專利名稱：一種a型口蹄疫病毒雙色熒光pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本試發(fā)明涉及檢測A型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)以及 各型口蹄疫病毒mRNA的方法，特別是涉及使用雙色熒光探針定量PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光 探針法)快速準(zhǔn)確的檢測發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)、血清等標(biāo)本以及細(xì)胞培養(yǎng)液中A型口蹄 疫病毒以及各型口蹄疫病毒mRNA的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于該病毒檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄動物共患的急性接觸性傳染病，被 國際獸疫部門列為A類動物傳染病之首。該病的易感動物包括牛、綿羊和豬等70多種家養(yǎng) 和野生哺乳動物。最易感染的動物是牛、豬、駱駝、羊、鹿等。口蹄疫在亞洲、非洲和中東以 及南美均有流行，在非流行區(qū)也有散發(fā)病例。早在17-19世紀(jì)，德國、法國、瑞士、意大利、奧地利已有口蹄疫的流行記載。十九世紀(jì)五十年代在英法等國家曾爆發(fā)過的口蹄疫，造成的高達(dá)1.43億英鎊的 經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展；1967年英國口蹄疫大爆發(fā)導(dǎo)致40萬頭牛被屠宰，造 成了 1.5億英鎊的經(jīng)濟(jì)損失。此后世界上其他國家和地區(qū)也陸續(xù)有爆發(fā)口蹄疫的報道。在我國，2009年四月十五日江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)鄭路鎮(zhèn)牟家村一奶牛養(yǎng)殖小區(qū)發(fā) 生口蹄疫疑似疫情，后經(jīng)中國農(nóng)業(yè)部國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室確診為A型口蹄疫疫情，相關(guān) 部門隨即對發(fā)病及同群牛已全部撲殺并做無害化處理?？谔阋咭坏┍l(fā)，將嚴(yán)重影響到了肉制品的售價。而大量宰殺牲畜后，給畜牧業(yè)造 成了巨大的損失。畜牧業(yè)的危害甚甚至波及到飼料行業(yè)的發(fā)展，因此其危害是巨大的?？谔阋呔哂辛餍锌?、傳播廣、發(fā)病急、危害大等流行病學(xué)特點(diǎn)，疫區(qū)發(fā)病率可達(dá) 50%-100%，犢牛死亡率較高。該病春秋兩季較多，尤其是春季。風(fēng)和鳥類也是遠(yuǎn)距離傳播 的因素之一。病畜齒齦、舌面、唇內(nèi)面可見到蠶豆到核桃大的水皰，涎液增多井呈白色泡沫 狀掛于嘴邊。趾間及蹄冠的柔軟皮膚上也發(fā)生水皰。有時在乳頭皮膚上也可見到水皰。有 些病例在水皰愈合過程中，病情突然惡化，往往因心臟麻痹而突然死亡，死亡率高達(dá)25% 50%。犢牛發(fā)病主要表現(xiàn)為出血性胃腸炎和心肌炎，死亡率較高?？谔阋叩牟≡w為口蹄疫病毒(FMDV)，屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，通過交叉 保護(hù)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)確定FMDV有7個血清型，即A、0、C、Asial和SATl、SAT2、SAT3等， 及65個以上的血清亞型。根據(jù)7個血清型的同源性將其分為兩群，即A、0、C和Asial型 為一群，SATU SAT2、SAT3為一群，兩群之間的血清型同源性較低，群內(nèi)同源性可達(dá)60% 70%，血清型之間無交叉和交叉免疫現(xiàn)象。A、0、C、型FMDV的毒力和抗原性均易發(fā)生變異， 幾乎遍布亞、非、拉、歐各洲。目前對于A型和各型口蹄疫病毒的實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括間接夾心酶聯(lián)免疫吸 附試驗(yàn)、反向間接血凝試驗(yàn)(RIHA)、中和試驗(yàn)、液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、非結(jié)構(gòu)蛋白 ELISA檢測、正向間接血凝試驗(yàn)(IHA) ,RT-PCR試驗(yàn)和病毒分離鑒定等。前幾種方法目的是 檢測相應(yīng)的抗體，屬于血清學(xué)檢測方法，鑒于口蹄疫病毒的高度變異性以及交叉性，其特異性難以保證，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性。后兩種方法屬于確診實(shí)驗(yàn)，其中從標(biāo)本中分病毒并 鑒定需要幾天的時間。RT-PCR試驗(yàn)可以設(shè)計針對口蹄疫病的特異性引物，進(jìn)行擴(kuò)增，通過擴(kuò) 增產(chǎn)物電泳來判斷結(jié)果。與上述其它幾種方法相比，該方法具有較高的靈敏度，但是容易產(chǎn) 生非特異性擴(kuò)增，甚至?xí)驗(yàn)椴僮鞯脑虺霈F(xiàn)假陽性，而且普通PCR擴(kuò)增法其結(jié)果的判斷 需要對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，操作較為繁瑣。