專利名稱：水稻秈型雜種育性基因S5-i的分離克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)?00710053552.9專利申請(qǐng)案的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體 涉及一種秈型雜種育性基因5"5-i的分離克隆、功能驗(yàn)證及在水稻改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻屬禾本科(Cra/B2'"eae)、未亞科(尸ooW朋e)的稻屬((2zrzese)，分為兩個(gè)栽培稻種亞洲栽培 稻(Ory幼sa"ra L.)和非洲栽培稻(&丁za ^a6em'鵬)。亞洲栽培稻又分為秈亞種(ssp. i/2t/j'ca) 和粳亞種(ssp. j'a;w"化a)。兩個(gè)亞種在形態(tài)和遺傳上存在著明顯的差異，同時(shí)也存在著生殖障礙，秈粳 亞種間雜種往往表現(xiàn)為不育或半不育(Kato S, Kosaka H, Hara S (1928) On the affinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants. S"ZZ Fac yferj'c A>osAu 〃m>, 3:132-147; Oka HI (1988) Origin of cultivated rice. Scientific Societies Press, Tokyo, Japan pp 181-209; Liu KD， Zhou ZQ, Xu CG, Zhang Q, Saghai Maroof船(1996) An analysis of hybrid sterility in rice using a diallel cross of 21 parents involving /"o^'cs, j'apcwics and wide compatibility varieties. Euphytica 90:275 -280)。水稻秈粳亞種間具有比水稻品種間更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，但秈粳亞種間雜種的不育 性卻限制了對(duì)其雜種優(yōu)勢(shì)的利用。研究者利用各種遺傳標(biāo)記對(duì)水稻秈粳亞種間雜種的不育現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛 的研究。研究表明影響小穗育性的位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)于胚囊育性和花粉育性，說(shuō)明雄性敗育和雌性敗育對(duì)亞種 間雜種敗育都有著很重要的作用。研究進(jìn)一步表明，控制水稻秈粳雜種育性的基因在雜合狀態(tài)下往往發(fā)生 不親和互作，使雄配子敗育或雌配子敗育，但是這些基因在純合狀態(tài)下(如純和的親本中)不影響配子的 正常發(fā)育。
Ikehashi禾卩Araki (Ikehashi H， Araki H (1986) Genetics of Fi sterility in remote crosses of rice. In: IRRI (ed) Rice genetics. IRRI， Manila, pp 119-130)首先將一個(gè)影響雜種育性的位點(diǎn)定 位在第6染色體的色素基因C和糯性基因盯之間，并命名為S5。他們通過(guò)對(duì)育性分離結(jié)果的考察，指出 S5位點(diǎn)是一組復(fù)等位基因Sfn (廣親和)、(秈稻)、5"fj (粳稻)。所述基因符號(hào)S代表雜種不育 性(Sterility), n、 i和j分別代表中性型(neutral)也稱廣親和型(wide-compatibility)、秈型(j'/ A'ca) 和粳型(乂a/w/3ica)的復(fù)等位基因。其中，由Sfn/5^n、 5fn/ 5fi、 5^n/ S5二j組合而成的合子，雜 種育性正常。而由S^jA ^i組成的合子，則表現(xiàn)為不育或半不育。
為了在雜交水稻育種中有效克服雜種不育性的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)圖位克隆(map-based cloning)技 術(shù)獲得了水稻雜種育性基因55的多個(gè)等位基因，包括廣親和型Sf n、秈型和粳型5fj，通過(guò)轉(zhuǎn)基 因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了此基因的功能。該基因的分離克隆使得水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用成為可能。其功能研 究和應(yīng)用將更好的利用水稻秈粳亞種間強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步提高雜交水稻的生物學(xué)產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從秈稻中分離克隆一個(gè)水稻秈型雜種育性基因Sf i，提供上述雜種育性基因所編碼的 蛋白質(zhì)，并對(duì)該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證及在水稻雜交育種中的應(yīng)用。所述的基因與天冬氨酰蛋白酶基因序列高 度同源，其生物學(xué)功能為控制水稻秈稻和粳稻雜種的胚囊育性。該基因?qū)е露i稻和粳稻雜交后代雌配子敗 育，對(duì)利用秈粳亞種間的雜種優(yōu)勢(shì)和提高水稻的生物學(xué)產(chǎn)量起重要作用。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一個(gè)編碼天冬氨酰蛋白酶的秈型雜種育性基因S5-i的DNA片段，并對(duì)該片段 的作用機(jī)理進(jìn)行闡述。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 3所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO: 3所 示的高度同源DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO: 3所示序列的亞片段。
可以采用己經(jīng)克隆的秈型雜種育性基因S5-i的DNA片段作探針，從cDNA和基因組文庫(kù)中篩選得到本 發(fā)明的基因或同源基因?？梢圆捎肞CR技術(shù)，從栽培稻或野生稻的基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā) 明的秈型雜種育性基因S5-i以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。同樣也可以采取化學(xué)合成的方法獲得本發(fā)明的基因或同源基因。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含秈型雜種育性基因S5-i的序列， 將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對(duì)粳稻雜交后代不育 的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強(qiáng)啟動(dòng) 子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，也可使用增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是 ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的翻譯。
攜帶有本發(fā)明秈型雜種育性基因S5-i的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化， 微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(ffeissbach (1998) Method for Plant Molecular Biology VIII， Academy Press, New York, pp. 411-463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology (2"d Edition))。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


序列表SEQ ID NO: 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有5^n基因編碼區(qū)DNA片段序列。序列表SEQ ID N0:2顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有5^j基因編碼區(qū)DNA片段序列。序列表SEQ ID N0:3顯示的是本 發(fā)明分離克隆的包含有基因編碼區(qū)DNA片段序列。
圖l: 55基因克隆和分離鑒定流程圖。
圖2: 5^基因效應(yīng)下秈稻、粳稻和廣親和品種雜種育性示意圖。
圖3:互補(bǔ)載體構(gòu)建示意圖。
圖4:遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301的結(jié)構(gòu)。
圖5: Ti代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(左)小穗不育和轉(zhuǎn)基因陰性植株(右)小穗可育。 圖6: l代轉(zhuǎn)基因陰性植株(a)和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(b)花粉均可育。
圖7: t代轉(zhuǎn)基因陰性植株(a〉胚囊可育和轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(b)胚囊敗育。標(biāo)尺長(zhǎng)度50Mm。 圖8: T。代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株(a)以及L代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株(b)胚囊 育性、花粉育性和小穗育性圖示。
圖9:廣親和品種、粳稻和秈稻W(wǎng)基因cDNA結(jié)構(gòu)示意圖。 圖10:廣親和品種、粳稻和秈稻S5蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。
圖ll: S5基因在水稻全生育期不同組織中表達(dá)水平示意圖。使用的芯片數(shù)據(jù)包括秈稻Zhenshan97和 Minghui 63不同生長(zhǎng)時(shí)期下的25種不同組織。
圖12:體外檢測(cè)S5蛋白絕對(duì)活性(a)和相對(duì)活性(b)。其中絕對(duì)活性以水為對(duì)照測(cè)定，相對(duì)活性以該 蛋白活性最高的點(diǎn)為對(duì)照測(cè)定。白色柱狀圖示意蛋白酶在不同pH條件下活性，深色柱狀圖示意蛋白酶活 性被p印statin A抑制。
圖13: SDS-PAGE膠圖顯示S5蛋白在不同pH條件下自身剪接活性。
圖14:原位雜交確定^S^基因在水稻中的表達(dá)部位。(a)該基因在Ballila珠被和孢母細(xì)胞表達(dá)；(b) 該基因在02428珠心和孢母細(xì)胞中表達(dá)；(c)該基因在Ballila小孢子母細(xì)胞中表達(dá)。標(biāo)尺長(zhǎng)度為25陶。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆包含有55基因完整 編碼區(qū)段的DNA片段以及驗(yàn)證55基因功能的方法(發(fā)明流程如圖1所示)。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對(duì)本發(fā)明做 出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。 實(shí)施例l :分離克隆包含有S5基因區(qū)段的DNA片段
1.利用圖位克隆技術(shù)鑒定水稻S5基因
