專利名稱：：檢測(cè)霍亂弧菌的組合物、試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及霍亂弧菌的特異性檢測(cè)用組合物、試劑盒和檢測(cè)方法，特別涉及產(chǎn)毒型霍亂弧菌的特異性檢測(cè)用組合物、試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：霍亂是由霍亂弧菌(Vibriochlorae)引起的烈性腸道傳染疾病，患者的臨床癥狀常表現(xiàn)為大量米湯狀排泄，造成迅速脫水。如不及時(shí)治療，可導(dǎo)致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡。目前人類歷史上只有01群和0139群霍亂弧菌引起過全球霍亂大流行(K即erJB，MorrisJG，LevineMM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev，1995，8:48-86)。因此1951年霍亂被WHO列為三種重大的流行病之一，中華人民共和國(guó)傳染病法也將其列為甲類法定傳染病。研究發(fā)現(xiàn)，霍亂的強(qiáng)致病作用主要是因?yàn)榛魜y弧菌分泌的霍亂毒素導(dǎo)致的腹瀉所致。不管是早期發(fā)現(xiàn)的01群還是后期出現(xiàn)的0139群霍亂弧菌，都含有霍亂毒素基因，具有產(chǎn)生霍亂毒素的能力，所以霍亂毒素的檢測(cè)一直是霍亂弧菌致病性檢測(cè)中的重要組成部分?；魜y毒素的檢測(cè)不僅僅用于對(duì)現(xiàn)有致病性霍亂弧菌01群和0139群的檢測(cè)，還由于其與霍亂的流行和致病密切相關(guān)，而對(duì)于監(jiān)測(cè)新的致病性霍亂弧菌菌株的出現(xiàn)具有重大意義。在檢測(cè)中，PCR法由于其快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)逐漸呈現(xiàn)出要替代以生化培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)為主的傳統(tǒng)的霍亂弧菌檢測(cè)方法的趨勢(shì)。而對(duì)于PCR方法來說，一對(duì)特異性引物是其檢測(cè)的特異性和敏感性的基礎(chǔ)。所以，需要一種更加特異性的引物來更加準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中霍亂弧菌產(chǎn)生霍亂毒素的能力。此外，對(duì)于已知的致病性霍亂弧菌的檢測(cè)，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)有一些非0139群也非01群的霍亂弧菌也表達(dá)霍亂毒素CT，但是并不會(huì)引發(fā)霍亂的爆發(fā)。同時(shí)，在偶然情況下01和0139群霍亂弧菌由于缺失ctx基因而不表達(dá)霍亂毒素，同時(shí)也不會(huì)引發(fā)霍亂的爆發(fā)。所以，要準(zhǔn)確檢測(cè)目前已知的致病性霍亂弧菌的存在需要同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)指標(biāo)霍亂毒素CT禾口血清型指標(biāo)(ChakrabortyS，MukhopadhyayAK，BhadraRK，etal.VirulencegenesinenvironmentalstrainsofVibriocholerae.Appl.Environ.Microbiol，2000，66:4022-4028)。實(shí)際檢測(cè)過程中，對(duì)于一個(gè)待測(cè)的樣品，如果僅僅檢測(cè)其中是否有01群霍亂弧菌，或者相反，僅僅檢測(cè)其中是否有0139群霍亂弧菌，并不能完全排除其致病性的危險(xiǎn)。而分別進(jìn)行兩次檢測(cè)的話，顯然，其檢測(cè)成本會(huì)大大升高。所以，還需要一種能夠同時(shí)檢測(cè)兩種致病性霍亂弧菌是否存在的試劑和/或方法，以便在簡(jiǎn)化檢測(cè)過程的同時(shí)節(jié)省檢測(cè)成本。
發(fā)明內(nèi)容為了特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力，發(fā)明人針對(duì)霍亂毒素ctxA基因設(shè)計(jì)了特異性引物，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇出其中特異性最好的一對(duì)，從而提供了一種特異3性檢測(cè)樣品中菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的組合物、試劑盒及其方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供一種用于特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的組合物，其中包括下列引物上游引物5'-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3'(序列號(hào)l)，下游引物5'-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3'(序列號(hào)2)。利用該組合物，可以特異性地檢測(cè)出樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力，除了可用于檢測(cè)檢測(cè)目前已知的致病性霍亂弧菌Ol群和0139群外，還可以作為監(jiān)測(cè)新的致病性霍亂弧菌的產(chǎn)生的重要指標(biāo)的一部分。該組合物中還可以進(jìn)一步包括探針5'-熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT(序列號(hào)3)-熒光淬滅基團(tuán)-3'，含有該探針的組合物可使用熒光實(shí)時(shí)PCR(realtimePCR)來檢測(cè)，其檢測(cè)過程省去了后續(xù)的電泳等檢測(cè)過程，使檢測(cè)更加簡(jiǎn)便。