專利名稱：：抗hAPE1蛋白的抗體及其制備方法與應(yīng)用該抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(hAPEl蛋白)的抗體及其制備方法以及應(yīng)用該抗體的ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，腫瘤標志物的檢測已成為腫瘤臨床診斷的常規(guī)手段之一，其原理是4企測肺瘤患者肺瘤細胞特異表達的異常蛋白質(zhì)或表達增高的蛋白質(zhì)，從而為腫瘤的診斷和療效評估提供參照，達到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療的目的。人脫口票呤脫嘧咬核酸內(nèi)切酶(humanApurinic/apyrimidinicendonuclease/redoxeffectorfactor,hAPEl)是DNA堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair,BER)途徑的關(guān)鍵限速酶，是一種多功能蛋白質(zhì)。hAPEl蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的生物大分子中最具結(jié)構(gòu)和功能特點的一個典范其一級結(jié)構(gòu)含有318個氨基酸，分子量35423Da,空間結(jié)構(gòu)呈四層的a/P三明治型，主要由N端和C端兩個有所重疊的功能域構(gòu)成，N端是一個不規(guī)則的柔性結(jié)構(gòu)區(qū)域，為氧化還原調(diào)控區(qū)；C端是一個致密的球形核酸酶結(jié)構(gòu)域，為DNA修復(fù)內(nèi)切酶活性區(qū)。正是這種雙重結(jié)構(gòu)使hAPEl具有多種生物功能它能夠與OGGl、XRCC1、PCNA、FEN1以及多聚酶P等蛋白質(zhì)相互作用，同時激活BER通路中的長、短通路，修復(fù)烷化和氧化引起的DNA損傷；能夠發(fā)揮3'-磷酸二酯酶和3'-5'核酸外切酶活性，分別在修復(fù)輻射引起的DNA損傷和切除DNA脫氧4核糖核苦類似物中發(fā)揮重要作用；同時，hAPEl還具有氧化還原功能，可通過氧化還原機制調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性及下游靶基因表達，參與氧化應(yīng)激、細胞周期調(diào)控及凋亡等多種關(guān)鍵的細胞反應(yīng)。受控的轉(zhuǎn)錄因子包括與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡相關(guān)的重要因子如NF-kB,AP-l,Egr-l,p53,PEBP2，Myb,HIF-1cc及Pax5、8等，這些轉(zhuǎn)錄因子與肺瘤的生成、發(fā)展以及放化療抵抗密切相關(guān)。機體各器官組織中均有hAPEl蛋白的表達，而國內(nèi)外的研究均表明，肺瘤組織中的hAPEl定位和表達與相應(yīng)的正常組織有顯著差異。此外，通過檢測肺瘤組織中hAPEl及相關(guān)因子的表達，發(fā)現(xiàn)其表達水平與肺瘤放化療抵抗密切相關(guān)。因此，hAPEl的表達水平和/或類型可能作為篩選某些腫瘤的輔助手段，hAPEl有望成為肺瘤早期診斷中一項敏感而特異的指標。1999年，Dianova等人制備純化了hAPEl多克隆抗體并應(yīng)用于細胞實驗，但其來源于免疫動物的血清，可識別多個抗原表位，因此特異性較低，且存在種屬交叉反應(yīng)的問題。單克隆抗體是針對某一抗原表位的特異性抗體，純度高，特異性強。然而目前大多數(shù)hAPEl的單克隆抗體的抗原表位未知，個別單克隆抗體雖表位已知，但抗體來源于合成的多肽，其表位為線性表位，而非構(gòu)象型表位。#元原表4立(epitope)也考爾為l元原決定蔟(antigenicdeterminant,AD)，是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，是抗原分子表面的一小部分，其大小相當于相應(yīng)抗體的結(jié)合部位，由57個氨基酸、單糖或核苦酸所組成?？乖砦豢煞譃檫B續(xù)性抗原表位(又稱線性表位，見于T細胞表位和部分B細胞表位)和不連續(xù)抗原表位(又稱構(gòu)象型抗原表位，只見于B細胞抗原表位)。每一個抗原表位的性質(zhì)和空間構(gòu)型決定著一種特異性，是使免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)，與生物機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。近來的研究發(fā)現(xiàn)，抗原的線性表位在體液免疫中有重要的作用，而構(gòu)象型表位則與某些免疫應(yīng)答發(fā)生改變或疾病狀態(tài)有關(guān)。因此，尋找針對天然hAPEl蛋白的構(gòu)象型表位的抗體對檢測疾病狀態(tài)下如腫瘤的hAPEl蛋白具有極其重要的意義。目前國內(nèi)外對hAPEl檢測的研究方法大都為免疫印跡和免疫組化法，這兩種均需取組織樣品進行hAPEl一全測，操作步驟繁瑣，處理時間長，成本高，效率低。發(fā)明人于前期研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者和已行放、化療的腫瘤患者其血清中hAPEl蛋白表達顯著增高，因此，對hAPEl進行血清學(xué)檢測有助于肺瘤的早期臨床診斷，并有效判斷肺瘤細胞放療和化療的每丈感性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種抗體，其與脫噤呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶hAPEl蛋白76-90位(其氨基酸序列如SEQIDNo.l所示)和109-123位(其氨基S吏序列如SEQIDNo.2所示)構(gòu)成的構(gòu)象型表位特異性結(jié)合。本發(fā)明所述"抗體"應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd;和雙鏈抗體(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在EP.A-0120694和EP.A.0125023中描述。抗體末端可以引入藥物、毒素、細胞因子、方文射性核素、熒光素、生物素和酶、半胱氨酸尾、酪蛋白激酶底物尾、E尾等結(jié)構(gòu)，有助于標記和偶聯(lián)其它分子，也可以引入鈣調(diào)蛋白尾、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂類標簽、組氨酸尾等，使表達產(chǎn)物易于檢測和純化?？贵w可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補性決定區(qū)(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見，EP.A.184187,GB2188638A或ERA.239400。還可以對雜交瘤細胞或產(chǎn)生抗體的其它細胞進4亍遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。本發(fā)明所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、合成抗體、抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體及其化學(xué)修飾衍生物，在具體實施方式中，優(yōu)選單克隆抗體。本發(fā)明所述還可以為人源化抗體。本發(fā)明所述抗體的亞型包括IgG、IgE、IgM、IgD和IgA,在具體實施方式中，本發(fā)明才是供的單克隆抗體亞型為IgG，其亞類為IgG2b。