專利名稱：一種超氧化物歧化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從梅花鹿肝臟細(xì)胞中克隆的Cu/Zn-SOD的編碼序列。實(shí)施方式之一，本發(fā)明提取梅花鹿肝臟細(xì)胞的基因組DNA，通過基因組文庫(kù)構(gòu)建好活性篩選的方法克隆到編碼Cu/Zn-SOD的全長(zhǎng)序列。實(shí)施方式之一中，所述編碼序列包含如SEQ NO.1所示的核酸序列，稱之為Cu/Zn-SOD。實(shí)施方式之一中，所述編碼序列是SEQ NO.1中的核苷酸1至456所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及包含所述Cu/Zn-SOD編碼序列的重組載體，例如由各種本領(lǐng)域常用的表達(dá)載體制備的重組載體，其中，所述編碼序列不包含其來源微生物的內(nèi)源性信號(hào)肽序列。實(shí)施方式之一中，將不帶內(nèi)源性信號(hào)肽編碼序列的本發(fā)明Cu/Zn-SOD編碼序列經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后與EcoRI和NotI雙酶切的pET21a(+)載體連接，得到大腸重組表達(dá)載pET21a(+)-SOD。另一實(shí)施方式中，將不帶內(nèi)源性信號(hào)肽編碼序列的本發(fā)明Cu/Zn-SOD編碼序列經(jīng)XhoI和NotI雙酶切后與XhoI和NotI雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體pPIC9k-SOD。
本發(fā)明還制備包含本發(fā)明Cu/Zn-SOD編碼序列的細(xì)胞。實(shí)施方式之一中，所述細(xì)胞是用上述本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。所述細(xì)胞優(yōu)選各種利于基因產(chǎn)物表達(dá)或發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞，此類細(xì)胞已為本領(lǐng)域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方式之一中，選用大腸桿菌Rosetta2(DE3)和的畢氏酵母GS115構(gòu)建表達(dá)Cu/Zn-SOD的重組細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了表達(dá)Cu/Zn-SOD的方法，包括培養(yǎng)前文所述本發(fā)明包含Cu/Zn-SOD編碼序列的細(xì)胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物，還可以可行性地包括純化表達(dá)產(chǎn)物的步驟。實(shí)施方式之一中，本發(fā)明通過包含本發(fā)明Cu/Zn-SOD編碼序列的酵母(例如畢氏酵母GS115)發(fā)酵來生產(chǎn)Cu/Zn-SOD，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
SEQ NO.1為本發(fā)明的氧化物歧化酶的核苷酸序列； SEQ NO.2為本發(fā)明的氧化物歧化酶的氨基酸序列； SEQ NO.3為其他來源SOD的氨基酸序列； SEQ NO.4為其他來源SOD的氨基酸序列； 本發(fā)明利用基因工程手段制備了能夠高效表達(dá)并分泌Cu/Zn-SOD的重組生產(chǎn)株，實(shí)現(xiàn)了Cu/Zn-SOD的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，并獲得了優(yōu)質(zhì)的Cu/Zn-SOD產(chǎn)品。本發(fā)明通過酶學(xué)性質(zhì)鑒定進(jìn)行了酶的最適作用溫度、最適作用pH值、pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性及比活力等理化性質(zhì)的分析，證明本發(fā)明的Cu/Zn-SOD具有很好的pH穩(wěn)定性，良好的熱穩(wěn)定性以及抗蛋白酶水解能力。



圖1來源于梅花鹿肝臟細(xì)胞的SOD的核苷酸序列和氨基酸序列。
圖2梅花鹿肝臟來源SOD與其他來源SOD(序列表中SEQ NO.3，SEQ NO.4)氨基酸序列的比較。
圖3梅花鹿肝臟來源SOD在質(zhì)粒pGEM-T Easy、pET21a(+)和pPIC9k上的重組子結(jié)構(gòu)圖。
圖4畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD的最適反應(yīng)溫度。
圖5畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD的最適反應(yīng)pH。
圖6畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD的熱穩(wěn)定性。
圖7畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD的pH穩(wěn)定性。
圖8畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD的發(fā)酵過程中的酶活力。
圖9畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD發(fā)酵過程中樣品的SDS-PAGE。
圖10畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD的分子量。
圖11畢氏酵母表達(dá)梅花鹿肝臟來源SOD對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