其中所述熒光基團(tuán)可為FAM，熒光淬滅基團(tuán)可為ECLIPSE。為了同時(shí)檢測(cè)樣品中是否含有01群和0139群霍亂弧菌，來確定樣品的致病性威脅，本發(fā)明還提供了一種除了包括上述引物外，還進(jìn)一步包括針對(duì)01群和0139群霍亂弧菌的0抗原編碼基因rfb-Ol和rfb-0139的特異性引物的組合物，該組合物中除了上述引物還包括下列引物rfb-Ol引物上游引物5'-ATATTgATCCgACAAgCCCAAATg-3'(序列號(hào)4)，下游引物5'-CgATgTTgAggCgAAgTTTAgg-3'(序列號(hào)5);和rfb-0139引物上游引物5'-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3'(序列號(hào)7)，下游引物5'-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3'(序列號(hào)8)。利用該組合物，不僅可以檢測(cè)樣品中菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力，還可以在一次檢測(cè)中就檢測(cè)出其中的霍亂弧菌是Ol群、0139群、二者都有、還是二者都不存在，可以基本徹底地確定該樣品是否具有致病性。這大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，節(jié)省了檢測(cè)成本。該組合物中可進(jìn)一步包括探針5'-熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)_3'，5'-熒光基團(tuán)-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT(序列號(hào)6)-熒光淬滅基團(tuán)-3'，和5'-熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA(序列號(hào)9)-熒光淬滅基團(tuán)-3'，并且在三個(gè)探針中分別使用不同的熒光基團(tuán)。包括探針的該組合物可用于實(shí)時(shí)熒光PCR中，從而使檢測(cè)不再需要后續(xù)的電泳等檢測(cè)過程，而直接讀取結(jié)果，更進(jìn)一步地簡(jiǎn)化了檢測(cè)過程，提高了檢測(cè)效率。上述探針的三對(duì)熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可以分別是Cy5和BHQ、Tet和ECLIPSE、以及FAM禾PECLIPSE。本發(fā)明還提供了一種用于特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)體系，和上述任一種組合物。優(yōu)選所述PCR反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系，其中優(yōu)選使用TaqMan探針體系進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè)。該試劑盒除了具有上述組合物所具有的效果之外，還由于所需試劑等的配套配置，更加方便了使用者的使用。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的方法，該方法包括提取樣品中的細(xì)菌基因組DNA;使用上述的組合物中的任一種，或使用上述試劑盒中的任一種，用PCR法擴(kuò)增所述細(xì)菌基因組DNA;對(duì)PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所使用的引物等而確定的PCR反應(yīng)條件，優(yōu)選為95士2t:預(yù)變性超過lmin，95士2t:變性超過5s，60士2t:延伸超過10s，共反應(yīng)超過30個(gè)循環(huán)，最后可選地在72士2t:下延伸超過2min。當(dāng)上述PCR法為普通PCR時(shí)，其反應(yīng)條件進(jìn)一步優(yōu)選為94。C預(yù)變性2min，94t:變性30s，6(TC延伸lmin，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸7min。當(dāng)采用實(shí)時(shí)定量PCR法時(shí)，其條件進(jìn)一步優(yōu)選為94t:預(yù)變性2min，94t:變性10s，6(TC延伸30s，共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。上述PCR法中優(yōu)選使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)。在上述熒光實(shí)時(shí)定量PCR中，優(yōu)選使用T叫Man探針法。本檢測(cè)體系所檢測(cè)標(biāo)本無需活菌，在樣品處理的第一步DNA提取的裂解過程中就可使霍亂弧菌迅速死亡，減少了對(duì)操作人員的生物危害。本方法無需增菌，整個(gè)反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成，大大節(jié)省了人力與時(shí)間，可用于快速檢測(cè)。由于使用了上述組合物，該檢測(cè)方法還具有上述組合物所能夠達(dá)到的所有技術(shù)效果。并且，利用本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式，例如，如上所述同時(shí)使用上述三對(duì)引物進(jìn)行PCR時(shí)，可以一次性地特異性檢測(cè)出樣品中的產(chǎn)毒型Ol群霍亂弧菌和產(chǎn)毒型0139群霍亂弧菌的存在，從而可以一次性檢測(cè)其致病危險(xiǎn)性，如果三種基因的檢測(cè)結(jié)果均為陰性(ctxA(-)/rfb-01(-)/rfb-0139(-))，則可以一次性排除其致病性威脅。