雙色或多色熒光定量PCR技術(shù)是指在同一個熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時擴(kuò)增兩 個或者多個目的基因，而每個目的基因采用的不用波長的熒光探針進(jìn)行檢測。熒光標(biāo)記的 探針有多種，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種熒光標(biāo)記的探針在PCR擴(kuò)增過程中所產(chǎn) 生的熒光信號不同。利用該原理發(fā)明的試劑盒在同一個標(biāo)本的檢測中，不但可以檢測A型 口蹄疫病毒還可以檢測各型口蹄疫病毒，實(shí)現(xiàn)了 一個標(biāo)本中同時檢測A型口蹄疫病毒和各 型口蹄疫病毒的目的，使用方便。由于該方法引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測 的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高容易漏診和 誤診的問題。

發(fā)明內(nèi)容
基于雙色熒光定量PCR的原理，本發(fā)明提供了檢測A型口蹄疫病毒以及各型口蹄 疫病毒mRNA方法，特別是提供了一種使用雙色熒光定量PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光探針法) 快速準(zhǔn)確的檢測出發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)、血清等標(biāo)本以及細(xì)胞培養(yǎng)液中A型口蹄疫病 毒以及各型口蹄疫病毒mRNA的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于該類病毒快速準(zhǔn)確檢測的 試齊U盒。本發(fā)明具體步驟包括(1)采集和運(yùn)送樣本(發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)、血清等標(biāo) 本以及細(xì)胞培養(yǎng)液等)；(2)樣本預(yù)處理和提取RNA ； (3) 一步RT-PCR雙色熒光探針體外擴(kuò) 增法對樣本進(jìn)行檢測合成特定引物和熒光探針，用雙色熒光定量PCR反應(yīng)技術(shù)并用A型口 蹄疫病毒PCR反應(yīng)液(PCR MIX)對樣本進(jìn)行擴(kuò)增檢測；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個擴(kuò)增 反應(yīng)的熒光強(qiáng)度對相應(yīng)樣本進(jìn)行分析，從而判斷所采集的樣本中A型口蹄疫病毒的存在并 根據(jù)陽性標(biāo)準(zhǔn)品對其標(biāo)本中的病毒進(jìn)行定量檢測。檢索Genbank上的口蹄疫病毒基因序列，用生物信息學(xué)的方法，經(jīng)過比對分析，試 用專門的引物探針設(shè)計軟件，設(shè)計檢測A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病毒的引物探針如 下(I)A 型口蹄疫病毒(FMDV-A)上游引物5，CTTCAACTTTGGTGCAGTTC-3，(SEQID NO. 1)下游引物5，-AGAGCTCAGCACGCTTCATG-3，(SEQID NO. 1)熒光探針FAM-5，GCCACGACCATCCACGAGCTTCTC3，-TAMRA (SEQID NO. 3)(2)各型口蹄疫病毒(FMDV-U)上游引物5，-CAGGCTAAGGATGCCCTTCA-3，(SEQID NO. 4)下游引物5，-GTCCCAGTCCCCTTCTCAGAT-3，(SEQID N0. 5)熒光探針VIC-5，ACCCCGAGGTAACACGCGACACTC3，-TAMRA (SEQID NO. 6)根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所檢測的口蹄疫病毒為A型口蹄疫病毒， 即為2009年四月十五日江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)鄭路鎮(zhèn)牟家村某奶牛養(yǎng)殖場爆發(fā)的口蹄疫疫情。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的檢測A型口蹄疫病毒的方法，同時 也對各型口蹄疫病毒(FMDV-U)進(jìn)行檢測，作為一個平行試驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的雙色熒光標(biāo)記是指檢測FMDV-A基 因的探針的熒光標(biāo)記為FAM，檢測FMDV-U基因探針的熒光標(biāo)記為VIC，淬滅基團(tuán)為TAMRA。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，為了完成本發(fā)明的分型檢測方法首先采集標(biāo) 本，該分型檢測方法適用標(biāo)本類型有發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)、血清、病毒細(xì)胞培養(yǎng)液等。對 發(fā)病動物需無菌條件下取Ig左右相應(yīng)組織；或病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，需取500 μ 1左右，置入 1. 