具體實(shí)施例方式 以下根據(jù)具體的實(shí)施例充分說明本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 1.菌株和載體 大腸桿菌Rosetta2(DE3)、JM109、DH5α、XL1-Blue及表達(dá)載體pET21a(+)、

購(gòu)自Novagen公司，

Easy Vector systems購(gòu)自promega公司，畢氏酵母GS115及表達(dá)載體pPIC9k均購(gòu)自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)。
2.酶類及其他生化試劑 限制性內(nèi)切酶、DNAMaker、蛋白質(zhì)Maker均購(gòu)自Fermentas(MBI)，SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他常規(guī)試劑為上海生工或進(jìn)口。
3.培養(yǎng)基 使用的培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培養(yǎng)基均參照Invitrogen畢氏酵母操作手冊(cè)。
4.本發(fā)明中所用到的生物化學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中，除非特殊說明，所有實(shí)驗(yàn)操作均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分進(jìn)行，包括[美]J.莎姆布魯克等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南；趙永芳等，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)；朱檢等，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]。
5.本發(fā)明中所有相關(guān)的酶活、酶活力、酶活性均是指SOD酶活性，均采用SOD檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，并按照其說明書中所述的方法進(jìn)行測(cè)定及計(jì)算。
實(shí)施例1Cu/Zn-SOD基因的獲得 (1)總RNA的分離提取 取梅花鹿肝臟小片，用液氮凍結(jié)后在研缽中粉碎，取約100mg粉末于1.5ml離心管中，加入1mL TRIzol溶液(

Reagent，InvitrogenTM Cat No.15596-026)，并按說明書方法操作提取總RNA。
取1uL稀釋100倍并進(jìn)行定量檢測(cè)，取必要的量用于反轉(zhuǎn)錄(RT)，剩余的量加入三倍體積的乙醇混合，于-80℃貯存。
(2)cDNA第一鏈的合成 RT-PCR是先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR擴(kuò)增。cDNA是指以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA(complementary DNA，簡(jiǎn)稱cDNA)。cDNA第一鏈的合成有兩個(gè)關(guān)鍵因素，一是模板mRNA，二是反轉(zhuǎn)錄酶。本cDNA第一鏈的合成應(yīng)用申能博彩逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按其說明進(jìn)行操作。
(3)PCR獲取目的基因 根據(jù)NCBI發(fā)表的馬鹿SOD序列設(shè)計(jì)上、下游引物P1和P2。上、下游引物分別含有EcoRI和Not I酶切位點(diǎn)，由上海生工合成，引物序列如下 P15’-GAATTCGCGACGAAGGCCGTCTG-3’ P25’-GCGGCCGCTTACTGGGCAATTCCAATTACACC-3’ 本研究PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循環(huán)擴(kuò)增30次；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并回收凝膠中的目標(biāo)基因。
(4)cDNA亞克隆 制備好的雙鏈cDNA插入到載體系統(tǒng)

Easy上，得到重組質(zhì)粒

Easy-SOD(如圖3所示)，用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化受體菌XL1-Blue，在含有100mg/ml Amp和0.5％X-gal的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜。挑取藍(lán)色的單克隆(藍(lán)白斑篩選)菌落接種到2ml含有100mg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)3-6h，10000rpm離心10min收集菌體，提取質(zhì)粒，酶切回收目的基因備用(質(zhì)粒提取和膠回收分別用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit試劑盒)。將所得目的基因進(jìn)行DNA序列測(cè)定(Invitrogen公司)，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果分別如圖1和圖2所示。
由此所得到的SOD的編碼序列共有456bp(圖1，SEQ ID NO1)，其中第454-456位為終止密碼子TAA、第1-453位編碼不含信號(hào)肽的成熟蛋白(圖2)，該成熟蛋白含有151個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)。根據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里同源性比對(duì)的結(jié)果初步確定所得到的SOD為Cu/Zn-SOD。