如果有一種存在，則可以一次區(qū)分下列幾種情況只有致病性01群霍亂弧菌(ctxA(+)/rfb-01(+)/rfb-0139(-))、只有致病性0139群霍亂弧菌(ctxA(+)/rfb-01(-)/rfb-0139(+))、只有非致病性01群霍亂弧菌(ctxA(-)/rfb-01(+)/rfb-0139(-))、只有非致病性0139群霍亂弧菌(ctxA(-)/rfb-01(-)/rfb-0139(+))、既有致病性01群又有致病性0139群霍亂弧菌(ctxA(+)/rfb-01(+)/rfb-0139(+))和含有能夠產(chǎn)生霍亂毒素的非01也非0139的霍亂弧菌。如果檢測(cè)到最后一種情況的結(jié)果，則可將其用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)，以便監(jiān)測(cè)新型致病性霍亂弧菌的產(chǎn)生。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用本發(fā)明所述的特異性探針，利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，該方法除了上述效果，還由于自動(dòng)化程度高，無需開蓋檢測(cè)產(chǎn)物，還減少了產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。利用本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或方法對(duì)樣品檢測(cè)時(shí)，能夠靈敏地檢測(cè)出樣品存在的產(chǎn)毒型01和/或0139群霍亂弧菌，其檢測(cè)敏感度為1.0X1()2拷貝每反應(yīng)體系。對(duì)01群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.OX10—每反應(yīng)體系，0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.OX10°pg每反應(yīng)體系。整個(gè)反應(yīng)可在2小時(shí)內(nèi)完成，并且在檢測(cè)19種其他致病菌時(shí)不存在非特異性擴(kuò)增。圖1為普通PCR檢測(cè)敏感度的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，"-"為陰性對(duì)照，泳道"10°""l(T"為每個(gè)PCR反應(yīng)所加質(zhì)粒DNA模板拷貝數(shù)分別為10°1010拷貝每反應(yīng)體系。圖2為三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)敏感度的擴(kuò)增曲線圖，平滑線為ctxA熒光檢測(cè)信號(hào)，標(biāo)識(shí)"o"曲線為rfb-Ol熒光檢測(cè)信號(hào)，標(biāo)識(shí)"*"曲線為rfb-0139熒光檢測(cè)信號(hào)，由左到右每PCR反應(yīng)的模板量分別為109102拷貝質(zhì)粒DNA;NTC信號(hào)線為陰性對(duì)照。圖3為普通三重PCR及實(shí)時(shí)熒光三重PCR檢測(cè)體系對(duì)Ol群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)圖，其中(A)M為分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道"-"為陰性對(duì)照，泳道"10—3""105"為每個(gè)PCR反應(yīng)所加基因組DNA模板數(shù)分別為1X10—3pg至1X105pg。(B)平滑線為為ctxA熒光檢測(cè)信號(hào)，標(biāo)識(shí)"o"曲線為rfb-01熒光檢測(cè)信號(hào)；由左到右每PCR反應(yīng)所加的模板量分別為109拷貝質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照("+")和1Xl()5pg至1X10—'pg基因組DNA每反應(yīng)體系("105""10—"，)；NTC水平信號(hào)線為陰性對(duì)照。圖4為普通三重PCR及實(shí)時(shí)熒光三重PCR檢測(cè)體系對(duì)0139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)圖。(A)M為分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道"-"為陰性對(duì)照，泳道"10—2""105"為每個(gè)PCR反應(yīng)所加基因組DNA模板數(shù)分別為1X10—2pg至1X105pg每反應(yīng)體系。(B)平滑線為為ctxA熒光檢測(cè)信號(hào)，標(biāo)識(shí)"*"曲線為rfb-0139熒光檢測(cè)信號(hào)；由左到右每PCR反應(yīng)所加的模板量分別為109拷貝質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照("+")和1Xl()5pg至1X10—^g基因組DNA每反應(yīng)體系("105""10°");NTC水平信號(hào)線為陰性對(duì)照。圖5為實(shí)時(shí)熒光三重PCR檢測(cè)體系對(duì)01和0139群霍亂弧菌的特異性檢測(cè)圖。平滑線為ctxA為熒光檢測(cè)信號(hào)，標(biāo)識(shí)"o"曲線為rfb-Ol熒光檢測(cè)信號(hào)，標(biāo)識(shí)"*"曲線rfb-0139熒光檢測(cè)信號(hào)。(A)左側(cè)"+"為109拷貝質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，右為01群霍亂弧菌lng基因組DNA;水平信號(hào)線為陰性對(duì)照和19種陰性對(duì)照菌基因組DNA;(B)左側(cè)"+"為109拷貝質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，右為0139群霍亂弧菌lng基因組DNA;水平信號(hào)線為陰性對(duì)照和19種陰性對(duì)照菌基因組DNA。