專利名稱：一種提高l-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法
一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酸制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn) 酸率的方法。
背景技術(shù)：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)中必須的八大氨基酸之 一，對人體和動(dòng)物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料和營 養(yǎng)保健等領(lǐng)域。近年來，隨著對L-苯丙氨酸生理功能了解和科學(xué)研究的不斷深入，L-苯丙 氨酸的應(yīng)用越來越廣泛，已成為一種國際市場上發(fā)展前景好，市場需求大的產(chǎn)品。
國內(nèi)外L-苯丙氨酸的生產(chǎn)方法主要有水解抽提法、化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法這 4種。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量較低，水解抽提法很少使用；化學(xué)合成法的工藝復(fù) 雜，成本較高，在國外基本上被酶法和發(fā)酵法取代。但由于底物和酶的價(jià)格較高且來源有 限，酶法應(yīng)用也受到限制；微生物直接發(fā)酵法可利用廉價(jià)且易得的原料又可在常溫常壓下 進(jìn)行，是目前生產(chǎn)L-苯丙氨酸的主流方法，具有較大的競爭優(yōu)勢。但是由于野生菌株體內(nèi) L-苯丙氨酸等終產(chǎn)物對芳香氨基酸合成代謝途徑上的關(guān)鍵酶有著強(qiáng)烈的反饋抑制作用，使 其細(xì)胞不能大量蓄積苯丙氨酸，因此若要進(jìn)行實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)，就必須改造野生菌株，解除其 代謝調(diào)控，使得代謝終產(chǎn)物能過量蓄積。 80年代中期，隨著載體和受體系統(tǒng)的構(gòu)建及基因重組等基因工程技術(shù)的發(fā)展，用 基因工程的方法通過對L-苯丙氨酸代謝途徑進(jìn)行調(diào)控來構(gòu)建L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株的研究 在國外開展廣泛，并取得不少成績，而國內(nèi)起步較晚。 基本原則為選擇不再受到反饋抑制的關(guān)鍵酶突變子，并破壞苯丙氨酸的酶系。主 要的方法有通過選育結(jié)構(gòu)抗類似物突變株以解除自身的反饋抑制；切斷由分支酸到預(yù)苯 酸、VK、CoQ等的支路代謝；通過減少支路代謝，解除Trp和Tyr對DS的反饋調(diào)節(jié)，增加分支 酸濃度的方法增加前體物；增加苯丙氨酸代謝流上aroF、pheA等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量以及 切斷苯丙氨酸進(jìn)一步代謝途徑等。 1985年，0zaki等把一株抗苯丙氨酸結(jié)構(gòu)類似物的生產(chǎn)菌株棒狀桿菌K38染色體 上的CM和PD基因克隆到質(zhì)粒pcE53中，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)回親株，苯丙氨酸的產(chǎn)量達(dá)到19g/ L，比親株提高50% ;1987年Robinson等從E. coliB菌株克隆了高效的轉(zhuǎn)氨基基因，將重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)回親株，其芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶活性為親株的10倍；1992年，Ikeda等從苯丙氨酸生 產(chǎn)菌株中克隆了脫敏的DS、 CM及PD酶基因，并將其串聯(lián)起來，克隆到同一個(gè)多拷貝的載體 上，轉(zhuǎn)移到苯丙氨酸生產(chǎn)菌株中，使之代謝流向產(chǎn)苯丙氨酸方向轉(zhuǎn)移，產(chǎn)酸達(dá)28g/L.
