉移酶，特別是人半乳糖基轉移酶。在最特別的實施方案中，所述半乳糖基轉移酶是人e1,4-半乳糖基轉移酶(GalT)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述木糖基轉移酶是ei,2-木糖基轉移酶。用于替換哺乳動物糖基轉移酶(如半乳糖基轉移酶)的CTS區(qū)或CTS片段的是早期在高爾基體中起作用而不是作為半乳糖基轉移酶的酶之一，包括但不限于導致含有不期望的木糖和海藻糖殘基的聚糖的顯著降低的XylT、FucT、GnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI、Manl、ManII和ManIII(見附圖2)。此外，半乳糖基化增加而聚糖多樣性降低。雖然不限于任何特定的機制，既不含有木糖也不含有海藻糖的半乳糖基化的聚糖增加被認為主要是由于GalGNMan5、GNMan5或GalG薩an4沉積。此外，半乳糖基化僅在一個聚糖臂上發(fā)生。顯然，高爾基中早期的半乳糖基化抑制由甘露糖酶II(Mann)將所述糖型修飾為的GalG剛an3。還抑制由GlcNAcTII(GnTII)增加第二個GlcNAc。因此，在一個實施方案中，包括獲得期望的雙臂被半乳糖基化而基本上不含有木糖和海藻糖的糖蛋白的其他步驟。因此，在一個實施方案中，如上指出的本發(fā)明的方法還包含增加半乳糖殘基到所述糖蛋白的臂上(見附圖3)。在本發(fā)明的一個實施方案中，半乳糖殘基被加到兩個臂上，采取往所述植物宿主系統(tǒng)中導入(a)編碼包含Gn'n的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和GnTH的活性結構域(或其部分)的第一個雜合酶的核酸序列；(b)編碼包含GnTI的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和ManII的活性結構域的第二個雜合酶的核酸序列；禾n(c)編碼包含XylT的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和人半乳糖基轉移酶(TmXyl-(;aIT)的活性結構域(.或其部分)的第三個雜合酶的核酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，半乳糖殘基被增加到雙臂上，通過往所述植物宿主系統(tǒng)中導入(a)編碼包含Manl的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和GnTI的活性結構域(或其部分)的第一個雜合酶的核酸序列；b)編碼包含ManI的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和GnTII的活性結構域(或其部分)的第二個雜合酶的核酸序列；(c)編碼包含M肌I的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和ManII的活性結構域(或其部分)的第三個雜合酶的核酸序列和(d)編碼包含XylT的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和人半乳糖基轉移酶(TmXyl-GalT)的活性結構域(或其部分)的第四個雜合酶的核酸序列。無意將本發(fā)明限制于特定的雜合酶的組合或者應用在單個細胞、植物組織或植物中的這種雜合酶的數(shù)量中。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括表達TmXyl-GaIT和TmGnTI-GnTII及TmGnTI-ManII的宿主細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，半乳糖殘基被增加到所述臂，通過往所述植物宿主系統(tǒng)中導入(a)編碼包含一種蛋白特別是一種酶包括但不限于N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的CTS區(qū)(或其片段)和甘露糖苷酶II(ManII)的催化區(qū)(或其部分)的第一個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)中的植物細胞的高爾基體中起作用，而不是作為甘露糖苷酶II或者其中跨膜部分被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的甘露糖苷酶II和(b)編碼包含包括但不限于N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)的催化區(qū)(或其部分)的第二個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)中的植物細胞的高爾基體中起作用，而不是作為N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)或者其中跨膜部分被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)。編碼N—乙酰葡糖胺基轉移酶或甘露糖苷酶或所述跨膜片段的序列來自植物或來自真核的非植物生物體(如哺乳動物)。還有在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括表達TmXyl-GaIT和TmGnTI-GnTI及TraGnTI-ManII和TmGnTI-GnTII的宿主細胞。在本發(fā)明的另一個實施方案中，半乳糖殘基被添加到所述臂，通過往所述植物宿主系統(tǒng)中導入(a)編碼包含一種蛋白特別是一種酶包括但不限于甘露糖苷酶I(Manl)的CTS區(qū)(或其片段，如包括跨膜結構域的片段)和N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的催化區(qū)(或其部分)的第一個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)中的植物細胞的高爾基體中起作用，而不是作為N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)或者其中跨膜部分被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)和(b)編碼包含包括一種酶但不限于甘露糖苷酶I(ManI)的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和甘露糖苷酶I[(ManII)的催化區(qū)(或其部分)的第二個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)中的植物細胞的高爾基體中起作用，而不是作為甘露糖苷酶II(M3nl[)或者其中跨膜部分被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的甘露糖苷酶lI(ManlI)和(c)編碼包含包括一種酶但不限于甘露糖苷酶I(ManI)的CTS區(qū)(或片段，如包括跨膜結構域的片段)和N一乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)的催化區(qū)(或其部分)的第三個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)中的植物細胞的高爾基體中起作用，而不是作為N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTll)或者其中跨膜部分被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的N-乙酰葡糖胺基轉移酶]l(GnTin。編碼N—乙酰葡糖胺基轉移酶或甘露糖苷酶或所述跨膜片段的序列來自植物或來自真核的非植物生物體(如哺乳動物)。還有在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括表達TmXyl-GaIT及ManIII的宿主細胞。在本發(fā)明的另一個實施方案中，半乳糖殘基被增加到所述臂上，通過往所述植物宿主體系中導入(a)編碼甘露糖苷酶III(Manin的核酸序列，野生型基因序列但不限于以及具有內質網(wǎng)滯留信號的ManIII;具有早期(順式)高爾基體糖基轉移酶(GnTI、Manl、GnTIII)的跨膜片段的ManIII。這些編碼甘露糖苷酶III的序列來源于昆蟲，優(yōu)選來自草地夜蛾(Spodopterafiugiperda)或黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(不限于此)、人或來自其他生物體。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括表達TmXyl-GalT和ManIII及TmGnTI-GnTII的宿主細胞。在還有另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括表達TmXyl-GalT和ManIII及TraManl-GnTI及TmManI-GnTII的宿主細胞。_在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可選擇地包含，往所述植物宿主體系中導入哺乳動物N—乙酰葡糖胺基轉移酶(GnTin)，優(yōu)選為人GnTIII或包含哺乳動物GnTlII的催化部分，和一種蛋白質的跨膜部分的雜合蛋白，所述蛋白質位于真核細胞的ER或高爾基體的早期區(qū)室中。例如，在一個實施方案中，包括雜合酶TmXyl-GnTIII(以及編碼這種雜合酶的核酸，含有這種核酸的載體，含有這種載體的宿主細胞和含有這種宿主細胞的植物或植物部分)。在另一個實施方案中，包括雜合酶TmFuc-GnTffi(以及編碼這種雜合酶的核酸，含有這種核酸的載體，含有這種載體的宿主細胞和含有這種宿主細胞的植物或植物部分)。本發(fā)明特別地包括表達這種雜合酶(含有或不含有其他的雜合酶或其他糖基轉移酶)的宿主細胞。本發(fā)明還提供所述雜合酶或被修飾的酶，編碼所述雜合酶的核酸序列，包含所制核酸序列的載體和獲得所述雜合酶的方法。此外，本發(fā)明提供包含異源糖蛋白的植物宿主系統(tǒng)，該糖蛋白優(yōu)選具有復合型雙觸角聚糖并至少在一個臂上含有至少一個半乳糖殘基，不含木糖和海藻糖。"異源糖蛋白"是來源于一個非植物宿主系統(tǒng)的種類的糖蛋白。糖蛋白包括但不限于抗體、激素、生長因子和生長因子受體和抗原。實際上，本發(fā)明特別可用于控制異源糖蛋白的糖基化，如抗體或抗體片段(單鏈抗體，F(xiàn)油片段、Fab2片段、Fv片段等)。為了控制抗體的糖基化，編碼本發(fā)明的雜合酶的基因構建體(如TmXy]-GaIT基因構建體)被導入到表達一種抗體(如單克隆抗體)或抗體片段的轉基因植物中。另一方面，編碼抗體(或抗體片段)的基因通過轉化表達TmXyl-GaIT基因構建體來被導入。在還有一個實施方案中，含有TmXyl-GaIT表達盒的雙元載體與含有在單一T-DNA上包含單克隆抗體的輕鏈和重鏈序列的表達盒的植物雙元載體或者與含有在各個T-DNA上分別包含單克隆抗體的輕鏈和重鏈序列的表達盒的植物雙元載體被共轉化到植物中。在一個實施方案中，本發(fā)明特別地包括將表達抗體的植物與本發(fā)明的表達雜合型糖基轉移,的植物雜交。"宿主系統(tǒng)"包括但不限于含有具有N—聚糖的糖蛋白的任何生物體。"