專利名稱：一種融合肝素酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程和生物催化領(lǐng)域，特別涉及融合肝素酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素酶(h印arinase)是一類作用于肝素的多糖裂解酶，在許多種微生物中發(fā) 現(xiàn)，包括棒桿菌0)/y/^Z^"eri咖sp.(高寧國(guó)等，肝素酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條 件，微生物學(xué)報(bào)1999 Vol. 39:64-67)、鞘胺醇桿菌^AiA^Z^cfei^'w/b sp.(高 寧國(guó)等，鞘胺醇桿菌肝素酶的產(chǎn)生，微生物學(xué)報(bào)2003 Vol. 43:813-816)、枯草芽 胞桿菌ife"77^ ^^Wh's(王忠彥等，肝素酶產(chǎn)生菌的篩選及其粗酶性質(zhì)的研究， 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2002 Vol. 39:777-779)、環(huán)狀芽孢桿菌^sw77"s c irc〃7朋51 (Yasutaka Tahara et al. ， Purification and characterization of h eparinase that degrades both heparin and heparin sulfate from勘cj77ws "'rcw7a/^ BioSci. Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66:1181—1184)、解肝素 擬桿菌/!reKote77s力eparz./7o/Wic3 (Kazuyuki Sugahara et al. ， Characteriz ation of hepaxinase from an oral bacterium尸rerafe723 Aepar/aoYjfics J. Biochem. 1998 Vol. 123:283-288)、糞便擬桿菌^scterwWes Werco^z's HJ-15 (D ong Hyuu Kim et al. ， Purification and characterization of a novel h印ar inase from AacterwVes Wercoris HJ—15 J. Biochem. 2000 Vol.128: 323—328) 禾卩肝素黃桿菌/^sraZ actei"/咖Ae/ ar// "/ (Sasiekharan， R. 1991 Ph.D. Thesis, Havard University)。但是來(lái)自肝素黃桿菌的肝素酶是商業(yè)化的唯一來(lái)源。
肝素酶的研究具有十分重要的意義(Sasiekharan, R. 1991 Ph. D. Thesis, Ha vard University; Sasiekharan, R.et al.，A comparative analysis of the prim ary sequences and characteristics of heparinase I，II， and III from尸73ra 力acterj'i/zz 力eparj./ w/b Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229:770-777):肝素酶是多糖裂解酶的一種，用于研究肝素酶及其底物 多糖肝素之間的相互作用有助于闡明多糖裂解酶的作用機(jī)制；肝素酶可以用于解析 肝素等復(fù)雜粘多糖的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能；肝素酶可以用于解析人體內(nèi)的凝血和抗凝血機(jī)制；肝素酶可以用作臨床血液肝素化的去除，防止手術(shù)后出血；肝素酶用于 PCR反應(yīng)前血液制品的處理；肝素酶可以用于制備低分子的抗凝血藥物低分子量肝 素。
來(lái)自肝素黃桿菌的肝素酶主要有三種，分別命名為肝素酶I (EC 4.2.2.7)、 II (NO EC code)和III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al., Purification and characterization of heparin lyases from /^SKoAsctei^.um /zeparj'/ w/n JBC 1992 Vol. 267:24347-24355)。其中肝素黃桿菌的肝素酶I (H印A)是目前為止研 究最充分的肝素酶之一，其在低分子肝素的生產(chǎn)和體外血液循環(huán)中肝素的去除上的 應(yīng)用已有報(bào)道，具有巨大的市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。
肝素酶I通常是從肝素黃桿菌發(fā)酵液中提純獲得的，通常需要經(jīng)過(guò)多步的色譜 純化，收率比較低。肝素黃桿菌增長(zhǎng)速度慢，肝素酶的生產(chǎn)穩(wěn)定性差，而且，產(chǎn)肝 素酶需要價(jià)格昂貴的肝素誘導(dǎo)，增加了酶的成本，因而重組菌生產(chǎn)肝素酶I受到極 大的關(guān)注，但通常情況下重組肝素酶I極容易形成包涵體，需要復(fù)雜的復(fù)性過(guò)程才 能形成活性蛋白。
來(lái)自大腸桿菌的天然的麥芽糖結(jié)合蛋白MBP能夠與麥芽糖特異吸附，參與大腸 桿菌對(duì)麥芽糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用。MBP不但能與amylose結(jié)合，實(shí)現(xiàn)親和分離，也能與 馬鈴薯淀粉結(jié)合實(shí)現(xiàn)親和分離(廉德君等， 一種改進(jìn)的融合蛋白親和層析純化方法， 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展1998 Vol. 25:283-284; Usha Srinivasan et al. ， A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions Journal of Biotechnology 1998 Vol. 62:163-167)，從而可大大降低 酶的分離純化的成本。本研究小組前期利用融合蛋白技術(shù),將MBP與從肝素黃桿菌中克 隆得到肝素酶I融合，構(gòu)建了高效生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，5L發(fā)酵罐生 產(chǎn)酶活可達(dá)20000IU/L以上(Chen Yin, Xing Xin_hui, Ye Feng-chun, Kuang Ying, Luo Ming-fang. Production of MBP-H印A fusion protein in recombinant Escherichia coli by optimization of culture medium, Biochemical Engineering Journal, 2007， 34:114-121)。該法得到的重組肝素酶I只需進(jìn)行一步親和層析就能達(dá)到95%的純化效果。 此項(xiàng)工作已申請(qǐng)專利，專利號(hào)為200410038098.6。