具體實(shí)施例方式為了特異性檢測(cè)樣品中菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力，發(fā)明人選擇了霍亂毒素基因ctxA作為靶標(biāo)序列，針對(duì)該基因設(shè)計(jì)了特異性引物，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇了最具有特異性的一對(duì)引物(ctxA-F和ctxA-R，見下表1)用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，選擇ctxA-F和ctxA-R作為特異性引物，用PCR方法檢測(cè)樣品中菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力。使用該方法，不但可特異性檢測(cè)樣品中菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力，而且在檢測(cè)初期就通過裂解使樣品中的菌株死亡，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員造成威脅。優(yōu)選使用熒光實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)，省去了普通PCR的凝膠電泳等時(shí)間，使其檢測(cè)和分析更加簡(jiǎn)便，縮短了檢測(cè)的時(shí)間。更優(yōu)選使用TaqMan技術(shù)標(biāo)記的熒光實(shí)時(shí)PCR法，使用TaqMan技術(shù)時(shí)，其探針優(yōu)選為ctxA-探針5'-熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)-3'，該探針為針對(duì)該靶標(biāo)序列特異性探針，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性。其熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)可以分別是FAM和ECLIPSE。同時(shí)，為了在檢測(cè)樣品中菌株產(chǎn)生霍亂毒素能力的同時(shí)檢測(cè)其血清型，即檢測(cè)其中致病性霍亂弧菌是否存在及其種類，發(fā)明人選擇了01和0139群霍亂弧菌的基因組0抗原編碼基因rfb-Ol和rfb-0139作為耙標(biāo)序列，針對(duì)這兩個(gè)基因設(shè)計(jì)了特異性引物，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇了最具有特異性的引物(rfbOl-F和rfbOl-R，以及rfb0139-F和rfb0139-R，見下表l)用于本發(fā)明中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，同時(shí)采用上述三對(duì)引物rfb01-F和rfb01-R、rfb0139-F和rfb0139-R、以及ctxA-F和ctxA-R，用三重PCR的方法檢測(cè)樣品中是否存在01或0139群霍亂弧菌，并判斷其產(chǎn)生霍亂毒素的能力，還可檢測(cè)出非01非0139但產(chǎn)生霍亂毒素的菌株，有助于監(jiān)測(cè)霍亂弧菌菌株的變異情況。使用該方法，在一次檢測(cè)中既可以對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行分型檢測(cè)，又能夠判斷該菌產(chǎn)生霍亂毒素的能力，可以更準(zhǔn)確地特異性檢測(cè)致病的產(chǎn)毒型01和0139群霍亂弧菌，從而可以一次就完成樣品的霍亂弧菌致病性的檢測(cè)。優(yōu)選采用熒光三重實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)，更優(yōu)選采用T叫Man技術(shù)標(biāo)記，所使用的探針為rfb01-探針5'-熒光基團(tuán)-08(1^0八八1八08八8(:(:(1^八881-熒光淬滅基團(tuán)-3'、rfb0139-探針5'-熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團(tuán)_3'、和ctxA-探針5'-熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)-3'，其中的三個(gè)探針中使用不同的熒光基團(tuán)。使用該方法，不僅可以準(zhǔn)確地檢測(cè)致病的產(chǎn)毒型01群霍亂弧菌，而且其操作更加簡(jiǎn)便，在加入所需試劑開始反應(yīng)后，不需再次開蓋加樣和取樣，避免了污染的發(fā)生。其結(jié)果可以直接讀出，而不需要后續(xù)的諸如凝膠電泳之類的操作，大大節(jié)省了檢測(cè)的時(shí)間。而且，這三個(gè)探針均為針對(duì)相應(yīng)基因設(shè)計(jì)的特異性探針，更加增強(qiáng)了其檢測(cè)的特異性。其中所述熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)對(duì)可以分別是Cy5和BHQ、Tet和ECLIPSE以及FAM和ECLIPSE。但是并不限于這三對(duì)熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇合適的熒光基團(tuán)及其對(duì)應(yīng)的熒光淬滅基團(tuán)。下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出的實(shí)施例僅僅為示例性說明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。