本發(fā)明中構(gòu)建定位群體時(shí)用到了三個(gè)親本02428、南京ll和Balilla。 02428是一個(gè)粳型的廣親和 品種，是選用兩個(gè)粳稻品種云南螃蟹谷和上海汲浜稻，分別用輻射誘變處理，并經(jīng)高光效篩選出的材料間 雜交，從后代中選育成的(鄒江石等，廣親和選系02428在秈粳亞種間雜交的初步利用.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，
41989， 22: 6-14)。南京11為江蘇農(nóng)科院育成的中秈品種，屬勝利秈衍生品系。巴利拉(Balilla)是引 自意大利的粳型品種。
本發(fā)明在前期工作中構(gòu)建了一個(gè)包含7000個(gè)單株的三交F!大群體。1999年春在海南陵水配制02428/ 南京ll雜交組合。同年夏天在武漢種植R代植株，篩選陽(yáng)性單株。1999年冬天，將雜種稻篼移往海南陵 水基地，并盡量分篼。在2000春天，以02428/南京11真雜種稻篼作為母本，與Balilla大量配制三交 F,雜種。2000年夏天，在水稻生長(zhǎng)季節(jié)，在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)(武漢)水稻試驗(yàn)田分單株植株02428/南京 11〃Balilla三交F,群體，最后共成苗7000株。
考察7000株三交R群體中所有高結(jié)實(shí)率的單株，總共獲得了 1000多株結(jié)實(shí)率在70%以上的單株。 從中隨機(jī)選取202株結(jié)實(shí)率在70%以上的真雜種單株，進(jìn)行DNA抽提和標(biāo)記分析，對(duì)5^區(qū)段的分子標(biāo)記 進(jìn)行重組交換分析。DM的抽提按Murray和Thompson的CTAB法進(jìn)行(Murray M G, Thompson W F (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant ■. Nucl Acids Res. 8: 4321-4325)。分子標(biāo)記 的RFLP分析，包括DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜和雜交，按Liu等人(Liu K D et al. (1997) A geno鵬-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theor Appl Genet. 95:809-814)的實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行。55基因限定在分子標(biāo)記N29和23D12R之間，結(jié) 果如表l所示。
表l 利用202株高結(jié)實(shí)率單株對(duì)廣親和基因的定位
交換單株數(shù) 68 68 55 52 52 50 51 53 53 65
選取SSR標(biāo)記RM253或PCR—RFLP標(biāo)記Cll和RG213對(duì)所有高結(jié)實(shí)率的單株進(jìn)行了掃描，單株用到SSR 標(biāo)記RM276和RM225進(jìn)行篩選。其中，標(biāo)記RM225、 RM253和Cll位于基因S5的一側(cè)，標(biāo)記RG213和RM276 位于基因S5的另一側(cè)。共篩選到了 44株在標(biāo)記之間發(fā)生重組的單株。利用S5區(qū)段的分子標(biāo)記對(duì)這44株 高結(jié)實(shí)率的重組單株進(jìn)行了重組分析，結(jié)果顯示^5基因限定在分子標(biāo)記7B1和15D2之間，兩端各有一個(gè) 重組單株，部分重組單株的信息如表2所示。
表2 利用S5區(qū)段的分子標(biāo)記對(duì)44株重組單株的基因型分析(部分?jǐn)?shù)據(jù))
F 0a 0
F 0 0
F 0 0
F 1 1
F 1 1
r i i
0 0
1 1 1
1 1 1
1 1 1
0 0 0
0 0 0
'Genotype 0 of each locus was composed of an allele from 02428 and an allele from Balilla bGenotype 1 of each locus was composed of an allele from Nanjing 11 and an allele from Balilla 上述結(jié)果將55基因定位在兩個(gè)亞克隆分子標(biāo)記7B1和15D2之間約40 kb的DM區(qū)段上。利用 http:〃www. softberry. com網(wǎng)站上的FGENSH軟件對(duì)分子標(biāo)記7B1和15D2之間40 kb的DNA片段進(jìn)行了 開放閱讀框(open reading frame: 0RF)的預(yù)測(cè)，共檢測(cè)到了 5個(gè)完整的ORFs, Blaxt X同源性分析發(fā) 現(xiàn)候選基因0RF5與天冬氨酸蛋白酶(eukaryotic aspartyl protease)高度同源。
R2171
RG138
KG213
23D12R
N29
Cll
RM253
RZ450
KZ398
記
標(biāo)
RG213
G200
WG138
R2349
23D12R
F7
7D3
7F11
15D2
7B1
F29
F34
F38
M6
1
Cll
E23
A30
RM253
Genotype
Individual
s2.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的表現(xiàn)
本發(fā)明基因S5位點(diǎn)是一組復(fù)等位基因5^n(廣親和)、5f i(秈稻)、5f j(粳稻)。其中，由5^n/5^n、 Sfn/5:i、 S&n/j組合而成的合子，雜種育性正常。而由S5"j/5^i組成的合子，則表現(xiàn)為不育或 半不育(圖2)。根據(jù)此基因的功能，申請(qǐng)人采取將秈稻片段轉(zhuǎn)化粳稻植株的策略，從轉(zhuǎn)基因植株(基因型 j/5^j+S^i)的育性表型來(lái)驗(yàn)證。此基因?qū)?huì)產(chǎn)生不育表型。
互補(bǔ)載體的構(gòu)建方法是根據(jù)秈稻南京11基因組序列設(shè)計(jì)PCR引物ASPHF(5'-TAMAAGCTTCATCATaGCTGCTGCTAGATGGA -3')和ASPHR (5' - TGCTMGCTTTACGAGGTCATGGGTTGAAGTCCT -3') 將候選基因區(qū)段擴(kuò)增出來(lái)，互補(bǔ)載體外源PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用的試劑來(lái)自Takara公司，反應(yīng)條件為94'C， 3 min; 94°C， 1 tnin, 60。C， 1 min, 68°C， 6 min, 30 cycles; 72°C， 5 min。
互補(bǔ)載體構(gòu)建示意圖如圖3所示。PCR產(chǎn)物直接用HindIII酶切，雙元載體(圖4) pCAMBIA1301 (來(lái) 自澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture),攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米強(qiáng)啟動(dòng)子Ubiquitinl的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載 體)也采用HindIII酶切，去磷酸化后連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1013 (購(gòu)自Invitrogen公司)，篩選陽(yáng)性克 隆。釆用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌菌株為超毒力菌株EHA105 (Sun X， Cao Y, Yang 2， Xu C， Li X, 沐ang S， Zhang Q (2004) Ja鄰 a gene conferring resistance to Ja/ A咖o朋s orj^ae pv. orjzae in rice, encoding a LRR rec印tor kinase-like protein. Plant J 37:517-527)，轉(zhuǎn)基因的受體為粳稻品 種Balilla。
本發(fā)明遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制方法如下所述
(1) 試劑和溶液縮寫
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA (6-BenzylarainoPurine, 6-芐基腺嘌 呤)；CN (Carbenicillin'羧節(jié)青霉素)；KT (Kinetin，激動(dòng)素)；NAA (N抑thalene acetic acid, 萘乙酸)；IAA (Indole-3-acetic acid,卩引哚乙酸)；2， 4_D (2, 4-Dichlorophe麗yacetic acid, 2,4-二氯苯氧乙酸)AS (Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate' 水解酪蛋白)；HN (Hygromycin B，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6腿x (N6 大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS 微量元素成分溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制) 硝酸鉀(KN03 ) 28 . 3克 磷酸二氫鉀(KH2P04) 4.0克
硫酸銨((NH4)2S04 ) 4 . 63克
硫酸鎂(MgS04 7H20) 1. 85克
氯化鈣(CaCl 2H20) 1.66克
將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至iooo毫升。
2) N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制 碘化鉀(KI) 0.08克
硼酸(H3B03) 0. 16克
硫酸錳(MnS04 4H20) 0. 44克
硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 15克
將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。
3) 鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)
將3. 73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2ft0)和2. 78克FeSCV7H20分別溶解，混合并用蒸餾水定容 至1000毫升，至70'C溫浴2小時(shí)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 64) 維生素貯存液(按照100X濃縮液配制) 煙酸(Nicotinic acid) 0. l克 維生素Bl (Thiamine HC1) 0. l克 維生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. l克 甘氨酸(Glycine) 0. 2克 肌醇(Inositol) IO克 加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照IOX濃縮液配制) 硝酸銨(NH4N03) 16. 5克
硝酸鉀 19.0克
磷酸二氫鉀 1.7克
硫酸鎂 3.7克
氯化鈣 4.4克
將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSrain母液)(按照100X濃縮液配制) 硫酸錳(MnS04 4H20 ) 2. 23克
硫酸鋅(ZnS04 '7H20) 0.86克 硼酸(H3B03 ) 0. 62克