植物宿主系統(tǒng)"包括但不限于植物或其部分，其包括但不限于植物細胞、植物器官/或植物組織。植物可以是單子葉植物(monocot)，是一種開花植物，其種胚具有一片子葉(cotyledon)或子葉(seedleaf),包括但不限于百合、禾本科植物、玉米(Zeamays)、水稻、谷物包括燕麥、小麥和大麥，蘭花、鷲尾、洋蔥和棕櫚?？蛇x擇地，植物可以是雙子葉植物(dicot)，其包括但不限于煙草(Nicotiana)、番茄、馬鈴薯、豆類(如紫花苜蓿和大豆)、玫瑰、雛菊(daises)、仙人掌、紫羅蘭和浮萍。植物也可以是一種苔蘚，包括但不限于Physcomitrellapaterls。本發(fā)明還提供獲得所述植物系統(tǒng)的方法。該方法包含將表達異源糖蛋白的植物與包含雜合酶(a)、(b)和(c)的植物雜交，雜合酶(a)包含通常不存在于植物中的半乳糖基轉移酶的催化區(qū)(或其部分)和一種蛋白質的CTS區(qū)(或其片段，如包括跨膜結構域的片段)，其中所述蛋白質早期在所述植物宿主系統(tǒng)的植物細胞的高爾基體中起作用而不是作為半乳糖基轉移酶或其中其跨膜部分己經(jīng)被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的半乳糖基轉移酶；雜合酶(b)包含一種蛋白質特別是一種酶包括但不限于N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的CTS區(qū)(或其片段，如包括跨膜結構域的片段)和甘露糖苷酶II(ManII)的催化區(qū)(或其部分)，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)的植物細胞的高爾基體中起作用而不是作為甘露糖苷酶II或其中其跨膜部分已經(jīng)被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的甘露糖苷酶II和雜合酶(c)至少包含一種酶包括但不限于N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的糖基轉移酶的跨膜區(qū)(如N末端的前40—60個氨基酸)和N—乙酰葡糖胺基轉移酶II的催化區(qū)，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)的植物細胞的高爾基體中起作用而不是作為N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)或其中其跨膜部分己經(jīng)被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的N—乙酰葡糖胺基轉移酶ii(Grvrn)，從所述雜交中收獲子代并篩選期望的子代植物，其表達所述異源糖蛋白。本發(fā)明還提供構成植物宿主系統(tǒng)的所述植物或其部分。所述植物宿主系統(tǒng)還包含哺乳動物GnTffl酶或者包含nig乳動物GnTllI的催化部分和一種蛋白質的跨膜部分的雜合蛋白，所述蛋白質位于真核細胞的ER或高爾基體的早期區(qū)室中。此外，本發(fā)明還提供植物宿主休系來制備期望的糖蛋白或其功能性片段的用途。本發(fā)明還提供獲得期望糖蛋白或其功能性片段的方法，包含培養(yǎng)按照本發(fā)明的細胞直到所述植物已經(jīng)達到收獲階段，例如生長足以有利收獲的生物量，然后采用本領域已知的已有方法收獲所述植物，用本領域已知的已有的技術分級所述植物材料，至少部分地從所述被分級的植物材料中分離所述糖蛋白。此外，獲得包含所述異源糖蛋白的所述植物宿主細胞體系還可以通過往植物宿主細胞體系或其部分中導入(a)編碼包含通常不存在于植物中的半乳糖基轉移的催化區(qū)和至少一種蛋白質的跨膜區(qū)(或CTS的更多部分)的雜合酶的核酸序列，所述蛋白質早期在所述植物宿主系統(tǒng)的植物細胞的高爾基體中起作用而不是作為半乳糖基轉移酶或其中跨膜部分已經(jīng)被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的半乳糖基轉移酶；(b)編碼包含至少一種蛋白質特別是一種酶包括但不限于N一乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的跨膜區(qū)(如果需要可以是CTS區(qū)的更多部分)和甘露糖苷酶II(ManII)的催化區(qū)的第一個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)的植物細胞的高爾基體中起作用而不是作為甘露糖苷酶1I或其中跨膜部分已經(jīng)被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的甘露糖苷酶II和(c)編碼包含至少一種蛋白質特別是一種酶包括但不限于N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的跨膜區(qū)(如果需要可以是CTS區(qū)的大部分)和N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)的催化區(qū)的第二個雜合酶的核酸序列，其中所述酶早期在所述植物宿主系統(tǒng)的植物細胞的高爾基體中起作用而不是作為N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)或其中跨膜部分己經(jīng)被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號的被修飾的N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)，和分離表達所述異源糖蛋白(或其部分)的植物或其部分。在一個實施方案中，包含所用核酸序列的載體被導入所述植物宿主系統(tǒng)中。在另一個實施方案中，每種核酸序列被插入各個載體中，并且這些載體被導入所述植物宿主系統(tǒng)中。在另一個實施方案中，兩個或多個核酸序列的組合被插入到各個載體中，然后這些載體通過再轉化或共轉化或雜交被結合到所述植物宿主系統(tǒng)中。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的這種植物來源的糖蛋白或其功能性片段來制備組合物，特別是藥物組合物的用途，例如用抗體、激素、疫苗抗原、酶等處理患者。還提供這種包含糖蛋白或其功能性片段的藥物組合物。最后，可以預期上述的方法可以用于降低表達一種或多種本發(fā)明的雜合酶的植物中的聚糖的總體差異性(與野生型植物或僅用哺乳動物GaIT簡單轉化的植物比較)。附圖1比較植物和哺乳動物中的糖蛋白的糖基化路徑。附圖2顯示用木糖基轉移酶置換半乳糖基轉移酶的CTS片段的效果。附圖3表示再定位甘露糖苷酶II和GlcNAcTII的其他影響。附圖4的上面組表示含有編碼聚糖被修飾的酶的基因的T-DNA構建體，其有效生成不含有免疫原性的木糖和海藻糖的半乳糖基化的聚糖，下邊組表示具有抗體輕鏈和重鏈基因的T-DNA構建體。附圖5表示人半乳糖基轉移酶(人Bl,4-半乳糖基轉移酶-GaIT)的核酸序列(SEQIDN0:1)。附圖6表示附圖5的核酸序列以及相應的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。附圖7表示來自人半乳糖基轉移酶的野生型氨基酸序列(SEQIDN0:2)的示意性的突變序列(SEQIDNO:59)，其中絲氨酸從胞質尾區(qū)被去除，而重復基序〔:-I-Y。當然這種變化僅僅是闡明本發(fā)明的保護范圍內的多種可能的變化。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括突變序列，其中僅進行(一次或多次)刪除(如胞質尾區(qū)或莖干結構域中的刪除)一沒有插入或重復。類似地，在一個實施方案中，本發(fā)明包括突變序列，其中僅進行(一次或多次)插入或置換(如在跨膜結構域)一沒有刪除。附圖8表示編碼包含人半乳糖基轉移酶(人Bl,4-半乳糖基轉移酶-GaIT)的雜合酶的核酸序列(SEQIDN0:3)。大寫字母是擬南芥的e1,2-木糖基轉移酶的mRNA的核苷酸(數(shù)據(jù)庫登錄EMBL:ATH277603,所用的TmXyl片段包括這個數(shù)據(jù)庫的序列的核苷酸135-297)。附圖9表示附圖8的核酸序列以及相應的氨基酸序列(SEQIDN0:4)。附圖IO表示由附圖8中的核酸編碼的雜合酶的氨基酸序列(SEQIDN(h4)。附圖11表示人糖基轉移酶GnTIII的核酸序列(SEQIDNO:5)(以及編碼myc-標記的其他序列)(原始登錄號(primaryaccessionnumber)Q09327GNT3HUMAN)。附圖12表示附圖11的核酸序列以及相應的氨基酸序列(SEQIDN0:6)。附圖13表示人GnTIII的氨基酸序列(SEQIDNO:6)(以及myc抗原決定簇標記的其他氨基酸序列SEQIDN0:7)。附圖14表示編碼本發(fā)明的雜合酶的一個實施方案的核酸序列(SEQIDN0:9)，所述雜合酶包含植物木糖基轉移酶(TmXyl-)的跨膜結構域和人GnTIII(TmXyl-GnTIII)(以及編碼myc-標記的其他序列)的催化結構域(以及其他區(qū)域)。附圖15表示附圖14的核酸序列以及相應的氨基酸序列(SEQIDNO:IO)。附圖16表示由附圖14的核酸序列編碼的雜合酶的氨基酸序列(SEQIDNO:IO)(以及myc抗原決定簇標記SEQIDN0:7的其他序列)。附圖17表示編碼雜合酶TmXyl-GaIT和TmGnT工-(;nTII及TmGnTI-ManII的表達盒的完整核酸序列(SEQIDN0:27)。附圖18表示編碼雜合酶TmGnTI-Manll的表達盒的完整核酸序列(SEQIDN0:28)(具有SEQIDN0:39所示RbcSl啟動子序列)。附圖19表示編碼雜合酶TmGnTI-Manl的核酸序列(SEQIDNO:29)。附圖20表示編碼雜合酶TmGnTI-GnTl[的核酸序列(SEQIDNO:30)。—附圖21表示編碼雜合酶Tm(;nTI-GnTn的核酸序列(SEQIDN0:31)，其中跨膜片段(被消化的TmGntI)具有SEQIDN0:32所示核酸序列。附圖22A表示編碼跨膜結構域片段(TmGnTI)的一個實施方案的核酸序列(SEQIDN0:32)。附圖22B表示編碼跨膜結構域片段(TmManI)的另一個實施方案的核酸序列(SEQIDNO:33)。附圖23表示本發(fā)明的三個表達盒的實施方案的完整核酸序列(SEQIDNO:34)。附圖24表示雜合基因表達盒(TmMan1-GnTI)的核酸序列(SEQIDN0:35)。附圖25表示組蛋白3.1啟動子的核酸序列(SEQIDNO:36)。附圖26表示雜合基因融合(TmManl-TmGnTI)的核酸序列(SEQIDN0:37)。附圖27表示雜合基因融合TmManI-ManII的核酸序列(SEQIDN0:38)(具有SEQIDNO:39所示RbcSl啟動子序列)。附圖28表示RbcSl啟動子的核酸序列(SEQIDNO:39)。附圖29表示雜合基因TmManI-ManII的核酸序列(SEQIDN0:40)，其中顯示編碼跨膜區(qū)片段的核酸序列(SEQIDN0:33)。附圖30表示雜合華因TmManI-GnTII的核酸序列(SEQIDN0:41)。附圖31表示Lhca啟動子的核酸序列(SEQIDN0:42)。附圖32表示雜合基因TmManI-GnTlI的核酸序列(SEQIDN0:43)，其中顯示編碼跨膜片段的核酸序列(SEQIDN0:33)。