引物和T叫Man探針的設(shè)計(jì)與合成利用Genbank的Blast工具對(duì)01群和0139群霍亂弧菌霍的主基因組0抗原編碼基因序列和霍亂弧菌腸毒素A亞基的編碼基因進(jìn)行分析，選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域rfb-Ol、rfb-0139和ctxA作為檢測(cè)耙標(biāo)序列，并針對(duì)這三個(gè)檢測(cè)耙標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中，ctxA基因的檢測(cè)探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記ELIPSE熒光淬滅基團(tuán)；rfb-Ol基因的檢測(cè)探針5'端標(biāo)記Cy5熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ熒光淬滅基團(tuán)；rfb-0139基因的檢測(cè)探針5'端標(biāo)記Tet熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記ECLIPSE熒光淬滅基團(tuán)。表l引物及探針序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>檢測(cè)菌種的準(zhǔn)備本實(shí)施例中所使用的01和0139群霍亂弧菌滅活疫苗由國(guó)家生物制品檢定所惠贈(zèng)。19種其他腸道致病菌或醫(yī)院感染中常見的致病菌致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)、溫禾口氣單胞菌(Aeromonassobria)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、宋內(nèi)志賀氏菌(Shigellas皿ei)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)、甲型副傷寒沙門菌(SalmonellaparatyphiA)、腸炎沙門菌(Salmonellaenteritidis)、腸炎耳卩爾森菌(Yersiniaenteroxolitica)、類志賀令卩單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、腦膜炎黃桿菌(Chromobacteriummeningos印ticum)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaimm皿ii)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、洋蔥伯克霍德菌(Burkholderiacepacia)、綠月農(nóng)桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心微生物實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)施例1采用普通PCR法的檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA的抽提抽提各細(xì)菌基因組DNA(TAKARA公司的MiniBEST試劑盒)。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各細(xì)菌基因組DNA的純度和濃度，01和0139群霍亂弧菌基因組DNA用TE緩沖液稀釋至1X105pg/ill至lj1X10—3pg/ii1的梯度標(biāo)準(zhǔn)品，其余19種其他腸道致病菌或醫(yī)院感染中常見的致病菌的基因組DNA用TE緩沖液稀釋至5X104pg/y1，各種基因組DNA均少量分裝，-2(TC保存?zhèn)溆?。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備采用TA克隆技術(shù)構(gòu)建目的質(zhì)粒。在經(jīng)過電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段分子量后，將rfb-Ol、rfb-0139和ctxA特異性序列的PCR產(chǎn)物連至pMD18_T載體(日本TaKaRa公司)上，重組陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒(Omega質(zhì)粒提取試劑盒)，采用pMD18_T載體的RVM引物進(jìn)行測(cè)序(美國(guó)BeckmanCoulter公司試劑盒)，利用CEQ8000軟件進(jìn)行序列分析，并與原目的序列進(jìn)行比對(duì)。序列完全正確的目的質(zhì)粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度計(jì))后，用1XTE(pH8.0)TE緩沖液稀釋到101Q拷貝/yl作為儲(chǔ)存液，-2(TC保存?zhèn)溆茫褂脮r(shí)連續(xù)IO倍稀釋至濃度在1.0X10—^考貝/ill1.0X1(T拷貝/iil之間，取10iil標(biāo)準(zhǔn)品作為實(shí)時(shí)定量PCR的模板，使參加每個(gè)PCR反應(yīng)的質(zhì)粒數(shù)形成1個(gè)拷貝到10"拷貝的梯度分布。普通三重PCR反應(yīng)條件普通三重PCR反應(yīng)體系為25iU，取10X含鎂的緩沖液2.5iU，dNTPs(各2.5mmol/L)2ii1，25iimol/L引物各0.5iil(終濃度為500nM)，模板DNAlO.Oii1，BlendTaqplusDNA聚合酶1.0U，加滅菌水至終體系25。PCR循環(huán)參數(shù)94。C預(yù)變性2min，94°C變性30s，6(TC延伸lmin，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，最后72t:延伸7min。擴(kuò)增后取5ulPCR產(chǎn)物在3.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳后用溴化乙錠(EB)染色，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析，結(jié)果見圖1、圖3A和圖4A。