5ml潔凈EP管；血清需用一次性注射器常規(guī)取抽血2-3ml，注入5ml干燥管中，立即送檢。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，為了完成本發(fā)明的檢測方法對上述各種標(biāo)本提 取RNA，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，為了完成本發(fā)明的分型檢測方法，擴(kuò)增體系按 照如下方式配制，上游引物(IOuM) Iul下游引物(IOuM) Iul熒光探針(IOuM) 0. 5ulPCR 反應(yīng)液(PCR MIX) 17. 5ulTotal20. 0μ 1根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，上述用于檢測A型口蹄疫病毒的PCR反應(yīng)液 (PCR MIX)包含F(xiàn)Q buffer (由5XFQ buffer經(jīng)雙蒸水稀釋為IX作為工作濃度)、四種核 苷酸單體(dNTPs)等成分。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，上述1 XFQ buffer工作液各主要成分和濃度如 下50mM Tris-HCl (pH8.0)、5mM MgC12、50mM KC1、0. 01 %的明膠等。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于快速檢測A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病 毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)病毒核酸提取試劑；(2)逆轉(zhuǎn)錄酶系和Taq酶系；(3)雙色熒 光PCR反應(yīng)體系(PCR MIX) ； (4)陽性和陰性質(zhì)控品。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的雙色熒光定量PCR反應(yīng)體系(PCR MIX)是由相應(yīng)特異性上游和下游引物、熒光探針(Fam或者VIC熒光標(biāo)記)、熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液(FQ-Buffer，內(nèi)含鎂離子、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體(dNTPs)、PCR擴(kuò)增增 強(qiáng)劑和去離子水等成分構(gòu)成的反應(yīng)體系。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，的反應(yīng)體系設(shè)置為25ul，具體配制方法是上 述PCR-MIX20ul、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶Iul、Taq耐熱DNA聚合酶Iul以及提取的RNA或者陽性質(zhì)控 品或者陰性質(zhì)控品分別為3ul。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的陽性質(zhì)控品是指A型口蹄疫病毒 的特異性擴(kuò)增片段，經(jīng)過克隆連接到T載體上，構(gòu)成的重組質(zhì)粒，經(jīng)過嚴(yán)格定量，其濃度為 107copies/mL· FMDV-A和FMDV-U普通定性PCR的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。對陽性質(zhì)控品進(jìn)行梯 度稀釋，其擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線和動力學(xué)曲線如圖2和3。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，稀釋陽性質(zhì)控品(107COpieS/ml)，濃度梯度為 每 ml 1. OXlO6U. OXlO5U. OXlO4U. OXlO3U. OXlO2U. OX IO1Copies,進(jìn)行靈敏度實(shí)
5驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)本試劑盒檢測靈敏度為1. 0X102COpieS/ml，該雙色熒光定量PCR的方法敏感 性和精確性優(yōu)于RT-PCR方法。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的試劑盒由于采用的是雙色熒光探針 PCR技術(shù)，不但可以檢測A型口蹄疫病毒，還可以檢測各型口蹄疫病毒即所謂的口蹄疫病毒 通用型(FMDV-U)的檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的快速實(shí)時定量檢測是通過一步 RT-PCR雙色熒光探針體外擴(kuò)增法同時對口蹄疫病毒(FMDV-A)和各型口蹄疫病毒(FMDV-U) 進(jìn)行定量檢測，無需專門的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，簡化了檢測流程。為了完成本發(fā)明的方法，首先采集標(biāo)本放在離心管中，密閉送檢。