附圖33表示所用終止子序列(見下文)的核酸序列(SEQIDN0:44)。附圖34是與對照植物比較，檢測本發(fā)明的植物總蛋白糖基化的蛋白質印跡。附圖35用RCA對雜交植物的子，代Fl進行血凝素印跡，所述子代按照本發(fā)明的一個實施方案制備。附圖36是蛋白質印跡。組A是用抗IgG抗體分析，組B用抗服P的抗體分析，組C用特異性抗Xyl抗體片段分析。組D是用特異性抗海藻糖抗體片段分析。組E用血凝素RCA分析。附圖37表示雜合基因的核酸序列(SEQIDN0:49，其中昆蟲甘露糖苷酶III的氨基末端CTS區(qū)用小鼠信號肽取代，并且添加羧基末端的內質網(wǎng)滯留信號(KDEL)。附圖38表示附圖37的核酸序列的相應氨基酸序列(SEQIDN0:50)。附圖39表示雜合基因的核酸序列(SEQIDN0:51)，其中人P1，4-半乳糖基轉移酶(GfdT)基因的氨基末端的CTS區(qū)用小鼠信號肽取代，并且添加羧基末端的內質網(wǎng)滯留信號(KDGL)。陽圖40表示附圖39的核酸序列的相應氨基酸序列(SEQIDN0:52)。附圖41表示雜合基因的核酸序列(SEQIDN0:53)，其中擬南芥GnTI基因的氨基木端的CTS區(qū)用小鼠信號肽取代，并且添加羧基末端的內質網(wǎng)滯留信號(匿L)。附圖42表示附圖41的核酸序列的相應氨基酸序列(SEQIDN0:54)。附圖43表示雜合基因的核酸序列(SEQIDN0:55)，其中擬南芥GnTII基因的氨基末端的CTS區(qū)用小鼠信號肽取代，并且添加羧基末端的內質網(wǎng)滯留信號(KDEL)。附圖44表示附圖43的核酸序列的相應氨基酸序列(SEQIDNO:56)。附圖45表示雜合酶的核酸序列(SEQIDNO:57)，其中人P1，4-半乳糖基轉移酶(GalT)基因的氨基末端的CTS區(qū)用人的(;nTI基因的CTS區(qū)取代。附圖46表示附圖45的核酸序列的相應氨基酸序列(S叫IDNO:58)。附圖47是酶如何定位于高爾基體的示意圖。附圖48是轉移酶的區(qū)域"交換"如何引起再定位的非限制性的假定示意圖。具體實施方式雜合酶采用本領域己知的各種重組DNA操作，如多聚酶鏈式反應或篩選表達文庫來刪除具有相同結構特征的克隆DNA片段，可以獲得編碼各種糖基化酶如甘露糖苷酶、GicNAcTs、半乳糖基轉移酶的核酸序列。參見，如Innis等，1990，PCR:方法和應用指南(A,GuidetoMethodsandApplication)，學院出版社，紐約?？梢圆捎闷渌怂釘U增操作如連接酶鏈式反應(LCR),連接激活轉錄(LAT)和核酸序列擴增(NASBA)或遠程PCR。一旦生成DNA片段，通過各種方式實現(xiàn)確定具有期望基因的特定DNA片段。例如，可以得到一定含量的基因的部分或其特定RNA或其片段，并被純化和標記，可以通過核酸雜交到標記探針來篩選生成的DNA片段[Benton和Davis,科學196:180(1977);Gr謹tein和Hogness，美國國家科學院匯編72:3961(1975)]。此外，可以通過基于表達產(chǎn)物的物理、化學或免疫特性的分析來檢測基因的存在。例如，選擇雜交篩選恰當mRNA的cDNA克隆或DNA克隆，其制備一種蛋白質，具有與目標蛋白已知的相似或相同的電泳遷移率、等電聚焦活性、蛋白水解消化圖譜或抗原特性?？扇缦芦@得編碼包含第一個酶的跨膜部分和第二個酶的催化部分的雜合酶的核酸序列。編碼跨膜部分的序列從第二個酶中去除，使得核酸序列包含編碼第二個酶的C末端部分的序列，包括催化部位。編碼第一個酶的跨膜部分的序列通過PCK被分離或得到，連接到編碼包含第二個酶的C末端部分的序列的序列上。被修飾的酶去除編碼跨膜片段的序列，用甲硫氨酸密碼子(起始翻譯)取代，和在半乳糖基轉移酶的最后一個密碼子和終止密碼子之間插入編碼ER滯留信號的核酸序歹U，如編碼KDEL的序列(氨基酸殘基序列賴氨酸-天冬氨酸-亮氨酸)[Rot.hman，細胞50:521(1987)]，獲得編碼蛋白質特別是酶的核酸序列，如滯留在ER中的半乳糖基轉移酶、甘露糖苷酶和N-乙酰葡胺基轉移酶。使用其結構域和部分如上指出，詞語"至少一部分"或"其片段"是指蛋白或肽保持其性質和天然功能所必需的最小氨基酸序列。例如，酶的功能是指其酶促或催化作用，在高爾基體中錨定一種蛋白質的能力，或作為一種信號肽。因此，詞語"至少跨膜結構域的一部分"或"跨膜結構域的一個片段"分別指較大跨膜結構域的最小氨基酸片段，其仍然保留至少一部分天然的跨膜功能(例如，功能雖然降低了，但是明顯的)。作為另一個例子，詞語"至少催化區(qū)的一部分"或"催化區(qū)的一個片段"分別指較大催化結構域的最小氨基酸片段，其仍然至少保留部分的天然催化功能(例如，既便有所降低，但是存在)。如在此所討論，本領域的技術人員將知曉一種蛋白質或肽保持至少一些天然蛋白質或肽功能的最小氨基酸片段。根據(jù)所轉移的糖類型，糖基轉移酶典型地分成兩個家族(半乳糖基轉移酶，唾液酸轉移酶等)。根據(jù)氨基酸相似性和立體化學的反應過程，糖基轉移酶可以被分為至少27個和可能多達47個家族[Campbell等，生物化學雜志(Biochem.J.)326:929-939(1997)，生物化學雜志(Biochem.J.)329:719(1998)]。至今被克隆的大多數(shù)糖基轉移酶是II型跨膜蛋白質(即在胞質中具有NH2末端和在高爾基體的內腔具有COOH末端的單一的跨膜結構域)。無論將它們如何分類，所有糖基轉移酶具有某些共同的結構特征短的NHr末端胞質M區(qū)，16-20個氨基酸信號錨或跨膜結構域，和擴展的莖干區(qū)，后面接著大的C00H-末端催化結構域。胞質尾似乎參與一些類型的糖基轉移酶特異地定位于高爾基體[Milland等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)277:10374-10378]。信號錨定結構域可以作為不可裂解的信號肽和作為跨膜區(qū)，指導糖基轉移酶的催化結構域進入高爾基體的內腔。在本發(fā)明的一個實施方案中，由Nicotianabenthamiana(煙草)乙酰葡糖胺基轉移酶I的N—末端的77個氨基酸定義的部分被包含，用于雜合酶，由于該部分被發(fā)現(xiàn)足以在植物高爾基體中指向和保持報道蛋白[Essl等，F(xiàn)EBSLett453:169-173(1999)]。在煙草中，由假定的胞質的、跨膜的和莖干結構域構成的各種融合蛋白的亞細胞定位表明，僅胞質一跨膜結構域就足以保持P1，2-木糖基轉移酶滯留在高爾基體中，而不需要任何腔序列的幫助[Dirnberger等，植物分子生物學(PlantMo]—.Biol.)50:273-281(2002)]。因此，如上指出，本發(fā)明的一些實施方案采用僅包括胞質一跨膜結構域(或其部分)的CTS區(qū)部分，而未使用CTS區(qū)的莖干區(qū)。但是，一些類型糖基轉移酶滯留高爾基體時主要依賴于其跨膜結構域，其他類型需要其跨膜區(qū)和該區(qū)的一端或兩端的側翼序列[Colley，糖生物學(Glycobiology)7:1-13(1997)]。例如，包含氨基酸1一32的N末端肽似乎是足以將e，6N-乙酖葡糖胺基轉移酶定位在高爾基體中的最小靶向信號。該肽組成這種酶的胞質結構域和跨膜結構域〔Zerfaoui等，糖生物學(Glycobiology)12:15-24]。大量特定糖基轉移酶結構域的氨基酸序列的信息是可以獲得的。例如，山GenBank登錄號AAM17731提供的哺乳動物半乳糖基轉移酶的氨基酸序列具有分別包括殘基19一]47和殘基"8—397的"莖"結構域和"催化"結構域[美國專利6,416，988,在此引入作為參考]和在一些實施方案中，本發(fā)明特別地包括將這些部分用于雜合酶。GenBank登錄號AAC91156提供的大鼠肝臟唾液酸轉移酶的氨基酸序列具有9個氨基酸的NH,末端胞質尾區(qū)、17個氨基酸的信號錨定結構域，和包括暴露的莖區(qū)的腔結構域，接著是41kDa的催化結構域[Hudgin等，加拿大生物化學雜志(Can.丄Biochem.)49:829-837(1971);美國專利5,032，519和5，776，772，在此引入作為參考]。已知的人和小鼠ei,3-半乳糖基轉移酶具有催化結構域，其具有8個保守區(qū)[Kolbinger等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)273:433-440(1998);Hennet等,生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)273:58-65(1998);美國專利5，955，282，在此引入作為參考]。例如，由GenBank登錄號NM020026提供的小鼠UDP-半乳糖0-N-乙酰氨基葡萄糖Pl,3-半乳糖基轉移酶-I的氨基酸序列具有如下催化區(qū)從殘基78-83的區(qū)1;從殘基93-102的區(qū)2;從殘基116-119的區(qū)3;從殘基147-158的區(qū)4;從172-183的區(qū)5;從殘基203-206的區(qū)6;從殘基236-246的區(qū)7;和從殘基264-275的區(qū)8.[He匿t等，同上文]-所有這些區(qū)都被包含在本發(fā)明的一些實施方案中，作為上面討論的雜合酶的有用部分。先前在己知的糖基轉移酶的cDNA克隆之間的比較表明，酶之間序列的同源性極低[Paulson等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)264:17615-618(1989)],最新進展使得可能推導出特異性不同的糖基轉移酶中的保守結構域[Kapitonov等，糖生物學(Glycobiology)9:961-978(1999)]。例如，通過采用由所得到的完整基因組序列提供的序列數(shù)據(jù)，已經(jīng)確定各種生物體的大量糖基轉移酶的核酸和氨基酸序列，如現(xiàn)代人(人類)、Caehorhabditiselega.ns(土壤線蟲)、擬南芥(thalecress，芥菜)和0ryzasativa(水稻)。作為廣泛研究的結果，己經(jīng)推導出各種糖基轉移酶家族的一致結合位點的共同氨基酸序列。例如，唾液酸轉移酶具有唾液酸基序(sialyl,tif)，其似乎參與共同底物CMP-硅酸的識別[Paulson等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)，264:17615-17618(1989);Da.U.a等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)，270:1497-1500(1995);Katsutoshi,糖科學糖技術趨勢(Trend'sGlycosci.Glycotech.)8:195-215(1996)]。Gala1-3半乳糖基轉移酶中的六肽RDKKND和GIcNAc131-4半乳糖基轉移酶中的RDKKNE被認為是UDP-Gal的結合位點[(Joziasse等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.),260:4941-4951(1985)，生物學化學雜志(J.Biol,Chem.)，264:14290-14297(1989);Joziasse,糖生物學(Glycobiology),2:271-277(1992))。