實(shí)施例2Cu/Zn-SOD編碼基因在大腸桿菌中的表達(dá)和擴(kuò)增 將實(shí)施例1-(4)中所得到的目的基因，與經(jīng)過到EcoR I和NotI雙酶切的pET21a(+)質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒pET21a(+)-SOD(如圖3所示)。
取10ul構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，加入到100ul制備好的感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌Rosetta2(DE3)和JM109)中，搖勻置于冰上，冰浴30min；置于42℃水浴中熱擊90s；將離心管快速移至冰水混合物中冰浴2min；每管加入400ul SOC培養(yǎng)基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器輕吸打散后于37℃搖床上復(fù)蘇1h(80rpm～200rpm)；離心，4000rpm×5min，除去400ul上清，剩余部分混勻；涂平板(LB-agar平板，含100ug/ml Amp)，37℃正置1h后，倒置培養(yǎng)過夜，在抗性平板上生長(zhǎng)的為含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆子。
取重組大腸桿菌菌株Rosetta2(DE3)，接種于50ml LB培養(yǎng)液中(250ml三角瓶，含100ug/ml Amp)，37℃250rpm振蕩培養(yǎng)1-1.5h，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度為2umol/ml)，37℃250rpm再振蕩培養(yǎng)3-3.5h。取培養(yǎng)液10000rpm離心10min，收集菌體，再加入等體積的無菌水重新懸浮菌體，12000rpm離心10min，取沉淀用1/5體積pH6.0，50mM的PBS懸浮菌體，進(jìn)行超聲波破碎，破碎條件為60％功率，間隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm離心，收集上清液分析SOD活力，并通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)量，結(jié)果表明SOD的編碼基因所編碼的SOD可在大腸桿菌中表達(dá)，且有一定的SOD活性，測(cè)得酶活力為2050U/ml。
取重組大腸桿菌菌株JM109，接種于50ml LB培養(yǎng)液中(250ml三角瓶，含100ug/ml Amp)，37℃250rpm振蕩培養(yǎng)2-2.5h，取培養(yǎng)液10000rpm離心10min，收集菌體，提取質(zhì)粒，酶切回收目的基因備用(質(zhì)粒提取和膠回收分別用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit試劑盒)。
實(shí)施例3酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將實(shí)施例2中所得到的目的基因，與經(jīng)過到EcoR I和NotI雙酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-SOD(如圖3所示)。
以所得pPIC9k重組質(zhì)粒為模板，以引物P1和引物P2構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行PCR，同時(shí)，以實(shí)施例2制備的pET21a(+)重組質(zhì)粒與引物P1和引物P2所構(gòu)成的引物對(duì)做PCR，從DNA水平上驗(yàn)證外源基因插入是否正確。PCR所得到的2種產(chǎn)物序列長(zhǎng)度均為456bp，與實(shí)施例1中從梅花鹿肝臟細(xì)胞中所得到的SOD原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位點(diǎn)、方向和序列正確。
實(shí)施例4畢氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)重組SOD 將實(shí)施例3 制備的重組質(zhì)粒pPIC9k-SOD經(jīng)SacI或者BglII酶切，得到線性化質(zhì)粒pPIC9k-SOD1。
取構(gòu)建好的線性重組質(zhì)粒DNA 50ug，直接加入到仍在零度以下的感受態(tài)細(xì)胞中(畢氏酵母GS115)；加入1.0ml含5ug/ml的鮭魚精DNA的溶液II(40％(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N，N-二羥乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5ul 1mg/ml的鮭魚精DNA并盡量的將兩者完全混勻；30℃水浴保溫1h以上，每隔15min輕輕的混勻一次；42℃保溫10min；室溫3000×g離心5min，棄去上清，用1.0ml的溶液III(0.15M NaCl，10mM N，N-二羥乙基甘氨酸，pH8.35)重新懸浮菌體；室溫3000×g離心5min，移去800ul上清，用剩余的200ul上清重新懸浮菌體；將200ul菌液涂YPD平板(YP和20％D單獨(dú)滅菌，倒平板之前按1∶9向YP中加入20％D；篩選抗性為80ug/ml Amp)，30℃倒置培養(yǎng)3-4天，在抗性平板上生長(zhǎng)的為含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆子。