然后取500μ1 樣品液加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機(jī)13，OOOrpm離心lOmin，去上清， 保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫 放置5min。對于血清或血漿等，取500 μ 1血清加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷 凍離心機(jī)13，OOOrpm離心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入500ul Trizol reagents (RNA提取液)充分震蕩，室溫放置5min。對于肺臟等組織等，取50mg左右組織用 玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎，加入500 μ 1 Trizol reagents (RNA提取液)，研磨或振蕩，轉(zhuǎn) 移到1. 5mL的EP管中，室溫放置5min。然后加入IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min， 4°C 13，OOOrpm離心lOmin。小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混 勻，13，OOOrpm離心IOmin0棄上清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm 離心lOmin，小心吸去大部分乙醇。將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈， 用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，取出新型甲型流感病毒Hmi亞型-PCR反應(yīng) 液(PCR MIX，內(nèi)含有擴(kuò)增用的引物探針和離子等)、Taq酶系、逆轉(zhuǎn)錄酶系，室溫融化并振蕩 混勻后，10，OOOrpm離心10s。每個測試反應(yīng)體系配制如下表 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈0.2ml離心管中，充分混勻， 10，OOOrpm離心10s，向設(shè)定每個PCR反應(yīng)管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣品 (提取的RNA)、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。將各反應(yīng)管放 入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品以及未知標(biāo)本，并設(shè) 置樣品名稱和標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報告基團(tuán)設(shè)置為FAM和VIC、淬滅基團(tuán)TAMRA)。根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實(shí)施方案，用于擴(kuò)增的條件為ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700, ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM 7300/7500 (使用 8 聯(lián)管)， MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件42°C—20分鐘，然后93°C—2 分鐘，然后93°C 30秒一550C 45秒，檢測熒光信號，40個循環(huán)。LightCycler等使用毛細(xì)管 的儀器循環(huán)條件42°C— 20分鐘，93°C— 2分鐘，然后93°C 5秒一58°C 45秒，檢測熒光信 號，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之 后，如果Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。判斷結(jié)果時 要注意以下問題陰性質(zhì)控品應(yīng)為全部陰性；新型甲型流感病毒Hmi亞型-陽性質(zhì)控品， 陽性質(zhì)控品的Ct值均應(yīng)小于30，且呈標(biāo)準(zhǔn)S型擴(kuò)增曲線。以上條件應(yīng)同時滿足，否則此次 試驗(yàn)視為無效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，用其它病毒感染的陽性標(biāo)本(豬藍(lán)耳病標(biāo)本、 豬細(xì)小病毒標(biāo)本、豬皰疹病毒、水泡病毒、豬瘟病毒等)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，本試劑 盒特異性較好，吻合度為100%。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有良好的重復(fù)性好和穩(wěn)定好的 性能。在-20°C條件下試劑盒可有效期可以達(dá)12個月。
四