在具體實施方式中，本發(fā)明提供的一種人的脫噤呤脫嘧咬核酸內(nèi)切酶hAPEl的單克隆抗體，由保藏在中閨典型培養(yǎng)物保藏中心、保藏編號為CCTCC:C200852、分類命名為雜交瘤細胞株DPCC2-G1的雜交瘤細胞林產(chǎn)生，保藏單位地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏日期為2008年11月3日。本發(fā)明所述抗體可用于^r測hAPEl蛋白在正常及腫瘤細胞內(nèi)分布，例如通過ELISA、WesternBlot、免疫組織化學(xué)對細胞及組織中hAPEl蛋白表達的定量檢測；用細胞組織化學(xué)、細胞熒光化學(xué)檢測hAPEl蛋白在細胞中的定位情況；用免疫組織化學(xué)法檢測單克隆抗體相應(yīng)抗原在腫瘤和正常組織中的表達和分布情況。本發(fā)明的另外一個目的是提供上述單克隆抗體的制備方法用氨基酸序列如SEQIDNo.5所示的hAPEl融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠分泌與hAPEl特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞注射動物腹腔，對產(chǎn)生的腹水分離純化獲得所述抗體。在本發(fā)明的具體實施方式中，用hAPEl融合蛋白免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0以PEG4000介導(dǎo)融合，HAT選捧性培養(yǎng)，間接ELISA法篩選，有限稀釋法克隆化。將100%對hAPE1融合蛋白陽性、pET28a菌體蛋白和Eppin-His融合蛋白陰性的雜交瘤細胞定抹凍存；將定林的雜交瘤細胞注射到經(jīng)石蠟油預(yù)處理的BALB/C小鼠腹腔，產(chǎn)生腹水。腹水用ProteinG柱親和純化，獲得純化的單克隆抗體。該單克隆抗體的結(jié)合常數(shù)Ka為1.8xl(T7,效價大于1:107。本發(fā)明所述抗體可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發(fā)明所述的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的抗體，進行氨基酸序列分析，進行人工合成或用PCR法擴增得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。本發(fā)明還提供制備上述抗體的雜交瘤，所述雜交瘤保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心、保藏編號為CCTCC:C200852。本發(fā)明的再一個目的是提供產(chǎn)生上述抗體的hAPEl融合蛋白，所述hAPEl融合蛋白C端含有10xHisTag,具有人APE1蛋白的生物活性，其氨基酸序列由SEQIDNo.5所示，適于用親和層析純化技術(shù)純8化APE1抗體。本發(fā)明中所述hAPEl融合蛋白以可溶性為主，產(chǎn)量高，純化條件十分筒單，因此具有快速、經(jīng)濟、方便的特點。引入的10xHisTag是為親和純化所設(shè)計，能增加His柱對hAPEl融合蛋白的親和力，更有利于非特異性蛋白的洗脫。此外，引入的10xHisTag能夠明顯增加hAPEl純化蛋白在體外的穩(wěn)定性。本發(fā)明所述hAPE1融合蛋白克服了基因重組獲得的融合蛋白多不具有生物學(xué)功能的缺陷，不僅具有抗原性，還具有氧化還原、修復(fù)和抗原性多重功能，因此應(yīng)用前景廣泛。在本發(fā)明的具體實施方式中，上述hAPEl融合蛋白的具體制備方法為1)以pcDNA3.1-APEl質(zhì)粒為才莫氺反，分別引入NcoI、BamHI酶切位點粘端，并在下游引入10xHisTag，行PCR反應(yīng)，得到重組hAPEl基因；2)將重組hAPEl基因與載體pET28a質(zhì)粒行NcoI和BamHI雙酶后連接，用卡鈉霉素平板篩選陽性克隆，得到pET28a-hAPEl質(zhì)粒。3)將pET28a-hAPEl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21中，挑菌至LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)4h,離心收集菌體，凍溶后超聲破菌，過濾，按Pharmacia公司提供的His親和柱純化得到hAPEl融合蛋白。本發(fā)明還提供一種診斷組合物，包括權(quán)利要求1-6任一項所述抗體，和可任選的免疫診斷方法中常規(guī)使用的合適試劑。本發(fā)明所述診斷組合物可用于肺瘤的臨床診斷及判斷肺瘤細胞放療和化療的敏感性。本發(fā)明的又一個目的是提供一種能快速、準確檢測人血清中hAPEl含量的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明所述抗體。本發(fā)9明所述ELISA試劑盒可以是是雙抗體夾心ELISA試劑盒。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明提供的雙抗體夾心ELISA試劑盒包括本發(fā)明所述單克隆抗體、本發(fā)明所述hAPEl融合蛋白以及另一種hAPEl抗體。本發(fā)明所述ELISA試劑盒可用于肺瘤的臨床診斷及判斷腫瘤細胞放療和化療的敏感性，具有更高的靈敏性，同時兼顧了特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等優(yōu)勢，不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以一全查幾百甚至上千份標本，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。因此，本發(fā)明所述hAPEl融合蛋白、hAPEl蛋白的抗體、診斷組合物、ELISA試劑盒具有廣泛的應(yīng)用前景及實用價^直。圖1表示瓊脂糖電泳檢測hAPEl重組基因PCR電泳結(jié)果，泳道1為DNA分子量標準；泳道2為hAPEl重組基因PCR擴增產(chǎn)物；泳道3為陰性對照。圖2表示瓊脂糖電泳檢測pET28a-hAPEl重組載體雙酶切結(jié)果，泳道1為DNA分子量標準；泳道2為pET28a-hAPEl經(jīng)NcoI、BamHI雙酶切；泳道3為pET28a-hAPEl。圖3表示SDS-PAGE電泳才企測hAPEl融合蛋白在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達及可溶性鑒定結(jié)果，泳道l為低分子量蛋白標準；泳道2為pET28a-hAPEl未謙導(dǎo)；泳道3為IPTG誘導(dǎo)pET28a-hAPEl4h后；泳道4為IPTG誘導(dǎo)pET28a-hAPEl4h破菌后上清；泳道5為IPTG誘導(dǎo)pET28a-hAPEl4h石皮菌后沉淀。圖4表示hAPEl融合蛋白的純化結(jié)果，泳道1為低分子量蛋白標準'，泳道2為上樣穿透液；泳道3為30mM。米峻洗脫液；泳道4為200mM咪唑洗脫液。圖5表示W(wǎng)esternblot檢測hAPEl融合蛋白純化結(jié)果，A圖中一抗為抗人APE1單克隆抗體(Novuse):1為純化后的hAPEl蛋白；2為HaLa細胞核蛋白；B圖中抗體為HRP-His抗體(Pierce):1為低分子量蛋白標準；2為純化后的hAPEl蛋白；3為HaLa細胞核蛋白；4為Eppin-His融合蛋白(含6xHisTag)。圖6表示hAPEl融合蛋白氧化還原活性檢測結(jié)果1為正常HaLa細胞核蛋白；2為感染Ad5/F35-siAPEl的HaLa細胞核蛋白；3為正常HaLa細胞核蛋白加入hAPEl融合蛋白后；4為感染Ad5/F35-siAPEl的HaLa細胞核蛋白中加入hAPEl融合蛋白后。圖7表示hAPEl融合蛋白AP修復(fù)活性檢測結(jié)果1為BSA陰性只十照；2為0.2|agAPE1融合蛋白；3為2ngAPE1融合蛋白；4為HaLa細胞核蛋白陽性對照。圖8表示SDS-PAGE電泳檢測DPCC2-G1單克隆抗體腹水IgG純化結(jié)果，泳道1為蛋白標準；泳道2為2-G1純化前；泳道3為2-G1純化穿透液；泳道4為2-G1純化后。