取重組質(zhì)粒pPIC9k-SOD1轉(zhuǎn)化的畢氏酵母GS115菌株陽(yáng)性克隆子，接種于150ml YPD培養(yǎng)液中，30℃250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600nm＝0.3～0.5(約20hr)，然后接種于3L發(fā)酵基本培養(yǎng)基(26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸鈣，18.7g/L硫酸鉀，15.5g/L硫酸鎂，4.17g/L氫氧化鉀，Glucose 40g/L葡萄糖)中，于5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。
在起始階段——菌體生長(zhǎng)階段，發(fā)酵過程中用25％的氨水調(diào)節(jié)pH，使其維持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1(30mM硫酸銅，0.54mM碘化鈉，17.6mM硫酸錳，0.80mM鉬酸鈉，0.32mM硼酸，2.4mM氯化鈷，0.18mM氯化鋅，0.24mM硫酸亞鐵，1.6mM生物素，0.19M硫酸)，進(jìn)行連續(xù)流加補(bǔ)料。攪拌并通氣培養(yǎng)20-24hr，在菌體生長(zhǎng)過程中溶氧逐漸下降至低于100％，直至碳源耗盡，溶氧又逐漸上升至高于80％，此時(shí)菌濕重可達(dá)到90g/L。
進(jìn)入碳源飼喂階段，以25ml/hr的速度流加用蒸餾水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持續(xù)流加4-6hr，并調(diào)節(jié)通氣量，使溶氧維持在20％上下，到代該階段的末期，菌濕重可達(dá)到160g/L。
在誘導(dǎo)階段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培養(yǎng)基中甲醇的終濃度最高不要超過0.3％(v/v)，并調(diào)節(jié)通氣量，使溶氧維持在20％上下。在誘導(dǎo)階段的發(fā)酵過程中每隔8-16hr取樣10ml，10000rpm離心5min，收集上清液測(cè)定SOD活力并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果分別如圖8和圖9所示。發(fā)酵達(dá)161hr時(shí)，菌濕重可達(dá)到330g/L，SOD的表達(dá)水平(以發(fā)酵液上清的酶活力表示)可達(dá)到3500U/ml，這說明梅花鹿肝臟細(xì)胞來源的SOD基因均在畢氏酵母中得到了表達(dá)和積累。
實(shí)施例5重組SOD的純化 將實(shí)施例4所制備的發(fā)酵培養(yǎng)液10000rpm離心10min去除菌體，取上清液作為粗酶液，用截留分子量為6000Da的外壓式中空纖維超濾膜進(jìn)行超濾，以去除粗酶液中小分子的雜質(zhì)，并將其濃縮3-5倍。
將上面所得粗酶液的濃縮液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至85％，13000rpm離心15min，取沉淀，用緩沖液重新溶解，置于截留分子量為6000Da的透析袋中，以pH8.0，20mM Tris-HCl為透析外液，透析外液與內(nèi)液的體積比大于50，4℃透析12-16h，中間每隔4h更換透析外液一次，透析完后，取透析內(nèi)液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，再進(jìn)行冷凍干燥后，置于-20℃的低溫冰箱中保存待用。
取20mg上面所得到的凍干粉末于離心管中，加入2ml pH8.0，50mM Tris-HCl緩沖液，使其充分溶解后，上TOSOH Toyopearl EDAE-650C陰離子柱。先用pH8.0，50mM Tris-HCl緩沖液平衡柱子，然后流加樣品，再用相同緩沖液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脫5個(gè)柱體積，流速為1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后對(duì)收集管中的溶液測(cè)定SOD活力及蛋白電泳分析。
收集離子交換分離后的活性峰，濃縮、脫鹽、凍干后，再用pH7.0，20mM PBS緩沖液溶解，上Superdex75HPLC柱。先用pH7.0，20mM PBS緩沖液平衡柱子，然后上樣，用pH7.0，20mM PBS緩沖液洗脫1.5個(gè)柱體積，流速為0.25ml/min，按峰收集，然后對(duì)收集的樣品測(cè)定SOD活力及進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。
純化完成后，梅花鹿肝臟基因來源的SOD比活性從粗酶液的237U/mg提高到純酶的3447U/mg，純化倍數(shù)為14.5，得率為13.8。SDS-PAGE結(jié)果(圖10)表明，梅花鹿肝臟基因來源的SOD純化后的SOD蛋白僅有單一的條帶，分子量均約為16kDa。
實(shí)施例6重組SOD的酶學(xué)性質(zhì)分析 將實(shí)施例4所制備的SOD在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。所用緩沖液為pH2.0-10.0的廣泛緩沖液(檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、氫氧化鈉、巴比妥)。SOD在不同的pH的緩沖液中，40℃下測(cè)定pH的適性結(jié)果，表明梅花鹿肝臟基因來源SOD的最適pH為7.0-8.0(圖5)。將SOD酶液在不同pH值的緩沖液中于室溫下處理60min，再測(cè)定殘余酶活性以研究SOD的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖7)，在pH4.0-9.0之間，SOD的殘余活性均在90％以上。這說明梅花鹿肝臟基因來源SOD有很好的pH穩(wěn)定性。