實(shí)施例2采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)法檢測(cè)采用與實(shí)施例相同的細(xì)菌基因組DNA和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其區(qū)別在于所采用的PCR方法為熒光實(shí)時(shí)定量PCR，并且使用了上述設(shè)計(jì)并合成的三種探針。實(shí)時(shí)熒光三重PCR反應(yīng)條件反應(yīng)體系為25ii1，取10XPCR緩沖液2.5ii1、2.5mmol/L各dNTP2.Oil1、25iimol/L引物各0.5ii1、5iimol/L探針各0.5ii1、BlendTaqplusDNA聚合酶1U、模板DNAlOul，加滅菌水至終體系25iU。PCR循環(huán)參數(shù)94。C預(yù)變性2min，94。C變性10s，60。C延伸30s，共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增結(jié)束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。實(shí)施例1和2的檢測(cè)體系的檢測(cè)敏感度的評(píng)價(jià)取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品每反應(yīng)體系10°拷貝至1(T拷貝，或以1X10—3pg/iil到lX105pg/P1梯度濃度的01和0139群霍亂弧菌細(xì)菌基因組DNA為模板，評(píng)價(jià)了普通三重PCR與實(shí)時(shí)三重?zé)晒釺叫ManPCR檢測(cè)體系的檢測(cè)敏感性，結(jié)果參見圖15。實(shí)施例1中對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)敏感度三重質(zhì)粒梯度稀釋模板進(jìn)行普通三重PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)顯示，當(dāng)每反應(yīng)體系中ctxA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因的質(zhì)粒DNA模板數(shù)降低至1.0X101及以下拷貝時(shí)，普通PCR反應(yīng)后電泳圖上未出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照也未見擴(kuò)增條帶(圖1)。實(shí)施例2中對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)敏感度三質(zhì)粒梯度稀釋模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)顯示，當(dāng)反應(yīng)體系ctxA基因、rfb-Ol基因和rfb-0139的質(zhì)粒DNA模板數(shù)為102拷貝以上時(shí)，其熒光信號(hào)強(qiáng)度ARn高于檢測(cè)域值(ARn二30)，其檢測(cè)范圍是1.0Xl(f1.0Xl(f拷貝每反應(yīng)體系(圖2)。三種標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和模板之間均存在良好的相關(guān)性，rfb-01相關(guān)性為0.999，擴(kuò)增效率達(dá)到1.0，rfb-0139相關(guān)性為0.998，擴(kuò)增效率達(dá)到1.0，ctxA相關(guān)性為0.999，擴(kuò)增效率為O.97，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。實(shí)施例1中對(duì)細(xì)菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度將01群霍亂弧菌基因組DNA梯度稀釋到1X105pg至1X10—3pg每反應(yīng)體系時(shí)普通三重PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)顯示，當(dāng)基因組DNA梯度稀釋至每反應(yīng)體系1X1(Tpg時(shí)普通三重PCR反應(yīng)后電泳圖上未出現(xiàn)ctxA和rfb-01目的擴(kuò)增條帶(圖3A)。將0139群霍亂弧菌基因組DNA梯度稀釋至IX105pg到IX10—2pg進(jìn)行普通三重PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)顯示，當(dāng)基因組DNA稀釋至1X10°pg及以下時(shí)普通三重PCR反應(yīng)后電泳圖上未出現(xiàn)ctxA和rfb-0139明亮的擴(kuò)增條帶(圖4A)。實(shí)施例2中對(duì)細(xì)菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度用與實(shí)施例1相同梯度濃度的01群霍亂弧菌基因組DNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)時(shí)顯示，在1.0X10—^g及以上時(shí)，其熒光信號(hào)強(qiáng)度ARn高于檢測(cè)域值(ARn=30)，該結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光三重PCR的檢測(cè)敏感度比普通三重PCR的檢測(cè)敏感度高10倍(圖3B)。該三重檢測(cè)體系中，被檢測(cè)的兩種靶基因擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和模板之間均存在良好的相關(guān)性，ctxA相關(guān)性為l，擴(kuò)增效率為0.936;rfb-Ol相關(guān)性為0.996，擴(kuò)增效率達(dá)到0.9。