1986年陳琦等采用原生質(zhì)體融合的技術(shù)選育苯丙氨酸產(chǎn)生菌，以北京棒桿菌 AS1. 299為出發(fā)菌株，經(jīng)過突變篩選，得到具有不同抗性的兩個(gè)親株，進(jìn)行原生質(zhì)體融合后， 苯丙氨酸產(chǎn)量為0.6%，高于親株50%。但這種細(xì)胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺點(diǎn)是只有同種或 近緣關(guān)系的微生物之間才能進(jìn)行且成功率低。 1994年中國醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)中心的史燕東等將tyrB基因克隆質(zhì)粒導(dǎo)入不同的宿主菌，得到產(chǎn)酸量提高的菌株；1999年復(fù)旦大學(xué)范長勝等通過將關(guān)鍵酶基因aroG、 pheA 進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)來構(gòu)建苯丙氨酸生產(chǎn)菌株，較大幅度提高了工程菌苯丙氨酸的發(fā)酵產(chǎn)酸量， 但是都未能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平。 從以上國內(nèi)外對L-苯丙氨酸基因工程菌育種情況看出，國內(nèi)外從分子水平對
L-苯丙氨酸菌株育種大部分停留在構(gòu)建基因工程菌的水平，且產(chǎn)酸水平不夠理想，尚未看
到在構(gòu)建基因工程菌的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對構(gòu)建的表達(dá)載體采用定向改造技術(shù)進(jìn)行菌種改良。 高產(chǎn)L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建，除改變代謝流外還可通過關(guān)鍵酶基因的克
隆表達(dá)增加酶的表達(dá)量和提高菌株對產(chǎn)物的反饋抑制雙重手段來提高產(chǎn)酸率。 此外，構(gòu)建的重組表達(dá)載體質(zhì)粒是否具有遺傳穩(wěn)定性也是限制苯丙氨酸基因工程
菌產(chǎn)酸的重要因素。重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性主要是指重組菌在培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或者缺
失，使重組菌失去原有的表型特征。如果細(xì)胞含有的質(zhì)?？截悢?shù)過高，或帶有對宿主細(xì)胞有
毒副作用的基因，以及以高密度培養(yǎng)或者連續(xù)培養(yǎng)的方式培養(yǎng)工程菌時(shí)，質(zhì)粒的丟失率會(huì)
大大增加等。 質(zhì)粒載體含有的啟動(dòng)子類型、par功能區(qū)、分離機(jī)制、復(fù)制起始點(diǎn)和啟動(dòng)子的距離、 啟動(dòng)子的強(qiáng)度等序列信息都會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 體外定向改造是一種新的分子改造策略，通過人工模擬自然進(jìn)化機(jī)制來實(shí)現(xiàn)"在 試管中的進(jìn)化"。其具體方法是首先在體外改造基因來模擬自然進(jìn)化的隨機(jī)突變和同源重 組，并在人為創(chuàng)造的選擇壓力下，篩選出所需性質(zhì)的進(jìn)化分子。它不需事先了解酶分子的空 間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，簡而言之，定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+正向重組+選擇(或篩選)。這樣就 能在較短時(shí)間內(nèi)完成漫長的自然進(jìn)化過程，甚至可以在幾周或幾個(gè)月的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出優(yōu)化 的酶，而在天然的進(jìn)化過程中，得到這個(gè)結(jié)果需要幾千萬年之久。 但是定向改造作為模擬自然界分子進(jìn)化的一種方式，并不能總是確切的反映進(jìn)化 的真實(shí)過程。定向改造操作一般針對某一個(gè)酶進(jìn)行的。而我們知道在自然界中，某一表型 的決定往往是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果。而這些基因產(chǎn)物間往往互相影響，互相制衡，某個(gè) 基因的改變往往難以造成表型的變化。 針對上述缺點(diǎn)，本申請人在中國發(fā)明申請第200910111381. X號，名稱為一種體外
定向協(xié)同共進(jìn)化改造L-苯丙氨酸基因工程菌的方法的專利中提供了將一株L-苯丙氨酸基 因工程菌上的aroG和pheA基因串聯(lián)表達(dá)后當(dāng)做一個(gè)整體，采用易錯(cuò)PCR和DNA改組這兩 種技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行體外定向協(xié)同共進(jìn)化改造，篩選獲得一株L-苯丙氨酸產(chǎn)量提高 114%的突變菌株，雖然有在構(gòu)建基因工程菌的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對構(gòu)建的表達(dá)載體采用定向 改造技術(shù)進(jìn)行菌種改良而大幅度提高了L-苯丙氨酸工程菌的產(chǎn)酸量，但由于其需從表達(dá) 質(zhì)粒載體中提取出aroG和pheA基因再進(jìn)行改造，操作起來復(fù)雜麻煩。因此，需要一種更為 簡便的提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，采用絡(luò) 氨酸營養(yǎng)缺陷型菌為宿主菌，通過突變改造基因工程菌的表達(dá)質(zhì)粒，提高L-苯丙氨酸基因 工程菌重組表達(dá)質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)改造利于大規(guī)模發(fā)酵、易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的L-苯丙 氨酸基因工程菌產(chǎn)酸菌株的同時(shí)，使改造操作更為容易簡單。
