專利名稱：檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蜱體內(nèi)檢測某種病原體的檢測i式劑盒及檢測方法，確切
講是一種用于檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的RLB檢測方法。
背景技術(shù)：
萊姆病(Lyme disease)又稱萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病,是一種蜱傳 性的自然疫源性人獸共患螺旋體病，因首次在美國康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)而 得名。病原體為伯氏疏螺旋體，可分為10個(gè)基因型,我國已發(fā)現(xiàn)報(bào)道的萊姆病 螺旋體有狹義伯氏疏螺旋體(5orreZ/a 6wg6fc^y^7'化"se^ s/r/"o)、伽氏疏螺旋體 (及^^'""')和嘎氏疏螺旋體(及"/^///)三個(gè)基因型。目前已在全球30多個(gè)國家和 地區(qū)報(bào)告有本病和自然疫源地存在，年發(fā)病人數(shù)在30萬左右，仍有不斷增多的趨 勢，在美國有"第二愛滋病，，之稱(Gratz N. Emerging and resurging vector-borne disease. Ann Rev Entomol， 1999， 44:51)。 1992年，世界衛(wèi)生組織(WHO)將此病列 為重點(diǎn)防治研究對象。我國于1986年首次在黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)了該病, 到目前，我國29個(gè)省(區(qū)、市)均已發(fā)現(xiàn)有萊姆病分布,每年新發(fā)病例高達(dá)萬余 例，某些省份林區(qū)的發(fā)病率在1-40%。
人感染后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為慢性炎癥性多系統(tǒng)損傷，除皮膚慢性游走性 紅斑、關(guān)節(jié)炎和慢性萎縮性肢皮炎外，常常會(huì)伴有心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，從 而引起腦膜炎、路神經(jīng)炎、運(yùn)動(dòng)及感覺神經(jīng)根炎、神經(jīng)叢炎、多發(fā)單神經(jīng)炎小 腦共濟(jì)失調(diào)等等癥狀。嚴(yán)重影響人類健康。
由于本病是一類蜱傳性疾病，所以探明媒介蜱的種類，為切斷傳播途徑，控 制本病的流行是十分重要的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在北美主要的媒介蜱是肩突硬蜱、新 節(jié)硬蜱和太平洋硬蜱，其中肩突硬蜱是主要的傳播媒介，帶菌率在12-100%; 歐洲的傳播媒介是篦子硬蜱和全溝硬蜱，篦子硬蜱的帶菌率可達(dá)到40%;在我 國，在全溝硬蜱、粒形硬蜱、銳跗硬蜱、長角血蜱、二棘血蜱、嗜群血蜱、臺(tái) 灣血蜱、微小牛蜱和森林革蜱等9種硬蜱體內(nèi)分離到病原，其中全溝硬蜱、二 棘血蜱和粒形硬蜱的帶菌率最高，分別達(dá)到20-45%、 16-40%和24%。研究證實(shí) 在我國北方林區(qū)主要是全溝硬蜱，南方林區(qū)為二棘血蜱和粒形硬蜱傳播本病。
目前，蜱體內(nèi)萊姆病病原的檢測方法目前主要有:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);組 織鏡檢與體外培養(yǎng)。以PCR為主，但是PCR在檢測本病原時(shí)常常表現(xiàn)為敏感性較 低，而且難以滿足進(jìn)行本病原全面的大規(guī)模調(diào)査的 要，因此，到目前為止，萊姆病的實(shí)驗(yàn)室診斷沒有得到有效的解決，全球仍然沒有統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)有
技術(shù)可參見BarbourA G, Biology of Borrelia species[J]. M icrobiological review, 1986， 50: 381- 4001 ， Chary V alckenaere I, Jaulhac B, Monteil H, et la. D iagnosis of L yme disease[J ]■ Current difficultiesand prospects, Rev國Rhum國Engl- Ed， 1995, 62 (4) :271- 280， Luger SW Krauss E Lyme disease, Interlaboratory variability [J] Arch-Intern- Med, 1990, 150 (4): 761- 763和Magnarelli LA Current status of laboratory diagnosis for Lyme disease[J ]. Am- J隱Med， 1995, 98 (4A ) : 10- 12