圖9表示W(wǎng)esternblot檢測DPCC2-G1單克隆抗體特異性的結(jié)果，1為hAPEl融合蛋白；2為HOS細月包蛋白；3為pET28a空載體i秀導(dǎo)蛋白；4為Eppin-His融合蛋白。圖10表示DPCC2-Gl雜交瘤細胞染色體鑒定結(jié)果。圖11表示抗體表位分析結(jié)果左上圖為hAPEl蛋白的空間結(jié)構(gòu)示意圖紅色曲線表示cx螺旋結(jié)構(gòu)，綠色箭頭曲線表示(3片層結(jié)構(gòu)；其余三圖為抗原構(gòu)象型表位在hAPEl蛋白上的定位紅色球體代表氧紅色曲線表示cc螺旋結(jié)構(gòu)，綠色箭頭曲線表示P片層結(jié)構(gòu)，紅色球體代表氧原子，白色球體代表碳原子，藍色球體代表氮原子。圖12表示激光共聚焦檢測細胞中APE1定位和表達A為熒光標記的線粒體；B為TOPRO-3探針標記的核；C為細胞中APE1蛋白的定位；D為ABC圖《象重組后。圖13表示免疫細胞化學(xué)檢測細胞中APE1定位和表達A圖為DPCC2-G1單克隆抗體(1:100)檢測結(jié)果；B圖為小鼠抗人APE1(1:100,購自美國Novus)。圖14表示免疫組織化學(xué)檢測組織中APE1定位和表達A為乳腺癌組織；B:肺&泉癌組織；C:腎癌組織；D:前列&泉癌組織。圖15表示雙抗體夾心ELISA檢測APE1蛋白的標準曲線，橫坐標為標準品濃度的常用對數(shù)，縱坐標為相應(yīng)OD450值。具體實施例方式為了有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，下文特舉較佳實施例并配合附圖詳細說明。材料與方法HOS細胞、HaLa細胞、大腸桿菌E.coliDH5cc和BL21(DE3)感受態(tài)細胞和pET28a載體均為本領(lǐng)域常規(guī)生物材料，真核表達載體pcDNA3.1-APEl(構(gòu)建方法參見2006年第三軍醫(yī)大學(xué)呼吸內(nèi)科學(xué)譚永紅博士的博士論文《放射性肺損傷關(guān)鍵靶細胞電離輻射效應(yīng)及其調(diào)控研究》)和重組腺病毒Ad5/F35-siAPEl(構(gòu)建方法參見XiangDBetal.CancerGeneTherapy.2008;15(10):625-35)由本室保存；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、聚乙二醇(PEG4000)購自Gibco公司；限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI、PrimerstarDNA聚合酶、T4DNA連沖妻酶購自Promega^^司；ECL檢測試劑盒、HRP標記羊抗小鼠IgG抗體、HRP標記-羊抗兔IgG抗體、HRP標記His抗體、電泳遷移率變動分析實驗LightShift試劑盒、DAB顯色劑購自Pierce公司；尿嘧咬糖基化酶(UDG)購自美國NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Geneaid/^司產(chǎn)品；完全與非完全弗氏佐劑、鼠抗體亞類鑒定試劑盒購自Sigma/>司；小鼠抗人APE1單克隆抗體購自NovusBiologicals公司；引物及測序由上海英駿生物工程公司合成；APE1-15肽陣列(CelluSpotsTMPeptideArrays)為德國INTAVISAG公司產(chǎn)品；His一主HiTrapchelatingHP、ProteinG、ProteinA親和色i普牙主購自Pharmacia公司，純化設(shè)備由重慶富進生物醫(yī)藥有限公司提供。實施例1pET28a-hAPEl原核表達載體構(gòu)建和鑒定應(yīng)用PrimerPremer5.0i更計軟件確定引物，兩端分別引入Ncol、BamHI酶切位點粘端，并在下游引入10xHisTag，上游引物核苷酸序列如SEQID.No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQID.No.4所示，以pcDNA3.1-APEl質(zhì)粒為模板進行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。分別將PCR膠回收產(chǎn)物及載體pET28a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI雙酶切，在T4DNA連接酶作用下16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliDH5oc中，卡鈉霉素平板篩選，挑取陽性克隆擴增，提取質(zhì)粒DNA,酶切和測序鑒定正確。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝月交電泳，結(jié)果如圖l所示，可見1007bp左右的片段，與預(yù)期大小相符。pET28a-hAPEl載體經(jīng)Nco1、BamHI雙酶切后，得到兩條約為1000bp和6000bp的片段，與預(yù)期的結(jié)果相符(如圖2所示)，測序結(jié)果表明插入的hAPEl在GeneBank中登錄的石咸基序列完全一致，無突變，表明原核表達載體構(gòu)建成功。hAPEl融合蛋白的氨基酸序列如SEQID.No.5所示。另外，經(jīng)比對編碼該融合蛋白的核苷酸序列與現(xiàn)已報道的其它編碼重組的hAPEl核苦酸序列均不完全一致。實施例2hAPEl融合蛋白的表達、純化與鑒定1.hAPEl融合蛋白的誘導(dǎo)表達將pET28a-hAPEl質(zhì)粒和空載體pET28a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，分別挑取克隆接種在含卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)液中，37。C培養(yǎng)過夜，按1:100轉(zhuǎn)接后，37°C培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時，f又誘導(dǎo)前的菌液lml作為對照，余下菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心收集沉淀，行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色。2.hAPEl融合蛋白的可溶性鑒定取誘導(dǎo)4h的菌液離心后棄上清，加入裂菌液(含0.1mg/L溶菌酶，5mmol/LEDTA)重懸，冰浴下超聲石皮菌，分離上清和沉淀，將沉淀用8mol/L尿素重懸后與上清分別制樣。行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，鑒定融合蛋白的表達形式。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，取細菌懸液進行12%SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示，在相對分子質(zhì)量約37x103處有目的蛋白條帶，且主要以可;容性表達為主。3.hAPEl融合蛋白的純化按上述條件大量搖菌誘導(dǎo)融合蛋白表達，收集菌液離心，收集沉淀，-20。C凍存過夜。次日融化沉淀，用上樣緩沖液(20mmol/LPBS,pH9.0)14重懸，冰浴下超聲破菌，離心收集上清，過濾后用上樣緩沖液平衡His柱后，取待純化的樣品上樣，用上樣緩沖液流洗至基線，再分別用30mmol/L和200mmol/L咪唑洗脫，收集蛋白峰。將純化后的蛋白行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后分析結(jié)果如圖4所示。4.hAPEl融合蛋白的鑒定細胞培養(yǎng)HaLa或HOS細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基37°C、5%C02條件下培養(yǎng)傳代。Ad5/F35-siAPEl以4MOI感染HaLa細胞2h后換液，繼續(xù)正常培養(yǎng)48h后收集細胞提取核蛋白。