—種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，主要是將構(gòu)建的L-苯丙氨酸基
因工程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒作為一個(gè)整體進(jìn)行定向突變；采用烷基化試劑EMS對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)
行突變的過程中，通過EMS與質(zhì)粒反應(yīng)時(shí)間的長短來控制突變率以獲得在相同突變條件下
的最佳突變時(shí)間，然后將經(jīng)EMS突變處理最佳突變時(shí)間后的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建菌
株突變庫；最后進(jìn)行穩(wěn)定高產(chǎn)突變菌株的篩選。 本發(fā)明具體包括以下幾個(gè)步驟 —、構(gòu)建L-苯丙氨酸基因工程菌突變庫 (l)EMS體外改造重組表達(dá)載體致死率的選擇以L-苯丙氨酸基因工程菌的表達(dá) 質(zhì)粒pbv-aroG-pheA作為突變對象，用烷基化試劑EMS對質(zhì)粒DNA進(jìn)行直接突變，取四支 1. 5ml EP管，分別加入1. 5 ii g純化表達(dá)質(zhì)粒，分別溶于400 y 1高純水，加入4 EMS混勻 后，于36。C溫浴0min、30min、60min、75min、90min，對突變條件進(jìn)行選擇，確定最佳突變時(shí) 間為60min ; (2)突變重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建菌株突變庫將經(jīng)EMS突變處理60min
后的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酪氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主菌構(gòu)建突變菌株庫； 二、從突變庫中篩選獲取高產(chǎn)穩(wěn)定的L-苯丙氨酸基因工程菌株 (1)抗高濃度對氟苯丙氨酸突變菌株的初步篩選將電轉(zhuǎn)復(fù)蘇的菌液，按照4%的
接種量分別接到含3mg/ml 、 4mg/ml 、 5mg/ml 、 6mg/ml 、 7mg/ml 、 8mg/ml對氟苯丙氨酸的LB/
Amp培養(yǎng)基中，37t:過夜振蕩培養(yǎng)； (2)高產(chǎn)穩(wěn)定突變菌株的高通量篩選復(fù)蘇的突變菌株在對氟苯丙氨酸濃度為 3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的LB/Amp培養(yǎng)基中生長，含8mg/ml對氟苯丙氨酸 的LB/Amp培養(yǎng)基菌未生長，而未突變質(zhì)粒的基因工程菌H9-26在對氟苯丙氨酸濃度為4mg/ ml的培養(yǎng)基就未見生長了，將7mg/ml對氟苯丙氨酸LB/Amp培養(yǎng)基中的突變菌株分離成單 菌落，分別挑取突變菌株至含150 iU LB/Amp培養(yǎng)基的96孔板中于37°C 、 150rpm條件下 培養(yǎng)48h，取突變菌株發(fā)酵上清液用鹽酸稀釋后，采用三波段測量法測定上清液中L-苯丙 氨酸的濃度，從近萬株突變株中篩選獲得4株L-苯丙氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)良突變菌 株； (3)優(yōu)良突變株質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將從平板中挑取獲得的4株優(yōu)良突變菌株單菌 落接入2ml LB/Amp培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)過夜，將種子20 yl接入LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)使 菌株在LB培養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖70代以上，取樣涂于LB平板上，次日，隨機(jī)挑取菌 落100個(gè)點(diǎn)在LB/Amp平板上，在平板上生長菌落的百分?jǐn)?shù)均超過未改造L-苯丙氨酸基因 工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的百分?jǐn)?shù)。 本發(fā)明主要將本室構(gòu)建的L-苯丙氨酸基因工程菌的表達(dá)質(zhì)粒作為整體，采用烷 基化試劑EMS對其進(jìn)行突變，通過EMS與質(zhì)粒反應(yīng)時(shí)間的長短得到不同的突變率，對突變條 件進(jìn)行選擇，確定最佳突變時(shí)間為60min，然后將經(jīng)EMS突變處理60min的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化 宿主菌構(gòu)建菌株突變庫，篩選獲得4株L-苯丙氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)良突變菌株。