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原伯氏疏螺旋體時(shí)檢測病原單 一，不能同時(shí)檢測出混合感染的發(fā)生，且敏感性低的缺點(diǎn)，提供一種能夠直接， 綜合性，高特異性和敏感性的檢測出目前己知所有的被檢樣品中的螺旋體感染 的檢測試劑盒，本發(fā)明同時(shí)提供使用這種試劑盒的檢測方法。
本發(fā)明的檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的試劑盒內(nèi)至少有其上共價(jià)結(jié)合有萊姆 病病原螺旋體通用探針和狹義螺旋體5. 6M ^^/eW化"sw^r/"o、嘎氏螺旋體5. g"n'"z7、伽氏螺旋體及a/ze/z7和5. va/aisz'a"a螺旋體特異寡核苷酸探針的Biodyne C膜，以及在螺旋體5S-23SrRNA基因序列兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對可擴(kuò)增出 的片段大小為225bp的引物，且其中的一條引物用生物素標(biāo)記。
本發(fā)明的檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的試劑盒中所用的萊姆病病原螺旋體通用 探針的序列為ctttgaccatatttttatcttcca;狹義螺旋體及6w Jor/er/犯"sm sWcto的特 異性寡核苷酸探針為aacaccaatatttaaaaaacataa;嘎氏螺旋體及gan'm7的特異性寡 核苷酸探針為aacatgaacatctaaaaacataaa;伽氏螺旋體5. a々e/H的特異性寡核苷酸 探針為aacatttaaaaaataaattcaagg; 5. va/a/w'a"a的特異性寡核苷酸探針為 cattaaaaaaatataaaaaataaatttaagg; —對引物的序歹lj各為
上游引物23SN2(5'隱accatagactcttattactttgacca-3')，
下游引物5SCB(5'-biotin-gagagtaggttattgccaggg-3)，其中下游引物用生物素 標(biāo)記。
本發(fā)明的試劑盒的使用方法是將捕捉的待檢蜱用75%酒精浸泡20 min，再 用生理鹽水漂洗，將其置于含有BSKII培養(yǎng)基的無菌研磨器中研磨碎后再進(jìn)行 菌體分離培養(yǎng)與提純，得到DNA，以所得到的DNA為模板，以試劑盒內(nèi)的引 物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物和固定在Biodyne C膜上的伯氏螺旋體的寡核苷酸進(jìn)行 雜交，再將BiodyneC膜放置在塑料布或者包裝膜內(nèi)，滴加A、 B混合液在膜上 含有寡核苷酸和PCR產(chǎn)物雜交的區(qū)域，用塑料層覆蓋膜，塑料薄膜封閉器封閉薄膜，將封閉好的薄膜于曝光儲(chǔ)片夾曝光處理，取出膠片進(jìn)行顯影定影處理后 觀察結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用萊姆病伯氏疏螺旋體5S-23S間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)的兩對 引物，第二對引物其中一條用生物素標(biāo)記，PCR擴(kuò)增伯氏疏螺旋體5S-23S間隔 區(qū)，通過單鏈的種特異性寡核苷酸探針與擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)，發(fā)現(xiàn) 所有的菌種都只與其相對應(yīng)的寡合苷酸進(jìn)行反應(yīng)出現(xiàn)雜交信號(hào)，而且沒有觀察 到有交叉反應(yīng)，雜交反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，所有感染有伯氏疏螺旋體的樣品均可看到一 個(gè)或者多個(gè)種的雜交信號(hào)產(chǎn)生。同時(shí)，伯氏疏螺旋體通用的寡核苷酸探針可以 表明，如果PCR產(chǎn)物與通用的探針發(fā)生雜交信號(hào)，而沒有與種特異性的探針產(chǎn) 生雜交信號(hào)，則可以判斷為一個(gè)新種或新的基因型的發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，設(shè)計(jì)的四個(gè) 種特異性探針(S1、 Ss、 Ga、 Bv)更加詳盡的診斷動(dòng)物所感染的菌種類別或者菌株， 本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，RLB能夠檢測出目前已存在的所有伯氏疏螺旋體菌種， 同時(shí)有助于新菌種的發(fā)現(xiàn)。