綠色熒光蛋白GFP，自從1994年Chalfie等(Chalfie M， Tu Y, Euskirchen G， Ward WW, Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994， 263:802-805 )首次在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)出來(lái)后，由于該熒光蛋白穩(wěn)定、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性、熒光檢測(cè)簡(jiǎn)單，而且產(chǎn)熒光不需要底物等特 點(diǎn)，已成為在生理學(xué)和生物技術(shù)的研究和開發(fā)中應(yīng)用最廣泛的報(bào)告蛋白之一。但是，
目前為止GFP在生物學(xué)和生物技術(shù)中的應(yīng)用主要側(cè)重于各種定性解析，將其應(yīng)用于 蛋白質(zhì)生物生產(chǎn)過(guò)程的定量監(jiān)測(cè)及過(guò)程優(yōu)化是一個(gè)新的領(lǐng)域。Po卯enborg等 (Poppenborg L， Friehs K， Flaschel E The green fluorescent protein is a versatile reporter for bioprocess monitoring. J". Biotechnol. 1997， 58:79-88 ) 首次證明了將GFP融合到一親和靶物上可以實(shí)現(xiàn)諸如培養(yǎng)、色譜分離等過(guò)程的快速 監(jiān)測(cè)。因此，GFP是用于定量快速監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化以及追蹤固定化酶 使用過(guò)程特性的具有極大潛力的工具。本實(shí)驗(yàn)室前期利用融合蛋白技術(shù),將GFP與從 肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I融合,構(gòu)建了生產(chǎn)可溶性的肝素酶I的基因工程菌株(Chen Yin, Xing Xin-hui, Ye Feng-chun， Kuang Ying. Soluble expression and rapid quantification of GFP-hepA fusion protein in recombinant Escherichia coli, Chinese Journal of Chemical Engineering, 2007， 15:122-126) 。 GFP的融合可以利 用熒光測(cè)量對(duì)工程菌濃度及肝素酶I酶活進(jìn)行快速定量追蹤，有利于肝素酶I生產(chǎn)過(guò)程的 優(yōu)化和控制，有利于肝素酶的保存和應(yīng)用過(guò)程的快速評(píng)價(jià)，有利于解析大分子肝素的結(jié)構(gòu) 和降解機(jī)理。此項(xiàng)工作巳申請(qǐng)專利，專利號(hào)為200510090872.2。
現(xiàn)有的肝素酶I生產(chǎn)和催化工藝中，缺乏酶生產(chǎn)一分離一應(yīng)用整個(gè)過(guò)程的集成 方法。因此，肝素酶I的高效可溶表達(dá)、分離純化、固定化、高效催化以及酶活的 快速檢測(cè)等多功能化集成就具有十分重要的意義。融合蛋白技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一多功能 化集成的有效手段之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合肝素酶。
本發(fā)明提供的融合肝素酶，命名為GFP-MBP-HepA，是如下a)或b)的蛋白
a) 序列表中序列1的第8-1016所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
b) 在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
上述b)的蛋白的氨基酸序列具體可為序列表中序列1所示的氨基酸序列。 上述蛋白的編碼基因，命名為她-m^-Z/eA4，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 上述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列
51) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；
2) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列2的核苷酸序列雜交且編碼上述蛋白的核苷 酸序列；
3) 與序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼上述蛋白 的核苷酸序列。
序列2中，妳的編碼區(qū)是序列2的自5'端第22-735位的堿基；m6p的編碼區(qū)是 序列2的自5，端第781-1881位的堿基；He;^的編碼區(qū)是序列2的自5，端第 1959-3048位的堿基。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， PH7.2， 7%SDS)中，65。C預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷 酸鈉緩沖液，pH7.2， 7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65。C雜交12hr;棄雜交 液，加入洗膜液I (20ramol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 5%SDS) ， 65。C洗膜2次，每次 30min;加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2，腦S) ， 65。C洗膜30min。
含有上述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
上述重組載體是通過(guò)以下步驟構(gòu)建的
將序列表中序列2的第1位-1881位所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體；
所述質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA是將序列2的第1959-3048位所示的肝素酶I的編 碼基因插入到質(zhì)粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到的重組質(zhì)粒。
含有權(quán)利要求上述基因的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