在對L-苯丙氨酸基因工程菌進(jìn)行突變改造操作以提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量時(shí)，大腸 桿菌體內(nèi)L-苯丙氨酸的代謝復(fù)雜多樣，將參與代謝的酶進(jìn)行部分改造，不僅影響代謝效 果，且還需對酶進(jìn)行提取，操作復(fù)雜麻煩，因此，本發(fā)明在了解大腸桿菌苯丙氨酸代謝途徑 的基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的L-苯丙氨酸工程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒做為一個(gè)整體進(jìn)行體外定向改造。
5即是將L-苯丙氨酸基因工程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行隨機(jī)突變，突變庫中存在L-苯丙氨酸 代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶基因和不同程度突變的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)基因相互搭配，從而篩選獲得 具有更高遺傳穩(wěn)定性且能抵抗更高濃度的L-苯丙氨酸反饋抑制的基因工程菌。
通過質(zhì)粒體外定向突變手段，篩選獲取的優(yōu)良菌株MD-8654質(zhì)?；蛐蛄杏?個(gè) 位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，并引起6個(gè)氨基酸發(fā)生改變。其L-苯丙氨酸產(chǎn)率由0. 23g/100ml提 高到0. 75g/100ml，且質(zhì)粒穩(wěn)定性由60%提高到95% ，對氟苯丙氨酸濃度由3mg/ml提高到 7mg/ml。從而找到穩(wěn)定高產(chǎn)的新苯丙氨酸基因工程菌。該技術(shù)的應(yīng)用加速了關(guān)鍵酶基因的 進(jìn)化速度，提高工程菌質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性，加快了篩選的時(shí)間，降低篩選成本。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，主要包括以下幾個(gè)步驟
步驟一 L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建，具體包括以下構(gòu)建步驟
1、酪氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的構(gòu)建 將野生型E. coil K12經(jīng)UV和NTG復(fù)合突變處理，用抗生素淘汰野生型菌株，富集
營養(yǎng)缺陷型菌株；用點(diǎn)植對照法獲取營養(yǎng)缺陷型菌株，最后進(jìn)行營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定，篩
選獲取酪氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主菌。 2、堿裂解法提取E. coil K12基因組DNA 3、關(guān)鍵酶aroG和pheA基因的獲得 以基因組DNA為模板，分別采用設(shè)計(jì)的aroG和pheA基因上下游引物，進(jìn)行目的基 因的PCR擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為:95。C預(yù)變性4min，94。C變性lmin，56. 5。C退火lmin，72。C延伸 lmin，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。混勻后取5 y 1產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)， 其余-2(TC保存?zhèn)溆?。切下特異性擴(kuò)增條帶，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按說明回收擴(kuò) 增的基因片斷。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件估算核酸濃度。
4、重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA的構(gòu)建 將擴(kuò)增的關(guān)鍵酶基因aroG和pMD-18T、 pheA和pMD-18T質(zhì)粒分別用EcoR I/Kpn
I、 Kpn I/BamH I進(jìn)行雙酶切，待酶切完全后取50 yl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢
測，并用瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收所需要aroG/pMD-18T、 pheA/pMD-18T基因片
段，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA。 5、關(guān)鍵酶基因的連接產(chǎn)物pMD-aroG和pMD-pheA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 分別取新鮮制備的100 iil感受態(tài)細(xì)胞和lOiU連接產(chǎn)物于1.5mlEP管中，混
勻，冰浴30min，42。C熱激90s，再冰浴2-10min。加入890ii 1 37。C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，
37°C 200rpm振蕩lh，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含7 y 1 IPIG(20%)和40 y lx-gal (2mg/y 1)的LB/
Amp平板上，于37t:培養(yǎng)16h，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，分別挑取數(shù)個(gè)白斑單菌落于2ml含100 y g/ml