圖1為本發(fā)明的伯氏疏螺旋體RLB標(biāo)準(zhǔn)陽性特異性試驗(yàn)中在感光膠片上顯 示的特異性雜交結(jié)果，其中Sl為伯氏疏螺旋體通用探針；Ga為5o廳e"a. gan'm7 特異性探針；Ss為5o廳e"a. 6Mrg<ior/en' se"s船s/n'"特異性探針；Af為5on^/z'a. "々e/"特異性探針；Vs為5o廳/z'a v"/a/w'a"特異性探針；支為支原體基因組；衣 為衣原體基因組；牛為健康牛基因組；羊?yàn)榻】笛蚧蚪M；水為空白對照。
具體實(shí)施例方式
一、引物和探針的設(shè)計(jì)與合成
在螺旋體5S-23SrRNA基因序列兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增出的片段大 小為225bp的引物，其上游引物為
23SN2(5'-ACCATAGACTCTTATTACTTTGACCA-3')， 下游引物為5SCB(5'-biotin-GAGAGTAGGTTATTGCCAGGG-3)。 根據(jù)己確定的萊姆病伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因序列的變異區(qū)域設(shè)計(jì)針對 ①狹義螺旋體及6wwcfo /eW;serat^/n'"o,②嘎氏螺旋體5. gan'm7，③伽氏螺 旋體及"/ze/z7和④螺旋體及VG/aW朋"的四個(gè)特異性寡核苷酸探針，即SS， BG， BA和BV，另外，針對所有螺旋體的通用探針SL也被設(shè)計(jì)合成。所有的寡 核苷酸探針均用N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl， N， N-diisopropyl phosphoramidite [TFA])-C6氨基團(tuán)連接修飾，將合成的探針0-800pmol/150ul 500mMNaHCO3(pH8.4)，尋找最佳濃度用于雜交。各寡核苷酸探針序列和其最佳濃度見表l。
表l.泰勒蟲和巴貝斯蟲寡核苷酸探針序列和最佳濃度
寡核苷酸序列最佳濃度
(Oligonucleotides)(Sequences'-3')(Optimised concentrations)5
fSL430-453)CTTTGACCATATnTTATCTTCCA100 '200pmo1
(SS299-322)AACACCAATATTTAAAAAACArAA100 '200pmo110
fi. ga"'"!'i' (BG 298-322)AACATGAACATCTAAAAACATAAA600 '800pmo1
及祐e/tfAACATTTAAAAAATAAATTCAAGG15
(BA 278-305)300 -400pmo1
(BV 278-303)CATTAAAAAAATATAAAAAATAAAT TTAAGG600--800pmo1
二、含有螺旋體種特異寡核苷酸BiodyneC膜的制備
螺旋體種的特異性寡核苷酸序列根據(jù)每個(gè)菌種的5S -23S rRNA基因序列設(shè) 計(jì)。所有的寡核苷酸5'端被氨基團(tuán)修飾后合成。它們能夠共價(jià)結(jié)合到帶有負(fù)電 荷的Biodyne C薄膜上。按照Gubbels等1999描述的方法改進(jìn)后進(jìn)行操作[28]， 基本過程如下
(1) 用149ul 500 mM NaHC03. pH 8，4(每次都要精確校對pH值)稀釋螺旋 體種的特異性寡核苷酸到已經(jīng)確定的最佳濃度。
(2) 將BiodyneC膜剪成14.5cmX14.5cm大小，用記號(hào)筆標(biāo)記薄膜以便能 在以后的操作中辨別方向。用去離子水配制新鮮的16% (w/v) l-ethyl-3畫(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)，力Q 10ml孵育10分鐘活 化Biodyne C膜，室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。
(3) 將薄膜放在塑料容器中用去離子水搖洗兩分鐘，然后放入潔凈的印跡 儀中。旋緊手柄。
(4) 通過抽吸除去孔里殘留的液體。將150ul稀釋的寡核苷酸溶液加入印 跡儀的孔槽，第一個(gè)和最后一個(gè)孔不加寡核苷酸。(5) 將墨水用2xSSPE緩沖液按1: 100的比例稀釋，加入第一個(gè)孔和最 后一個(gè)孔。