最適反應(yīng)溫度的測(cè)定在磷酸鹽(pH7.0)緩沖體系及不同溫度下(30℃-80℃)進(jìn)行酶促反應(yīng)。熱穩(wěn)定性研究為在不同溫度下處理10-60min，再進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶促反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖4)表明，SOD的最適反應(yīng)溫度為40℃。在30℃-50℃的范圍內(nèi)保溫60min，殘余酶活力均可維持在85％以上(圖6)。在60℃下保溫30min，殘余酶活力為80％左右。說明梅花鹿肝臟基因來源SOD有較好的熱穩(wěn)定性。
分別在梅花鹿肝臟基因來源SOD酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0PBS緩沖液配置)和胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL緩沖液配置)于37℃處理30-240min，稀釋后再測(cè)定SOD活性。經(jīng)胰蛋白酶處理240min后，SOD的殘余酶活力仍維持在100％，無明顯的損失；經(jīng)胃蛋白酶處理240min后，SOD殘余酶活力在65％左右(圖11)，說明梅花鹿肝臟基因來源SOD具有較好的抗蛋白酶水解能力。
功能及用途試驗(yàn) 實(shí)施例7重組SOD對(duì)小鼠的抗疲勞實(shí)驗(yàn) 超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)超氧化物陰離子自由基的清除劑，能夠增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)代謝廢物的清除能力，從而消除疲勞。普通的SOD多由動(dòng)植物中提取，但是由于其是非人源的，不可避免某些異源SOD的過敏反應(yīng)，基因組動(dòng)物源SOD可以彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)。但是，目前關(guān)于動(dòng)物源SOD的抗疲勞作用的研究較少，本專利中通過小鼠的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)探討基因重組動(dòng)物源SOD的抗疲勞作用。
1材料 昆明小鼠，共40只，雌雄各半，體重(20±2)g，福建醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?；蛑亟M動(dòng)物源SOD由實(shí)施例4所制備。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、SOD、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒由南京建成生物技術(shù)公司提供，具體測(cè)定方法采用試劑盒中所提供的方法進(jìn)行。
2給藥方法 昆明小鼠隨機(jī)分成四組，每組10只，雌雄各半。小鼠經(jīng)口灌胃給藥，劑量分別為500、1 500、6 000U/kg；另設(shè)生理鹽水對(duì)照組。各組動(dòng)物每天固定時(shí)間給藥1次，連續(xù)給藥1w。末次給藥后，將小鼠放入游泳箱中進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)(負(fù)重10％體重)，游泳箱規(guī)格為50cm×50cm×40cm，水溫為25℃～27℃，直至沉入水中不再浮起時(shí)將其撈出，分別記錄游泳時(shí)間，所得結(jié)果如表1所示。
3檢測(cè)指標(biāo) 末次給藥后，將小鼠放入游泳箱中游泳1h后撈出擦干，脫臼處死，取肝臟組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，將組織放入青霉素瓶中，加入生理鹽水研磨，3 500r/min離心10min，取上清，制成10％的組織勻漿液。用分光光度法測(cè)定小鼠組織中GSH-PX、SOD、T-AOC和MDA的水平，所得結(jié)果見表2。
4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用spss統(tǒng)計(jì)軟件，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以x±s表示，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。
表1小鼠游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表1可以看出，給藥三組的均明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)，這說明SOD可顯著延長(zhǎng)游泳時(shí)間，提高運(yùn)動(dòng)耐力。
表2實(shí)驗(yàn)后小鼠的生化指標(biāo) 由表2中的結(jié)果可知，給予小鼠SOD后，提高了其肝臟組織SOD、GSH-PX和T-AOC活力，降低了MDA含量。其中低濃度組GSH-PX的水平顯著提高(p＜0.05)；中濃度組SOD和T-AOC的水平顯著提高(p＜0.05)，MDA顯著降低(p＜0.05)；高濃度組SOD的水平顯著提高(p＜0.05)，MDA顯著降低(p＜0.05)。