上述重組菌是含有上述的重組載體的重組大腸桿菌。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)肝素酶的方法，是將上述的重組菌誘導(dǎo)培 養(yǎng)，表達(dá)得到肝素酶。
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是0. 3-lmM的IPTG， 10-3(TC誘導(dǎo)培養(yǎng)5-30小時(shí)。 搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明產(chǎn)生的融合肝素酶的酶活可達(dá)660. 3IU/L培養(yǎng)基， 比酶活可達(dá)1.931 IU/mg蛋白。本發(fā)明可以利用GFP蛋白實(shí)現(xiàn)菌體濃度和酶活的快 速在線檢測(cè)。因?yàn)楸景l(fā)明中酶活與細(xì)菌濃度、熒光強(qiáng)度均存在著良好的線性關(guān)系， 可以利用熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌濃度以及酶活的快速定量。上述結(jié)果說(shuō)明在 發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度以快速獲得菌體濃度和肝素酶I的酶活的變 化，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)三重融合肝素酶I的培養(yǎng)過(guò)程優(yōu)化和控制。


圖1為表達(dá)載體pMAL-hepA的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
圖2為從肝素黃桿菌中PCR擴(kuò)增得到的肝素酶I基因電泳圖譜。
圖3為表達(dá)載體phGMH-L2的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
圖4為大腸桿菌TBl/phGMH-L2和TOP10/phGMH-L2工程菌株表達(dá) GFP-MBP-HepA的SDS-PAGE電泳分析圖。
圖5為大腸桿菌TBl/phGMH-L2和TOP10/phGMH-L2工程菌株15度誘導(dǎo)培養(yǎng) 21h后菌體濃度、粗酶液酶活及熒光量比較情況示意圖。
圖6為大腸桿菌TBl/phGMH-L2和TOP10/phGMH-L2工程菌株15度誘導(dǎo)培養(yǎng) 21h后粗酶液比酶活及比熒光強(qiáng)度比較情況示意圖。
圖7為TOP10/phGMH-L2培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活(IU/L 培養(yǎng)基)和熒光強(qiáng)度(U/L)的變化曲線圖。
圖8為TOP10/phGMH-L2培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞濃度(0D6。。)、熒光強(qiáng)度(U/L)與肝 素酶I的酶活(IU/L培養(yǎng)基)的關(guān)系曲線圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。 下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1.綠色熒光蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白和肝素酶I三重融合蛋白的表達(dá) 一、三重融合蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建
1、含有麥芽糖結(jié)合蛋白和肝素酶I 二重融合蛋白編碼基因的表達(dá)載體 pMAL-c2x-H印A的構(gòu)建
表達(dá)載體pMAL-c2x-HepA的構(gòu)建過(guò)程如圖l所示，具體過(guò)程如下從肝素黃 桿菌(F/ava6flcfen'Mm /^/7an>zw/ )(購(gòu)買自IAM)的染色體組DNA中擴(kuò)增肝素酶 I基因，所用的引物分別為
上游弓l物5, -GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC -3'(帶下戈lj 線的堿基為BamHI的酶識(shí)別位點(diǎn))，
下游引物5' - CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC- 3'(帶 下劃線的堿基為HindIII酶識(shí)別位點(diǎn))，擴(kuò)增后，分別引入BamHI和HindIII酶識(shí)別位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50ng模板DNA， 100pmol每種引物，lx擴(kuò)增緩沖液 (北京天為生物技術(shù)有限公司)，20(Himol/L每種dNTP， l單位高保Pfo酶；擴(kuò)增 程序?yàn)?5攝氏度變性5分鐘，50-60 (51、 53、 55、 57或59°0攝氏度引物退火 45秒，72攝氏度引物延伸90秒，30個(gè)循環(huán)后，72攝氏度延伸5分鐘結(jié)束反應(yīng)。 該P(yáng)CR結(jié)果如圖2所示，表明擴(kuò)增得到l.lkb的肝素酶I基因片段。測(cè)序表明，該 片段具有自序列表中序列2的5'端第1959-3048位核苷酸序列。圖2中，泳道2-6 分別為引物退火溫度為51、 53、 55、 57或59'C擴(kuò)增結(jié)果，泳道1為分子量marker (條帶大小依次為15kb、 10kb、 7500bp、 5000bp、 2500bp、 1000bp、 750bp)，箭 頭所指處為l.lkb目標(biāo)片段。
將上述得到的PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII雙酶切后，分別插入到購(gòu)自美國(guó)N ew England Biolabs公司的pMAL-c2x載體的BamHI和HindIII酶識(shí)別位點(diǎn)之間， 得到pMAL-c2x重組載體，將pMAL-c2x重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，以5'GCC TGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3，禾口 5' CTTAAAGCTTTTACTATCT GGCAGTTTCGCTGTAC 3'為引物，通過(guò)菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，提取可得到l.lkb PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子中的pMAL-c2x重組載體，分別通過(guò)BamHI和HindIII雙酶切驗(yàn) 證。將通過(guò)BamHI和HindIII雙酶切得到l.lkb片段的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將含有具有 序列表中序列2的第1959-3048位核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白編碼基因的pMal -c2x重組載體命名為pMAL-c2x-HepA。在pMAL-c2x-HepA中，//e/W基因與/acZ a基因之間有兩個(gè)連續(xù)的終止密碼TAGTAA，從而能夠有效地終止蛋白翻譯不會(huì)表 達(dá)lacZa蛋白。