(6) 所有的樣品都加入以后，室溫下孵育2分鐘。
(7) 通過抽吸除去每個(gè)孔槽內(nèi)的寡核苷酸溶液及第一和最后一個(gè)孔槽的墨 水稀釋液。
(8) 用鑷子從印跡儀中除去膜，然后用250ml新鮮配制的100 mMNaOH(最 大量)在塑料容器中孵育10分鐘，不斷搖動(dòng)容器使膜鈍化。
(9) 用去離子水漂洗薄膜。
(10) 在塑料容器中用250 ml 2x SSPE /0.1% SDS 60°C漂洗5分鐘，漂洗 期間輕微搖動(dòng)溶液瓶。
(11) 用100 ml 20 mM EDTA pH 8,0在塑料容器中漂洗薄膜，室溫下輕輕 搖動(dòng)15分鐘。
(12) 4。C保存薄膜直到使用(用塑料制品密封或者用包裝膜包裝避免薄膜 脫水)。
三、檢測實(shí)例
(一) 伯氏疏螺旋體的分離
采集的活蜱鑒定蜱種后，未吸血的活蜱20只一組，吸血活蜱6~10只一 組，先用75X酒精浸泡20min后，用無菌濾紙吸干，再用生理鹽水，漂洗3次， 用無菌濾紙吸干蜱體表水份后，置于含有BSKII培養(yǎng)基的無菌研磨器中研磨。 研磨碎后，置于離心管中，1000rpm離心10min，吸取上清液約0.1-0.2 ml接種于1.5 ml培養(yǎng)基中，于33 "C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌液變色后用暗視野 顯微鏡觀察。伯氏疏螺旋體的培養(yǎng)和傳代將通過分離獲得的萊姆病菌株培養(yǎng)液 取lml分別接種于lmlBSKlI培養(yǎng)基培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。
(二) 菌體的分離與提純
(1) 取細(xì)菌培養(yǎng)液l-5ml， 10， OOOrpm離心l分鐘，盡量吸凈上清。
(2) 向菌液沉淀中加入200ul緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。
(3) 向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混勻。
(4) 加入220ul緩沖液GB，振蕩15秒，7(TC放置10分鐘，溶液應(yīng)變清 亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
(5) 加220ul無水乙醇，充分振蕩混勻10秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀， 簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
(6) 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入 收集管中)，12， 000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
(7) 向吸附柱CB3中加入500ul緩沖液GD， 12， 000rpm離心30秒，倒 掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
(8) 向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW， 12， 000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。
(9) 向吸附柱CB3中加入500^1漂洗液PW， 12， 000rpm離心30秒，倒 掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
(10) 將吸附柱CB3放回收集管中，12， 000rpm離心2分鐘，倒掉廢液。 將吸附柱CB3開蓋置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
(11) 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空 滴加50-200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12， 000rpm離心2分鐘，將 溶液收集到離心管中。
(三) PCR擴(kuò)增
本發(fā)明的PCR擴(kuò)增，采用前述的引物，以所得到的DNA為模板，其具體 的做法如下
基因片段PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及程序
H20 56単 10x buffer* 7.2|il 10mMdNTP 1.6|xl lOOuM上游引物(RLBF) 3.6pl lOOuM下游引物(RLBR) 3.6|il Genomic DNA lul Taq酶 0.36^d *(200 mM Tris-HCl (pH 8.55)， 160mM (NH4)2S04和20mM MgC12) 所有的樣品混合后12000rpm離心10秒，置于PCR擴(kuò)增儀中按照如下循環(huán)進(jìn)行 擴(kuò)增