提取細胞核蛋白0.25%胰酶消化HaLa細胞或HOS細胞，收集lxl07細胞，離心收集沉淀，以PBS洗滌，以500^1預(yù)冷4氐滲緩沖液A(10mMHEPES，10mMKC1,0.1mMMgCl2,0.1mMEDTA,O.lmMDTT,5mMPMSF,pH7.9)重懸，冰浴10min;離心收集沉淀，以500(^1預(yù)冷緩沖液B(10mMHEPES,100mMNaCl,1.5mMMgCl2,O.lmMEDTA,O.lmMDTT,5mMPMSF,pH7.9)重懸，冰浴20min,離心取上清測定蛋白濃度后于-70°C保存。將純化的蛋白溶液4°C透析過夜，取樣行12%SDS-PAGE電泳，分A、B兩組電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，A組以HaLa細胞提取核蛋白為陽性對照，B組用帶6xHisTag的Eppin-His融合蛋白為陽性對照，HaLa細胞核蛋白為陰性對照。用1%的BSA37。C封閉2h,A組一抗用小鼠抗人APEl單抗1:20000稀釋4°C孵育過夜，二抗用HRP標記的羊抗小鼠IgG單抗1:4000稀釋37°C孵育40min;B組用HRP標記的His抗體1:4000稀釋37°C孵育lh，采用發(fā)光蛋白免疫印跡法對兩組進行顯影分析。結(jié)果如圖5所示，經(jīng)hAPEl抗體和His抗體孵育的融合蛋白在相對分子質(zhì)量37x103處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，表明該重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，連接其他Tag的hAPEl融合蛋白在體外的活性極其不穩(wěn)定，易降解，而引入10xHisTag后使得人APEl蛋白在體外的穩(wěn)定性增加，4。C保存一周后，用ELISA法檢測，其00450值無差別。5.hAPEl融合蛋白活性分析提取細胞核蛋白HaLa細胞用含10%小牛血清、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100jug/ml)的DMEM培養(yǎng)基，37。C、5%C02條件下培養(yǎng)，每3d傳代1次。Ad5/F35-siAPEl以4MOI感染HaLa細胞2h后換液，繼續(xù)正常培養(yǎng)48h后收集細胞提取核蛋白。hAPEl融合蛋白氧化還原活性檢測采用電泳遷移率變動分析實驗EMSA參照文獻(ZhangL,etal.ProcNatlAcadSciUSA,1998，95(16):9184-9489),人工合成NF-kB探針序列如下P1:5'-AGCTTAGAGGGGACTTTCCGAGAGGA-3，(核苷酸序列如SEQIDNo:6所示)，P2:5'-TCCTCTCGGAAAGTCCCCTCTAAGCT-3'(核苦酸序列如SEQIDNo:7所示)，其中包含NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的識別序列，其3，端以生物素標記，退火形成雙鏈，按照LightShift試劑盒說明書進行。結(jié)合反應(yīng)體系(20jul)為lx結(jié)合緩沖液，2.5%甘油，5mMMgCl2,0.050/。NP-40,50ng/ialpoly(dl.dC)，2jug純化hAPEl蛋白，以正常HaLa細胞的核蛋白(4ng)及感染Ad5/F35-siAPEl的HaLa細月包核蛋白(4|ag)為對照，室溫保溫20min后，加探針lpmol,室溫反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢后，將混合物進行7.5%PAGE恒壓100V電泳，以380mA恒流電轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外線照射交耳關(guān)lOmin,封閉液37°C封閉20min,HRP偶聯(lián)的親和素(1:500)37°C孵育20min，洗滌液洗滌416次，室溫平衡15min后用ECL檢測試劑盒檢測。結(jié)果顯示如圖6所示，正常HaLa細胞核蛋白可與NF-KB探針結(jié)合，當加入hAPEl融合蛋白后，與NF-kb探針的結(jié)合明顯增加；當感染重組腺病毒Ad5/F35-siAPE1后，與NF-kB探針的結(jié)合明顯減少；而當感染Ad5/F35-siAPEl后再加入hAPEl融合蛋白，與NF-kB探針的結(jié)合又顯著增多。說明hAPEl可以增加HaLa細胞核蛋白與NF-kB轉(zhuǎn)錄因子序列的結(jié)合，具有氧化還原活性。hAPE1融合蛋白AP修復(fù)活性檢測參照文獻(WongHK,etal.NucleicAcidsResearch,2007,35(12):4103~4113)設(shè)計才莫擬AP位點的42mer寡核苷酸正義《連和反義鏈，序列為正義鏈22-U:-3',(核苷酸序列如SEQIDNo:8所示)反義《連22-C:-5'，(核苷酸序列如SEQIDNo:9所示)其中U代表尿嘧口定，22-U的5，端標記生物素，退火形成雙4連。22-U中含有的尿嘧啶在尿嘧咬糖基化酶(UDG)作用下可形成一個AP位點，使雙鏈探針能夠被APE1識別并將其切開為22mer的反應(yīng)產(chǎn)物。APE1蛋白結(jié)合反應(yīng)(20ial)體系為10mMHEPES(pH7.4),lOOmMKCl,不同量的純4匕hAPEl蛋白(0.2|ag-2jng),以4jagHaLa細胞核蛋白做陽性對照，2jugBSA蛋白做陰性對照，探針2pmo1,37°C反應(yīng)30min。加甲酰胺終止反應(yīng)，并將混合物進行10%PAGE(含7M尿素)電泳，電壓150V50min，電轉(zhuǎn)至尼龍膜30min,紫外交耳關(guān)后檢測步驟同EMSA。結(jié)果如圖7所示，hAPE1融合蛋白可以參與反應(yīng)切下22mer的產(chǎn)物，并且隨著加入的蛋白量的增加，切下的產(chǎn)物量明顯增加。提示，hAPE1融合蛋白具有AP修復(fù)活性。實施例3hAPEl融合蛋白在抗體親和層析純化中的應(yīng)用稱取0.5g填料裝入純化柱，用10-15倍柱體積的A緩沖液(1mMHC1)在0-4。C預(yù)冷條件下活化填料；用B緩沖液(0.1MNaHC03,0.5MNaCl，pH8.3)按0.5:1(緩沖液蛋白)稀釋hAPEl融合蛋白后，加入到活化好的填料中，在4。C條件下，每30min流盡液體，再循環(huán)加入到純化柱中6-8次，使充分橋耳關(guān)；用5倍柱體積的B液沖洗填料，洗去未結(jié)合的樣品；用C緩沖液(0.1MTris-HCl，pH8.0)平4軒2h;再用3倍柱體積的DH沖液(0.1M醋酸，0.5MNaCl，pH3~4)和E緩沖液(0.1MTris-HCl,0.5MNaClpH8.0)交替洗滌柱子，各約2~3次，滅活填料；將待純化的APE1單克隆抗體或多克隆抗體上樣，37。C緩慢搖動4h,使抗體充分橋聯(lián)；用B液沖洗柱子3次，洗去未結(jié)合的抗體和雜蛋白；用5mlO.IM甘氨酸(pH2.7)洗脫柱子；將洗脫液立即滴入pH9.0的1MTris-HCl中，使緩沖體系迅速被中和，避免強酸條件下抗體解聚，即得到特異性親和純化的APE1單克隆抗體或多克隆抗體。該純化的APE1抗體專交普通的ProteinA或ProteinG親和柱純化的抗體具有更高的特異性和純度。實施例4hAPEl單克隆抗體的制備1.動物免疫以實施例2所得純化的hAPEl融合蛋白，免疫5只6~8周齡17g22g的雌性健康BALB/C小鼠。免疫方法首次免疫^f吏用抗原與完全弗氏佐劑充分乳化后四肢皮下及腹腔注射，60ug/只；4周后第260ug/只；14d后第3次免疫腹腔注射不加佐劑抗原60ug/只,7d后剪尾采血，以hAPEl融合蛋白作檢測原，間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價；以后每間隔14d腹腔注射一次抗原60ug/只，選擇ELISA血清抗體效價達1:106以上的BALB/c小鼠用于融合；融合前3d腹腔注射抗原1次加強免疫，劑量60ug/只。2.小鼠脾細胞的制備摘除小鼠眼球放血，血清留作陽性對照。