2、三重融合蛋白表達(dá)載體phGMH的構(gòu)建
根據(jù)三重融合蛋白中連接綠色熒光蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白的氨基酸殘基序列 不同，我們構(gòu)建了 phGMH表達(dá)載體，命名為phGMH-L2。 phGMH-L2中連接GFP 與MBP的氨基酸殘基序列為(EAAAK)3，構(gòu)建過(guò)程如圖3所示。具體過(guò)程如下
phGMH-L2的構(gòu)建過(guò)程 以質(zhì)粒pSG1729 (從Bacillus Genetic Stock Center獲得)為模板，用上游引 物CGAGCACTTCACGAACAAGGACCATAGCATATTAATCATCATCATCAT CATCATATGAGTAAAGGAGAAG 3'(帶下劃線的堿基為Asel酶識(shí)別位點(diǎn))和 下游引物5' GTTATTGCGGCCGCTTCTTTTGCTGCAGCTTCTTTGTATAGTTCA
8TCCAT 3'(帶下劃線的堿基為Notl酶識(shí)別位點(diǎn))擴(kuò)增帶有組氨酸標(biāo)記His6的綠 色熒光蛋白基因/^-她，分別引入Asel和Notl酶識(shí)別位點(diǎn)。
以質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA為模板，用上游引物5' TCACGAGCGGCCGCAAA AGAAGCAGCAGCAAAAATGAAAATCGAAGAAGGTA 3'(帶下劃線的堿基為 Notl酶識(shí)別位點(diǎn))和下游引物5' CCGCTGCCAACCGAATTCTGAAATCCTTCCC TCGATCCCG 3'(帶下劃線的堿基為EcoRI酶識(shí)別位點(diǎn))擴(kuò)增麥芽糖結(jié)合蛋白蛋 白基因m6p，分別引入NotI和EcoRI酶識(shí)別位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 50ng模板DNA， 1 OOpmol每種引物，2 X TransTaq High Fidelity (HiFi) PCRSuperMixII;擴(kuò)增程序?yàn)?5攝氏度變性5分鐘，60。C退火 45秒，72攝氏度引物延伸90秒，30個(gè)循環(huán)后，72攝氏度延伸10分鐘結(jié)束反應(yīng)。 測(cè)序表明，/^-妳具有SEQ ID Nq: 2中5'端第1-735位核苷酸序列；具有 SEQ ID Na: 2中5'端第781-1881位核苷酸序列。
將上述得到的PCR產(chǎn)物用Ase I和Notl雙酶切，m6; 用Notl和EcoRI 雙酶切后，與pMAL-c2x-HepA經(jīng)Ndel (酶切位點(diǎn)為CATATG)和EcoRl雙酶切后 的大片斷用T4DNA連接酶，得到重組載體，將將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。重組質(zhì) 粒經(jīng)酶切鑒定并通過(guò)序列測(cè)定確認(rèn)(美國(guó)Invitrogen公司)。將含有三重融合蛋 白的編碼基因(如序列表中序列2所示)的重組載體命名為phGMH-L2。其中，妳 的編碼區(qū)是序列2的自5'端第22-735位的堿基；的編碼區(qū)是序列2的自5， 端第781-1881位的堿基；i/ep4的編碼區(qū)是序列2的自5'端第1959-3048位的堿 基。
二、三重融合蛋白的表達(dá) 1、誘導(dǎo)表達(dá)
提取步驟一中含有phGMH-L2的大腸桿菌DH5ot中的質(zhì)粒，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化 大腸桿菌TBI和TOPIO，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素篩選和利用步驟一中2提供的引物進(jìn)行 菌落PCR鑒定，得到含有phGMH-L2的大腸桿菌TBI和TOPIO，即TBl/phGMH-L2 和TOP10/phGMH-L2作為表達(dá)GFP-MBP-HepA的工程菌。
以質(zhì)粒pMAL-c2x轉(zhuǎn)化大腸桿菌TBI和TOPIO，得到空載體對(duì)照 TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x。
以下操作對(duì)上面的工程菌平行進(jìn)行。將空載體對(duì)照和工程菌分別在LB培養(yǎng)基(含IOO pg/ml氨芐青霉素)37t培 養(yǎng)至0D6。。約為0.600附近后，加入終濃度為0.3 mM IPTG 15。C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)21h。 10000 rpm, 8min離心收集菌體并用20 ramol/L Tris-HCl (pH 7.4)洗滌兩次，重 懸至OD咖約為8. 000附近，取樣40pl做細(xì)胞全蛋白組分SDS—PAGE電泳。將上面 0D6。。約為8. 00重懸液進(jìn)行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的 處理198次)，12000rpm， 30min取上清液40|il做可溶蛋白組分SDS—PAGE電泳。 結(jié)果如圖4所示，圖4中3個(gè)M均為marker(從上而下分子量依次均為120kDa、 100kDa、 65kDa、 50kDa) ， Cl為空載體對(duì)照TOP10/pMAL-c2x全蛋白組分；C2為空 載體對(duì)照TBl/pMAL-c2x的全蛋白組分；S5、 S6分別為大腸桿菌TBI (phGMHS-L2) 的全蛋白組分和可溶蛋白組分；S7、 S8分別為大腸桿菌TOP10(phGMHS-L2)的全蛋 白組分和可溶蛋白組分。
結(jié)果表明空載體對(duì)照菌株TBl/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x誘導(dǎo)培養(yǎng)后無(wú) 熒光無(wú)酶活，其它工程菌均表達(dá)出了可溶性的GFP-MBP-HepA三重融合蛋白，其 中大腸桿菌TOPIO中的表達(dá)效果均要優(yōu)于大腸桿菌TB1。并且經(jīng)過(guò)測(cè)序， TBl/phGMH-L2、 TOP10/phGMH-L2表達(dá)出的蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所 示；并且該融合蛋白的GFP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第8-245位所示；該 融合蛋白的MBP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第261-627所示；該融合蛋白 的HepA的氨基酸序列如序列1的自氨基端第654-1016所示。