用與實(shí)施例1相同梯度濃度的0139群霍亂弧菌基因組DNA進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)時(shí)，在1.OX10°pg以上時(shí)，其熒光信號(hào)強(qiáng)度ARn高于檢測(cè)域值(ARn=30)(圖4B)。該三重檢測(cè)體系中，被檢測(cè)的兩種靶基因擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值和模板之間均存在良好的相關(guān)性，ctxA相關(guān)性為0.997，擴(kuò)增效率為1.02，rfb-0139相關(guān)性為0.999，擴(kuò)增效率達(dá)到0.97。檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)以上述19種其他腸道致病菌或醫(yī)院感染中常見的致病菌的基因組DNA為模板評(píng)價(jià)了三重T叫Man實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的特異性。利用實(shí)施例2中所述的體系對(duì)01群和0139群霍亂弧菌滅活疫苗基因組DNA的1Xl(fpg每反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可見明確的擴(kuò)增曲線，對(duì)上述19種非霍亂弧菌的病原菌基因組DNA的5X105pg每反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)時(shí)均未產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，說明我們使用的探針和引物與我們選定的19種陰性對(duì)照菌之間不存在交叉反應(yīng)。用已知濃度(1.0X107每反應(yīng)體系)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照進(jìn)行盲檢測(cè)，未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果(圖5)。盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過具體實(shí)施例示例性說明了本發(fā)明的某些實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明并不限于上面所公開的實(shí)施方式，而是可以根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的知識(shí)對(duì)其進(jìn)行修改，所作修改不會(huì)超出本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。例如，本發(fā)明所使用的熒光實(shí)時(shí)PCR也可以根據(jù)需要采用說明書中所列出的實(shí)施例中指出的熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)以外的標(biāo)記物質(zhì)，如HEX、TAMRA、R0X、BHQ、Cy3、TxRd、J0E等標(biāo)記物；或使用T叫man技術(shù)之外的其他標(biāo)記體系，例如MGB探針、分子信標(biāo)MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標(biāo)記技術(shù)；或使用染料嵌合法如SYBRGreenI等不飽和染料與LCGreen等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定量檢測(cè)目的基因的存在，進(jìn)而特異性地檢測(cè)樣品中是否存在能夠產(chǎn)生霍亂毒素的菌株，檢測(cè)樣品中是否存在產(chǎn)毒型01群和/或0139群霍亂弧菌，從而可以判斷樣本的致病危險(xiǎn)性。所以，這些本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書所限定。序列表〈110〉蔡劍平〈120〉檢測(cè)霍亂弧菌的組合物、試劑盒和檢測(cè)方法〈130>DF10-081417〈160>9〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>atgccaagaggacagagtgagt22〈210>2〈211>28〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>tcaaactaattgaggtggaaacatatcc28〈210>3〈211>30〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>tcgtgcctaacaaatcccgtctgagttcct30〈210>4〈211>24〈212>DNA〈213>霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>atattgatccgacaagcccaaatg24〈210>5〈211>22<212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>cgatgttg￡iggcgaagtttagg22〈210〉6〈211>23〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)<400>cgccgcaatacgagccccaaggt23〈210>7〈211>24〈212>醒〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>tgatgttgtgggataagcaatctt24〈210>8〈211>20[O川]〈212>DNA〈213〉霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>ctcagcaatgcggtggtcta20<210>9〈211>26〈212>DNA〈213>霍亂弧菌(Vibriochlorae)〈400>aacccgcccttctaatgaacacgcca2權(quán)利要求一種用于特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的組合物，其中包括下列引物上游引物5′-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3′，下游引物5′-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3′。