專利名稱：一種可降低發(fā)酵副產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可降低發(fā)酵副產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵工程菌，本發(fā)明還涉及所述工程菌 的制備方法及其在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
許多植物，尤其是一些常被廢棄的植物中纖維素含量較高，如在農(nóng)作物秸稈和殘 留物中，纖維素和半纖維素的含量可占到干重的75%以上。如果能用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，是非 常好的利用方式。纖維素主要是由六碳糖和五碳糖，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等組 成。大腸桿菌含有利用六碳糖和五碳糖的所有必需酶，可發(fā)酵某些六碳糖和五碳糖。 但是利用未經(jīng)改造的野生型大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)率很低，且副產(chǎn)物多，在產(chǎn)業(yè)上并不 可行。中國專利200710177003. 2公開了一種大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌，將大腸桿菌 JML09通過乙醇的多代篩選得到突變株，然后轉(zhuǎn)入了運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II 和丙酮酸脫羧酶基因，在分別以木糖和葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時，乙醇產(chǎn)率達到了理 論產(chǎn)率的79%和87%。但是，已知在六碳糖和五碳糖的發(fā)酵過程中會積累很多有機酸類中間代謝的副產(chǎn) 物，如甲酸和乳酸等，乙醇僅占很少一部分。副產(chǎn)物的問題不僅影響了乙醇產(chǎn)量，還存在后 續(xù)處理時與副產(chǎn)物分離的工藝問題。因此，設(shè)法在發(fā)酵時降低副產(chǎn)物，在利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的技術(shù)中是亟待解 決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌，使其在用五碳糖和六碳 糖做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時能減少副產(chǎn)物，從而提高乙醇產(chǎn)率。具體目的是對大腸桿菌的乙醇代謝途徑進行改造，敲除積累副產(chǎn)物的基因，減少 發(fā)酵時副產(chǎn)物的形成；同時引入高效的乙醇發(fā)酵途徑，使乙醇成為主要發(fā)酵產(chǎn)物。在高濃度 乙醇下依然能夠保持較高的發(fā)酵速率，而且有較高的乙醇產(chǎn)率。本發(fā)明用以下兩種方式達到了本發(fā)明的上述目的1、對產(chǎn)乙醇的大腸桿菌突變株進行了基因改造。將大腸桿菌通過Red重組系統(tǒng)將丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因突變， 從而不能積累甲酸和乳酸等副產(chǎn)物，得到減少副產(chǎn)物的突變株。所述Red重組系統(tǒng)來源于 Datsenko and Wanner(見 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2000,97(12)，6640-6645)。2、在去除副產(chǎn)物的突變株中轉(zhuǎn)入了運動發(fā)酵單胞菌基因所述運動發(fā)酵單胞菌基因是產(chǎn)乙醇的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因，
3兩個基因在可被大腸桿菌RNA聚合酶高效識別的強啟動子Ptac啟動下發(fā)生共表達，得到高 產(chǎn)乙醇的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。由于引入同型乙醇發(fā)酵途徑，控制其細胞內(nèi)的碳代謝向生成乙醇的方向進行，使 得其發(fā)酵主產(chǎn)物為乙醇。在本發(fā)明的一個實施例中，大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌的具體制備方法是1、通過Red重組系統(tǒng)分別突變失活大腸桿菌MG1655丙酮酸甲酸裂解酶和乙醇脫 氫酶基因，從而減少副產(chǎn)物甲酸和乳酸的產(chǎn)生，在無氧的條件下使其碳代謝和能量代謝流 向生產(chǎn)乙醇的方向，達到積累乙醇的目的。