山兩個天門冬氨酸殘基構成小的高保守性基序(DA'D)，通常被親水區(qū)包圍，已經(jīng)在大量不同真核生物轉移酶中被確定，包括a-l，3-甘露糖基轉移酶，1,4-半乳糖基轉移酶，a-l，3-半乳糖基轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，海藻糖基轉移酶，糖原引物(glycogenins)等[Wiggins等，美國國家科學院匯編(Proc.Natl.Acacl.Sci.U.S.A.)95:7945-7950(1998)]。突變試驗表明這個基序是酶促活性所必需的[Busch等，生物學化學雜志(J.Biol..Chem.)273:19566-19572(1998);Wang等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)277:18568-18573(2002)]。多重肽對比表明一些對應于假定催化區(qū)的基序在所有P3-半乳糖基轉移酶家族的成員中是保守的，也就是II型跨膜結構域，保守性DxD基序，N-糖基化位點和五個保守性胱氨酸[Gromova等，分子致癌性(Mol.Careinog.)32:61-72(2001)]。通過BLAST檢索和多重對比，發(fā)現(xiàn)E-X7-E基序在滯留糖基轉移酶的四個家族的成員中是高度保守的。[Cid等，生物學化學雜志(J.Biol.Chem.)275:33614-33621(2000)]。O-連接乙酰葡糖胺基轉移酶(GIcNAc)將一個P-N-乙酰氨基葡萄糖成分添加到特定絲氨酸或蘇氨酸羥基上。BLAST分析、相同的二級結構預測和折疊識別研究表明，第二個Rossmann結構域中的保守基序對應UDP-GicNAc供體-結合位點[Wrabl等，分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)314:365-374(2001)]。迄今確定的e1,3-糖基轉移酶共有一些保守區(qū)和保守半胱氨酸殘基，都位于假定的催化區(qū)。定點突變鼠P3GatT-I基因(登錄號為ATO29790)表明，保守性殘基W101和W162參與UDP-半乳糖供體的結合，殘基W315參與N-乙酰氨基葡萄糖P-p-硝基酚受體結合，包括E264的結構域似乎參與這兩種底物的結合[Malissard等，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)269:233-239(2002)]。在植物宿主系統(tǒng)中表達目標蛋白按照本發(fā)明的一些實施方案，編碼雜合或改進的酶或其他異源蛋白質如異源糖蛋白的核酸被插入到合適的表達載體中，即包含插入的編碼序列的轉錄和翻譯所需元件的載體，或者為RNA病毒載體的情況下，復制和翻譯的必需元件，以及選擇性標記。這些包括但不限于啟動子區(qū)，信號序列，5'不翻譯序列，起始密碼子(取決于結構基因是否攜帶一個)，和轉錄和翻譯終止序列。獲得這些載體的方法在本領域是已知的(參見W(XH/29242作為綜述)。適合于植物中的表達的啟動子序列在現(xiàn)有技術中被描述，如W091/198696。包括非組成型啟動子或組成型啟動子，如胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶啟動子、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S、35S啟動子和玄參花葉病毒(FMV)35啟動子(見美國專利5,352，605和6，051,753，都在此引入作為參考)。所用的啟動子可以是組織特異性啟動子，如靶向胚乳、糊粉層、胚胎、果皮、莖、葉、塊莖、根等。信號序列使蛋白質被恰當?shù)丶庸ず娃D移。信號來源于植物或者是非植物信號序列。信號肽指引初生多肽到內質網(wǎng)，隨后多肽在此進行翻譯后的修飾。信號肽可fcld本領域技術人員常規(guī)地確定。信號肽通常具有三聯(lián)結構，在N末端具有正電荷氨基酸，接著是疏水區(qū)，然后在低疏水性區(qū)內具有裂解位點。轉錄末端通常在轉錄起始調控區(qū)的相反端。其可能與轉錄起始區(qū)相關，來自不同基因，被選擇用來增強表達。一個例子是來自農桿菌Ti質粒的N0S終止子和水稻a-淀粉酶終止子。還可以添加聚腺苷酸尾。例子包括但不限于農桿菌章魚堿合成il信號[Gielen等，EMB0J.3:835-846(1984)]或相同種類的胭脂堿合成酶[D印icker等，分子應用遺傳學(Mol.Appl.Genet.)1:561-573(1982)]?？梢园ㄔ鰪娮觼硖岣吆?或最大化異源蛋白質的轉錄。這些包括但不限于肽排出信號序列、密碼子選擇、內含子、聚腺苷酰化和轉錄終止位點(見wo01/29242)。標記優(yōu)選包括原核生物的選擇性標記。這種標記包括抗生素抗性如氨卡青霉素、四環(huán)素、卡那霉素和奇霉素。特別的例子包括但不限于編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶(印O基因、編碼卡那霉素或遺傳抗性的新霉素磷酸轉移酶(，t//)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(力pt)基因。采用本領域已知的方法(參見W001/29242和W001/31045),將所構建的載體導入植物宿主系統(tǒng)中。載體被改進為介導植物轉化質粒，含有與根癌農桿菌載體同源的區(qū)域、來自根癌農桿菌的T-DNA邊界區(qū)?？蛇x擇地，用于本發(fā)明的方法的載體可以是農桿菌載體。導入載體的方法包括但不限于微注躬'，用具有核酸的小顆粒速度彈道穿透，核酸在小珠或顆粒的基質中或者在表面，以及電穿孔。載體被導入植物細胞、組織或器官中。在一個特別的實施方案中，一旦確定存在異源基因，可用本領域的已知方法再生植物?？梢圆捎帽绢I域已知的方法篩選期望的蛋白，優(yōu)選采用篩選分析，其中以產(chǎn)生可檢測的信號的方式來檢測生物學活性位點。該信號可以直接或間接產(chǎn)生。這種分析的例子包括ELISA或放射免疫分析。瞬時表達本發(fā)明特別包括上述雜合酶的穩(wěn)定表達和瞬時表達。用于轉化大量各種高等植物種類來瞬時表達表達盒的技術是已知的[見如Weising等，Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)]。不同系統(tǒng)的變量包括被轉化的核酸類型(DNA、,A、質粒、病毒)、被轉化的組織類型、導入轉基因的方法和轉化條件。例如可以采用從電轉化、PEGparation、粒子轟擊、硅纖維呈遞、植物細胞原生質體或K愈傷組織或其他植物組織微注射-，或者農桿菌介導轉化等范圍內的技術[Hiei等，植物雜志(PlantJ.)6:271-282(1994)]，將核酸構建體直接導入植物細胞中。山于轉化效率是變化的，常常采用內參(如35S-Luc)來規(guī)格化轉化效率。用于瞬時分析的表達構建體包括質粒和病毒載體?？梢杂米鬏d體的各種植物病毒在本領域是已知的，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙粒病毒組、雀麥草花葉病毒和煙草花葉病毒。適合于瞬時表達的植物組織包括培養(yǎng)的細胞，或者是完整的或者作為原生質體(其中細胞被去除)、培養(yǎng)的組織、培養(yǎng)的植物和植物組織如葉子。一些瞬時表達的方法采用通過電轉化或聚乙二醇介導將基因轉化到植物細胞原生質體中。這些方法需要制備和培養(yǎng)植物原生質體，包括在原生質體上形成穿孔，核酸通過該孔被轉化到原生質體的內部。示例性的電轉化技術在Fro隱等，美國國家科學院(Proc.Natl.Acad.Sci.)82:5824(1985)中被描述。采用聚乙二醇穿透的DNA構建體導入在Paszkowski等，EMBOJ.3:2717-2722(1984)中被描述。煙草原生質體的PEG-介導轉化在Lyck等，(1997)植物界(Planta)202:117-125和Scharf等，(1998)分子細胞生物學(MolCellBiol)18:2240-2251，和Kirschner等，(2000)植物雜志(ThePlantJ)24(3):397-411中被描述，包括原生質體的分離、純化和轉化的歩驟。這些方法己經(jīng)被用于例如確定由外部刺激激活的啟動子中的順式作用元件，Abel和Theologis(1994)，植物雜志(PlantJ)5:42H27;Hattori等，(1992)遺傳發(fā)育(GenesDev)6:609-618;Sablowski等，(1994)EMBOJ13:128-137;和Solano等，(1995)EMBOJ14:1773-1784),以及其他的基因表達研究(美國專利6，376，747,在此引入作為參考)。彈道轉化技術在Klein等，(1987)自然(Nature)327:70-73中被描述。彈道瞬時轉化用于懸浮細胞或植物器官。例如，其已經(jīng)被開發(fā)用于煙草葉子，Godon等，(1993)Biochimie75(7):591-595。其還用于研究植物啟動子，(Baum等，(1997)植物雜志(PlantJ)12:463-469;Stromvik等，(1999)植物分子生物學(PlantMolBiol)41(2):217-31,Tuerck和Fromm(1994)植物細胞(PlantCell)6:1655-1663;和美國專利5,847,102，在此引入作為參考)，和用于表征轉錄因子(Goff等，(1990)EMBOJ9:2517-2522;Gubler等,(1999)植物雜志(PlantJ)17:1-9;和Sainz等，(1997)植物細胞(PlantCell)9:611-625)。另一種方法可以原位可視化基因的瞬時表達，例如洋蔥表皮剝落，其中可以觀察到GFP在各種細胞腔室內表達(Scott等，(1999)生物技術(Biotechniques)26(6):1128-1132。還可以通過直接注射將核酸導入植物中。瞬時基因表達可以通過將DM注射到植物的繁殖器官中來實現(xiàn)(見如，Perui等,(987)自然，325:274)，如將隨轉化到花粉中(見如Zhou等，(1983)酶學中的方法(MethodsinEnzymology)'101:433;D.Hess(1987)InternRev.Cytol.,107:367;Luo等，(1988)植物分子生物學報道(PlantMol.Biol.R印orter)，6:165。DNA還可以直接注射到未成熟的胚胎的細胞中(見如，Neuhaus等，(1987)Theor.Appl.Genet:75:30;和Be油rook等，(1986)ProceedingsBioExpo1986，Buttenvorth，Stoneham，Mass,27—54)。農桿菌介導的轉化可以應用于雙子葉植物和單子葉植物。用于禾本科植物如水稻和玉米的農桿菌介導的轉化的最佳方法和載體已經(jīng)被描述(見如，Heath等，(1997)分子植物微生物互作(MoLPlant-MicrobeInteract.)10:221—227;Hiei等，(1994)植物雜志(PlantJ.)6:271—282和Ishida等，(1996)自然生物技術(Nat.Biotech.)14:745—750)。玉米轉化的效率受到各種因素的影響，包括感染的組織的類型和階段、農桿菌濃度、組織培養(yǎng)液、Ti載體和玉米基因型。另一種有效的基本轉化操作包括結合粒子轟擊創(chuàng)傷，接著用農桿菌呈遞DNA(見如，Bidney等，(1992)植物分子生物學(PlantMol.Biol.)18:301—313)。完整的分生轉化和斷裂分生轉化也是已知的(美國專利6,300,545在此引入作為參考)。利用農桿菌的其他方法包括農桿菌感染法和農桿菌滲入。