按無菌操作取出脾臟，并將脾臟放在預(yù)溫不完全培養(yǎng)基中，剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織，置100目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨。收集過濾后的細胞懸液于離心管中，計數(shù)，取lxl()8個細胞，1000rpm離心5min，棄上清，置室溫待用。3.骨髓瘤細胞的準備融合前2周，復(fù)蘇凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0),用含8-AG的1640完全培養(yǎng)基于37°C,5%032培養(yǎng)。融合前2d3d，改用不含8-AG的1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞約lxl(^2xl(^個細胞，1000轉(zhuǎn)/min離心5min,棄上清，置室溫待用。4.祠養(yǎng)細胞的準備融前一天，耳又610周齡健康BALB/C小鼠，斷頸法處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，消毒35min。用無菌剪刀剪開皮膚，充分暴露腹膜，用無菌注射器注入預(yù)冷的10ml無血清培養(yǎng)液。反復(fù)沖洗，更換剪刀剪開腹膜，吸出沖洗液。放入10ml離心管，1200rpm離心10min，用完全培養(yǎng)液重懸，計數(shù)調(diào)整細胞數(shù)2xl05/ml。分鋪在96空細胞培養(yǎng)i中，100nl/孔，37°C,5。/。C02培養(yǎng)備用。5.細力包融合19融前一天將PEG4000置37。C,5。/。C02細胞培養(yǎng)箱中調(diào)整pH值和溫度。將骨髓瘤細胞懸液和脾臟B淋巴細胞懸液按1:10混合，1000rpm,離心10min,棄去上清。輕輕彈擊管底，使細胞團松散成糊狀。在60s內(nèi)緩慢加入0.8ml預(yù)溫的PEG4000,邊加邊轉(zhuǎn)動離心管，靜置90s后，立即在5min內(nèi)加入10ml不完全培養(yǎng)基，具體加法是第lmin力口lml、第2min力口lml、第3min力口1.5ml、第4min力口1.5ml、第5min加完，最后補至30ml。將離心管在37。C培養(yǎng)箱中靜止5min后取出，800rpm離心6min,棄上清，加入40ml完全培養(yǎng)液和1xHAT，輕柔重懸，鋪入8個96孔板細胞培養(yǎng)皿中，100jul/孑L，置37°C,5%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d~14d。注意小心開關(guān)細胞養(yǎng)箱門，盡量避免振動。6.雜交瘤細胞克隆化融合后第5d補液，50lal/孑L;融合后第10d~14d時，用間接ELISA法檢測各培養(yǎng)孔的上清，以hAPEl融合蛋白、pET28a空載體誘導(dǎo)的菌體蛋白、含HisTag的Eppin蛋白為檢測抗原，選擇hAPEl融合蛋白強陽性、pET28a菌體蛋白和Eppin蛋白陰性的單克隆細胞，用有限稀釋法轉(zhuǎn)種于96孔細胞培養(yǎng)板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d~14d后，再取上清按上述方法檢測，將強陽性孔再進行克隆化培養(yǎng)，直至達到100%克隆均為hAPEl融合蛋白陽性、pET28a菌體蛋白和Eppin蛋白陰性，即雜交瘤細胞只分泌hAPEl特異性抗體，而對HisTag和雜蛋白無抗性。將強陽性孔的單克隆細胞定株，大量培養(yǎng)，凍存。結(jié)果經(jīng)4次細胞融合、間接ELISA篩選并克隆化后，獲得l抹穩(wěn)定分泌抗人APE1蛋白的雜交瘤克隆系，命名為DPCC2-G1，其已保藏在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC:C200852。實施例5單克隆抗體的腹水制備和純化1.單克隆抗體的腹水制備選擇2022g健康雌性BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0.5ml/只預(yù)處理，飼養(yǎng)7d后，每只小鼠腹腔注射0.5xl06~lxl06個定抹的雜交瘤細胞；飼養(yǎng)7d10d后，小鼠腹部明顯膨隆，收集腹水，4。C離心15min,分離收集中段的澄清腹水液。2.單克隆抗體的純化用45|um濾紙過濾腹水液。根據(jù)Ig亞類結(jié)果，選擇ProteinG親和層析純化抗體。用上樣緩沖液平衡ProteinG柱，上樣待純化的腹水液后，用上樣緩沖液再平tf,用洗脫i爰沖液洗脫ProteinG柱，收集洗脫液。將純化的抗體用10%SDS-PAGE檢驗純度，Lowry法測定抗體濃度。結(jié)果如圖8所示，顯示DPCC2-Gl單克隆抗體經(jīng)ProteinG親和層沖斤純化，SDS-PAGE電泳鑒定純度均達95%以上。實施例6單克隆抗體的生物學(xué)鑒定1.Westernblot鑒定抗體的特異性WesternBlot檢測抗體特異性以hAPEl融合蛋白、HOS細胞提取APE1蛋白、pET28a空載體在大腸桿菌E.coliBL21中誘導(dǎo)后的菌液、帶6xHisTag的Eppin-His融合蛋白(Eppin-His融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.10所示)上樣進4亍12%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1%的BSA37。C封閉lh,用制備的單克隆抗體(l:2000)37°C孵育1.5h,HRP標記的羊抗小鼠IgG單抗(l:2000)37。C孵育lh,采用發(fā)光蛋白免疫印跡法對兩組進行顯影分析。結(jié)果顯示DPCC2-G1雜交瘤分泌的抗體能特異性與hAPEl融合蛋21白、HOS細胞中的APE1蛋白反應(yīng)，而不與pET28a空載體誘導(dǎo)蛋白和帶HisTag的Eppin-His融合蛋白反應(yīng)(見圖9),說明DPCC2-Gl雜交瘤分泌的單克隆抗體的特異性好。2.抗體亞類鑒定Ig亞類鑒定按照Sigma公司鼠抗體亞類鑒定試劑盒"l喿作說明進行，每個亞類做復(fù)孔驗證。結(jié)果DPCC2-Gl雜交瘤分泌的單克隆抗體亞類為IgG2b。3.抗體效價間接ELISA法檢測抗體效價將hAPEl融合蛋白按5嗎/ml4。C包被過夜，1%BSA37°C封閉lh，加入倍比稀釋的單克隆抗體，以骨髓瘤細胞SP2/0細胞的培養(yǎng)上清為陰性對照，37°C孵育lh,再加入HRP標記羊抗鼠IgG抗體(1:3000)37°C孵育40min,OPD顯色測定OD495腿值，以下列公式計算結(jié)果所對應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)為單克隆抗體的效價M=(檢測孔OD值-空白孔OD值)/(陰性空OD值-空白孔OD值)>2結(jié)果如表l所示，根據(jù)公式計算，當DPCC2-G1單抗的稀釋倍數(shù)為l:107時，M>2,說明該單抗的效價>1:107。表l間接ELISA法檢測2-G1單克隆抗效價及其純化前后的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注陰性對照為骨髓瘤細胞SP2/0細胞的培養(yǎng)上清提前48~36小時將DPCC2-G1雜交瘤細胞傳代，加入秋水仙素(100ug/ml，除菌)，使終濃度為0.4ug/ml;繼續(xù)培養(yǎng)46h，收集細胞，1000r/min離心10min,棄上清；力口入37。C預(yù)溫的0.075mol/LKC1溶液5ml，重懸細胞并混勻，37。C水浴15~20min;入新配制的固定液(甲醇與冰醋酸3:l混合)lml，混勻，1000r/min離心10min,棄上清；加入固定液5ml，重懸細胞混勻，室溫靜置20~30min;1000r/min離心10min,棄上清；重復(fù)上述操作一次；加入5ml固定液，重懸細胞混勻，4。