Amp的LB培養(yǎng)基中，于37t:震蕩培養(yǎng)過夜。 6、陽性克隆子的鑒定及基因的測序分析 (1)重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA的快速制備 用堿裂解法提取保存于E. col i JM109中的含關(guān)鍵酶基因的pMD-aroG和 pMD-pheA。 (2)重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA的酶切驗(yàn)證
將提取出來的重組質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA分別進(jìn)行EcoR I/Kpn I及Kpn 1/ BamH I的雙酶切驗(yàn)證，酶切完全后，取10 y 1酶切產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn) 目的基因條帶即可判定所挑的菌落為陽性克隆子。
(3)關(guān)鍵酶aroG和pheA基因序列的測定 將篩選出來的陽性克隆子pMD-aroG和pMD-pheA送生工，進(jìn)行序列分析。
7、關(guān)鍵酶基因串聯(lián)重組子pMD-aroG-pheA的構(gòu)建 [OO48] (1)目的基因的酶切、連接 將鑒定的陽性克隆質(zhì)粒pMD-aroG和pMD-pheA分別用Kpn I和BamH I進(jìn)行雙酶 切，酶切完全后將分別將50 酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖電泳 PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收所需要pMD-aroG和pheA目的基因片段，用T4DNA連接酶連接，構(gòu) 建表達(dá)質(zhì)粒pMD-aroG-pheA。
(2)重組質(zhì)粒pMD-aroG-pheA的轉(zhuǎn)化 取新鮮制備的100 ill感受態(tài)細(xì)胞和lOiU連接產(chǎn)物于1. 5mlEP管中，混勻，冰浴 30min，42。C熱激90s，再冰浴2-10min。加入890 ii 1 37。C預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37°C 200rpm振 蕩lh，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含7iU IPIG(20%)和40iU x-gal (2mg/yl)的LB/Amp平板上，于 37t:培養(yǎng)16h，分別挑取數(shù)個(gè)白斑單菌落于2ml含100 y g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，于37°C 震蕩培養(yǎng)過夜。 (3)重組菌陽性克隆子的快速篩選及酶切驗(yàn)證 隨機(jī)挑取20個(gè)單菌落，37t:搖床培養(yǎng)過夜；分別取1ml菌液到EP管中，12000rpm， 離心去上清，收集菌體；加入20iU (1朋20、20111酚氯仿異戊醇(24 : 25 : l)和4iU 6X lddding buffer,還有少量的Rnase酶，混勻后，劇烈震蕩2min ;震蕩后，12000rpm，離心 2min，取上清進(jìn)行l(wèi)^瓊脂糖凝膠電泳檢測。出現(xiàn)目的條帶即可初步判定所挑的菌落為陽性 克隆子，再提取陽性重組菌的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和BamH I雙酶切驗(yàn)證。
8、關(guān)鍵酶基因串聯(lián)表達(dá)重組子pBV-aroG-pheA的構(gòu)建
(1)大腸桿菌培養(yǎng)及質(zhì)粒DNA的提取。 分別取含質(zhì)粒pMD-aroG-pheA和質(zhì)粒pBV220的大腸桿菌單菌落，于含100 ii g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C 220rpm過夜培養(yǎng)，利用堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA。
(2)目的基因的酶切、連接 將鑒定的陽性克隆質(zhì)粒pMD-aroG-pheA和質(zhì)粒pBV220分別用EcoR I和BamH I 進(jìn)行雙酶切，酶切完全后將50 iU酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用瓊脂糖電泳 PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收所需要-aroG-pheA-和pBV220目的基因片段，用T4DNA連接酶連 接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBV-aroG-pheA。 [OO59] (3)重組質(zhì)粒pBV-aroG-pheA的轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化監(jiān)氨酸缺陷型E. coil K12感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含Amp的LB平 板上，于37t:過夜培養(yǎng)。 (4)重組菌陽性克隆子的快速篩選及酶切驗(yàn)證 隨機(jī)挑取平板上20個(gè)陽性克隆子，37t:搖床培 過夜后，利用質(zhì)?？焖俪樘岱ㄌ?取質(zhì)粒DNA，電泳檢測后，出現(xiàn)目的條帶即可初步判定所挑的菌落為陽性克隆子，再提取陽 性重組菌的質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和BamH I雙酶切驗(yàn)證。