通過將病毒基因組插入T-DNA，農桿菌可用于介導植物的病毒感染(見如，美國專利6，300,545在此引入作為參考)。在將T-DNA轉入植物細胞后，成功病毒感染要求病毒基因組從T-DNA上切除(轉移)。這種用于將病毒導入植物宿主的農桿菌介導方法被稱作農桿菌感染(見，如，Grimsley，"農桿菌感染"，325—342，分子生物學中的方法(MethodsinMolecularBiology),第44巻農桿菌操作，Gartland和Davey編輯，HumanaPress,Inc.，Totowa，新澤西州；Grisley(1990)Physiol.Plant.79:147—153)。用于在植物中表達外源基因的植物病毒基因載體的發(fā)展提供了一種方法，在短時間內產(chǎn)生高水平的基因表達。適宜的表達復制子包括來自具有雙鏈DNA基因組的病毒的雙鏈DNA或者復制介質。被切除的病毒DNA可以獨立地或者與翻譯中添加因子一起作為復制子和復制介質。病毒DNA編碼或不編碼感染性的病毒顆粒，還可以具有插入、刪除、取代、重排或其他修飾。病毒DNA含有異源DNA，可以是任何非病毒的或來自不同病毒的DNA。例如，異源DNA可以包含目標蛋白或RM的表達盒。具有農桿菌A281和A348的病毒基因的超級雙元載體可以用于單子葉植物的高效轉化。但是，既便不采用高效的載體，已經(jīng)證明T-DNA能有效地轉化玉米，雖然不形成細胞瘤，但是產(chǎn)生由農桿菌誘導的病毒的系統(tǒng)性感染(Grimsley等，(1989)Mol.Gen.Genet.217:309-316)。這是山于含有病毒基因組的T-DNA的整合不要求病毒增ffi，切除的病毒基因組作為獨立的復制子。另一種農桿菌介導的瞬時病毒分析基于農桿菌介導轉化inplanta的煙草葉片(Yang等，(2000)植物學雜志(ThePlantJ)22(6):543-551)。這種方法采用含有質粒構建體的農桿菌侵入煙草葉片中，稱作為農桿菌侵入；已經(jīng)被用于體內分析在2—3天內的啟動子和轉錄因子的表達。也可以原位檢測外部刺激，如病原體感染和環(huán)境應激對啟動子活性的影響。實施例1采用先前描述的基于親緣種選擇操作的PCR[Bakker等，BBRC261:829(1999)]，從cDM文庫中分離編碼131,2-木糖基轉移酶的擬南芥cDNA。用從兔抗辣根過氧化酶抗血清中純化的木糖特異性抗體免疫染色被轉化的CHO細胞，確定木糖基轉移酶活性。用引物Xy畫lTpvuF:ATACTC(;AGTTAACAATGAGTAAACGGAATC(SEQIDN0:45)禾卩XylTpvuK:TTCTC(;ATCGCCGATTGGTTATTC(SEQIDN0:46)擴增含有木糖基轉移酶的N末端部分的DNA片段，在起始密碼子的前面引入Xhol和HpaI限制性位點，而在相反末端引入PvuI。用引物GalTpvuF:GCCGCCGCGATCGGGCAGTCCTCC(SEQIDN0:47)和GalTrev:AACGGATCCACGCTAGCTCGGTGTCCCGAT(SEQIDNO:48)擴增人ei,4半乳糖基轉移酶(登錄號x55415，Aoki1992)的C末端片段，然后引入Pvul和BamHI位點。將Xhol/Pvul和PvuI/BamHI的消化的PCR片段連接到用XhoI/BamHI消化的pBluescriptSK+上并測序。得到的開放閱讀框編碼融合蛋白，其含有與人P1，4半乳糖基轉移酶的69—398氨基酸融合的擬南芥j31，2-木糖基轉移酶的前54個氨基酸，稱作為TmXyl-C'alT。用Hpal/BamHI，將該片段克隆到植物表達載體中，位于CaMV35S啟動子和Nos終止子之間。如天然的人P1,4半乳糖基轉移酶[Bakker等，美國國家科學院匯編(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)98:2899(2001)]—樣，該克隆被導入煙草(samsunNN)中。如描述[Bakker等，美國國家科學院匯編(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)98:2899(2001)]，進行轉基因植物蛋白質的提取和蛋白質印跡。根據(jù)血凝素RCA的反應，通過MALDI-T0F[Elbers等，植物生理學(PlantPhysiology)126:1314(2001)]，選擇表達TmXylGalT的轉基因植物用于進一步分析聚糖，并與從表達天然01，4半乳糖基轉移酶的植物中分離的聚糖比較，以及與野生型植物的聚糖比較。表1中給出MALDI-T0F質譜的相對峰值區(qū)。也就是說，表1是對照煙草("Tobacco")、表達人ei,4-半乳糖基轉移酶的轉基因煙草("GalT")，以及CTS區(qū)用3-1,2-木糖基轉移酶的CTS區(qū)取代的表達l3-1.4-糖基轉移酶的轉基因煙草植物("TmXyl-GaIT")的內源性糖蛋白的N聚糖的質譜(MALDI-TOF)分析結果的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>14%野生型植物相比，82%聚糖不攜帶木糖或海藻糖。2.半乳糖苷化從C;aIT植物的9%增加到TmXylGalT植物的32%。實施例2根據(jù)生物素標記RCA(VectorLaboratories,伯林蓋姆，加利福尼亞)的血凝素印跡，篩選表達所述TmXy]-GaIT基因的轉基因植物(TmXyl-GaIT-12植物)(如上)。用抗IIRP(辣根過氧化酶)多克隆抗體(已知具有高抗木糖和抗海藻糖的反應性)，比較MGR48轉基因植物(對照)、表達未被修飾的人P1,4-半乳糖基轉移酶基因的被選擇的轉基因植物和TmXyi-GalT-12植物的蛋白質提取物中含有的木糖和海藻糖，結果表明木糖和海藻糖減少(附圖34"抗辣根")。采用抗HRP的抗木糖片段和抗海藻糖片段的蛋白質印跡(每種都在適宜的配體上通過親合層析制備)表明，與對照植物相比，尤其降低了木糖(附圖34:"抗-Fuc"和"抗-Xyl")。實施例3TinXyl-Ga.IT-12植物與來自單一T-DNA整合事件的表達單克隆抗體MGR48的轉基因植物(M〔;R48-31)雜交，首先通過選擇不能山卡那霉素抗性標記和抗體產(chǎn)物分離的子代植物來純合(MGR48-31-4)。用MGK48-3卜4的花粉給去雄的TmXy1-〔;alT-l2植物授粉。相反，用TmXyl-GalT-12植物的花粉給去雄的M(;R48-31-4植物授粉。通過蛋白質印跡，分析大量的Fl植物是否存在MGR48，并采用RCA通過血凝素印跡分析內源性糖蛋白的半乳糖基化(附圖35)。選擇一種表達MGR48并具有內源性糖蛋白的半乳糖基化的植物，用于進一步分析。該植物稱作為XGM8.種植TmXy卜GalT-12()XMGR48-31_4()的種子，采用先前描述的常規(guī)技術，通過蛋白質印跡分析子代植物(XGM)的抗體產(chǎn)量和用生物素標記的RCA120(VectorLabs.,伯林蓋姆，加利福尼亞)通過血凝素印跡分析半乳糖基化。所有植物如預期表達單克隆抗體MGR48，并且如RCA120的血凝素印跡所示，大部分植物還具有半乳糖基化的聚糖。個別表達抗體MGR48并具有半乳糖基化的N—聚糖的植物被選擇用于進一步分析(XGM8)(TmXyl-GalT-12XMGR48-31-4子代植物8)。如先前描述，從該植物中純化到單克隆重組MGR48抗體，用于MALDI-T0F的N—聚糖分析。簡而言之，在最佳條件下，將XGM8植物種植在溫室里來生產(chǎn)抗體[Elbers等，植物生理學(PlantPhysiology)126:1314(2001)]。進行轉基因植物XGM8葉片的蛋白質提取，如所述[Bakker等，美國國家科學院匯編(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)98:2899(2001)]，用G蛋白層析純化單克隆抗體。純化的單克隆抗體的N-聚糖的MALDI-T0F被描述(Elbers等，2001，同上文)。如所述的采用牛睪丸P-半乳糖通過酶測序來確定聚糖上是否存在半乳糖(Bakker等，2001,同上文;表2)。表2(下文)是對TraXyl-GaIT-12植物與生產(chǎn)rec-mAb(MGR48)的植物的Fl雜合子的內源性糖蛋白("Xyl-GaITEndo")的N—聚糖和通過蛋白G層析從所述Fl雜合子純化的rec-mAB的N—聚糖的質譜分析(MALDI-TOF)的結構的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明:1.在F1雜合子中，聚糖的木糖基化和海藻糖基化顯著下降，內源性糖蛋白的43%聚糖不含木糖和海藻糖，而野生型煙草植物僅為14%。2.這種Fl雜合子的純化mAb的聚糖的木糖和海藻糖降低了47%，而野生型煙草為14%,見附圖36組B—D。3.Fl雜合子的內源性糖蛋白的半乳糖基化從GalT植物的9%增加到FlTmXyl-GaITXMGR48植物的37X。見附圖35。4.從所述F1中純化的rec-niAb的半乳糖基化升高(見附圖36組A);即46%具有半乳糖。見附圖36組E。但是應當指出，所觀察到的數(shù)量(MALDI-TOF)并不必然地反映體內所述糖型的分子比例?；贛ALDI-T0F的量化可能是過低估計或過高估計，取決于所試驗的特定糖型。此外，由于Gal和Man之間不存在分子量的差異，一些峰不能被清楚地被標注，除非在半乳糖苷酶處理前后特定分子的相對高度具有顯著差別。實施例4通過檢測來自雜交瘤、轉基因煙草和TmXyl-GalT轉基因煙草中的MGR48IgG抗體，可以直接比較木糖、海藻糖和半乳糖的含量。如上所述，TmXyl-GaIT-12植物與表達MGR48IgG的煙草植物(MGR48煙草)雜交，產(chǎn)生具有MGR48TmXyl-GaIT的Fl雜合子。Fl植物被選擇用于提取和純化MGR48IgG。采用G蛋白層析(Elbers等，200L植物生理學(PlantPhysiology)126:1314-1322)分離和純化來自所述植物(煙草和TmXyl-GalT)的抗體。將3C)0ng的各種雜交瘤MGR48和植物來源的重組MGR48加載到預制的12%SDS-PAGE凝膠上(BioRad)，進行電泳。各個泳道的內容物如下泳道l，雜交瘤MGR48;泳道2，從普通轉基因煙草植物中純化的重組MGR48;泳道3，從TmXyl-GaIT轉基因植物中純化的重組MGR48。在SDS-PAGE之后，用C八PS緩沖液將蛋白質轉移到硝化纖維上。斑點與A，抗小鼠IgG;B，多克隆兔抗一HRP(抗木糖/a1，3-海藻糖);C，抗木糖；1)，抗(a1,3-)海藻糖抗體；和E，生物素化RCA—起溫育。在與HRP標記的綿羊抗小鼠(組A)或山羊抗兔(組B—D)抗體和HRP—標記的鏈霉抗生物素(E)溫育后，在Lumi圖像儀中用Lumi光進行檢測。組A表明，在所有泳道中加載了幾乎相同含量的MGR48Ig(;。L是指MGR48IgG輕鏈，H是指MGR48IgG的重鏈。組B表示MGR48抗體重鏈在泳道2(煙草)中如期望的與抗HRP激烈反應，而來自雜交瘤的MGR48的重鏈(泳道l)不反應(如預期)。來源雜交瘤的抗體不含有木糖和u1,3-海藻糖殘基。特別地，來自TmXyl-(;aIT煙草植物的MGR48抗體也不反應，表明來自這種植物的抗體的重鏈的N—聚糖上的木糖和海藻糖的含量顯著降低(約90%或更多)。這得到組C(抗木糖)和D(抗海藻糖)表示的試驗的證實。組E表明雜交瘤的M〔;R48抗體的重鏈(泳道l)具有半乳糖基化的N—聚糖，而煙草來源的MGR48(泳道2)沒有，兩個結果都是預期的。