碘化鉀(KI) 0.083克 鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0. 025克
硫酸銅(CuS04 5H20 ) 0. 00 25克
氯化鈷(CoCl2'6H20 ) 0. 00 25克
將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
7) 2,4-D貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，于室溫下保存。
8) 6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取6-BA100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，室溫保存。
9) 萘乙酸(NM)貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取NM100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 10) 吲哚乙酸(IAA )貯存液(l毫克/毫升)的配制秤取IM100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，4"C保存?zhèn)溆谩?br> 11) 葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制
秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> 12) AS貯存液的配制
秤取AS 0.392克，加入DMS0 10毫升溶解，分裝至l. 5毫升離心管內(nèi)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 13) 1N氫氧化鉀貯存液
秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存?zhèn)溆谩?(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方 1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max母液(取已經(jīng)制備好的10X濃縮液，下同) IOO毫升N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
2， 4-D貯存液(取上述制備好的) 2. 5毫升
脯氨酸(Proline) 0. 3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如121'C下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的 滅菌方法相同)。
2) 繼代培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA Jt存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
2, 4-D貯存液 2. 0毫升
脯氨酸 0.5克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
3) 預(yù)培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D貯存液 0. 75毫升
CH 0. 15克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克 加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升 /皿)。
4) 共培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe"EDTA C存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D貯存液 0. 75毫升
CH 0.2克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克N6max母液(10X)
N6mix母液(100X)
Fe2+EDTA Jt存液(100X)
維生素貯存液(100X)
2, 4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/ 每皿)。
5) 懸浮培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 5毫升 N6mix母液(100X) 0. 5毫升
Fe2+EDTA JC存液(100X) 0. 5毫升
維生素貯存液(100X) l毫升 2, 4-D貯存液 0. 2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。 使用前加入l毫升無(wú)菌葡萄糖C存液和100微升ASC存液。
6) 選擇培養(yǎng)基
25毫升 2.5毫升 2. 5毫升 2.5亳升 0. 625毫升 0.喊 7. 5克 L75克
加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升)分裝倒入培養(yǎng)皿 中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng) 基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7) 預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 25毫升 N6mix母液(100X) 2. 5毫升
Fe2+EDTA C存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升 6-BA貯存液 0. 5毫升
KT貯存液 0. 5毫升
NAA於存液 50微升 IM貯存液 50微升 CH 0. 15克
蔗糖 7.5克
瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,封口，按上述方法滅菌。 使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升) 毫升/皿)。
8) 分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升 N6mix母液(100X) IO毫升
分裝倒入培養(yǎng)皿中(25
9Fe2+EDTA Jt存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
6-BA貯存液 2毫升
KT貯存液 2毫升
NM貯存液 0. 2毫升
iM ie存液 0. 2毫升
C H l克 蔗糖 30克 Phytagel 3克 加蒸餾水至900毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。 9)生根培養(yǎng)基
MSmax母液(10X) 50毫升 MSmix母液(100X) 5 Fe2+EDTA Jt存液(100X) 5 維生素貯存液(100X) 5 蔗糖 2 Phytagel 3 加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。 (4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟 4. 1愈傷誘導(dǎo)
1) 將成熟的Ballila水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子 表面消毒15分鐘；
2) 用滅菌水洗種子4-5次；
3) 將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
4) 將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25土rC。 4.2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士1'C。 4. 3預(yù)培養(yǎng)
挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25土rC。 4. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)
1) 在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J(rèn).薩姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌5K1W5(該菌株來(lái)自CAMBIA公 司公開使用的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28'C;
2) 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28。C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。 4. 5農(nóng)桿菌侵染
1) 將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；
2) 調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D 0. 8-1. 0;
3) 將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-2(TC。 4. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
2) 浸泡在含400毫克/L潮霉素的滅菌水中30分鐘；
毫毫毫喊克
103) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。 4. 7分化
1) 將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；
2) 轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26。C。 4.8生根
1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；
然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C 。 4.9移栽
洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。
本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)基因T。代水稻植株33株，包括29株陽(yáng)性單株和4株陰性單株。所獲得的L代 水稻植株以B10家系為例，包括15株陽(yáng)性單株和14株陰性單株。
轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性和陰性植株小穗育性(圖5)差異顯著(t=7.4， /M).0000);轉(zhuǎn)基因水稻陰性植株小 穗平均育性(53.3%)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性植株2. 8%的小穗育性。申請(qǐng)人亦檢測(cè)了 T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株 的胚囊育性和花粉育性，其中花粉育性在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和陰性水稻植株中無(wú)顯著差異(見圖6)，而轉(zhuǎn)基因陰 性植株胚囊育性顯著高于轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株胚囊育性(圖7) (t=12.33, P=0.0000)。 T。代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和 轉(zhuǎn)基因陰性植株以及t代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株胚囊育性、花粉育性和小穗育性如圖8所示， 結(jié)果表明本發(fā)明克隆的秈型雜種育性基因51^i參與決定秈稻和粳稻亞種間雜交后代的雌配子育性，將導(dǎo) 致胚囊敗育，進(jìn)而導(dǎo)致雜種育性降低。