2、將包含有SD序列的運動發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因經(jīng)過 PCR克隆后連接到pGEM-T easy載體上，經(jīng)過酶切后置于含有可被大腸桿菌RNA聚合酶高效 識別的強啟動子Ptac的表達載體PZY507上，使得乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因在 大腸桿菌中發(fā)生共轉(zhuǎn)錄和共表達，得到大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌。經(jīng)實驗證實，用本發(fā)明所提供的大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌在發(fā)酵五碳糖和六碳糖 生產(chǎn)乙醇時，其發(fā)酵葡萄糖轉(zhuǎn)化率達到理論產(chǎn)值的(97% )發(fā)酵木糖的轉(zhuǎn)化率達到理論產(chǎn) 值的(96% )本發(fā)明的優(yōu)點是1.將丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因突變，從而不能積累甲酸和乳酸等 副產(chǎn)物，在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時降低了副產(chǎn)物的含量；2.同時共同轉(zhuǎn)錄和表達運動發(fā)酵單胞菌的外源基因，乙醇成為主產(chǎn)物。本發(fā)明以具有乙醇耐受性大腸桿菌MG1655構(gòu)建發(fā)酵乙醇的雙突變株，從而降低 副產(chǎn)物的積累，使得工程菌能夠生產(chǎn)高濃度乙醇，同時可以耐受高濃度乙醇；利用了含有能被大腸桿菌RNA聚合酶高效識別的強啟動子Ptac的表達載體使運 動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因在大腸桿菌耐乙醇突變株ET1中共 同轉(zhuǎn)錄和表達。使得其發(fā)酵主產(chǎn)物為乙醇，在提高乙醇產(chǎn)率的同時降低了后續(xù)純化，如蒸餾 過程中的投入。
具體實施例方式實施例1耐乙醇大腸桿菌乙醇發(fā)酵工程菌的制備A、大腸桿菌乙醇耐受株MG1655的篩選大腸桿菌MG1655，JML09, BW25113, BL21, BW25141在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長到對數(shù) 期后轉(zhuǎn)接到含有4%，6%乙醇的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)中，(乙醇經(jīng)過0. 45 y m的濾膜過濾除菌后 加入到LB培養(yǎng)基中)，12h，24h分別測定液體LB培養(yǎng)基中0D_的吸光值來測量篩選菌株 之間生長速度的差異。比較0D_得出結(jié)論，MG1655在乙醇耐受性方面優(yōu)于其他大腸桿菌。B、大腸桿菌產(chǎn)乙醇丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因突變株的篩選利用氯化鈣將大腸桿菌MG1655制成感受態(tài)細胞，經(jīng)熱激(42°C 90秒，冰上120秒) 轉(zhuǎn)化后，將輔助質(zhì)粒PKD46轉(zhuǎn)入MG1655，在含有20 y g/mL的氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子。根據(jù) Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97 (12)，6640-6645) Red重組先得到的pflB (丙酮酸甲酸裂解酶)突變株，然后得到ldhA(乳酸脫氫酶)基因的 突變的雙突變株。根據(jù)這個方法
以 SEQ ID NO: 1(5 ‘ -GTCCGAGC TTAATGAAAAG-3 ‘)禾口 SEQ ID NO: 2(5' -AAGTCCACTGGATAGCTT-3')為引物，擴增pf IB兩端同源臂與pUC4K的卡那抗性盒的 線性片段基因，其產(chǎn)物大小為1544bp，將PCR產(chǎn)物回收做線性轉(zhuǎn)化。PCR 反應(yīng)體系(pUC4K)10XPCR buffer2 u L2. 5mMdNTP2 u L50pM gfol2u L50pM gfo22 u L模板 DNA5ng5U/ u LTaq 酶0. 25 u L加無菌水至20 ii LPCR反應(yīng)條件1、94°C 預(yù)變性300s2、94°C30s50 °C30s72 °C60s(30 個循環(huán))3、72°C5min 以 SEQ ID NO 3(5 ' -ATTCATTAAA TCCGCCAGCT TATAAG-3 ')禾口 SEQ ID NO: 4 (5' -ATCCAGGTGT TAGGCAGCATG-3')擴增帶有l(wèi)dhA兩端同源臂及PKD3的氯霉素抗性盒 的片段，其產(chǎn)物大小為1918bp，PCR片段進行回收，然后線性轉(zhuǎn)化。PCR反應(yīng)體系(PkD3)
10XPCR buffer2u L
2.5mMdNTP2u L