據(jù)報(bào)道，竭力運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)的自由基生成增多，同時(shí)運(yùn)動(dòng)后其防御系統(tǒng)也得到了加強(qiáng)，但運(yùn)動(dòng)后即刻抗氧化酶活性的增強(qiáng)不足以清除增多的自由基，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)的堆積，組織內(nèi)SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活性降低。由于自由基非常活潑，化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，它可以參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能，從而使機(jī)體疲勞。
自由基還能引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，使體內(nèi)的許多酶及激素失去生物活性。SOD作為一種蛋白質(zhì)，在運(yùn)動(dòng)后自由基增多的情況下很容易失活而起不到抗氧化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性給予SOD后，組織內(nèi)SOD的活性明顯升高，尤以中、高劑量組升高最為明顯，由此推測(cè)SOD具有增強(qiáng)組織清除自由基的能力。
谷胱甘肽是一種小分子肽，其在GSH-PX的催化下具有還原過氧化物的作用。近來的研究證明，其能使維生素e(Ve)恢復(fù)到還原狀態(tài)，而脂質(zhì)過氧化物的毒性作用可被Ve對(duì)抗，其能阻斷脂質(zhì)過氧化作用，維護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能；而且谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)活潑的巰基，易被氧化脫氧，這一特異結(jié)構(gòu)使其成為體內(nèi)主要的自由基清除劑。因此，GSH-PX可以使組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化物生成減少，從而降低細(xì)胞的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SOD提高了GSH-PX的活性，尤以低濃度組效果最明顯，這說明SOD可能有效地阻斷了脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。
T-AOC是綜合反映組織對(duì)抗自由基對(duì)脂質(zhì)膜損害、清除活性氧能力的良好指標(biāo)，它克服了單一的抗氧化指標(biāo)難以全面反映機(jī)體抗氧化能力的不足，能夠?qū)Ω骺寡趸到y(tǒng)協(xié)同完整的抗氧化能力做出綜合全面評(píng)價(jià)。T-AOC用于運(yùn)動(dòng)性疲勞研究，有利于更全面評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的綜合作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服SOD后T-AOC的水平明顯提高，這說明SOD提高了組織對(duì)抗自由基對(duì)脂質(zhì)膜損害、清除活性氧的能力。
細(xì)胞膜富含不飽和脂肪酸，最易受到氧自由基的攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其分解產(chǎn)物之一是MDA，MDA的含量能直接反映細(xì)胞膜被氧化的程度。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，口服SOD后，小鼠體內(nèi)MDA的水平顯著降低，中、高劑量組的效果尤其顯著，這說明SOD能夠顯著增加組織對(duì)自由基的清除能力。
因此，綜合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，SOD對(duì)于降低運(yùn)動(dòng)引起的自由基增加的狀況和延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生是十分有利的，可作為生物體內(nèi)有效的抗氧化劑加以補(bǔ)充。但是對(duì)于不同的指標(biāo)，抗氧化作用的最佳劑量有些不一致，可能是因?yàn)槠跁r(shí)不同的抗氧化酶代謝速率不同，所以對(duì)于提高不同的酶的活性，給予的外源性抗氧化劑的劑量也不同。
序列表
SEQ NO.1
<110>福州大學(xué)
<120>一種超氧化物歧化酶及其制備方法
<160>4
<210>1
<211>序列的長(zhǎng)度
<212>DNA
<213>梅花鹿肝臟細(xì)胞
<220>
<223>該DNA序列共有456bp，其中第454-456位為終止密碼子TAA、第1-453位編碼不含信號(hào)肽的成熟
蛋白，該成熟蛋白含有151個(gè)氨基酸。
<400>1
gcgacgaagg ccgtctgcgt gctgaagggc gacggcccgg tgcaaggcac catccgcttc 60
gaggcaaagg gacatacagt cgtcgtaact ggatccatta caggattgac tgaaggtgat120
catggattcc acgtccatca gtttggagac gatacgcaag gctgtaccag tgcaggtcct180
cactttaatc ctctgtccaa aaaacacggt gggccaaaag atgatgagag gcatgttgga240