2.如權(quán)利要求l所述的組合物，其中進(jìn)一步包括探針5'_熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)_3'。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述熒光基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為ECLIPSE。4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中進(jìn)一步包括下列引物rfb-01引物上游引物5'-ATATTgATCCgACAAgCCCAAATg-3'，下游引物5'-CgATgTTgAggCgAAgTTTAgg-3';禾口rfb-0139引物上游引物5'-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3'，下游引物5'-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3'。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中進(jìn)一步包括探針5'_熒光基團(tuán)-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT-熒光淬滅基團(tuán)_3'，5'_熒光基團(tuán)-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-熒光淬滅基團(tuán)_3'，和5'_熒光基團(tuán)-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-熒光淬滅基團(tuán)_3'，并且在三個(gè)探針中分別使用不同的熒光基團(tuán)。6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述的三對(duì)熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分別為Cy5禾口BHQ、Tet禾口ECLIPSE、以及FAM禾口ECLIPSE。7.—種用于特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)體系，和權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的組合物。8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中所述PCR反應(yīng)體系為實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。9.一種特異性檢測(cè)樣品中的菌株產(chǎn)生霍亂毒素的能力的方法，包括提取樣品中的細(xì)菌基因組DNA;使用權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的組合物，或使用權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，用PCR法擴(kuò)增所述細(xì)菌基因組DNA;對(duì)PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述PCR法的反應(yīng)條件為95士2t:預(yù)變性超過lmin，95士2t:變性超過5s，60士2t:延伸超過10s，共反應(yīng)超過30個(gè)循環(huán)，最后在72士2t:下延伸超過2min;或95士2t:預(yù)變性超過lmin，95士2t:變性超過5s，60士2t:延伸超過10s，共反應(yīng)超過30個(gè)循環(huán)。全文摘要本發(fā)明涉及檢測(cè)霍亂弧菌的組合物、試劑盒和檢測(cè)方法，該組合物中可含有針對(duì)O1群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb-O1、O139群霍亂弧菌O抗原編碼基因rfb-O139和產(chǎn)生霍亂毒素的致病毒素基因ctxA的特異性引物。利用本發(fā)明的組合物或試劑盒，可快速鑒別樣品中是否存在O1和/或O139群霍亂弧菌，同時(shí)檢測(cè)其產(chǎn)生霍亂毒素的能力。本發(fā)明的組合物和試劑盒能夠靈敏地檢測(cè)出樣品存在的產(chǎn)毒型O1和/或O139群霍亂弧菌，其檢測(cè)敏感度為1.0×102拷貝每反應(yīng)體系。對(duì)O1群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.0×10-1pg每反應(yīng)體系，O139群霍亂弧菌基因組DNA的檢測(cè)敏感度為1.0×100pg每反應(yīng)體系。整個(gè)反應(yīng)可在2小時(shí)內(nèi)完成，并且在檢測(cè)19種其他致病菌時(shí)不存在非特異性擴(kuò)增。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101768636SQ20091007653公開日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年1月6日優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日發(fā)明者吳麗娟,楊輝,胡繼紅,蔡劍平,龔成申請(qǐng)人:蔡劍平