50pM pflB-F2u L
50pM pflB-R2u L
模板DNA5ng
5U/u L Taq 酶0. 25u L
加無菌水至20 uL
PCR反應(yīng)條件
1、94°C預(yù)變性300s
2、94°C30s
60 °C30s
72 V40s
(30個循環(huán))
3,72VlOmin
將得到的PCR線性片段通過瓊脂糖膠回收，并且電激轉(zhuǎn)化含有溫度敏感型質(zhì)粒
PKD46 的MG1655 丙酮酸甲酸裂解酶突變株。pKD46(Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97 12 :6640_45)包含有一段噬菌體 X (GenBank accession No. J02459)基因，包含有l(wèi)ambda Red同源重組系統(tǒng)(.gamma.，. beta.，exo genes)，在一個阿拉伯糖誘導(dǎo) 的啟動子的控制下。通過PKD46可以將PCR回收片段插入到MG1655的基因組中。電激轉(zhuǎn)化感受態(tài)制作方法如下1)過夜培養(yǎng)含有 PKD46E. coli MG1655，30°C2)按1 %接種到50mL的LB中，氨芐青霉素(20 y g/mL)和L_阿拉伯糖(ImM)，30°C 培養(yǎng)到0D6(1(1在0. 6左右收集。3)迅速將培養(yǎng)物置于冰浴15-30min。4)用10%的甘油洗三次菌體，4000Xg，10min。5)電激加入50mL和lOOng的PCR片段，電激之后加入lmL的LB培養(yǎng)基，37°C輕柔 振蕩下培養(yǎng)lh，然后涂布在加了 Km抗性LB平板上37°C培養(yǎng)，12_16h出現(xiàn)重組子。6)將篩選的重組子涂布在42°C的平板上去除PKD46，通過氨芐青霉素抗性驗證 PKD46是否存在。驗證突變株pflB-ldhA雙突變株通過PCR驗證，通過驗證引物以SEQ ID NO 5(5' -CTGACAAAAAAGGCTCTCGCG-3‘)和SEQ ID NO 6(5' -TCGGTGGTGGTTTGTTGG-3‘)擴 增帶有pflB兩端同源臂及PUC4K的卡那霉素抗性盒的片段，其產(chǎn)物大小為4104bp，野生型 是 2494bp。分別以野生型基因組和突變株基因組做PCR，PCR程序如下10XPCR buffer2 u L2. 5mMdNTP2 u L50pM yz-F2u L50pM yz-R2 u L模板 DNA5ng5U/ ii L Taq 酶0. 25 u L加無菌水至20 ii LPCR反應(yīng)條件1、94°C 預(yù)變性300 s2、94°C30s48°C (ldhA 60° ) 30s72 °C40s(30 循環(huán))3、72°ClOmin以 SEQ ID NO: 7 (5 ' —GTCATT ACTTACACAT CCCGC—3 ')和 SEQ ID NO: 8 (5' -TAGTGTAGGC GCAACCTTCA-3')擴增帶有l(wèi)dhA兩端同源臂及PKD3的氯霉素抗性盒 的片段，其產(chǎn)物大小為1446bp，野生型是1246bp。C、大腸桿菌MG1655運動發(fā)酵單胞菌XW101乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因 的克隆以 SEQ ID N0 :9(5' -GGATCCGTGTTTTGAATATATGGA-3 ‘)和 SEQ ID N0 10 (5 ‘ -G CATGCTAGAGGAGCTTGTTAACAG-3‘)為引物，擴增運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因，其產(chǎn)物大小為 1800bp ；以 SEQ ID NO 11(5' -GCGAGCTCAGTATGTAGGGTGAGG-3‘)和 SEQ ID NO 12(5' -GTCGACTTAGAAAGCGCTCAGGAA-3‘)為引物，擴增運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基 因，其產(chǎn)物大小為1200bp。并分別克隆到pGEM-T easy(Promega)載體上，經(jīng)測序分析后，與 已報道的運動發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因的同源性為99%，經(jīng)過酶切 后將pdc和adhB基因連接到表達載體PZY507上得到質(zhì)粒pZY507bc。