3.含有S5基因區(qū)段的DNA片段的分離克隆
分別使用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和PCR引物延伸的方法獲得該基因全長(zhǎng)cDNA。使用材料為秈稻 南京ll，粳稻Ballila和廣親和品種02428幼穗發(fā)育的五期葉片，液氮冷凍后于-70'C冰箱待用。按照TRIZOL 說(shuō)明書所述步驟提取RNA (注TRIZOLReagent, InvitrogenCat. No. 15596-018),稀釋濃度至lug/wl， -70匯保存待用。
RACE具體步驟使用Clontech的SMART MCE cDNA Amplification Kit,步驟參照該試劑盒說(shuō)明書。 5'端RACE引物S5-GSP1: CCGTTCCMCCAGMTAGTCGTGCT
S5-R1: ACCCGAACATGAGATCCATMACGA 3'端MCE引物S5-GSP2: AAGATGGTGACAGACACGCTGAGGA
S5-RACE4: CMTCMCAGGCCAACCTACTCAC UPM: Long (0.4M): CTMTACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCM CGCAGAGT
Short (2uM): CTMTACGACTCACTATAGGGC NUPM: MGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 其中UPM和NUPM由上述試劑盒提供。 第一輪PCR反應(yīng)條件-94'C變性30秒，72'C3分鐘，5個(gè)循環(huán)； 94。C變性30秒，7(TC退火30秒，72'C延伸3分鐘，5個(gè)循環(huán)； 94。C變性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸3分鐘，27個(gè)循環(huán)； 72'C最終延伸10分鐘。 5'貼0￡使用引物1^1 + S5-GSP1 3' RACE使用引物UPM+ S5-GSP2 第二輪PCR反應(yīng)條件 94'C預(yù)變性4分鐘94。C變性l分鐘，59'C退火1分鐘，72。C延伸l分鐘20秒，35個(gè)循環(huán)；
72'C最終延伸IO分鐘。
5' RACE使用引物NUPM+ S5-R1
3' RACE使用引物NUPM+ S5-RACE4
PCR引物延伸具體步驟反轉(zhuǎn)錄采用20 u 1體系，按照DNaseI說(shuō)明書所述步驟去除RNA中痕量DNA 后，按Superscript II說(shuō)明書所述步驟操作，產(chǎn)物于-20'C保存待用。(注Deoxyribonuclease I， Invitrogen Cat. No. 18068-015; Superscript II Reverse Transcriptase , Invitrogen Cat. No. 18064-022)使用上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lu 1為模板做PCR。使用rairara ￡x T^ (Takara code: DRR01AM)做 PCR， PCR所用試劑均來(lái)自T^ara ￡y 7a。包裝。
PCR所用引物如下 F5-3: ATCMCCCATTTCCTTTCCTACG F5-2: CTGCCCCTGAGCMGCMGAAAG F19-3: AGCCGACGACGAGTTGGAGTGT 5F2 CCMGATCTGCCGACGACGAGTTGGAGTGT BDF2: GACGACGAGTTGGAGTGT S5-F11: CAGCCGACGACGAGTTGGAGT S5-F2: GTGCGGCGAGCTGAGGTACGAT S5-GSP2: MGATGGTGACAGACACGCTGAGGA S5-RACE4: CAATCMCAGGCCMCCTACTCAC Rll: ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA BDR: CATTAGGMCAGGAAGTCGT S5-mi: CTCTGCCCGTTGGCGATMGC S5-R2: TCTGGGTGGCMAGCGAGTGC S5-R33: ATGGCGGCACGGTCGTATCTT R3-1: ACGTAAACATCTAGTAGTGGCTCA R3-2: TTGGCACGMCGGTTCMGAG R3-3: GATCAGTTATTTGGGCAAACCAG R3-4: GGTCCCAAATCMGTACCGCTAG R3-5: GCTCAACMTTAGGACATACGAC
分別對(duì)RACE產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得所需全長(zhǎng)基因。
實(shí)施例2: i"5基因在水稻不同亞種的結(jié)構(gòu)分析
對(duì)實(shí)施例1中測(cè)序得到的序列進(jìn)行分析水稻品種02428 (廣親和)、Ballila (粳稻)和南京11 (秈 稻)的全長(zhǎng)cDNA分別是1778bp、 1912bp和1911bp，其結(jié)構(gòu)由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成(圖9)。秈 稻和粳稻有且僅有三個(gè)堿基的差異，其中南京11在3'非翻譯區(qū)有一個(gè)單堿基的缺失，南京11和Ballila 在編碼區(qū)有兩個(gè)單堿基多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，這兩個(gè)SNP在編碼蛋白中形 成兩個(gè)錯(cuò)義突變(圖10) 。 55基因編碼一個(gè)472氨基酸的蛋白質(zhì)，BLASTp分析 (http:〃www.ncbi.nlm.nih. gov/ )表明該蛋白與天冬氨酰蛋白酶高度同源。PROSITE (http:〃www. expasy. ch/cgi-bin/prosite/)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在第129-140個(gè)氨基酸和334-345個(gè)氨基 酸存在兩個(gè)活性位點(diǎn)。SignalP 3.0 (http:,//www. cbs. dtu. dk/cgi-bin/)軟件分析表明S5蛋白存在一 個(gè)信號(hào)肽，它在蛋白成熟過(guò)程中被切除。
實(shí)施例3:利用芯片數(shù)據(jù)檢測(cè)S5基因在水稻全生育期中表達(dá)水平
本發(fā)明利用芯片數(shù)據(jù)(Database of the National Center of Plant Gene Research, available athttp:〃cr印.ncpgr.cn/.)檢測(cè)基因在水稻全生育期不同組織中表達(dá)水平，使用的芯片數(shù)據(jù)包括秈稻 Zhenshan 97和Minghui 63不同生長(zhǎng)時(shí)期下的25種不同組織(表3)的表達(dá)譜(圖11)。結(jié)果表明55基 因在全生育期都極低水平表達(dá)。
_^_芯片數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)水稻組織名稱_
1 Calli:15 day after induction
2 Resistant calli-screening stage
3 Seed: germination (72 h after imbibition)
4 Seedling: 3 days after sowing
5 Seedling: trefoil stage
6 Shoot: seedling with 2 tillers
7 Root: seedling with 2 tillers
8 Panicle: secondary branch primordium differentiation stage
9 Leaf: secondary branch primordium differentiation stage
10 Sheath: secondary branch primordium differentiation stage
11 Panicle: 4-5 cm young panicle
12 Leaf: 4-5 cm young panicle
13 Sheath: 4-5 ctn young panicle
14 Panicle: pistil/stamen primordium differentiation stage
15 Panicle: pollen-mother cell formation stage
16 Stem: 5 days before heading
17 Flag leaf: 5 days before heading
18 Stem: heading stage
19 P肌icle: heading stage
20 Glume: one day before flowering
21 Stamen: one day before flowering
22 Spikelet: 3 days after pollination
23 Endosperm: 7 days after pollination
24 Endosperm: 14 days after pollination
_25 Endosperm: 21 days after pollination_
實(shí)施例4: S5蛋白具有天冬氨酰蛋白酶活性
天冬氨酰蛋白酶在酸性條件下被激活且其活性為pepstatin A所抑制(Rawlings ND， Barrett AJ (1995) Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods Enzymol. 248:105-20)。而本發(fā)明基因與天冬氨酰蛋白酶高度同源，為了驗(yàn)證本發(fā)明基因6^是否編碼一個(gè)典型的天 冬氨酰蛋白酶，本實(shí)例設(shè)計(jì)一個(gè)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證S5蛋白是否具有這一功能。
具體實(shí)施步驟為 (1)原核表達(dá)載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)引物5F1 (5， -GGGAGATCTATGGTGATCTTCGAGCAGCCA-3，， 接頭加BglII酶切位點(diǎn))和5R (5，-AGGCTCGAGCGACGATCAGCAAACGGCA-3' 接頭加Xhol酶切位點(diǎn))，以日本晴全長(zhǎng)cDNA (來(lái)自北京凱拓公司) 為模板PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用的試劑來(lái)自Takara公司。反應(yīng)條件為94'C， 5min; 94。C， 1 min， 59。C， 1 min， 72。C， 1. 5min， 30 cycles; 72°C， 5 min。產(chǎn)物構(gòu)建到pGEM ~T (購(gòu)自Promega)載體中， 測(cè)序驗(yàn)證。然后分別將外源構(gòu)建到pMAL-c2x載體中(購(gòu)自&"sZ^)，載體用BamHI和XhoI酶切。 (2〉蛋白誘導(dǎo)表達(dá)將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21 (購(gòu)自Irwitrogen公司)，等菌液0D值達(dá)到0. 6時(shí)，加入終 濃度為0. 5mM的IPTG(isopropyl 1-thio-P -D-galactopyranoside)，然后37。C誘導(dǎo)表達(dá)3hrs。收集菌體， 加入一倍體積的PBS懸浮，置-20 'C過(guò)夜。第二天溶解，立即放在冰上，加入終濃度為lmM的PMSF，超聲 處理，整個(gè)超聲過(guò)程在冰上進(jìn)行，以保證蛋白處于天然狀態(tài)。超聲處理完成之后12000rpm, 4'C冷凍離心。 收集上清，用Amylose Resin (購(gòu)自純化。純化步驟參照pMAL Protein Fusion and Purification Instruction Manual, Catalog #E8000S