2、酶活及熒光強(qiáng)度檢測(cè)分析
粗酶液即為上面步驟中超聲破碎后離心所得的上清液。酶活力(單位為IU/L) 的檢測(cè)采用232 nm的光吸收法，1IU的酶活的定義為3(TC每分鐘產(chǎn)生lpmol不飽 和鍵的反應(yīng)效力。取肝素底物溶液0.5 ml (25 g/L肝素，40 mMNaCl， 3.5 mM CaCl2， 17mMTris-HCl， pH7.4)，加入步驟3中所得的粗酶液，其它體積以Tris緩沖液 補(bǔ)充，最終的反應(yīng)液體積為1.5ml，測(cè)單位時(shí)間內(nèi)在232nm的吸光度變化AA232。 消光系數(shù)e二3800]Vr1。比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗酶液蛋 白濃度(單位為mg/L)的比值。蛋白濃度監(jiān)測(cè)采用常規(guī)的Bradford法。熒光強(qiáng)度 (單位為U/L)檢測(cè)采用熒光分光光度計(jì)HITACHI F-2500，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，檢測(cè) 吸收波長(zhǎng)為512nm。比熒光強(qiáng)度定義為熒光強(qiáng)度與粗酶液蛋白濃度(單位為mg/L) 的比值。15X:誘導(dǎo)培養(yǎng)工程菌21h后，OD6W)、酶活、熒光強(qiáng)度結(jié)果如圖5所示，比酶 活和比熒光強(qiáng)度結(jié)果如圖6所示，其中空載體對(duì)照誘導(dǎo)培養(yǎng)后無(wú)熒光無(wú)酶活未在圖 上顯示，重組載體是phGMH-L2時(shí)的數(shù)值酶活可達(dá)360.8 IU/L培養(yǎng)基，比酶活可達(dá) 1.931 IU/mg蛋白，比熒光強(qiáng)度可達(dá)0.758 IU/mg蛋白。
實(shí)施例2.三重融合蛋白肝素酶酶活的熒光定量追蹤
選取大腸桿菌TOP10/phGMH-L2進(jìn)行了三重融合蛋白肝素酶酶活的熒光定量 追蹤實(shí)驗(yàn)。用含100 pg/ml氨芐青霉素的M9YE培養(yǎng)基(17. 1 g/L Na2HP04 12H20， 3,0 g/L KH2P04， 0.5 g/L NaCl; 1.0 g/L NH4C1, 12. 5 g/L酵母提取物，12 g/L葡 萄糖)對(duì)TOP10/phGMH-L2進(jìn)行培養(yǎng)，在37。C培養(yǎng)大約3. 5小時(shí)(至OD咖為0. 735) 后，加入終濃度為0. 3 mM的IPTG，并將培養(yǎng)溫度改為15"C進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。之后每 隔2小時(shí)，取2ml菌液分別測(cè)其細(xì)胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活和熒光強(qiáng)度(熒 光分光光度計(jì)HITACHI F-2500)，直至誘導(dǎo)培養(yǎng)30小時(shí)。
肝素酶I的酶活是按照實(shí)施例1步驟二中的步驟2的方法測(cè)定，結(jié)果表明肝素 酶I的酶活隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增加。熒光強(qiáng)度的測(cè)定分為兩種方式 方式1是直接利用菌液測(cè)定熒光強(qiáng)度值，方式2是將菌液離心后用相同體積的20 mM 的Tris緩沖液(PH7.4)重懸，用實(shí)施例1中步驟二中的步驟1的方法超聲破碎后 離心去上清來(lái)測(cè)定熒光強(qiáng)度值。
培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)胞濃度(0D6。。)、肝素酶I的酶活(IU/L培養(yǎng)基)和熒光強(qiáng)度(RFU) 的變化如圖7所示,最高酶活可達(dá)660.3IU/L培養(yǎng)基。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，細(xì)胞 濃度、酶活和熒光量均增加，但由于細(xì)胞散射的影響，方式l所測(cè)得的熒光強(qiáng)度偏 小，且細(xì)胞濃度越大，偏差越大。此時(shí)可通過(guò)方式2來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量熒光量。
為進(jìn)一步研究利用GFP蛋白實(shí)現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在線檢測(cè)，我們研究了 酶活與0D6。。、熒光強(qiáng)度的關(guān)系，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，酶活與細(xì)菌濃度、熒 光強(qiáng)度均存在著良好的線性關(guān)系，可以利用熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌濃度以及 酶活的快速定量。上述結(jié)果說(shuō)明在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中可以通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度以快速獲 得菌體濃度和肝素酶I的酶活的變化，從而實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)三重融合肝素酶I的培養(yǎng) 過(guò)程優(yōu)化和控制。序列表
<110〉清華大學(xué)
〈120>融合肝素酶及其編碼基因
<130> CGGNARL92434
〈160〉 2
1
1016 PRT
人工序列
<210> 〈211> <212> 〈213〉 <220> <230>
〈400〉 1
Met His His 1
Gly Val Val
Lys Phe Ser 35
Leu Thr Leu 50
Pro Thr Leu 65
Tyr Pro Asp
His
Pro 20 Val
His 5
lie
His His Met Ser
Leu Val
Ser Gly Glu Lys Phe
Val Thr
His
lie Cys
55 Thr Leu 70
Lys Gin
Met 85
Glu Gly Tyr Val Gin Glu Arg
Glu Leu
25 Gly Glu 40
Thr Thr Thr Tyr His Asp Thr lie
Lys Gly 10
Asp Gly
Gly A印
Gly Lys
Gly Val 75 Phe Phe 90
Phe Phe
Glu Glu Leu
Asp Val
Ala
Leu
60
Gin
Lys
Lys
Thr
45
Pro
Asn
30
Tyr
Val
Cys Phe
Ser Ala
Asp Asp
Phe Thr 15
Gly His
Gly Lys
Pro Trp
Ser Arg
80 Met Pro 95
Gly AsnTyr
Arg