94。C 3min 94 °C lmin 30sec
55。C lmin30sec 72。C lmin 30sec
72。C 3min 4°C 保存
取PCR產(chǎn)物L(fēng)Sul在1.0。/。的瓊脂糖凝膠(含0.5。/。ug/ml溴化乙錠)，在75伏的電 壓下進(jìn)行電泳分析，觀察擴(kuò)增結(jié)果。
(四) 檢測蜱體內(nèi)伯氏螺旋體RLB方法的建立
將生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和固定在Biodyne C膜上的伯氏螺旋體的寡核苷 酸進(jìn)行雜交。如果存在螺旋體，則和寡核苷酸特異性作用后用 streptavidin-peroxidase和ECL-detection (增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)孵育后在黑色的方格里
、
40個(gè)循環(huán)面的膠片上可以看到顯影，操作步驟如下
(1) 準(zhǔn)備下面的緩沖液，用無離子水稀釋，所有的緩沖液使用前要預(yù)熱。 (按一張膜的量)
250 ml 2xSSPE/0.1% SDS， 60oC， 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS， 60。C, 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS， 42。C. 500ml2xSSPE，室溫.
(2) 加20 pi的PCR產(chǎn)物到130 pi 2xSSPE/0.1 % SDS中。
(3) 稀釋后的PCR產(chǎn)物99°C熱激10分鐘然后立即在冰中冷卻。
(4) 用250 ml2xSSPE/0.1% SDS 60°C漂洗膜5分鐘。
(5) 在印跡儀中按照與寡核苷酸成垂直的方向放入薄膜和支持氣墊。
(6) 通過抽吸的方法除去印跡儀中殘留的液體。
(7) 用稀釋后的PCR產(chǎn)物填充孔槽，在水平面上60。C雜交10分鐘。
(8) 通過抽吸除掉印跡儀中的樣品，然后用鑷子將膜取出。
(9) 用250 ml 2xSSPE/0.5% SDS 60°C， 10分鐘，.漂洗膜兩次。
(10) 放置膜在旋轉(zhuǎn)瓶中使其冷卻，以免下一步因過氧化物酶作用而失活。
(11) 加入2.5ul鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(500U/ml)結(jié)合到10ml 2xSSPE/0.5% SDS中，將此溶液加入旋轉(zhuǎn)瓶中42°C孵化薄膜45-60分鐘。
(12) 用250 ml的2xSSPE/0.5。/。SDS溶液42。C IO分鐘漂洗兩次。
(13) 用250 ml的2xSSPE在室溫下5分鐘漂洗膜兩次。
(14) 加1ml免疫印跡發(fā)光氨試劑A于一個(gè)5ml試管中，隨后加入1ml的 試劑B，混合均勻。
(15) 將薄膜放置在塑料布或者包裝膜內(nèi)，滴加A、 B混合液在膜上含有寡 核苷酸和PCR產(chǎn)物雜交的區(qū)域，用塑料層覆蓋膜，塑料薄膜封閉器封閉薄膜。
(16) 放置封閉好的薄膜于曝光儲(chǔ)片夾內(nèi)，放一張X光膠片在薄膜上(在 膠片的左側(cè)角打折為了以后辨認(rèn)方向)，曝光30分鐘。
(17) 取出X光膠片放入顯影液中顯影5分鐘，然后用無離子水漂洗2分 鐘，隨后轉(zhuǎn)入定影液中定影5分鐘，再用無離子水漂洗，充分洗去定影液后觀 察結(jié)果。
(18) 如果膠片上的信號(hào)太弱或太強(qiáng)，可延長或縮短曝光時(shí)間將薄膜直接 曝光于另一張膠片。雜交過的PCR產(chǎn)物可以從膜上除去。 一張膜可以重復(fù)利用大約15次。
需說明的在實(shí)際的試劑盒中也可將以上所使用的試劑、酶、緩沖液，以及 顯影、定影劑等均放入試劑盒內(nèi)，這樣可以使檢測更為方便、快捷。 (五)結(jié)果判定
1、 特異性檢測結(jié)果
通過PCR擴(kuò)增現(xiàn)有所有菌株的5S-23S rRNA基因變異區(qū)域，產(chǎn)生的DNA 片段和固定在薄膜上的寡核苷酸探針進(jìn)行核酸雜交，寡核苷酸探針經(jīng)光學(xué)發(fā)光 作用，在膠片上產(chǎn)生一定強(qiáng)度的信號(hào)，檢測結(jié)果見附圖1。圖1中Sl為伯氏疏 螺方定體通用探針；Ga為特異性探針；Ss為5c^re//fl.6w^￡for/en' sera^ 特異性探針；Af為Bo廳e/^. ^^e///特異性探針；Vs為5owto.