圖1顯示常規(guī)PCR擴(kuò)增特異性片段，2%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，其擴(kuò)增 產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下觀察，可看到與目的片段大小一致的電泳條帶，從 左到右依次是分子量Marker、FMDV-A、FMDV-U和陰性對照RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果。圖2顯示陽 性質(zhì)控品擴(kuò)增動力曲線，梯度稀釋；圖3為陽性質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)曲線。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 標(biāo)本采集本發(fā)明的方法和試劑盒適用標(biāo)本類型包括發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)等組織；病 毒細(xì)胞培養(yǎng)液、血清等。發(fā)病動物水泡液、淋巴結(jié)等需無菌條件下取Ig左右組織塊，置入 1. 5ml潔凈EP管，立即送檢。病毒細(xì)胞培養(yǎng)液取500 μ 1左右，置入1. 5ml潔凈EP管，立即 送檢。血清，用一次性注射器常規(guī)取抽血2-3ml，注入5ml干燥管中，密閉送檢。以上標(biāo)本短 期內(nèi)可保存于-20°C，長期保存可置-70°C。但不能超過6個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0°C冰壺。實(shí)施例2 口蹄疫病毒RNA的提取取500 μ 1樣品液加入500 μ 1病毒濃縮液充分震蕩，4°C冷凍離心機(jī)13，OOOrpm離 心lOmin，去上清，保留50 μ 1左右的樣品液體，加入150ul RNA提取液充分震蕩，室溫放置 5min。加入IOOul氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置5min，4°C 13，OOOrpm離心IOmin0小心將 上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加等體積異丙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心lOmin。棄上 清，加入500 μ 1 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13，OOOrpm離心IOmin,小心吸去大部分乙醇。 將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20 μ 1 DEPC Η20溶解沉淀。取 50 μ 1陰性質(zhì)控品加入150 μ 1 RNA提取液充分震蕩，室溫放置lOmin。后按上述操作，陽性 質(zhì)控品可直接取3 μ 1進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)施例3 口蹄疫病毒FMDV-A和FMDV-U的檢測取出雙色熒光PCRMIX、Taq酶系，逆轉(zhuǎn)錄酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10，OOOrpm 離心10s。每個測試反應(yīng)體系配制如下，PCR MIX 20μ 1, Taq酶系和逆轉(zhuǎn)錄酶各lul，計算 好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈0. 2ml離心管中，充分混勻，10，OOOrpm離心10s， 向設(shè)定的PCR反應(yīng)管中分別加入22 μ 1，向每管中加入處理后樣品(提取RNA)或陽性質(zhì)控 品或陰性質(zhì)控品3 μ 1，10，OOOrpm瞬時離心10秒。
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì) 控品以及未知標(biāo)本并設(shè)置樣品名稱，設(shè)置熒光基團(tuán)種類(報告基團(tuán)選擇FAM和VIC猝滅 基團(tuán)選擇 TAMRA)和循環(huán)條件:ABI PRISM 7700、ABIPRISM5700, ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon等使用薄壁管的儀器循環(huán)條件42°C— 20分鐘，后93°C— 2 分鐘，后93°C 30秒一550C 45秒，40個循環(huán)。LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件 4220分鐘，93°C— 2分鐘，后93°C 5秒一58°C 45秒，共40個循環(huán)。實(shí)施例4 結(jié)果分析和判定反應(yīng)結(jié)束后，使用手動調(diào)整閾值使陰性質(zhì)控品Ct值在40以上，Ct值小于35個循 環(huán)的為陽性；Ct值在35-40個循環(huán)之間，為灰區(qū)，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。重復(fù)試驗(yàn)之后，如果 Ct值仍然在35-40個循環(huán)之間，判斷為陽性，沒有熒光值增長為陰性。需要滿足陰性質(zhì)控 品應(yīng)為全部陰性；陽性質(zhì)控品的Ct值均應(yīng)小于30，且呈標(biāo)準(zhǔn)S型擴(kuò)增曲線。