Gly 145 Ala
Lys
lie 130 His
Asp
100
Arg Ala Glu Val
Thr 115
Glu Leu Lys Gly
Lys Leu Glu Lys
Gin
Lys 165 Gly
Tyr 150 Asn
Ser
Thr Pro lie 195
Gin Ser Ala Leu
Ser
Thr 210
Val Leu Leu Glu
Met 225
Asp Glu Leu Tyr
Ala Ala Ala Lys 260
Asn Gly Asp Lys 275
Glu Lys Asp Thr 290 Glu
Lys 245 Met
Gly
Gly
lie
Lys 120 Asp
lie 135
Asn Tyr Asn Ser
105
Phe Glu Gly Asp Phe Lys Glu
Asn lie Glu Asp 180
Gly Asp Gly Pro
Gly lie Lys Val
His 155 Asn
Gin
Val 200
Lys Asp Pro Asn
Ser 215
Val Thr Ala Ala
Phe 230
Glu Ala Ala Ala
Lys lie Glu Tyr
Lys 250 Gly
Asn
Gly 280
Val Thr Val Glu
Glu 305
lie Phe Trp Ala
Lys 295
Val Ala Ala Thr
Asp 140 Asn
Phe
110
Thr Leu Val Asn 125
Gly Asn lie Leu
Val 170
Ala Asp His
Leu 185
Leu Ser Pro Asp
Val Lys Tyr
Glu 220 lie
Asn 205 Lys
Glu 265
Leu Ala Glu Val
Lys Leu Val Glu
Cys Phe Pro G
310 315 Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala 325 330 Leu Ala Glu lie Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gin Asp Lys Leu
His 300 Asp
Gly 285 Pro
Tyr
lie
Gin 190 His
Gly 235
Glu Ala Ala Ala
Gly Gin Lys
lie 270 Lys
Asp
Pro
Ser
lie
Arg 175 Gin
Tyr Asp
Thr His Gly
Lys 255 Trp
Lys
Lys
Asp
Gly 335 Tyr
Met 160 His
Asn
Leu
Arg Asp His
Met 240 Glu
lie
Phe
Leu
lie 320 Leu
Pro
13340
Asp Ala Val Arg
Phe Thr Trp 355
Val Glu Ala Leu
lie
Asn 385 Lys
Ala 370 Pro
Ala
Tyr 360 Leu
345 Asn
lie
Pro
Lys
Phe Thr Trp
Glu Asn Gly 435 Ala
Lys Gly
Ser 375
Glu Glu lie Pro
Gly Lys Leu Tyr
Thr Trp 390
Ser Ala Leu Met
Lys 405
Leu lie Ala Ala
Pro 420
Lys Tyr Asp lie
Asp 425 Asp
Phe 楊 Gly
Val
Asn
Ala 395 Asn
Gly
Gly
Ala
Lys 450 Asn
Ala Asp Thr
Met 465
Gly Glu Thr Ala
Gly Leu Thr Asp
Lys 440
Leu Val Asp Leu
Lys 380 Leu
Leu
Tyr
Val
350
lie Ala Tyr Pro 365
Asp Leu Leu Pro
Asp Lys Glu Gin
Ala
Glu
Phe 430 Asn
Pro 415 Lys
Ala
Asp 470 Thr
Phe 455
Tyr Ser lie Ala
lie 460
Ala Ala Phe Asn
Asp Thr Ser Gly Gin Ala
Met 485
Val Asn Tyr Gly
Glu 475
Trp Ala Trp Ser
Lys 500
Ser Lys Pro
lie Asn Gly Pro 490
Thr Val Leu Pro
Pro 515
Ser Pro Asn ILys
Tyr Gly Val 505
Phe Val Gly Val Leu Ser
Asn 495 Phe
Ala 530
Leu Leu Thr Asp Glu 545
Gly Ala Val Ala
Val 520
Leu Ala Lys Glu
Glu 535
Leu Glu Ala Val
Gly Leu Glu Ala Val Asn 550 555 Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
Leu 565
Arg lie Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gin Lys Gly Glu lie Met Pro
Glu 570 Gin
Phe 540 Lys
Leu
Asp Ala
Lys Lys
Pro
Asp 575 Met
Leu 400 Tyr
Tyr
Gly
Asp 445
Lys Asn Lys His
Lys ■ lie
Lys
Thr 510
Gly lie Asn
Ala 525
Leu Glu Asn Tyr
Leu 560 Pro580
Gin Met Ser Ala
Asn lie Pro 595
lie Asn Ala Ala Ser Gly
585
Trp Tyr Ala Val
Ala 625 Asn
Lys
Lys
Lys
Asn 610
Gin Thr Asn Ser
Leu
Ser
Gin
Pro 690 Ser
Gly Gly
lie
Asn 660 Glu
Glu 645 lie
Glu 725 Asp
Gin
Phe 785 Ser
Gly 770 Pro
Phe 600
Gin Thr Val Asp
Ser 630 Gly
Arg 615
Ser Asn Asn Asn
590
Arg Thr Ala Val 605
Ala Leu Lys Asp
Glu 620
Asn Asn Asn Asn
Ser 675
Tyr Ala Leu Gin
Arg lie Ser Pro Tyr Arg lie lie Asp
Asn 635
Phe Gly Ser Gin
Pro Ser Tyr Arg Phe 705
Tyr Ala Ala Gly
Ala Thr Thr Asn 740
Ala Gin Lys Leu 755 Ser
Glu 710 Thr
Phe
Tyr 695 Leu
Lys
Lys
Asn 680 Asp
Val 665 Lys
Glu 650
Asn Val Gin Ala
Asp
Trp Val Ala Lys
Asp 670 Gly
Gin 655 Ser
Asn 640 Lys
Ala
lie Asn
Leu
Val 685
Phe Asn Gly Lys
Lys Ala Glu Gly Arg Lys
Arg 700
Asn Ser Leu Glu
Asp 715
Glu Leu Ser Tyr
lie 730