由于存在表達雜合酶的構建體，來自TmXyl-GalT植物MGR48重鏈(泳道3)也具有半乳糖基化的N—聚糖。這些數(shù)據(jù)與從先前所示采用從類似植物(煙草和TmXy1-GalT-12植物)提取的總蛋白的類似試驗得到的數(shù)據(jù)一致，說明由TmXyl-GaIT基因的表達而引入煙草的新特性可以被穩(wěn)定地傳遞給子代和重組單克隆抗體。實施例5用e-半乳糖苷酶處理來進一步表征上述fi雜合子。表3是在用p-半乳糖苷酶處理聚糖前后，用G蛋白層析從TmXyl-GaIT和MGR48植物的Fl雜合子純化的rec-mAbs的N-聚糖的質譜分析(MALDI-T0F)結果的比較。表3Xyl-GaITIgG-Xyl-GaITIgG+0-半乳糖苷酶m/'z類型933M344蘭XM322翻FM333函M4541136G麗3231211FXM3341241FM422<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>這些數(shù)據(jù)表明:1.來自Fl雜合子的Rec—mAb含有半乳糖，這可以從在P—牛乳糖處理后所觀察的特定糖型(含半乳糖)的減少和不含有半乳糖的糖型的增加推導出。觀察到m/z1622從6%降低到1%，同時m/z1460從10%升高到14%，這是由于從GalGNM5去除半乳糖而加上了GNM5所致。m/z簡(3%降低到1%)和相應的m/zl606峰(從4%增加到6%)情況也如此。見附圖36組E。2.類似地，大量的峰是山于牛乳糖處理使含有半乳糖的聚糖減少導致的，特別是ni/'z1501,1647和1663，說明存在半乳糖。實施例6在另一個實施方案中，昆蟲甘露糖苷酶III基因(登錄號AF005034;錯誤地標注為甘露糖苷酶II基因！)的氨基末端的CTS區(qū)用進入內質網(wǎng)的小鼠信號肽編碼序列取代(見附圖37)。編碼完全活性的信號肽的信號肽序列通常存在于IgG序列的氨基沐端，先前已經(jīng)在植物和其他生物體中成功地被使用。而且，編碼所謂的內質網(wǎng)滯留序列(KDEL)的人工序列被添加到編碼ER滯留的催化片段的基因部分的羧基沐端。因此，由該基因序列編碼的雜合型甘露糖苷酶III優(yōu)選沉積在內質網(wǎng)中。實施例7在另一個實施方案中，人3-1,4半乳糖基轉移酶(GalT)基因(登錄號A52551)的氨基沐端CTS區(qū)用編碼進入內質網(wǎng)的小鼠信號肽的編碼序列取代(見附圖39)。編碼完全活性的信號肽的信號肽序列通常存在于IgG序列的氨基末端，已經(jīng)在植物和其他生物體中成功地被使用。而且，編碼所謂內質網(wǎng)滯留序列(KDEL)的合成序列被添加到編碼ER滯留的催化片段的基因部分的羧基末端。由該基因序列編碼的雜合e-1,4半乳糖基轉移酶蛋白將優(yōu)選地沉積在內質網(wǎng)中。實施例8在另一個實施方案中，擬南芥GnTI(登錄號AJ243198)的氨基末端的CTS區(qū)用編碼進入內質網(wǎng)的小鼠信號肽編碼序列取代(見附圖41)。編碼完全活性的信號肽的信號肽序列通常存在于IgG序列的氨基末端，已經(jīng)在植物和其他生物體中成功使用。而且，編碼所謂內質網(wǎng)滯留序列(KDEL)的人工序列被添加到編碼ER滯留的催化片段的基因部分的羧基末端。由該基因序列編碼的雜合GnTI蛋白將優(yōu)選41地沉積在內質網(wǎng)中。實施例9在另一個實施方案中，擬南芥CmTll(登錄號:AJ249274)的氨基末端的CTS區(qū)用編碼進入內質網(wǎng)的小鼠信號肽編碼序列取代(見附圖43)。編碼完全活性的信號肽的信號肽序列通常存在于1gG序列的氨基末端，已經(jīng)在植物和其他生物體中成功地使用。而且，編碼所謂內質網(wǎng)滯留序列(KDEL)的人工序列被添加到編碼ER滯留的催化片段的基因部分的羧基末端。山該基因序列編碼的雜合CnTII蛋白將優(yōu)選地沉積在內質網(wǎng)中。實施例10在另一個實施方案中，人0-1，4-半乳糖基轉移酶(Ga,lT)基因氨基末端的CTS區(qū)用人GnTI(Tmhu(;nTI-GaIT)的CTS區(qū)基因取代(見附圖45)。應當理解，本發(fā)明不限于任何特定^L制。也不需要理解該機制來成功應用本發(fā)明的各種實施方案。但是，一般認為，高爾基體酶是連續(xù)分布的(附圖47)，植物糖基轉移酶的跨膜結構域的交換引起重新定位(附圖48)。一般認為，本發(fā)明不限于在此描述的特定方法、操作、細胞系、載體和試劑，它們是可改變的。還應當理解，在此所用的術語僅是用于描述特定實施方案的目的，而不是限定本發(fā)明的保護范圍。應當指出，在此和附加的權利要求中，除非文章中清楚指出，單數(shù)形式包括復數(shù)形式。除非另外定義，在此所用的所有科技術語具有本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同意義。由于實施方案是用于闡明本發(fā)明的各個方面，在此描述和要求保護的發(fā)明不被限定在本文描述的特定實施例中。任何等價的實施方案被認為在本發(fā)明的保護范圍內。實際上，除了本文給出和描述的內容，本發(fā)明的各種改進對于本領域技術人員來說根據(jù)先前描述的是顯而易見的。這種改進也被認為落入附加權利要求的保護范圍中。本文引用的各種參考文獻及其公開的內容全部被引入作為參考。序列表<uo〉閨際校物研究所<i20〉Yi:椅物中優(yōu)化聚糖生成<130〉62861A-P033486W0<150>US-60/365，735〈151〉2002-03-19<160>59<170〉Patentlnversion3.2(■〉1atgaggcttccgggcctgcctacctggctgcagggcggctggggcccggc3gcccagtcgC3C8('C3CCgatgctgattggtgaagatggatcattccatgtCCtgC3gCatatt.caatctacacctgctaggtgtttttccttatgttcaatggatttcttagtttttaatccgccactcacscasagggt3C3g3g3tgggagrcgctgcctgct.cgtgccgcgacctcgaacagtgccgccgcctcctggattctggc.actgtcgctagt.U.aacatgcggccgctatccgcaaccggcceigcagctgtgctaagcttt.gtgtmgcacagccacgagtattttggct幼taatt3gaggcatgtccaagagacaaagacaatgctaccceittgtacctgsgcggcggccgtctgcgagccgcctgCgCCgCC3t.Ctctaggcgccccctggccccgcccgcctgcgcxtgtggact.gcccccagggcaggagcacggactatggccctcaatgtttgacgtggacgcacat.ttccsggtgtctctttggggctggtatatctcgcctctgatggttaiccca33tc3gcgccgcgagctctgcaccCCCC33CtgggggC3gtCCttcctcccagcgclagcsactcctgaggagtctggagctcggactgcgtctctcaagtactatctatgttaggCtttC33gctcattccsagttgc犯tgggCtCt88gt3ggagg柳3gccaaatgctgcccaatcctcttgaactcacacagtggacatgccsggcgcttggcgtcactcggsgtct.cccggggagctcgcgcccgggtgacctcggtcc('cgctgcttggcaaagcactcctcacaaggctatattatca3cc3ggc犯gccttgaatgaatgacca3t33gUtggaacaacagttatgatgacattggtcgggagagaggtttgatcacctaccatcgggacaccgtccctacagcctcgt.ttaccacaccgctgccggsccggat.ggcgact.cccccigtgccctgtgggcc('cgaacccaaatggtggccat.ctttgcacccagggsgscact.ggactstgactaatgcgtacattcagcctatctsaccatcttttascagagtgtcgcatgccgaattgcaggtgctgg3tg3gCt3g<210〉2<211〉398<212>PRT<213>人類<400〉2ArgLeuMet1AlaHisArgAsn65GlyGlyAsnAlaSerLeuLeu50SerAlaGlyLeuCysdoLeu35ProAlaArgAspThr115ProArgGin20ValGinAlaProSer100SerGlu5ArgThrLeuAlaPro85SerValProAlaLeuVailie70ProProProSerLeuCysValGly55GlyProValValPro135LeuArgTyrValGinLeuValPro120LeuSerLeu25TyrSerSerGlyAsp105HisLeuGly10Leul>euThrSerAla90SerThrValSerValAlaProGly75SerGlyThrGlyAlaAlaGlyLeu60GluSerProAlaPro140AlaVal45GinLeuGinGlyLeu125MetMetPro15CysAla30Aspl>euGlyGlyArgThrProArg95ProAla110SerLeuLeulieGlyLeuSerSerGly80ProSerProGlu1uD人>>>、oI-2A222cV<<.."oo1143PheValLysTyrTyrAla225TyrHisMetValAsn305LeuArgProAspPro385Asn匕ysValTrpGlyLysThrAsnAspSer290AsnValCysGinGlyLeuMetProValMetAlaGlv(;1y16:5Leu195lieLeuCysAlaLvs275AlaTyrPheArgArg355LeuTyrlieHe180TyrTyrTyrValLeuAsnPheVal245T、'rArgPheGlyLeuSerTipGJyArgGlv32:5Metlie340PheAspAsnSerThrGinAsp150ArglieLeulieVal230PheCysPheLysTrp310MetArgArgLeulie390LeuTyrProHisAsn215GlySerPheSerGin295GlySerHislieGluLeuVa]AlaPheProArg170ArgAsn185Thr375ThrPro200GinPheAspSerLeu280GinGlylieSerAla360TyrValValA丄aGinValGin265ProGluSerArg345HisGinAspLeuGlyGluAsp250PioTyrLeuAspArg330AspThrVallieAla155AspArgGLiiAspAla235LeuArgValThrAsp315ProLysLysLeuGly395LysCysG]nArgThi.220LeulieHisGinIk'300AspAsn匕ysGluAsp380ThrGinAsnProValGluSerPro175Gin205lieLysProlieTvrAsnlieAlaAsnThr365ValProHisLeu190GinLeuPlieAsnAspTyrMetAsn255SerVal270PheGlyGlyPhePheAsnValVal335GluPro350MetLeuGinArgSerAsn160HisLysAspArgAsp240AspAlaGlyProAi'gGlyAsnSerTyr〈210〉<211〉<212〉<213>31152DNAhybrid<400>33tgagt犯acctctttctcacctcctcatagagctccggaccgggtggcgtcggtcccagctgcttgtggcac卿gtggtattatttgcC3ggCggg3gttgaaggacttttggattcacagtttctaagscatttttag卿ggtgtctttgaccgaat.accaggtgcacaccgagctggwtccgaatcatctactttataccacgtccggaggggca.ctccagccctgccccacacgccccatgctcaaatgtgaaccatcatcatacccagtcctacactatattatgactacaccgtacaggtggcctaccttaccatcaatggacagattagtgcatgatccgttgcacacactggatgt織gattctgaagcgtttttcacttcagtgaatccggccgccgsgtcgtggatcaccgcactggattgagtttgatgggcggctccattccgcgcagcgccagcaatcgtgctctgctttgtgtttttcacagtgttcagtatatt,tcctaatmt.agsggcaaaggagacagagatacccaatttttctgttcatcgtcgtaaccaatcggcctcctctagtctggccctgtcgctgcccgaacatgcctgcgctatgcccaaccggcaggcagctggactaagctcctcatttagtgacgccacggcacatUggaggtgaattattgggatgtctatatatgctctctgttgt,at.acccatatgttacttttcaccggacgatcgggcagcgcctcctcgccccgctagcctgccctgatggacctggaCC8ggg3CtgagcacctcaaatggcatctaatgttggctttggacctcattttccgttgctctctgctctgctggggaggctcgcccaaaatgaacccaaatggtttgaaaaatcacagttctcaactctgcagtcacaggtcctccgggccagccgcgccaacttgaccggagtccccggctcgtggcacgtctctcctgtactggctatgttatcaactcaagaagcctccaatgaataatggataagaagtaaacaaagaagatgattgctgtggtctcctcagaggctcactC8ccggacat.cggg601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401152lieLeuLvsUePheLeuTvrMetLeu1510'15LeuLeuAsnSerLeuPheLeulieTieTvrPheValPheHisSerSer202530Se]'PheSerProGluGinSerGinProProHislieTvrHisValSer35404虧ValAsnAsnGLnSerAlalieGlvGinSei'Sei'GivGluLeuArgThr505560GlyGWAlaArgProProProProLeuGiyAlaSerSerGinProArg65707580ProGlyGiyAspSerSerProValValAspSerGlvProGlvProAla859095SerAsnLetiThrSerValProVeilProHisThrThrAlaLeuSerLeu100105110ProAlaCysProGluGluSei.ProLeuLeuValGlyProMetLeulie115120125GluPheAsnMetProValAspInGluLeuVslAlaUsGinAsnPro130135140AsnValLysMetGivGlvAr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tggattcacagtttctaagacatttttagggaggtgtctttgaccgaataccaggtgcacaccgagctagcagtctgctgctcctcttatggcgacccccggaggggcactccagccctgccccacacgccccatgctcaaatgtgaaccatcatcatacccagtcctacactatattatgactacaccgtacaggtggcctaccttaccatcaatggacagattagtgcatgatccgttgcacacactggatgtacaagggcttgtgcttctggacgcgccagcctcccggccgccgagtcgtggatcaccgcactggattgagtttgatgggcggctccattccgcgcagcgccagcaatcgtgctctgctttgtgtttttcacagtgttcagtatatttcct犯tttttagaggcccactcaagaaaaggagacagagatacccactgtggggcgcgcccagcacacccgggaagcctcctctagtctggccctgtcgctgcccgaacatgcctgcgctatgcccaaccggcaggcagctggactaagctcctcEitttagtgacgccacggcac3tttggaggtgaattattgggatgtctatatgacaagaaaaatgctctctgttgtatacccctatcctcttctggcaggcctcgacatgcagcgcctcctcgccccgctagcctgccctgatggacctggaccagggactgagcacctcaaatggcatctaatgttggctttggacctcattttccgttgctctctgctctgctggggaggctcgcccaaaatgaacccaaatggtttgaaaaatcacagttgtggcctggaccctcagtcgtcctccgggccagccgcgccaacttgaccggagtccccggctcgtggcacgtctctcctgtactggctatgttatcaactc肌g犯gcctccaatgaataatggataagaagtaaacaaagaagatgattgctgtggtctcctcagaggctcactcaccggacatcggg601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401152<210〉58<211>383<212>PRT〈213>人類<400>58MetLeuLys1LysGin5SerAlaGlyLeuVal10LeuTrpGlyAlalie15LeuPheValAlaTrp20AsnAlaLeuLeuLeu25LeuPhePheTrpThr30ArgProAlaProGly35ArgProProSerVal40SerAlaLeuAspGly45AspProAlaSerGly65ProSerProGluAsn145HisLysAspArgAsp225AspAlaGlyProArg305GlyAsnSerTyrLeu50GlyGlyAsnAlaPhe130ValLysTyrTyrAla210TyrHisMetValAsn290LeuArgProAspPro370ThrAlaGlyLeuCys115AsnLysValTrpGIyLysThrAsnAspSer275AsnValCysGinGly355LeuArgArgAspThr100ProMetMetAlaLeu180lieLeuCysAlaLys260AlaTyrPheArgArg340LeuTyrGluProSer85SerGluProGlylie165TyrTyrLeuPheTyr245PheLeuTrpArgMet325PheAsnThrValPro70SerValGluValGly150lieTyrValAsnVal230ArgGlySerGlyGly310lieAspSerGinAsp55ProProProSerAsp135ArglieLeulieVal215PheCysPheLysTrp295MetArgArgLeulie375MetProValValPro120LeuTyrProHisAsn200GlySerPheSerGin280GlySerHislieGinLeuValPro105LeuGluAlaPhePro185GinPheAspSerLeu265GinGlylieSerSerGlyAsp90HisLeuLeuProArg170ValAlaGinValGin250ProPheGluSerArg330Ala.—345.HisGinThrValAspThrTyr360SerAla75SerThrValValArg155AsnLeuGlyGluAsp235ProTyrLeuAspArg315AspThrVallieGly60SerGlyThrGlyAla140AspArgGinAspAla220LeuArgValThrAsp300ProlysLysLeuGly380GluSerProAlaPro125LysCysGinArgThr205LeulieHisGinlie285AspAsnLysGluAsp365ThrLeuGinGlyLeu110MetGinValGluGin190lieLysProlieTyr270AsnlieAlaAsnThr350ValProArgProPro95SerLeuAsnSerHis175GinPheAspMetSer255PheGlyPheValGlu335MetGinSerThrArg80AlaLeulieProPro160LeuLeuAsnTyrAsn240ValGlyPheAsnVal320ProLeuArg<210>59<211〉400<212〉PRT<213>人類<400>59MetArgLeu1ArgGluProLeuLeuSerGlyAlaAlaMetProGlyAla51015SerLeuGinArgAlaCysArg20LeuLeu25ValAlaValCysAlaLeuHis30LeuLeuSer65AlaGlyLeuCysAsn145LysValTrpGlyAsn225TyrAsnValGlyPhe305AsnValProLeuArg385GlyPro50AlaArgAspThrPro130MetMetAlaLeulie210ArgAspAspAlaGly290ProArgGlyAsnSer370丁yrVal35GinAlaProSerSer115GluProGlylie丁yr195TyrAlaTyrHisMet275ValAsnLeuArgPro355AspProThrLeuAlaProSer100ValGluValGlylie180TyrGly匕ysThrAsn260AspSerAsnValCys340GinGlyLeuLeuValliePro85ProProSerAspArg165lieLeulieLeuCys245AlaLysAlaTyrPhe325ArgArgLeuTyrValGlyGly70ProValValProLeu150TyrProHisTyrl>eii230PheTyrPheLeuTrp310ArgMetPheAsnThr390TyrVal55GinLeuValProLeu135GluAlaPheProVal215AsnValArgGlySer295GlyGlylieAspSer375GinTyr40SerSerGlyAspHis120LeuLeuProArgVal200lieValPheCysPhe280LysTrpMetArgArg360LeulieLeuThrSerAlaSer105ThrValValArgAsn185LeuAsnGlySerPhe265SerGinGlySerHis345lieThrThrAlaProGlySer90GlyThrGlyAlaAsp170ArgGinGinPheAsp250SerLeuGinGlylie330SerAlaTyrValGlyLeuGlu75SerProAlaProLys155CysGinArgAlaGin235ValGinProPheGlu315SerArgHisGinAsp395ArgGin60LeuGinGlyLeuMet140GinValGluGinGly220GluAspProTyrLeu300AspArgAspThrVal380lieAsp45GlyArgProProSer125LeuAsnSerHisGin205AspAlaLeuArgVal285ThrAspProLysLysLeuGlyLeuGlyThrArgAla110LeulieProProLeu190LeuThrLeulieHis270GinlieAspAsnLys350GluAspThrSerSerGlyPro95SerProGluAsnHis175LysAsplieLysPro255lieTyrAsnlieAla335AsnThrValProArgAsnGly80GlyAsnAlaPheVal160LysTyrTyrPheAsp240MetSerPheGlyPhe320ValGluMetGinSer4007權利要求1.