(5)質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 從平板中挑取一單菌落，接入2ml含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)過夜，將 種子20 1接入不含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，35。C培養(yǎng)使菌株在熱誘導(dǎo)前在無Amp的培 養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖50代以上，最后一次，細(xì)菌在生長到0D6。。 = 0. 3時(shí)，轉(zhuǎn)入37tH秀 導(dǎo)，取樣涂于不含Amp的LB平板上，次日，隨機(jī)挑取菌落100個(gè)點(diǎn)含Amp的平板上，在含Amp 平板上生長菌落的百分?jǐn)?shù)為60%，證明基因工程菌穩(wěn)定性有待提高。
9 、重組質(zhì)粒pBV-aroG-pheA的表達(dá)研究 挑取構(gòu)建的L-苯丙氨酸基因工程菌單克隆，至lml LB/Amp培養(yǎng)基中，37t:、 220rpm振蕩培養(yǎng)48h， 3000rpm/min離心，取發(fā)酵液上清用鹽酸稀釋后，采用酶標(biāo)儀三波段 測量法測定上清液中L-苯丙氨酸的產(chǎn)酸水平。 以上完成了酪氨酸營養(yǎng)缺陷型L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建，將該工程菌作為 以下定向改造的出發(fā)菌株。
步驟二 構(gòu)建L-苯丙氨酸基因工程菌突變庫，具體包括以下構(gòu)建步驟
1、 L-苯丙氨酸基因工程菌的培養(yǎng) 在平板上挑取L-苯丙氨酸基因工程菌單菌落至含有Amp的3ml LB的試管中，37t: 過夜培養(yǎng)。 2、堿裂解法提取重組質(zhì)粒 (3)EMS體外改造重組表達(dá)載體致死率的選擇 EMS是常用的烷基化化學(xué)突變劑，它是親電子的化合物，很容易與生物中大分子的 親核位點(diǎn)起反應(yīng)。烷基化試劑可使DNA發(fā)生各種類型的損傷鹼基烷基化、鹼基脫落、斷鏈 等。在構(gòu)成DNA的四種堿基中，鳥嘌呤和腺嘌呤最容易受到其攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對 會(huì)發(fā)生變化，造成序列的改變。 在試驗(yàn)中，以L-苯丙氨酸基因工程菌的表達(dá)質(zhì)粒pBV-aroG-pheA作為突變對象， 用烷基化試劑EMS對質(zhì)粒DNA進(jìn)行直接突變。 該質(zhì)粒上存在氨芐霉素抗性基因及復(fù)制起始點(diǎn)，如果突變位點(diǎn)發(fā)生在這兩段基因 的關(guān)鍵位點(diǎn)，會(huì)引起致死突變。突發(fā)發(fā)生在質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的其他區(qū)域會(huì)引起質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性的 改變。當(dāng)含有致死突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞時(shí)，在抗生素選擇壓力下就相應(yīng)地表現(xiàn)為致 死率。EMS與質(zhì)粒反應(yīng)的時(shí)間越長，突變率越高，相應(yīng)的致死率越高、存活率就越低。因此，在 試驗(yàn)中我們將存活率作為判斷突變頻率的指標(biāo)(當(dāng)存活率為1%左右時(shí)，相應(yīng)的突變率大 約為5個(gè)突變/kb)，取四支1. 5ml EP管，分別加入1. 5 ii g純化表達(dá)質(zhì)粒，分別溶于400 y 1 高純水，加入4ii 1 EMS混勻后，于36。C溫浴0min、30min、60min、75min、90min。對突變條件 進(jìn)行選擇，確定最佳突變時(shí)間為60min。 (4)突變重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建菌株突變庫 將EMS突變處理60min的表達(dá)載體質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酪氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主菌構(gòu)建突變 菌株庫。 步驟三從突變庫中篩選獲取高產(chǎn)穩(wěn)定的L-苯丙氨酸基因工程菌株
1、抗高濃度對氟苯丙氨酸突變株的初步篩選 將電轉(zhuǎn)復(fù)蘇的菌液，按照4%的接種量分別接到含3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ ml、7mg/ml、8mg/ml對氟苯丙氨酸的LB/Amp培養(yǎng)基中，37。C過夜振蕩培養(yǎng)。
2、穩(wěn)定高產(chǎn)突變株的高通量篩選 復(fù)蘇的突變株在對氟苯丙氨酸濃度為3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的 LB/Amp培養(yǎng)基中生長，含8mg/ml對氟苯丙氨酸的LB/Amp培養(yǎng)基菌未生長。而未突變質(zhì)粒 得宿主菌，在對氟苯丙氨酸濃度為4mg/ml的培養(yǎng)基就未見生長了。將7mg/ml對氟苯丙氨 酸的LB/Amp培養(yǎng)基中的突變株均勻分離單菌落。分別挑取突變菌株至含150iU LB/Amp 培養(yǎng)基的96孔板中37°C、150rpm培養(yǎng)48h。取突變菌株發(fā)酵液上清用鹽酸稀釋后，采用三 波段測量法，測定上清液中L-苯丙氨酸的濃度，從1萬多株突變株中篩選獲取4株L-苯丙 氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)良突變株MD-3482、MD-4675、MD-8654、MD-9865。產(chǎn)酸分別為 0. 65mg/100ml、0. 70mg/100ml、0. 75mg/100ml、0. 68mg/100ml，未改造L_苯丙氨酸基因工程 菌H9-26產(chǎn)酸為0. 23mg/100ml 。