0091]PCR反應(yīng)體系(Z. itpdc)0092]10XPCR buffer2u L0093]2. 5mMdNTP2u L0094]10XBSA2u L0095]50pM gfol2u L0096]50pM gfo22u L0097]模板DNA5ng0098]5U/u L Taq 酶0. 25 u0099]加無菌水至20 uL0100]PCR反應(yīng)條件0101]1、94°C預(yù)變性300s0102]2、94°C30s0103]56 °C30s0104]72 °C60s0105](28個循環(huán))0106]3,72V5min0107]PCR反應(yīng)體系(Z. itadhB)0108]10XPCR buffer2u L0109]2. 5mM dNTP2u L0110]10XBSA2u L0111]50pM gfol2u L0112]50pM gfo22u L0113]模板DNA5ng0114]5U/u LTaq 酶0. 25 u0115]加無菌水至20 uL0116]PCR反應(yīng)條件0117]1、94°C預(yù)變性300s0118]2、94°C30s0119]62 °C30s0120]72 V40s0121](28個循環(huán))0122]3,72V5min0123]連接體系與連接反應(yīng)0124]2X buffer5 u
pGEM-T easy1 u LPCR 產(chǎn)物liiLT4 連接酶(3U/ii L) luL加水至10iiL，4°C過夜連接。D、高產(chǎn)乙醇突變株的大腸桿菌乙醇工程菌的構(gòu)建利用氯化鈣將大腸桿菌乙醇耐受突變株MPL制成感受態(tài)細胞，經(jīng)熱激(42°C 90秒， 冰上120秒)轉(zhuǎn)化后，在含有25 u g/mL的氯霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基上工程菌株，得到 工程菌株 MPL-pzy507bc。E、運動發(fā)酵單胞菌XW101醇脫氫酶基因和丙酮酸脫羧酶基因的驗證采用B中的引物，以工程菌株MPL_pZY507bc的質(zhì)粒為模板(反應(yīng)條件和反應(yīng)體系 如B中所述)，可分別擴增到大小約1. 2kb和1. 8kb的條帶，利用RNA試劑盒提取ETlbc的 總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后PCR擴增到一條3. Okb的條帶，說明運動發(fā)酵單胞菌XW101醇脫氫酶基 因和丙酮酸脫羧酶基因在大腸桿菌中做為一個轉(zhuǎn)錄單元發(fā)生了共轉(zhuǎn)錄。實施例2工程菌株MPL_pzy507bc發(fā)酵生產(chǎn)乙醇1.培養(yǎng)條件1. 1M9培養(yǎng)基，成分為葡萄糖2%、Na2HP04 7H20 64g、KH2P0415g、NaCl 2.5g、NH4Cl 5. 0g、121°C，15min。 lmol/L MgS042mL、lmol/L CaCl20. lmL，終體積 1L ；木糖10% Na2HP04 7H20 64g、KH2P0415g、NaCl 2. 5g、NH4C1 5. 0g、121°C，15min。 lmol/L MgS042mL、lmol/L CaCl20. lmL，終體積 1L ；1.2培養(yǎng)和發(fā)酵條件將MPL-pZY507bc接種到M9培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD600 = 0 . 2左右時加入1. OmM的 IPTG誘導(dǎo)，當(dāng)MPL-pZY507bc生長到0D6(1(1 = 1. 0時離心收集菌體，接種到1. 1所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基中，接種后使其0D_值大約為1. 0左右，37°C厭氧培養(yǎng)。2.發(fā)酵液中殘留糖的測定方法采用高效液相色譜檢測發(fā)酵液中的殘留糖含量，測定條件如下，檢測器 Waters410示差折光檢測器；柱溫35 ；色譜柱大連依利特公司HyperSilNH2(4. 6mmi. d. X250mm5um,)；流動相V(乙腈)V(水)=80 20 ；流速lmL mirT1，進樣量 10 y m。3.乙醇的測定方法采用GC-17A島津氣相色譜儀檢測發(fā)酵液中的乙醇含量，F(xiàn)ID檢測器。色譜柱CP-Wax57CB毛細管柱，長50m，內(nèi)徑0. 25mm,膜厚0. 2 y m。色譜條件柱溫130°C。檢測器溫度180°C。進樣器溫度180°C。載氣高純氮；氫氣流速50mL/min；空氣500mL/min ；尾吹30. OmL/min。進樣量0.5iiL。4.有機酸的測定方法采用安捷倫(Agilent)高效液相色譜檢測發(fā)酵液中的有機酸含量，測定條件如下 Waters410示差折光檢測器；柱溫35°C ；色譜柱美國伯樂公司Aminex HPX_87H(7. 8mmi.d. X 300mm5 u m,)；流動相:H2S04 (5mM)；流速0. 8mL mirT1，進樣量 10 u m。5.試驗方法說明所有利用農(nóng)作物秸稈進行乙醇生產(chǎn)的技術(shù)都是將其經(jīng)過酶解或者酸解處理 成為五碳或者六碳糖以后再進行發(fā)酵的。因此，本試驗以2%的木糖和葡萄糖為發(fā)酵底物， 用20mLM9培養(yǎng)基，在37°C的發(fā)酵條件下，經(jīng)過42小時發(fā)酵后，檢測l)MPL-pzy507bc發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸副產(chǎn)物；2)殘留糖和發(fā)酵產(chǎn)物乙醇含量。6、試驗結(jié)果6. 