Pro Pro Ser Val
Lys Thr Val Arg
Phe 745
His Tyr Gly Lys
Ser 735 Gin
Gly 720 Tyr
Asn
Ser Arg Ser
Tyr 760
Thr Phe Ser Val
Tyr 750
lie Cys Glu
Arg Glu
Asp Asn Ala Thr
Tyr 775
Thr lie Phe Ala
Leu
Val 805 Leu
Thr 790
Ala Thr Pro Glu
Tyr 780 Trp
Gly 765
lie Pro Ser Ser
Gly Thr
lie Glu Glu Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met lie Phe Lys
Gly 810 Arg
Gin 795
Glu lie Lys
His Gly Ala
Leu 815 Lys
Pro ■ Ser
Asn820 825 830
lie Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys lie Thr
835 840 845
Tyr Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gin Gly Gly Tyr
850 855 860
Pro Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr lie Lys Ala 865 870 875 880
Asn Ser Asp Arg Gin Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala
885 890 895
Asn Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys
900 905 910
Thr Ser Thr lie Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gin Phe Pro Lys Asp
915 920 925
Cys Trp lie Thr Phe Asp Val Ala lie Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys
930 935 940
Glu Ala Asn Thr lie Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr 945 950 955 960
Tyr Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gin Lys Ala His lie Val Asn Gin Gin
965 970 975
Glu lie Leu lie Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe
980 985 990
Gly lie Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu
995 1000 1005
Ser Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg 1010 1015
〈210〉 2
<211> 3054
<212〉 DNA <213〉人工序列
16<220〉 〈230>
<400> 2
atgcaccaccacc3ccax:ca^catgagtaaagg卿ag獄ttttcactggagttgtccca60
attcttgttgaattagatggtgacgttaatgggcacaaattttctgtcagtgg卿gggt120
gaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaacta180
cctgttccatggccaacacttgtcactactctgacttatggtgttcaatgcttttcaaga240
tacccagatcgcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgta300
caggaaagaactatatttttcsaagatgacgggaactacaaggic3Cgtgctgaagtcaag360
tttgaaggtgatacccttgttaatagaatcggigttaaaaggtattgattt420
ggaaacattcattggaatacaactataactcacacaatgtatacattatg480
gcagacaaacaaaagaatggaMca^gttaac 11 c aaaattagacacaacattgaagat540
ggaagcgttcccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtc600
ctttcaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatccc33cga^660
aca/tggtccttcttgagtttgtaa^gctgctgggattacacatggcatg720
gatgaactatacaaageiagctgcagcaaaagaagcggccgceiaaagaagcagcagcaaaa780
atgaa肌tcgaaga3ggtaaactggtaa_tctggattaacggcgataaaggctsta^cggt840
ctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcat900
ccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggc幼CtggCg8tggccctgacatt960
atcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctga犯tc1020
accccggacaeiagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttac1080
aacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttg肌gcgttatcgctgatttataacaaa1140
gatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggat3犯g肌Ctg1200
aaagcgaaeiggteiEigagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttCElCCtggCCg1260
ctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaa1320
gacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgatt1380
acatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaa1440
ggCgEL雄3gcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcga1500
gtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaccgttcgtt1560ggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttc1620
ctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataa3geicaaaccgctg1680
ggtgccgtagcgctgaagtcttacg2iggaageigttggcgaaagatccacgtattgccgcc1740
3ct3tggaa3acgcccagaaatgccgaacatcccgcagatgtccgctttc1800
tggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaa1860
gCCCtg36L6lgacgcgcagactaattcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaac1920
aacctcgggatcg鄉(xiāng)gaaggatttcagaattcggatcccatccggtaac1980
atcccttaccgggtaaatgtgcaggccgacagtgctaagctattgacaac2040
腿tgggtggcagtaggcatcaataaaccttatgcattacaataLtgacgataaactgcgc2100
tttaatggaaaaccatcctatcgctttgagcttaaagccgaagacaattcgcttgaaggt2160
tatgctgcaggggccgtatag犯ttgtcgtacagctatgcaaccaccaat2220
aatttccccca^gcgtat3cc肌aMgcgca^犯gctaaa犯ccgtttat2280
cattacggca肌ggg3tttgtg獄3ggggagctcccgcagctataccttttcagtgtac2340
ataccctcctccttccccgacaatgcgactactatttttgcccaatggcatggtgcaccc2400
agcagaacgcttgtagctac2icc卿gggagaaattaaaaceictgaigcatagaagagttt2460
ttggccttatacgaccgcatgatcttcaaaaaaaatatcgcccatgataaagttgaaaaa2520
tacttatgtagccggaaagccaaatggctgg肪ggt柳32580
c朋ggtggttatccaccgctggcctUggtttttctaaagggtatttttacatcaaggca2640
aactccgaccggcagtggctta_ccgacaaagccgaccgtaacaatgccaatcccgagaat2700
agtgaagtaatgaagccctattcctcggaactaccattgcctataaaatg2760
ccctttgcccagttccctaaagattgctggattacttttgatgtcgccatgigactggacg2820
aaatatggaa肌g3ggCC肌tacaattttg3肌CCCggt3鄉(xiāng)tggatgtgatgatgact2880
tata^ccaagaataagaaaccacei8iaaagcgcal3tcgt3aaccagcaggaaatcctgatc2940
ggacgt纖gatgacgatggctattacttcsaatttggEiatUELC3gggtcggtaacagc3000
acggtcccggttacttataacctgagcgggtacagcgaaactgccagatagtaa3054
18
權(quán)利要求
1、一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1016所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能融合肝素酶，其特征在于所述b)的蛋白的氨 基酸序列是序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3、 權(quán)利要求1或2所述蛋白的編碼基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的序列是如下l)或2)或3)的核苷酸序列1) 序列表中序列2所示的核苷酸序列；2) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列2的核苷酸序列雜交且編碼權(quán)利要求1或2所述 蛋白的核苷酸序列；3) 與序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1 或2所述蛋白的核苷酸序列。
5、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是通過(guò)以下步 驟構(gòu)建的將序列表中序列2的第1位-1881位所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA 的多克隆位點(diǎn)，得到重組載體；所述質(zhì)粒pMAL-c2x-HepA是將序列2的第1959-3048位所示的肝素酶I的編碼 基因插入到質(zhì)粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)之間，得到的重組質(zhì)粒。
7、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組菌。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權(quán)利要求5 或6所述的重組載體的重組大腸桿菌。
9、 一種生產(chǎn)肝素酶的方法，是將權(quán)利要求7或8所述的重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá) 得到肝素酶。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是0.3-lmM的 IPTG， 10-30。C誘導(dǎo)培養(yǎng)5-30小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合肝素酶。該融合肝素酶是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列1的第8-1016所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)生的三重融合蛋白的酶活通過(guò)搖瓶培養(yǎng)可達(dá)660.3IU/L培養(yǎng)基，比酶活可達(dá)1.931IU/mg蛋白。本發(fā)明可以利用GFP蛋白實(shí)現(xiàn)菌體濃度和酶活的快速在線檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101608180SQ200910090169
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者葉逢春, 翀 張, 蔣培霞, 邢新會(huì) 申請(qǐng)人:清華大學(xué)