(3)優(yōu)良突變株質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 從平板中挑取優(yōu)良突變株單菌落MD-3482、 MD_4675、 MD_8654、 MD-9865，接入2ml 含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜，將種子20 接入不合LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 使菌株在Amp的培養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖70代以上，取樣涂于LB平板上，次日，隨機(jī)挑 取菌落100個(gè)點(diǎn)含氨芐霉素的平板上，在Amp平板上生長菌落的百分?jǐn)?shù)為70X、55X、95X、 47% ，證明基因工程菌有較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性，未改造L-苯丙氨酸基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性為 60%。 (4)優(yōu)良突變株MD-8654基因序列的分析 堿裂解法提取優(yōu)良突變株MD-8654的質(zhì)粒DNA，測定基因序列。 測序結(jié)果表明通過定向改造L-苯丙氨酸基因工程菌重組表達(dá)載體篩選獲得的優(yōu)
良L-苯丙氨酸基因工程菌的質(zhì)?；蚬?個(gè)堿基位點(diǎn)產(chǎn)生突變，其中在表達(dá)載體結(jié)構(gòu)基因
發(fā)生3個(gè)堿基的突變，引起了 2個(gè)氨基酸的突變，L-苯丙氨酸代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶基因
aroG、 pheA操縱子上發(fā)生共發(fā)生5個(gè)堿基的突變引起了 4個(gè)氨基酸的突變。 將上述經(jīng)過改造后的基因工程菌突變株MD-9865應(yīng)用于擴(kuò)大生產(chǎn)，在50M3發(fā)酵罐
中平均產(chǎn)L-苯丙氨酸水平達(dá)7. lg/100ml，且生產(chǎn)性能穩(wěn)定。 本發(fā)明主要將本室構(gòu)建苯丙氨酸基因工程菌的表達(dá)載體采用化學(xué)藥品EMS進(jìn)行 體外定向改造，提高L-苯丙氨酸基因工程菌重組表達(dá)質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)使之表達(dá) 的酶既有高效的催化活性又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制，從而篩選獲得一株穩(wěn)定高產(chǎn) 的L-苯丙氨酸基因工程菌MD-8654,發(fā)酵罐產(chǎn)酸水平比未改造的基因工程菌H9-26提高 226%。 對重組表達(dá)質(zhì)粒的定向改造，通過改變某些氨基酸殘基的性質(zhì)，得到比原始序列 具有優(yōu)化性質(zhì)的蛋白或者更加穩(wěn)定的基因結(jié)構(gòu)，這種方法在制藥和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有廣闊的 應(yīng)用前景。如改變重組載體的遺傳穩(wěn)定性、酶的Km值，改變酶與底物結(jié)合的能力；改變酶的 最適pH值、耐熱性、溶解性等；增加酶的特異性，減少副反應(yīng)；解除別構(gòu)效應(yīng)引起底物對酶
的反饋抑制等以增加產(chǎn)量。 為了構(gòu)建穩(wěn)定高產(chǎn)的L-苯丙氨酸基因工程菌，解除產(chǎn)物L(fēng)-苯丙氨酸對其代謝途 徑關(guān)鍵酶的反饋抑制，使代謝流充分流向L-苯丙氨酸產(chǎn)生的方向，我們將L-苯丙氨酸工 程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒做為一個(gè)整體進(jìn)行體外定向改造。在對L-苯丙氨酸基因工程菌進(jìn)行 定向改造操作以提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量時(shí)，大腸桿菌體內(nèi)L-苯丙氨酸的代謝有多種酶共同參與，如果單獨(dú)的對某一個(gè)酶進(jìn)行改造，都很難破壞已經(jīng)穩(wěn)固建立的代謝平衡和酶分子間 的協(xié)調(diào)。唯一的方法是將參與這一代謝途徑的所有酶或者是代謝途徑上的關(guān)鍵酶都進(jìn)行改 造，從而實(shí)現(xiàn)提高L-苯丙氨酸產(chǎn)量的目標(biāo)。 本發(fā)明將L-苯丙氨酸基因工程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行隨機(jī)突變，突變庫中存在 L-苯丙氨酸代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶基因和表達(dá)載體結(jié)構(gòu)基因不同程度改變的不同搭配，從 而找到新的具有抗反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的代謝平衡，篩選獲得具有更高遺傳穩(wěn)定性的重組質(zhì)粒， 且L-苯丙氨酸關(guān)鍵酶基因取得更高的催化活性同時(shí)又能抵抗L-苯丙氨酸反饋抑制的基因 工程菌，且整個(gè)突變改造操作較從表達(dá)質(zhì)粒載體中提取關(guān)鍵酶基因aroG、 pheA后再將其改 造要容易簡單。
權(quán)利要求