一種編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含植物糖基轉移酶的跨膜區(qū)和哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)。2.權利要求i的核酸，其屮所述植物糖基轉移酶是木糖基轉移酶。3.權利要求1的核酸，其中所述植物糖基轉移酶是N—乙酰葡糖胺基轉移酶。4.權利要求1的核酸，其中所述植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。5.權利要求1的核酸，其中所述哺乳動物糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶。6.權利要求5的核酸，其中所述人半乳糖基轉移酶是山至少SEQTDN():1的核酸序列的一部分編碼。7.—種表達載體，包含權利要求1的核酸。8.—種用權利要求7的載體轉染的宿主細胞。9.權利要求8的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞。10.—種細胞懸浮液，包含權利要求9的宿主細胞。11.由權利要求9的植物細胞表達的雜合酶。12.—種編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含第一個糖基轉移酶的跨膜區(qū)和第二個糖基轉移酶的催化區(qū)。13.權利要求12的核酸，其中所述第一個糖基轉移酶包含植物糖基轉移酶。14.權利要求13的核酸，其中所述植物糖基轉移酶是木糖基轉移酶。15.權利要求13的核酸，其中所述植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。16.權利要求12的核酸，其中所述第二個糖基轉移酶包含哺乳動物糖基轉移酶。17.權利要求16的核酸，其中所述哺乳動物糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶。18.權利要求12的核酸，其中所述第一個糖基轉移酶包含第一個哺乳動物糖基轉移酶和所述第二個糖基轉移酶包含第二個哺乳動物糖基轉移酶。19.權利要求18的核酸，其中所述第一個哺乳動物糖基轉移酶是非人類糖基轉移酶。20.權利要求18的核酸，其中所述第二個l他乳動物糖基轉移酶是人糖基轉移酶。21.—種方法，包含a)提供i)一種植物細胞，和ii)一種包含編碼雜合酶的核酸的表達載體，所述雜合酶包含植物糖基轉移酶的跨膜區(qū)和哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)；禾Q—b)在使得所述雜合酶被表達的條件下，將所述表達載體導入所述植物細胞。22.權利要求21的方法，其中所述植物糖基轉移酶是N—乙酰葡糖胺基轉移酶。23.權利要求21的方法，其屮所述植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。24.權利要求21的方法，其中所述哺乳動物糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶。25.權利要求17的核酸，其中所述人半乳糖基轉移酶是由至少SEQIDNO-1的核酸序列的一部分編碼。26.—種方法，包含a)提供i)一種植物細胞，和ii)包含編碼雜合酶的核酸的第一種表達載體，所述雜合酶包含植物糖基轉移酶的跨膜區(qū)和哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)；和iii)包含編碼異源糖蛋白的核酸的第二個表達載體，和；b)在使得所述雜合酶被表達的條件下，將所述第一和第二種載體導入所述植物細胞。27.權利要求26的方法，其中所述異源蛋白是一種抗體或抗體片段。28.—種方法，包含a)提供i)包含第一種表達載體的第一種植物，所述第一個載體包含編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含至少植物糖基轉移酶的跨膜區(qū)的一部分和至少哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分，和ii)包含第二個表達載體的第二種植物，所述第二個載體包含編碼異源蛋白的核酸；和b)雜交所述第一種植物和第二種植物來制備表達所述雜合酶和所述異源蛋白的子代。29.—種編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含被修飾的哺乳動物糖基轉移酶，其中跨膜部分被刪除而插入內質網(wǎng)滯留信號。30.—種編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含植物糖基轉移酶的CTS區(qū)或其部分和哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)，其中所述CTS區(qū)來自N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnT)，所述催化區(qū)來自甘露糖苷酶Il(Man11)。31.—種編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含植物糖基轉移酶的CTS區(qū)或其部分和哺乳動物糖基轉移酶的催化區(qū)，其中所述CTS區(qū)或其部分來自N—乙酰葡糖胺基轉移酶l(GnTl)，所述催化區(qū)來自N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(〔;nT32.—種方法，包含(a)往所述植物宿主系統(tǒng)中導入一個載體，其包含i)編碼雜合酶的核酸序列，雜合酶包含通常不存在于植物的半乳糖基轉移酶的催化區(qū)和一種蛋白的跨膜區(qū)，ii)編碼包含N-乙酰葡糖腔基轉移酶I(GnTI)的跨膜區(qū)和甘露糖苷酶II(ManII)的催化區(qū)的雜合酶的核酸序列，iii)編碼包含N—乙酰葡糖胺基轉移酶I(GnTI)的跨膜區(qū)和N—乙酰葡糖胺基轉移酶II(GnTII)的催化區(qū)的雜合酶的核酸序列禾口(b)分離表達所述核酸序列的植物或其部分。33.—種方法，包含-(a)提供i)一種宿主細胞，禾Bii)包含編碼雜合酶的核酸的表達載體，所述雜合酶包含第一個糖基轉移酶的跨膜區(qū)和第二個糖基轉移酶的催化區(qū)；和(b)在使得所述雜合酶被表達的條件下，將所述表達載體導入所述宿主系統(tǒng)中。34.權利要求33的方法，其中所述第一個糖基轉移酶包含植物糖基轉移酶。35.權利要求34的方法，其中所述植物糖基轉移酶是N—乙酰葡糖胺基轉移酶。36.權利要求34的方法，其中所述植物糖基轉移酶是海藻糖基轉移酶。37.權利要求33的方法，其中所述第二個糖基轉移酶包含哺乳動物糖基轉移酶。38.權利要求37的方法，其中所述哺乳動物糖基轉移酶是人半乳糖基轉移酶。39.—種方法，包含(a)提供i)一種宿主細胞，禾Pii)包含編碼雜合酶的核酸的第一種表達載體，所述雜合酶包含第一個糖基轉移酶的跨膜區(qū)和第二個糖基轉移酶的催化區(qū)；和iii)包含編碼異源糖蛋白的核酸的第二個表達載體；和(b)在使得所述雜合酶和異源蛋白被表達的條件下，將所述第--種和第二種表達載體導入所述宿主系統(tǒng)中，。40.權利要求39的方法，其中所述異源蛋白是抗體或抗體片段。41.權利要求39的方法，還包括步驟(c)分離所述異源蛋白。42.—種宿主細胞，包含第一種和第二種表達載體，所述第一個載體包含編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含至少第一個糖基轉移酶的跨膜部分的一部分和至少第二個糖基轉移酶的催化區(qū)的一部分，所述第二個載體包含編碼異源蛋白的核酸。43.編碼雜合酶的核酸，所述雜合酶包含植物N—乙酰葡糖胺基轉移,I(GnTl)的跨膜區(qū)域和哺乳動物甘露糖苷酶Il(ManII)的催化區(qū)域。44.一種表達載體，包含權利要求43所述的核酸。45.—種用權利要求44的載體轉染的宿主細胞。46.如權利要求45所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞。47.—種方法，包含(a)提供i)一種植物細胞，和ii)一種包含如權利要求43所述的核酸的表達載體；禾口；(b)在使得所述雜合酶被表達的條件下，將所述表達載體導入所述植物細胞。48.如權利要求47所述的方法，其中還提供第二個表達載體，其包含編碼異源糖蛋白的核酸，在使得所述雜合酶和所述異源蛋白被表達的條件下，將所述表達載體導入所述植物細胞。49.權利要求48的方法，其中所述異源蛋白是一種抗體或抗體片段。50.—種生產(chǎn)植物的方法，包含(a)提供i)包含如權利要求46所述宿主細胞的第一種植物，和ii)包含第二個表達載體的第二種植物，所述第二個載體包含編碼異源蛋白的核酸；和(b)雜交所述第一種植物和第二種植物來制備表達所述雜合酶和所述異源蛋白的子代。51.—種方法，包含(a)提供i)宿主細胞，和ii)如權利要求44所述的宿主細胞；和(b)在使得所述雜合酶被表達的條件下，將所述表達載體導入所述宿主細胞。52.—種宿主細胞，其包含第一和第二表達載體，所述第一載體為如權利要求M所述的表達載體.，所述第二載體包含編碼異源蛋白的核酸。全文摘要本發(fā)明涉及優(yōu)化生物體(特別是植物中)的聚糖生成方法，以獲得具有復合型雙觸角聚糖的糖蛋白，并且在雙臂上含有5半乳糖殘基而不含有(或減少)木糖和海藻糖。本發(fā)明還涉及獲得的所述糖蛋白和含有所述蛋白的宿主系統(tǒng)。文檔編號C12P21/02GK101613705SQ20091014952公開日2009年12月30日申請日期2003年3月18日優(yōu)先權日2002年3月19日發(fā)明者D·E·A·弗洛拉克,G·J·A·魯文德爾,H·A·C·巴克,H·J·博斯申請人:國際植物研究所