gacctgggca acgtgacggc tgacaaaaac ggtgttgcca aagtggatat tgtagattct300
ctgatctcac tgtcaggaga acattccatc attggccgca cgatggtggt ccatgaaaaa360
ccggatgact tgggcagagg tggaaatgaa gaaagtacaa agactggaaa cgctggaaat420
cgtttggcct gtggtgtaat tggaattgcc cagtaa 456
SEQ NO.2
<210>2
<211>151
<212>PRT
<213>梅花鹿肝臟細(xì)胞
<220>
<400>2
Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 20
Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly His Thr Val Val Val Thr
20 25 30
Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His Vis
35 40 45
His Gln Phe Gly Asp Asp Thr Gln Gky Cys Thr Ser Ala Gly Pro
50 55 60
His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Asp
65 70 75
Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asn
80 85 90
Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ser
95 100 105
Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu Lys
110 115 120
Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr
125 130 135
Gly Asn Ala Gly Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala
140 145 150
Gln
SEQ NO.3
<210>3
<211>152
<212>PRT
<213>馬鹿(北美)
<220>
<400>3
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly His Thr Val Val Val
20 25 30
Thr Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His
35 40 45
Val His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Gln Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp
65 70 75
Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys
80 85 90
Asn Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu
95 100 105
Ser Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu
110 115 120
Lys Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Arg Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Ala Gln
SEQ NO.4
<210>4
<211>152
<212>PRT
<213>馬鹿(歐洲)
<220>
<400>4
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Met Lys Gly Asp Gly Pro Val
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly Asn Thr Val Val Val
20 25 30
Thr Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His
35 40 45
Val His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Gln Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp
65 70 75
Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys
80 85 90
Asn Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu
95 100 105
Ser Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu
110 115 120
Lys Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Arg Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Ala Gln
權(quán)利要求
1.一種超氧化物歧化酶，其特征在于所述的超氧化物歧化酶為銅鋅超氧化物歧化酶，所述述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超氧化物歧化酶，其特征在于所述氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