C過夜；次日1000r/min離心5min,輕輕吸去上清液，根據(jù)細胞壓積多少而留下0.5-lml固定液，重懸，吸取細胞懸液1~2滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，在火焰上通過數(shù)次，使細胞平鋪于載玻片上，自然干燥；10%Giemsa染液染色10~20min,自來水洗去染液，自然干燥；鏡檢，選擇染色體分散好、無重疊、無失散的細胞進行觀察分析，每份標本應(yīng)計數(shù)IOO個完整的中期核細胞，并注意觀察是否有標志染色體。結(jié)果如圖10所示，DPCC2-Gl雜交瘤細胞染色體為4倍體，大多數(shù)為端著絲點染色體，個別為中部著絲點染色體和亞中部著絲點染色體，符合小鼠脾細胞和骨髓瘤SP2/0細胞融合后的染色體特征。DPCC2-G1單克隆抗體雜交瘤細胞染色體數(shù)目約為96-92,平均94。5.單克隆抗體親和常數(shù)測定以hAPEl融合蛋白按5嗎/ml、2.5、1.25|ig/ml作為包被抗原，100pl/孔，4。C過夜，PBS洗滌3遍，拍干；封閉力口7%小牛血清封閉液100(al/孔，37。C2h,PBST洗斧反拍干；將抗體濃度4安2800ng/ml、1400ng/ml、700ng/ml、350ng/ml、180ng/ml、90ng/ml、45ng/ml、24ng/ml、12ng/ml、6ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml稀釋，100pl/孔，37。Clh,PBST洗板拍干；加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(l:3000稀釋)IOO)al/孔，37°C水浴40分鐘，PBST洗板拍干；加底物顯色液100|^1/孔，37。C避光反應(yīng)10分鐘；加終止液立即在酶標4義上以492nm波長測定OD值；按照下列公式計算單克隆抗體親和常數(shù)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>該公式中，n為平衡常數(shù)，為兩種抗原包被濃度比值倍數(shù)(本發(fā)明中比值為4);在曲線中，以每條曲線上段平臺段的OD值為100%,以下段平臺段OD值為0，[Ab]和[Ab']為兩條曲線中OD值為50%時所對應(yīng)的抗體濃度，且[Ab]和[Ab']分別與[Ag]和[Ag，]相對應(yīng)?！┦扛?nor1「，A六E^j44厶V、AA*U夂4孑/1目古玄AtS,w^口,1、.iv丄nl-vj丄75、^^/田>tw/ji_i'|z|、yvuj"T"乂Lil王kurf、^r,卜jr。ju力.i工和高親和力，親和常數(shù)Ka二1.8xl(T7。6.種屬交叉反應(yīng)Westernblot;險測種屬交叉反應(yīng)分別4是耳又兔、大鼠、小鼠的心、肝臟、肺組織蛋白，用Westernblot檢測DPCC2-G1單抗對兔、大鼠、小鼠的種屬交叉反應(yīng)。結(jié)果顯示DPCC2-Gl雜交瘤分泌的抗體不能與兔、小鼠和大鼠的心、肝臟、肺組織蛋白反應(yīng)，說明該抗體特異性好，且與兔、小鼠、大鼠無種屬交叉反應(yīng)。7.表位分析制備APE1-15肽陣列根據(jù)hAPEl在GeneBank中登錄的氨基酸序列，將hAPEl第115、418、721...304318位氨基酸分別合成15短肽，與支持物(如纖維素)共價結(jié)合后以點陣的形式有序地固化于載玻片的表面。(德國INTAVISAG公司提供)。用1%脫脂奶4分37。C封閉APE1-15肽陣列4h，0.5%。TBST洗滌后，將DPCC2-G1單抗1:500稀釋，4。C孵育過夜，0.5%。TBST洗滌后，37。C孵育HRP標記羊抗鼠IgG抗體(1:3000)lh,0.5%。TBST洗滌，DAB顯色IOmin,蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。以棕黃色點為陽性點，根據(jù)陽性點所對應(yīng)的氨基酸序列，并應(yīng)用Molsoft.ICM-Pro.軟件分析表位。結(jié)果APE1-15肽陣列與DPCC2-Gl雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體反應(yīng)后，可見兩個不相鄰的陽性點，對應(yīng)為hAPEl天然蛋白氨基酸序列的76-90位(其氨基酸序列如SEQIDNo:l所示)和109-123位(其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示)。s"pnTnxu1《asi^rTnxio筋爪^feT、主4擊frfiig壬乾:l^店志位是構(gòu)象型表位。用三維立體結(jié)構(gòu)觀察軟件Molsoft.ICM-Pro可以看到立體結(jié)構(gòu)圖如圖11所示，該兩段序列的氨基酸殘基均位于蛋白表面。經(jīng)比對未發(fā)現(xiàn)國外已有抗體中有相同表位的報道。實施例7單克隆抗體在^f企測細胞和組織中APE1定位和表達的應(yīng)用1.免疫熒光染色取對數(shù)期生長的HOS細胞接種于六孔板內(nèi)20mmx20mm蓋玻片上，每孔約lxl()S個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12h后取出有細胞貼壁的蓋玻片，用2%甲醛溶液室溫固定20min,0.5%TritonX-10037。C打孔20min,山羊血清工作液37。C封閉30min,滴加DPCC2-Gl單抗(1:100)4。C孵育過夜，以PBS替代一抗作為陰性對照；以異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗小鼠IgG為二抗(1:50)37。C孵育30min;以TOPRO-3探針25(1:100)作為細胞核探針37。C孵育5min。以緩沖甘油封片后在激光共聚焦顯^l鏡下觀察和掃描，結(jié)果如圖12所示，可見細胞核呈綠色熒光的陽性表達，說明DPCC2-G1單克隆抗體可特異性識別細胞核內(nèi)的APE1蛋白。2.免疫細胞化學(xué)取對數(shù)期生長的HOS細胞接種于六孔板內(nèi)20mmx20mm蓋玻片上，每孔約lxl()S個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12h后取出有細胞貼壁的蓋玻片，用95%乙醇固定室溫20min,0.5%TritonX-10037。C打孔20min,山羊血清工作液37。C封閉30min,滴加DPCC2-G1單抗(1:100)4。C孵育過夜，以PBS替代一抗作為陰性對照，以美國Novus產(chǎn)品d、鼠抗人APE1(1:100)為陽性對照；以HRP標記的羊抗小鼠lgG為二抗(l:50)37。C孵育30min;PBS清洗后用二曱苯聯(lián)苯鞍(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，樹脂封片，結(jié)果如圖13所示，可見細胞核呈棕黃色陽性表達，說明DPCC2-G1單克隆抗體可特異性識別細胞核內(nèi)的APE1蛋白。3.免疫組織化學(xué)收集人前列腺癌、乳腺癌、肺腺癌和腎癌組織蠟塊標本，常規(guī)切片，5。/oH2O2浸泡10min，PBS漂洗后用胰酶4"C修復(fù)10min,再用枸櫞酸鈉緩沖液微波修復(fù)中火5min,低火3min,PBS漂洗后滴加DPCC2-G1單抗(1:500)4。C孵育過夜，以PBS替代一抗作為陰性對照；以HRP標記的羊抗小鼠IgG為二抗37。C孵育30min;PBS漂洗后用二曱苯聯(lián)苯鞍(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，樹脂封片。結(jié)果如圖14所示，可見肺瘤細胞核呈棕黃色強陽性表達，說明DPCC2-Gl單克隆抗體可特異性識別細胞核內(nèi)的hAPEl蛋白，可作為良好的檢測試劑。實施例8APE1多克隆抗體制備1.免疫動物以實施例2所得純化的hAPEl融合蛋白為抗原，釆用背部皮下及四肢多點注射免疫新西蘭大白兔。免疫程序基礎(chǔ)免疫前耳緣靜脈取血5ml分離血清作為陰性對照。