一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于將構(gòu)建的L-苯丙氨酸基因工程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒作為一個(gè)整體進(jìn)行定向突變；采用烷基化試劑EMS對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行突變的過程中，通過EMS與質(zhì)粒反應(yīng)時(shí)間的長短來控制突變率以獲得在相同突變條件下的最佳突變時(shí)間，然后將經(jīng)EMS突變處理最佳突變時(shí)間后的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建菌株突變庫；最后進(jìn)行穩(wěn)定高產(chǎn)突變菌株的篩選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于 具體包括以下幾個(gè)步驟一、 構(gòu)建L-苯丙氨酸基因工程菌突變庫(1) EMS體外改造重組表達(dá)載體致死率的選擇以L-苯丙氨酸基因工程菌的表達(dá)質(zhì)粒 pbv-aroG-pheA作為突變對象，用烷基化試劑EMS對質(zhì)粒DNA進(jìn)行直接突變，取四支1. 5ml EP管，分別加入1.5iig純化表達(dá)質(zhì)粒，分別溶于400ii1高純水，加入4iU EMS混勻后， 于36。C溫浴0min、30min、60min、75min、90min，對突變條件進(jìn)行選擇，確定最佳突變時(shí)間為 60min ;(2) 突變重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建菌株突變庫將經(jīng)EMS突變處理60min后的 表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酪氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主菌構(gòu)建突變菌株庫；二、 從突變庫中篩選獲取高產(chǎn)穩(wěn)定的L-苯丙氨酸基因工程菌株(1) 抗高濃度對氟苯丙氨酸突變菌株的初步篩選將電轉(zhuǎn)復(fù)蘇的菌液，按照4%的接種 量分別接到含3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml對氟苯丙氨酸的LB/Amp培 養(yǎng)基中，37t:過夜振蕩培養(yǎng)；(2) 高產(chǎn)穩(wěn)定突變菌株的高通量篩選復(fù)蘇的突變菌株在對氟苯丙氨酸濃度為3mg/ ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml的LB/Amp培養(yǎng)基中生長，含8mg/ml對氟苯丙氨酸的 LB/Amp培養(yǎng)基菌未生長，而未突變質(zhì)粒的基因工程菌H9-26在對氟苯丙氨酸濃度為4mg/ml 的培養(yǎng)基就未見生長了，將7mg/ml對氟苯丙氨酸LB/Amp培養(yǎng)基中的突變菌株分離成單菌 落，分別挑取突變菌株至含150 ii 1 LB/Amp培養(yǎng)基的96孔板中于37°C 、 150rpm條件下培養(yǎng) 48h，取突變菌株發(fā)酵上清液用鹽酸稀釋后，采用三波段測量法測定上清液中L-苯丙氨酸 的濃度，從近萬株突變株中篩選獲得4株L-苯丙氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)良突變菌株；(3) 優(yōu)良突變株質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將從平板中挑取獲得的4株優(yōu)良突變菌株單菌落接 入2ml LB/Amp培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)過夜，將種子20 yl接入LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)使菌株 在LB培養(yǎng)基中連續(xù)生長48h，繁殖70代以上，取樣涂于LB平板上，次日，隨機(jī)挑取菌落100 個(gè)點(diǎn)在LB/Amp平板上，在平板上生長菌落的百分?jǐn)?shù)均超過未改造L-苯丙氨酸基因工程菌 質(zhì)粒穩(wěn)定性的百分?jǐn)?shù)。
全文摘要
本發(fā)明一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，將本室構(gòu)建的L-苯丙氨酸基因工程菌的重組表達(dá)質(zhì)粒作為一個(gè)整體進(jìn)行定向突變；采用烷基化試劑EMS對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行突變的過程中，通過EMS與質(zhì)粒反應(yīng)時(shí)間的長短來控制突變率以獲得在相同突變條件下的最佳突變時(shí)間，然后將經(jīng)EMS突變處理最佳突變時(shí)間后的表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主菌構(gòu)建菌株突變庫；篩選獲得4株L-苯丙氨酸產(chǎn)量不同程度提高的優(yōu)良突變菌株。本發(fā)明在實(shí)現(xiàn)改造利于大規(guī)模發(fā)酵、易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸菌株的同時(shí)使改造操作更為容易簡單。
文檔編號C12P13/00GK101717769SQ200910112929
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日 公開號200910112929.發(fā)明者劉建明, 葉玲敏, 吳偉斌, 吳松剛, 左祖楨, 施巧琴, 翁雪清, 蔡愛金, 趙燕玉, 鄭斌, 黃祥峰, 黃欽耿 申請人:福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司