1發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸的含量，見表1。表1發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸含量 在MPL-pzy507bc發(fā)酵產(chǎn)物中沒有檢測到甲酸和乳酸。6. 2發(fā)酵液中所測得的殘留糖和乙醇含量，見表2。表2糖和乙醇含量 在分別以木糖和葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時，乙醇產(chǎn)率達到了理論產(chǎn)率的96% 和 97%。6.試驗結(jié)論1)用本發(fā)明的菌株MPL-pzy507bc，不產(chǎn)生副產(chǎn)物甲酸和乳酸。2)糖的轉(zhuǎn)化率高。證明本發(fā)明制備的工程菌在用農(nóng)作物秸稈等分解后的主要產(chǎn)物五碳糖和六碳糖 做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇時，乙醇產(chǎn)率高。
權(quán)利要求
一種可降低發(fā)酵副產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵工程菌，其特征是大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因失活，且大腸桿菌中轉(zhuǎn)入了運動發(fā)酵單胞菌基因。
2.權(quán)利要求1所述的工程菌，所述大腸桿菌是大腸桿菌MG1655菌株，所述運動發(fā)酵單 胞菌基因是運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶基因。
3.權(quán)利要求1所述的工程菌的制備方法，步驟為1)大腸桿菌根據(jù)Red重組系統(tǒng)分別突變其丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因， 得到了發(fā)酵時不產(chǎn)生乳酸和甲酸的突變株；2)在步驟1)所述突變株中轉(zhuǎn)入運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因II和丙酮酸脫羧酶 基因，該兩個基因在強啟動子Ptac啟動下發(fā)生共表達。
4.權(quán)利要求3所述的工程菌的制備方法，所述大腸桿菌是大腸桿菌MG1655菌株。
5.權(quán)利要求3所述的工程菌的制備方法，所述轉(zhuǎn)入運動發(fā)酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因 II和丙酮酸脫羧酶基因的方法是將包含有SD序列的運動發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶基因和 丙酮酸脫羧酶基因經(jīng)過PCR克隆后連接到pGEM-T easy載體上，經(jīng)過酶切后置于含有可被 大腸桿菌RNA聚合酶高效識別的強啟動子Ptac的表達載體pZY507上，使得乙醇脫氫酶基 因和丙酮酸脫羧酶基因在大腸桿菌中發(fā)生共轉(zhuǎn)錄和共表達。
6.權(quán)利要求1或2所述的工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
7.—種可降低發(fā)酵副產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵工程菌突變株，其特征是將丙酮酸甲酸裂解酶和 乳酸脫氫酶基因突變，同時轉(zhuǎn)入運動發(fā)酵單胞菌基因。
8.權(quán)利要求7所述的突變株的制備方法，其特征是通過Red重組系統(tǒng)突變大腸桿菌 MG1655菌株的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因，經(jīng)過篩選后得到重組子，挑選生 長迅速的單菌落轉(zhuǎn)入運動發(fā)酵單胞菌基因進行發(fā)酵培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可降低發(fā)酵副產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵工程菌，其特征是大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因失活，且大腸桿菌中轉(zhuǎn)入了運動發(fā)酵單胞菌基因。用本發(fā)明的工程菌發(fā)酵六碳糖和五碳糖生產(chǎn)乙醇時，不產(chǎn)生乳酸和甲酸，減少了副產(chǎn)物，從而提高了乙醇產(chǎn)率。
文檔編號C12P7/06GK101875912SQ200910083250
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者張維, 徐玉泉, 林敏 , 陸偉, 陳明, 馬瑞強 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所