(3) 蛋白酶活性檢測(cè)
20nl (10u g)純化的蛋白，加入等體積的pH緩沖液與20u 1 FITC-case in (Protease Fluorescent Detection Kit), 37"C下反應(yīng)15小時(shí)后加入lOOul 0. 6N TCA (三氯乙酸)沉淀，12000rpm離心lOmin， 吸上清100ul，加入2ml assay buffer,用熒光分光光度計(jì)(Fluorescence spectrophotometer, Hitachi850) 測(cè)量。水為對(duì)照。
pH緩沖液配方
0. 1M Gly-HCl， pH2. 5
0. 1M 0. 1 M sodium citrate, pH3. 0， pH3. 5, pH 4.0: 0. 1M sodium acetate, pH 5.0; 0. 1 M sodium phosphate, pH 6.0;
(4) 檢測(cè)ASP是否被p印statin A抑制劑抑制
實(shí)驗(yàn)步驟8ug純化的目標(biāo)蛋白中加入終濃度為0. 15mM p印statin A， 4°C孵育1.5小時(shí)后，加入 pH=3的緩沖液至終體積40u 1，然后再加入底物FITC-Casein 20 u 1 (sigma, PFOIOO)， 37 。C下孵育12小 時(shí)后，加入100 u 1 0. 6NTCA沉淀，吸上清100 u 1，加入2ml assay buffer,用熒光分光光度計(jì)(Hitachi M850 fluorescence spectrophotometer , Japan)測(cè)量。只含有標(biāo)簽MBP (麥芽糖結(jié)合蛋白)的純化蛋白 作為對(duì)照，每個(gè)做三次重復(fù)。
(5) 天冬氨酸蛋白酶的自身剪接，形成成熟蛋白的初步分析
原核表達(dá)純化的J印10ia(20ng)，加入1/2體積的PH緩沖液，37'C反應(yīng)過(guò)夜，加入一倍體積的 loading buffer,水煮5min, 12%SDS-PAGE電泳，考馬斯藍(lán)染液染膠。
結(jié)果表明該蛋白在pH3.0的條件下活性最高(圖12)，且被p印statin A完全抑制(圖12)。實(shí)驗(yàn)同 時(shí)表明該蛋白PH 2. 5-4. 0的條件下通過(guò)自身剪接，形成成熟蛋白(圖13)。
上述結(jié)果表明本發(fā)明基因確實(shí)編碼一個(gè)典型的天冬氨酰蛋白酶。 實(shí)施例5: 5^基因的表達(dá)部位
為了確定S5基因的表達(dá)部位，本實(shí)例使用了 RNA原位雜交技術(shù)。根據(jù)RNA探針雜交信號(hào)確定本發(fā)明 基因在珠心、珠被、孢母細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞中表達(dá)(圖14)。
RNA原位雜交流程參見Drews (Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71 Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353—71)。
14<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120>水稻秈型雜種育性基因,
<130〉
〈141〉2007-10-10
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<170>Patentln version 3. 1
<210>1
<211>1778
<212>DM
<213〉7JC稻(0ryza sativa)
<220〉
<221>g6H6
<222>(l).. (1778)
<223>
<220〉
<221>5'UTR
<222>(1441).. (1778)
<223〉
〈220〉
<221>3'UTR
〈222〉(l)..加
<223>
<220〉
〈221〉CDS
<222>(22). (1440)
<223〉
〈400〉1
的分離克隆及應(yīng)用
atcaacccat ttcctttcct a cgt ttg
Arg Leu 1
c犯gaa aga aag aaa gaa ggg ￡itt Gin Glu Arg Lys Lys Glu Gly lie 15
gca gcc gac gac gag ttg gag tgt Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys 30
gtg aac tct caa ggc gcc att cag Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin 45
caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val 60 65
act gcc Thr Ala
aaa ttt Lys Phe 20
ccc tec Pro Ser
35 ttc ccc Phe Pro 50
cgt gca Arg Ala
tgc Cys 5
get Ala
ctg Leu
taa
ccc ctg Pro Leu
tec ggc Ser Gly
tec ate ttc gat Ser lie Phe Asp
gtg Val
Thr
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cag Gin
esc aag His Lys 55
gca tec Ala Ser 70
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His
40
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Lys
Lys 10
Thr 25 get Ala
ceic His
teg acc Ser Thr
51
99
147
195
243
15gga gca tea gga gca gga a犯gga gga gga ttg aac aat eta cag gaa 291 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gin Glu
75 80 85
gag gag ate act tea tea agt agt aca aaa ate gac gtg ate gaa gac 339 Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie A印Val lie Glu Asp 90 95 100 105
age age ate aac gac ttc ctg ttc eta atg gcc gtc agt ctg ggc aag 387 Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Ser* Leu Gly Lys
110 115 120
cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga tec acc etc teg 435 Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser
125 130 135
tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac acg cag tec gcg 483 Trp Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His Thr Gin Ser Ala
140 145 150
aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac aca tec egg cga 531 Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg
155 160 165
gtt cgc tgc teg teg gtx aag tgc ggc gag ctg agg tac gat ctg egg 579 Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg 170 175 180 185
etc cag caa gcc犯t tgc stg gag朋g gas gsc age tgc acg toe age 627 Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser
190 195 200
gtc acg tac ggg犯c ggg tgg gcg tac age gtg ggc卿atg gtg aca 675 Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr
205 210 215
gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc atg ttc ggg tgc 723 Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys
220 225 230
age atg gat gtc aag tac age gaa ttc gag gcc ggc ate ttt ggt ttc 771 Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly lie Phe Gly Phe
235 240 245
ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca ggg tac cct gat 819 Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala Gly Tyr Pro Asp 250 255 260 265
att ctg agt tac aag gca ttc age tac tgc ttg ccc act gac gag acc 867 lie Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr
270 275 280
aag ccc gga tac atg ate ctg gga aga tac gac cgt gcc gcc atg gat 915 Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp
285 290 295
ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg cca ace tac tea 963 Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg Pro Thr Tyr Ser300 305 310
ctg acg atg gag atg ctt ate gcc aac ggg cag aga ttg gtg aca tcg 1011 Leu Thr Met Glu Met Leu lie Ala Asn Gly Gin Arg Leu Val Thr Ser
315 320 325
tct tcg gag atg ate gtc gat tec ggg gcc cag agg acg tec ctg tgg 1059 Ser Ser Glu Met lie Val A印Ser Gly Ala Gin Arg Thr Ser Leu Trp 330 335 340 345
cct tec act ttt get etc ctt gac aag acc ate acg cag gca atg tcg 1107 Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr Gin Ala Met Ser
350 355 360
tcg att ggg tat cac egg aca tea aga gcg cgc caa gaa tea tac ate 1155 Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin Glu Ser Tyr lie
365 370 375
tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac ggc acc ate acg 1203 Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr lie Thr
380 385 390
ccc ttc tec aac tgg tec gcc ttg cct ctg ctg gag ate ggc ttc gcc 1251 Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu lie Gly Phe Ala
395 400 405
ggc ggt get gca etc get ttg cca ccc aga aac gtc ttc tac aac gat 1299 Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val Phe Tyr Asn Asp 410 415 420 425
cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt get cag aat cct get etc a_gg 1347 Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn Pro Ala Leu Arg
430 435 440
tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tec ttc gga aca acc ttc 1395 Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe GlyThr Thr Phe 445 450 455
gac ate cag ggg 3a8 c犯ttc ggc ttc aaa tat gcc get tgc tga 1440 A印lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Ala Cys
460465470
tegtcgattattcctcatcctatgatatatcttatagcttgegggtcgat taattagctg1500
gtttgccc肌ataactgatcggattggagtcttctcccgcgctacactac ccctagctgc1560
gategtateacaagctagcggtacttgatttgggacctaattcgttcaaa aaaaacttgg1620
cagcttaatttggg織t3gtagctagctgagccactact￡tgatgttta<c gtsccagct31680
tccgtcgtttgtttgtgtctcctgtgcttgtgetaaaectatctcttgaa ccgttcgtgc1740
caacttaattatttggtcgtatgtcct犯ttgttgatc1778
<210> 2 〈211〉 21 〈212〉 PRT
<213> 水稻(Oryza sativa) 〈400> 2
Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys Gin Glu Arg Lys Lys Glu 15 10 15Gly lie Lys Phe Ala 20
<210〉 3
<211〉 450
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
〈400〉 3
Ser Gly AlaThrAlaAlaAspAspGluLeuGluCysProSerSerlie
151015
Phe Asp HisAlaValAsnSerGinGlyAlalieGinPheProValPhe
202530
His Lys LysHisGinCysLeuArgProTrpSerValArgAlaThrGin
354045
Ala Ser SerThrGlyAlaSerGlyAlaGlyLysGlyGlyGlyLeuAsn
505560
Asn Leu GinGluGluGlulieThrSerSerSerSerThrLyslieAsp
65707580
Val lie GluAspSerSerlieAsnAspPheLeuPheLeuMetAlaVal
859095
Ser Leu GlyLysProProValValAsnLeuValAlalieAspThrGly
100105110
Ser Thr LeuSerTrpValGinCysGinProCysAlaValHisCysHis
115120125
Thr Gin SerAlaLysAlaGlyProliePheAspProGlyArgSerTyr
130135140
Thr Ser ArgArgValArgCysSerSerValLysCysGlyGluLeuArg
145150155160
Tyr Asp LeuArgLeuGinGinAlaAsnCysMetGluLysGluAspSer
165170175
Cys Thr TyrSerValThrTyrGlyAsnGlyTrpAlaTyrSerValGly
180185190
Lys Met ValThrAspThrLeuArglieGlyAspSerPheMetAspLeu
195200205
Met Phe GlyCysSerMetAspValLysTyrSerGluPheGluAlaGly
210215220
lie Phe GlyPheGlySerSerSerPheSerPhePheGluGinLeuAla
225230235240
Gly Tyr ProAsplieLeuSerTyrLysAlaPheSerTyrCysLeuPro
245250255
Thr Asp GluThrLysProGlyTyrMetlieLeuGlyArgTyrAspArg
260265270
Ala Ala MetAspGlyGlyTyrThrProLeuPheArgSerlieAsnArg
275280285
Pro Thr TyrSerLeuThrMetGluMetLeulieAlaAsnGlyGinArg
18290 295 300
Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met lie Val Asp Ser Gly Ala Gin Arg 305 310 315 320
Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr
325 330 335
Gin Ala Met Ser Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin
340 345 350
Glu Ser Tyr lie Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn
355 360 365
Gly Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu
370 375 380
lie Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val 385 390 395 400
Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn
405 410 415
Pro Ala Leu Arg Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Thr Phe Asp lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr Ala 435 440 445
Ala Cys 450
<210>4
<211>1912
<212>醒
<213>水稻(Oryza sativa)
〈220>
<221>g6H6
<222〉(l).. (1912)
〈223>
〈220〉
<221〉5'證
<222>(1577)(1912)
<223>
〈220〉
<221>3'UTR
<222>(l).. (157)
<223>
<220>
<221〉CDS
<222〉(158).. (1576)
〈223〉
<400>4
atcaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga 60 aagaaagaag ggattaaatt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt aacaatgact 120gactttteat ttgtttgcag ctagggtggg gatcgag atg gtg ate ttg ga<g cag 175
Met Val lie Leu Glu Gin 1 5
cca cag ctg etc ctt ctt ctt ctt ctt ctt gta gca get gca get gca 223 Pro Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala
10 15 20
acc ggc gcc aca gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tec tec ate 271 Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser lie
25 30 35
ttc gat cac get gtg aac tct caa ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc 319 Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin Phe Pro Val Phe
40 45 50
cac aag aag cac caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag 367 His Lys Lys His Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gin 55 60 65 70
gca tec teg acc gga gca tea gga gca gga aaa gga gga gga ttg aac 415 Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn
75 80 85
aat eta cag gaa gag gag ate act tea tea agt agt aca aaa ate gac 463 Asn Leu Gin Glu Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie Asp
90 95 100
gtg ate gaa gac age age ate aac gac ttc ctg ttc eta atg gcc gtc 511 Val lie Glu Asp Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val
105 110 115
agt ctg ggc aag cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga 559 Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly
120 125 130
tec acc etc teg tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac 607 Ser Thr Leu Ser Trp Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His 135 140 145 150
acg cag tec gcg aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac 655 Thr Gin Ser Ala Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr
155 160 165
aca tec egg cga gtt cgc tgc teg teg gtc aag tgc ggc gag ctg agg 703 Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg
170 175 180
tac gat ctg egg etc cag caa gcc aat tgc atg gag犯g g犯gac age 751 Tyr Asp Leu Arg Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser
185 190 195
tgc acg tac age gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac age gtg ggc 799 Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly
200 205 210
aag atg gtg aca gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc 847 Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu
20215 220 225 230
atg ttc ggg tgc age atg gat gtc aag tac age gaa ttc gag gcc ggc 艦
Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly
235 240 245
ate ttt ggt ttc ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca 943lie Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala
250 255 260
ggg tac cct gat att ctg agt tac aag gca tta age tac tgc ttg ccc 991Gly Tyr Pro Asp lie Leu Ser Tyr Lys Ala Leu Ser Tyr Cys Leu Pro
265 270 275
act gac gag acc aag ccc gga tac atg ate ctg gga aga tac gac cgt 1039Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg
280 285 290
gcc gcc atg gat ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg 1087Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg295 300 305 310
cca acc tac tea ctg acg atg gag atg ctt ate gcc aac ggg cag aga 1135Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu lie Ala Asn Gly Gin Arg
315 320 325
ttg gtg aca tcg tct tcg gag ￡itg ate gtc gat tec ggg gcc cag agg 1183Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met lie Val Asp Ser Gly Ala Gin Arg
330 335 340
acg tec ctg tgg cct tec act ttt get etc ctt gac aag acc ate acg 1231Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr
345 350 355
cag gca atg tcg tcg att ggg tat cac egg aca tea aga gcg cgc caa 1279Gin Ala Met Ser Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin
360 365 370
gaa tea tac ate tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg aac 1327Glu Ser Tyr lie Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn375 380 385 390
ggc acc ate acg ccc ttc tec aac tgg tec gcc ttg cct ctg ctg gag 1375Gly Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu
395 400 405
ate ggc ttc gcc ggc ggt get gca etc get ttg cca ccc aga aac gtc 1423lie Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Asn Val
410 415 420
ttc tac犯c gat cca cac cgc ggt ttg tgc atg acc ttt get cag aat 1471Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys Met Thr Phe Ala Gin Asn
425 430 435
cct get etc agg tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act cga tec ttc 1519Pro Ala Leu Arg Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr Arg Ser Phe
440 445 450
gga aca acc ttc gac ate cag ggg aaa caa ttc ggc ttc aaa tat gcc 1567Gly Thr Thr Phe Asp lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr Ala
455 460 465 470
gtt tgc tga tcgtcgatta ttcctcatcc tatgatatct tatagcttgc 1616
Val Cys
gggtCg3tt3 3ttagCtggt ttgCCC幼Elt 3ElCtg3tCgg
tacBctaccc ct3gctgcg3 tcgtatcaca sgctagcggtcgttcaaa33 aaacttggcs gcttaatttg ggaxctagteatgtttacgt accagctatc cgtcgtttgt ttgtgtctccctcttgaacc gttcgtgcca acttaattat ttggtcgtat<210〉 5
<211> 472<212〉 PRT<213〉 水稻<400〉 5Met Val lie
1
Val
Glu
lie
Ser
65
Lys
Ser
Leu
Val
Cys145Asp
Lys
Met
Trp
Asp
Ala
Cys
Gin
50
Val
Gly
Ser
Phe
Ala130Ala
Pro
Cys
Glu
Ala210Ser
Ala
Pro
35
Phe
Arg
Gly
Thr
Leu115lie
Val
Gly
Gly
Lys195Tyr
Phe
(Oryza sativa)Leu Glu Gin Pro
Ala
20
Ser
Pro
Ala
Gly
Lys100Met
Asp
His
Arg
Glu180Glu
Ser
Met
Glu5
Ala
Ser
Val
Thr
Leu
85
lie
Ala
Thr
Cys
Ser165Leu
Asp
Val
Asp
Ala
lie
Phe
Gin
70
Asn
Asp
Val
Gly
His150Tyr
Arg
Ser
Gly
Leu
Thr
Phe
His
55
Ala
Asn
Val
Ser
Ser135Thr
Thr
Tyr
Cys
Lys215Met
Gin
Gly
Asp
40
Lys
Ser
Leu
lie
Leu120Thr
Gin
Ser
Asp
Thr200Met
Phe
Leu
Ala
25
His
Lys
Ser
Gin
Glu105Gly
Leu
Ser
Arg
Leu185
Tyr
ValGly
Leu
10
Thr
Ala
His
Thr
Glu90
Asp
Lys
Ser
Ala
Arg170Arg
Ser
Thr
Cys
Leu
Ala
Val
Gin
Gly
75
Glu
Ser
Pro
Trp
Lys155Val
Leu
Val
Asp
Ser
attggagtct tctcccgcgc 1676
acttgatttg ggacctaatt 1736
gctagctgag ccactactag 1796
tgtgcttgtg ctaaacctat 1856
gtcctaattg ttgatc 1912
Leu
Ala
Asn
Cys
60
Ala
Glu
Ser
Pro
Val140Ala
Arg
Gin
Thr
Thr220Met
Leu
Asp
Ser
45
Leu
Ser
lie
lie
Val125Gin
Gly
Cys
Gin
Tyr205Leu
Asp
Leu
Asp
30
Gin
Arg
Gly
Thr
Asn110Val
Cys
Pro
Ser
Ala190Gly
Arg
Val
Leu
15
Glu
Gly
Pro
Ala
Ser
95
Asp
Asn
Gin
lie
Ser175Asn
Asn
lie
Lys
Leu
Leu
Ala
Trp
Gly
80
Ser
Phe
Leu
Pro
Phe160Val
Cys
Gly
Gly
Tyr
22225 230 235 240
Ser Glu Phe Glu Ala Gly lie Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser
245 250 255
Phe Phe Glu Gin Uu Ala Gly Tyr Pro Asp lie Leu Ser Tyr Lys Ala
260 265 270
Leu Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met lie
275 280 285
Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu
290 295 300
Phe Arg Ser lie Asn Arg Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu305 310 315 320
lie Ala Asn Gly Gin Arg Leu Val Thr Ser Ser Ser Glu Met lie Val
325 330 335
Asp Ser Gly Ala Gin Arg Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu
340 345 350
Leu Asp Lys Thr lie Thr Gin Ala Met Ser Ser lie Gly Tyr His Arg
355 360 365
丁hr Ser Arg Ala Arg Gin Glu Ser Tyr lie Cys Tyr Leu Ser Glu His
370 375 380
Asp Tyr Ser Gly Trp Asn Gly Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn T卬Ser385 390 395 400
Ala Leu Pro Leu Leu Glu lie Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala
405 410 415
Leu Pro Pro Arg Asn Val Phe Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys
420 425 430
Met Thr Phe Ala Gin Asn Pro Ala Leu Arg Ser Gin lie Leu Gly Asn
435 440 445
Arg Val Thr Arg Ser Phe Gly Thr Thr Phe Asp lie Gin Gly Lys Gin
450 455 460
Phe Gly Phe Lys Tyr Ala Val Cys465 470
<210><211〉〈212>〈213〉<220><221〉<222>〈223〉〈220〉<221><222><223><220〉
6
1911
DNA
水稻
g6ri6(l)..