vof/a/w'aw特異性探針；；PKo為Bo^re//" fl々e加的代表菌株，PKa為 Bwre/zaAw^^or/w/serawssW"的代表菌株，PBi、 T25、 PBr、 20047、 IP90、 TN 為5o/re//a. gaW"z7的{戈表菌株，VS116為5cwt/zVx va/a/w'aw的<戈表菌株。支為支 原體基因組；衣為衣原體基因組；牛為健康牛基因組；羊?yàn)榻】笛蚧蚪M；水 為空白水對照。由圖1可見，所有的探針僅與它們各自的靶序列進(jìn)行結(jié)合，不 同的種之間沒有交叉反應(yīng)，很清楚的與相應(yīng)的菌種產(chǎn)生雜交信號(hào)。每個(gè)菌種可 以分別被四個(gè)核苷酸探針識(shí)別①及Wr/cto，②5. gan'm7,③ 及fl々e?、?. v"/a^a"a四個(gè)特異性寡核苷酸探針，艮口 SS， BG， BA和BV， 所有的菌株都可被通用探針SL識(shí)別。
2、 野外試樣的檢測結(jié)果見表2
研究表明，根據(jù)已報(bào)道的螺旋體5S-23S rRNA基因序列設(shè)計(jì)伯氏螺旋體的 通用性引物對和伯氏螺旋體通用探針和種特異性寡核苷酸探針固定于Biodyne C薄膜上，將PCR方法和RLB方法相結(jié)合建立了一種特異，敏感的診斷方法， 可以識(shí)別相應(yīng)的螺旋體種。通過對13個(gè)地區(qū)的野外樣品用RLB檢測后得出 13個(gè)地區(qū)樣品的RLB檢測陽性樣品數(shù)量及檢測率分別為9 (36%)、 8 (57%)、 8(17%)、 73 (77%)、 5 (100%)、 41 (98%)、 10 (21%)、 2(50%) 、8(42%)、 7 (88%)、 5 (100%) 、 9 (82%) 、 44 (90%),參見表2。而總的陽性樣品 數(shù)量是231，陽性率是62%，被檢樣品多數(shù)為混合感染四種伯氏疏螺旋體的兩種 或以上，少數(shù)僅僅感染一種病原，不論是華南地區(qū)還是黑龍江地區(qū)5orre"". a,e/f!'的感染率都很高，說明50^^/^.<^///在我國的華南地區(qū)和東北地區(qū)是優(yōu) 勢種。So廳/^.va/"Waw的感染率在華南地區(qū)很低，但在東北部分地區(qū)有發(fā)現(xiàn)。由以上內(nèi)容可知，本發(fā)明可以檢測出螺旋體的種類和混合感染的情況，為 萊姆病的檢測、菌種鑒定和流行病學(xué)調(diào)查提供了有利的工具。 表2.部分野外樣品檢測結(jié)果
野外樣品采集地點(diǎn)野外樣 陽性樣品數(shù)量_陽性率％
品數(shù)量BBBGBABVSlBBBGBABVSl
福建省南平市邵武25082090328036
縣島石村
福建南平市建陽營1481087577057
口鎮(zhèn)上白源村
湖南懷化新晃縣禾48264084138017
灘鄉(xiāng)禾灘村
湖南懷化芷江縣大265746173286149177
洪山鄉(xiāng)金塘溪村93
湖南懷化芷江縣五55050510001000100
浪溪鄉(xiāng)牛皮寨村
廣西省賓州縣武宣424104104198098098
縣雙獅村
廣東省惠東縣百花483740106158021
鎮(zhèn)兩山村
黑龍江省牡丹江市4112222525505050
海林縣
黑龍江省加格達(dá)旗1943482116372142
黑龍江革蜱83373838886388
吉林楊泡鄉(xiāng)5100100100100100
吉林樺南11449993636828282
黑龍江帽兒山4933354443446771908890
總計(jì)37112813717769231353748186權(quán)利要求