以上條件應(yīng)同 時滿足，否則此次試驗(yàn)視為無效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。本發(fā)明的試劑盒結(jié)果的判斷有如下 幾種情況，見表1:表1.A型口蹄疫病毒雙色熒光定量PCR檢測試劑盒結(jié)果判斷 六、序列表SEQUENCE LISTING<110>北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司<120> 一種A型口蹄疫病毒雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒<130><160>6<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1cttcaacttt ggtgcagttc 20<210>2<211>20
<212>DNA<213〉人工合成<400>2agagctcagc acgcttcatg 20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3gccacgacca tccacgagct tctc 24<210>4<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4caggctaagg atgcccttca20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5gtcccagtcc ccttctcaga t21<210>6<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>6accccgaggt aacacgcgac actc 2權(quán)利要求
本發(fā)明為一種A型口蹄疫病毒的(FMDV A)的雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒，從樣品中提取口蹄疫病毒RNA，通過一步RT PCR雙色熒光探針擴(kuò)增法對A型口蹄疫病毒和各型口蹄疫病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增，達(dá)到實(shí)時快速定量檢測之目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測A型口蹄疫病毒的雙色熒光PCR檢測方法及其試劑 盒，特征在于試劑盒中同時引入了針對各型口蹄疫病毒(FMDV-U)的平行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙色熒光PCR檢測方法及其試劑盒，所設(shè)計的引物和熒光探 針序列為(1)A型口蹄疫病毒(FMDV-A)上游引物5’ -CTTCAACTTTGGTGCAGTTC-3，；下游引物5’ -AGAGCTCAGCACGCTTCATG-3’ ；熒光探針FAM-5’ GCCACGACCATCCACGAGCTTCTC 3’ -TAMRA(2)各型口蹄疫病毒(FMDV-U)上游引物5’ -CAGGCTAAGGATGCCCTTCA-3’ ；下游引物5，-GTCCCAGTCCCCTTCTCAGAT-3，；熒光探針VIC-5，ACCCCGAGGTAACACGCGACACTC 3’ -TAMRA其中檢測FMDV-A基因的探針熒光標(biāo)記為FAM，檢測FMDV-U基因的探針熒光標(biāo)記為 VIC，淬滅基團(tuán)均TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一步法擴(kuò)增程序如下ABIPRISM 7700、ABIPRISM5700、 ABIGeneAmp7000、ABI PRISM7300/7500、MJ Opticon 等擴(kuò)增儀，42 °C — 20 分鐘，然后 93°C— 2分鐘，然后93°C 30秒一55°C 45秒(檢測熒光)，40個循環(huán)；LightCycler等擴(kuò)增 儀，42°C— 20分鐘，然后93°C— 2分鐘，然后93°C 5秒一58°C 45秒(檢測熒光)，共40個 循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用雙色熒光定量PCR技術(shù)(PCR-雙色熒光探針法)快速準(zhǔn)確的檢測出樣品中A型口蹄疫病毒(FMDV-A)以及各型口蹄疫病毒(FMDV-U)mRNA的方法。該方法包括(1)采集樣品；(2)樣本預(yù)處理和提取RNA；(3)一步RT-PCR雙色熒光探針擴(kuò)增法對樣本進(jìn)行檢測；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)每個擴(kuò)增反應(yīng)的熒光強(qiáng)度對相應(yīng)樣本進(jìn)行分析，從而判斷所采集的樣本中A型口蹄疫病毒和(或)各型口蹄疫病毒的存在，并能對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量(圖2)，實(shí)現(xiàn)了對A型口蹄疫病毒的實(shí)時快確檢測。
文檔編號C12Q1/70GK101928780SQ20091014819
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者任美峰, 劉健翊, 史成軍, 徐貴峰 申請人:北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司