每只用抗原500lug與等體積完全弗氏佐劑充分乳化后進行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐劑加強免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐劑第3次免疫。第3次免疫后7天，耳緣靜脈取血5ml分離血清，用間接ELISA檢測抗血清的效價。效價達1:64000時頸動脈插管收集全血，4。C放置過夜，4000rpm離心收集血清，-70。C保存。效價達不到要求可再加強免疫1次。2.特異性親和純化抗體將待純化的血清用上樣緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.1M檸檬酸三鈉，PH7.0)適當稀釋后加入到ProteinA柱中，用洗脫緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.1M梓檬酸鈉，PH3.0)洗脫柱子，收集單峰。收集的純化產(chǎn)物再經(jīng)抗原抗體特異性親和純化(詳見實施例3)，得到純化的hAPEl多克隆抗體。實施例9雙抗體夾心ELISA的建立1.雙抗體夾心ELISA的建立用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(PH9.6)稀釋單抗DPCC2-G1單克隆抗體包被酶標板，100|^1/孔，4°C過夜，用洗液(0.5%。PBST,pH7.4)洗3次；5。/。BSA封閉，200ju1/孔，37°C孵育2h后洗3次；加入APE1標準品(即實施例2所得純化的hAPEl融合蛋白)和待測血清樣本，100jal/孔，標準品做倍比稀釋。37°C孵育1h后洗3次；加入APE1多抗(即實施例8所得hAPEl多抗)，100jul/孔，37°C孵育lh后洗3次；再加入HRP標記的羊抗兔IgG,37°C孵育45min后用洗滌液(l%oPBST,pH7.4)洗6次；力口TMB底物，100nl/孑L,37°C顯色10min，以2mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標儀450nm處測吸光度值(OD柳)。2.ELISA最佳反應(yīng)條件的確定用棋盤滴定法確定各抗體的最佳工作濃度，將DPCC2-Gl單抗按1:2000、1:10000、1:50000稀釋3個濃度包被酶標板，陽性對照(0.5ug/mlhAPEl融合蛋白為標準品)和陰性對照(PBS)為樣品，多抗按1:2000、1:5000、1:IOOOO稀釋3個濃度，HRP標記羊抗兔IgG按試劑說明書推薦稀釋度，按上述實驗步驟操作，確定抗體的最佳工作濃度。然后將HRP標記羊抗兔IgG倍比稀釋，再次做棋盤滴定。取陽性對照OD45Q值在1.5左右，陰性對照OD45。值小于0.1的條件為最佳，初次結(jié)果不理想，可進一步縮小或擴大稀釋度以取得抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。結(jié)果在捕獲抗體稀釋度為1:40000、夾心抗體的稀釋度為1:5000和酶標記抗體稀釋度為1:5000條件下該ELISA一企測方法的信價比最高。實施例IOELISA方法的質(zhì)量評^f介1.標準曲線的繪制及靈敏度檢測將hAPEl融合蛋白做一系列的倍比稀釋，如1:500、1:1000、1:2000直到1:256000進行測定，以標準品濃度的常用對數(shù)為橫座標，OD450值為縱座標，繪制標準曲線，確定其線性檢測范圍及最小檢出濃28度。2.重復(fù)性檢測(1)批內(nèi)試驗對高、中、低三個濃度的標準品在同一批板子上分別進行10次平行檢測，測其OD4so值,計算變異系數(shù)CV值。CV(%)=s/xx酵/0。(2)批間試驗在3個不同批次的板子上檢測同一標準品，每次設(shè)8個重復(fù)孔，測其OD45。值，計算CV值。3.準確性;險測取3份健康體檢者血清，分另'J力。入0.2ug/ml、0.5ug/ml和1.0ug/ml的標準品進行;險測，計算4企測值與理i侖值的一致性，即回收率?；厥章?檢測值/理論值x100%。4.穩(wěn)定性檢測將包被好的板子分別放于4°C和37°C保存一周，檢測同一樣品，比較其OD45。值有無差別。結(jié)果標準曲線如圖15所示，在8.0200ng/ml范圍內(nèi)曲線線性良好，一大于0.99。本法的最低檢測濃度約為2.0ng/ml。重復(fù)性、準確性及穩(wěn)定性檢測結(jié)果中，批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.37%，8.97%,8.60%,均小于10%;批間變異系數(shù)分別為10.47%,11.25%，14.57%,均小于15%;回收率分別為78.56%,85.23%和107.35%;同一樣品，在4。C和37。C保存一周后，檢測其OD45o值差別不大，說明其重復(fù)性、準確性及穩(wěn)定性均較好，符合檢測試劑盒要求。實施例11ELISA^r測試劑盒的初步應(yīng)用采用所建立的ELISA對200例健康體纟全者、200例肺癌患者、127例鼻咽癌患者和70例結(jié)直腸癌患者血清樣本進行了^^測。對計量資料進行統(tǒng)計分析。結(jié)果如表2所示，顯示健康體4企者和肺癌患者、鼻咽癌患者及結(jié)直腸癌患者血清APE1含量分別為9.00(2.98，15.39)ng/ml，16.90(9.89,26.39)ng/ml，19.57(4.66，70.58)ng/ml和14.27(0.00,34.02)ng/ml,肺癌、鼻咽癌和結(jié)直腸癌患者血清hAPEl含量均明顯高于健康體檢者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。表2健康體檢者及不同腫瘤患者血清APE1蛋白含量的比較分組中位數(shù)P25P75Mann-WhitneyU檢驗P值健康體檢者9.002.9815.39肺癌16.909.8926.3912056.50.000a鼻咽癌19.574.6670.588244.00.000b結(jié)直腸癌14.270.0034.025589.00.012ea:肺癌患者與健康體^^者比較；b:鼻咽癌患者與健康體檢者比較；c:結(jié)直腸癌患者與健康體檢者比較。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110〉中國人民解;^丈軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院<120>抗hAPEl蛋白的抗體及其制備方法與應(yīng)用該抗體的試劑盒<130>MP090257<160>10<170>Patentlnversion3,3<210>1<211〉15<212>PRT<213>hAPEl蛋白76-90位<400>1lieLysLysLysGlyLeuAspTrpValLysGluGluAlaProAsp151015<210>2<211>15<212〉PRT<213〉hAPEl蛋白109-123位<400>2GinGluLeuProGlyLeuSerHisGinTyrTrpSerAlaProSer151015<210>3<211〉26<212>DNA<213>hAPEl基因的上游引物<400>3catgccatggctccgaagcgtgggaa26<210>4<211>57<212>DNA<213>hAPEl基因的下游引物<400>4gcggatcctcaatgatgatgatgatgatgatgatgatgatgcagtgctaggtatagg57<210>5<211>328<212>PRT<213>hAPEl融合蛋白<400>5MetProLysArgGlyLysLysGlyAlaValAlaGluAspGlyAspGlu151015LeuArgThrGluProGluAlaLysLysSerLysThrAlaAlaLysLys202530AsnAspLysGluAlaAlaGlyGluGlyProAlaLeuTyrGluAspPro354045ProAspGinLysThrSerProSerGlyLysProAlaThrLeuLyslie505560CysSerTrpAsnValAspGlyLeuArgAlaTrplieLysLysLysGly65707580LeuAspTrpValLysGluGluAlaProAsplieLeuCysLeuGinGlu85909532ThrLysCysSerGluAsnLysLeuProAlaGluLeuGinGluLeuPro100105110GlyLeuSerHisGinTyrTrpSerAlaProSerAspLysGluGlyTyr115120125SerGlyValGlyLeuLeuSerArgGinCysProLeuLysValSerTyr130135140GlylieGlyAspGluGluHisAspGinGluGlyArgVallieValAla145150155160GluPheAspSerPheValLeuValThrAlaTyrValProAsnAlaGly165170175ArgGlyLeuValArgLeuGluTyrArgGinArgTrpAspGluAlaPhe180185190ArgLysPheLeuLysGlyLeuAlaSerArgLysProLeuValLeuCys195200205GlyAspLeuAsnValAlaHisGluGlulieAspLeuArgAsnProLys210215220GlyAsnLysLysAsnAlaGlyPheThrProGinGluArgGinGlyPhe225230235240GlyGluLeuLeuGinAlaValProLeuAlaAspSerPheArgHisLeu245250255TyrProAsnThrProTyrAlaTyrThrPheTrpThrTyrMetMetAsn260265270AlaArgSerLysAsnValGlyTrpArgLeuAspTyrPheLeuLeuSer275280285HisSerLeuLeuProAlaLeuCysAspSerLyslieArgSerLysAla290295300LeuGlySerAspHisCysProlieThrLeuTyrLeuAlaLeuHisHis30531031532033HisHisHisHisHisHisHisHis325<210>6<211>26<212>DNA<213>NF-kB探針Pl<400>6agcttagaggggactttccgagagga26<210>7<211>26<212>DNA<213>NF-kB探針P2<400>7tcctctcggaaagtcccctctaagct26<210>8<211>42<212>DNA<213>AP4立點正義《連22-U<400>8ccgctgaattgcaccctcgauctaggtcgatgatcctaagca42<211>42<212>DNA<213〉A(chǔ)P位點反義鏈22-C<400>9Tgcttaggatcatcgacctaggtcgagggtgcaattcagcgg42<210>10<211〉186<212>PRT<213>Eppin-His蛋白<400>10GlySerGlySerGlyHisMetHisHisHisHisHisHisSerSerGly151015LeuValProArgGlySerGlyMetLysGluThrAlaAlaAlaLysPhe202530GluArgGinHisMetAspSerProAspLeuGlyThrAspAspAspAsp354045LysAlaMetAlaAsplieMetGlySerSerGlyLeuLeuSerLeuLeu50556065707580TrpLeuPheProArgArgCysProLyslieArgGluGluCysGluPhe859095GinGluArgAspValCysThrLysAspArgGinCysGinAspAsnLys100105110LysCysCysValPheSerCysGlyLysLysCysLeuAspLeuLysGin115120125AspValCysGluMetProLysGluThrGlyProCysLeuAlaTyrPhe130135140LeuHisTrpTrpTyrAspLysLysAspAsnThrCysSerMetPheVal145150155160TyrGlyGlyCysGinGlyAsnAsnAsnAsnPheGinSerLysAlaAsn165170175CysLeuAsnThrCysLysAsnLysArgPhe1801853權(quán)利要求1、一種抗體，其特征在于，與hAPE1蛋白76-90位和109-123位構(gòu)成的構(gòu)象型表位特異性結(jié)合，所述hAPE1蛋白的76-90位氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，109-123位氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、合成抗體、抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體及它們的化學(xué)修飾衍生物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體的亞型為IgG、IgE、IgM、IgD或IgA。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體為人源化抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體的親和常數(shù)為6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體由保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心、保藏編號為CCTCC:C200852的雜交瘤細胞林產(chǎn)生。7、一種雜交瘤，其特征在于，所述雜交瘤保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC:C200852。8、一種hAPEl融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列由SEQIDNo.5所示。9、根據(jù)權(quán)利要求l-6任一項所述抗體的制備方法，包含以下步驟將權(quán)利要求8所述hAPEl融合蛋白免疫動物，篩選出分泌與hAPEl特異性結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞注射動物腹腔，對產(chǎn)生的腹水分離純化獲得所述抗體。10、一種診斷組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求l-6任一項所述抗體，和可任選的免疫診斷方法中常規(guī)使用的合適試劑。11、一種包含權(quán)利要求l-6任一項所述抗體的ELISA試劑盒。12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的ELISA試劑盒，其特征在于，還包括權(quán)利要求8所述hAPEl融合蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了一種人脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶即hAPE1蛋白的抗體，該抗體特異性結(jié)合hAPE1蛋白76-90位和109-123位構(gòu)成的構(gòu)象型表位。本發(fā)明還提供一種所述抗體的制備方法及應(yīng)用該抗體的ELISA試劑盒。本發(fā)明所述抗體與hAPE1蛋白的構(gòu)象型表位特異性結(jié)合，可檢測正常和疾病狀態(tài)下hAPE1蛋白的表達，特異性好，親和常數(shù)Ka為1.8×10^-7，效價大于1∶10⁷，具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12N5/20GK101671394SQ200910135680公開日2010年3月17日申請日期2009年4月24日優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日發(fā)明者楠戴,曹曉靜,李夢俠,東王,胡川閩申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院