(Oryza sativa)
(1911)
5'UTR
(1577).. (1911)
23<221> 3' UTR〈222〉 (1)..(157)〈223〉〈220〉
〈221> CDS
〈222〉 (158).. (1576)
<223〉
<400> 6
atcaacccat ttcctttcct acgtttgact gcctgcctgc ccctgagcaa gcaagaaaga 60aagaaagaag ggatta犯tt tgctcgctcc tacgaatcct gcccctgagt aacaatgact 120g8cttttaat ttgtttgcag ctagggtggg gatcgag atg gtg stc ttg gag C3g 175
Met Val lie Leu Glu Gin1 5
cca cag ctg etc ctt ctt ctt ctt ctt ctt gta gca get gca get gca 223Pro Gin Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala
10 15 20
acc ggc gcc aca gca gcc gac gac gag ttg gag tgt ccc tec tec ate 271Thr Gly Ala Thr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys Pro Ser Ser lie
25 30 35
ttc gat cac get gtg aac tct caa ggc gcc att cag ttc ccc gtg ttc 319Phe Asp His Ala Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin Phe Pro Val Phe
40 45 50
cac aag aag cac caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc cgt gca acc cag 367His Lys Lys His Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val Arg Ala Thr Gin55 60 65 70
gca tec teg acc gga gca tcs ggs gca gga asa gga gga gga ttg aac 415Ala Ser Ser Thr Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn
75 80 85
aat eta cag gaa gag gag ate act tea "tea agt agt aca aaa ate gac 463Asn Leu Gin Glu Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie Asp
90 95 100
gtg ate gaa gac age age ate aac gac ttc ctg ttc eta atg gcc gtc 511Val lie Glu Asp Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val
105 110 115
agt ctg ggc aag cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga 559Ser Leu Gly Lys Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly
120 125 130
tec acc etc teg tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac 607Ser Thr Leu Ser Trp Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His135 140 145 150
acg cag tec gcg aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac 655Thr Gin Ser Ala Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr
155 160 165
aca tec egg cga gtt cgc tgc teg teg gtc aag tgc ggc gag ctg agg 703Thr Ser Arg Arg Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg
170 175 180
tac gat ctg egg etc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa gac age 751Tyr Asp Leu Arg Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser
185 190 195
tgc acg tac age gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac age gtg ggc 799Cys Thr Tyr Ser Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly
200 205 210
aag atg gtg aca gac acg ctg agg att ggg gac tcg ttt atg gat etc 847Lys Met Val Thr Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu215 220 225 230
atg ttc ggg tgc age atg gat gtc犯g tac ￡igc g犯ttc g3g gcc ggc 鵬Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly
235 240 245
ate ttt ggt ttc ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca 943lie Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala
250 255 260
ggg tac cct gat att ctg agt tac aag gca ttc age tac tgc ttg ccc 991Gly Tyr Pro Asp lie Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro
265 270 275
act gac gag acc aag ccc gga tac atg ate ctg gga aga tac gac cgt 1039Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg
280 285 290
gcc gcc atg gat ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg 1087Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg295 300 305 310
cca acc tac tea ctg acg atg gag atg ctt ate gcc aac ggg cag aga 1135Pro Thr Tyr Ser Leu Thr Met Glu Met Leu lie Ala Asn Gly Gin Arg
315 320 325
ttg gtg aca tcg tct tcg gag atg stc gtc印t tec ggg gcc cag鄉(xiāng) 1183Leu Val Thr Ser* Ser Ser Glu Met lie Val Asp Ser Gly Ala Gin Arg
330 335 340
acg tec ctg tgg cct tec act ttt get etc ctt gac aag acc ate acg 1231Thr Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu Leu Asp Lys Thr lie Thr
345 350 355
cag gca atg tcg tcg att ggg tat cac egg aca tea aga gcg cgc caa 1279Gin Ala Met Ser Ser lie Gly Tyr His Arg Thr Ser Arg Ala Arg Gin
360 365 370
gaa tea tac ate tgc tac tta tcg gag cac gac tat tct ggt tgg犯c 1327Glu Ser Tyr lie Cys Tyr Leu Ser Glu His Asp Tyr Ser Gly Trp Asn375 380 385 390
ggc acc ate acg ccc ttc tec aac tgg tec gcc ttg cct ctg ctg gag 1375Gly Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser Ala Leu Pro Leu Leu Glu395 400 405
25ate ggc lie Gly
ttc tac Phe Tyr
cct get Pro Ala 440 ggs sea Gly Thr 455
get tgc Ala Cys
ttc Phe
肌c Asn 425 etc Leu
acc Thr
gcc Ala 410
Asp
Arg
Uc Phe
ggc Gly
cca Pro
tct Ser
gsc Asp
ggt Gly
C3C
His
Gin
ate lie 460
get Ala
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〈210> 7
〈211〉 472
〈212〉 PRT
〈213〉 水稻(Oryza sativa)
〈400〉 7
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Phe
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Leu
Asp
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Gin 325 Gin
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Tyr
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Ser
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Gly
Tyr 240 Ser
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Leu 320 Val
Leu
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Ser 400 Ala
Cys
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Gin
2權(quán)利要求
1、分離克隆的秈型雜種育性基因S5-i，它是(a)SEQ ID NO3中第1-1911位所示的核苷酸序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2、 權(quán)利要求l所述的基因在水稻改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)水稻秈型雜種育性基因S5-i的分離克隆、功能驗(yàn)證及其在改良水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明包括秈型雜種育性基因的DNA序列和其編碼的天冬氨酰蛋白酶。水稻秈稻和粳稻兩個(gè)亞種之間具有比水稻品種間更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，但秈粳亞種間雜種的不育性卻限制了對(duì)其雜種優(yōu)勢(shì)的利用。本發(fā)明克隆的秈型雜種育性基因?qū)朔径i粳亞種間雜種的不育性起重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101684469SQ20091014886
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者丁寄花, 劉克德, 張啟發(fā), 歐陽(yáng)亦聃, 陳炯炯 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)