3.一種如權(quán)利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重組載體，其特征在于所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的載體是大腸桿菌質(zhì)?；蚪湍纲|(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重組載體，其特征在于所述的載體為pGEM-T Easy-SOD、pET21a(+)-SOD或pPIC9k-SOD。
5.一種如權(quán)利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的編碼序列的細(xì)胞，其特征在于所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的細(xì)胞選大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞；所述核苷酸分子的細(xì)胞由所述載體轉(zhuǎn)化而得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的超氧化物歧化酶的編碼序列的細(xì)胞，其特征在于所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的細(xì)胞是包含所述核苷酸分子或用所述載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌或包含所述核酸分子或用所述載體轉(zhuǎn)化的畢氏酵母。
7.一種如權(quán)利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于所述超氧化物歧化酶的制備步驟包括Cu/Zn-SOD基因的獲得從梅花鹿肝臟中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并回收凝膠中的目標(biāo)基因；制備好的雙鏈cDNA進(jìn)行亞克隆將所得目的基因進(jìn)行DNA序列測(cè)定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，得到Cu/Zn-SOD基因。
8.一種如權(quán)利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重組載體的制備方法，其特征在于所述Cu/Zn-SOD基因的重組載體的制備為采用所述Cu/Zn-SOD編碼序列經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后與EcoRI和NotI雙酶切的pET21a(+)載體連接，得到大腸重組表達(dá)載pET21a(+)-SOD或采用所述的Cu/Zn-SOD編碼序列經(jīng)XhoI和NotI雙酶切后與XhoI和NotI雙酶切的pPIC9k載體連接，得到酵母重組表達(dá)載體pPIC9k-SOD。
9.一種如權(quán)利要求5所述的的超氧化物歧化酶的編碼序列的細(xì)胞的構(gòu)建，其特征在于所述細(xì)胞是用所述重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的；所述細(xì)胞選大腸桿菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞，選用大腸桿菌和畢氏酵母構(gòu)建表達(dá)Cu/Zn-SOD的重組細(xì)胞。
10.一種如權(quán)利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的表達(dá)，其特征在于培養(yǎng)所述包含Cu/Zn-SOD編碼序列的細(xì)胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，誘導(dǎo)其表達(dá)，收獲表達(dá)產(chǎn)物通過包含本發(fā)明Cu/Zn-SOD編碼序列的酵母發(fā)酵來生產(chǎn)Cu/Zn-SOD，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種動(dòng)物來源的SOD基因，以及將其在大腸桿菌和酵母細(xì)胞中克隆表達(dá)的方法，所述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示；氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQNO.2所示；核苷酸分子的載體是大腸桿菌質(zhì)?；蚪湍纲|(zhì)粒；核苷酸分子的細(xì)胞由所述載體轉(zhuǎn)化而得；所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的細(xì)胞是包含所述核苷酸分子或用所述載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌或包含所述核酸分子或用所述載體轉(zhuǎn)化的畢氏酵母。本發(fā)明制備出能夠高效表達(dá)并分泌Cu/Zn-SOD的重組生產(chǎn)株，實(shí)現(xiàn)Cu/Zn-SOD的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，獲得具有很好的pH穩(wěn)定性，良好的熱穩(wěn)定性以及抗蛋白酶水解能力的Cu/Zn-SOD產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101633916SQ200910112388
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日
發(fā)明者葉秀云, 李仁寬, 靳偉剛, 洋 張, 羅鋆琳 申請(qǐng)人:福州大學(xué)