1、檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)至少有其上共價(jià)結(jié)合有萊母病病原螺旋體通用探針和狹義螺旋體B.buredorferi sensu stricto、嘎氏螺旋體B.garinii，、伽氏螺旋體B.afzelii和B.valaisiana螺旋體特異寡核苷酸探針的Biodyne C膜，以及在螺旋體5S-23SrRNA基因序列兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對可擴(kuò)增出的片段大小為225bp的引物，且其中的一條引物用生物素標(biāo)記。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的試劑盒，其特征是萊母 病病原螺旋體通用探針的序列為ctttgaccatatttttatcttcca; 5.特異性寡核苷酸探針為aacaccaatatttaaaaaacataa;及gwWm7特異性寡核苷酸探針 為 aacatgaacatctaaaaacataaa ; 5. 喊e/H 特異'性寡禾亥苷酸探針為 aacatttaaaaaataaattcaagg ; 5. va/a/^"a 特異性寡核苷酸探針為 cattaaaaaaatataaaaaataaatttaagg; —對引物的序歹!j各為 上游引物23SN2(5'國accatagactcttattactttgacca-3'),下游引物5SCB(5'-biotin-gagagtaggttattgccaggg國3)。
3、 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒的使用方法，其特征是將捕捉的待檢蜱用 75W酒精浸泡20min，再用生理鹽水漂洗，將其置于含有BSKII培養(yǎng)基的無菌 研磨器中研磨碎后再進(jìn)行菌體分離與 提純，得到DNA，以所得到的DNA為 模板，以試劑盒內(nèi)的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物和固定在Biodyne C膜上的伯氏 螺旋體的寡核苷酸進(jìn)行雜交，再將BiodyneC膜放置在塑料布或者包裝膜內(nèi)，滴 加A、 B混合液在膜上含有寡核苷酸和PCR產(chǎn)物雜交的區(qū)域，用塑料層覆蓋膜， 塑料薄膜封閉器封閉薄膜，將封閉好的薄膜于曝光儲(chǔ)片夾曝光處理，取出膠片 進(jìn)行顯影定影處理后觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從蜱體內(nèi)檢測某種病原體的檢測試劑盒及檢測方法。本發(fā)明的檢測蜱體內(nèi)萊姆病病原的試劑盒內(nèi)至少有其上共價(jià)結(jié)合有萊姆病病原螺旋體通用探針和狹義螺旋體B.buredorferi sensu stricto、嘎氏螺旋體B.garinii、伽氏螺旋體B.afzelii和B.valaisiana螺旋體特異寡核苷酸探針的Biodyne C膜，以及在螺旋體5S-23SrRNA基因序列兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對可擴(kuò)增出的片段大小為225bp的引物，且其中的一條引物用生物素標(biāo)記。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101613757SQ20091013990
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日
發(fā)明者任巧云, 關(guān)貴全, 劉軍龍, 劉志杰, 劉愛紅, 李有全, 楊吉飛, 宏 殷, 牛慶麗, 羅建勛, 馬米玲, 高金亮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所