專利名稱：：一種釀酒酵母、含有該酵母的酵母制劑、飼料、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種釀酒酵母、含有該酵母的酵母制劑、飼料、其制備方法及其用途，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：自從發(fā)現(xiàn)詞用抗生素可以通過影響倡導(dǎo)微生物初期在宿主體內(nèi)的定植，從而起到促進(jìn)生長的作用之后，抗生素的應(yīng)用在畜牧業(yè)方面產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益。但是由于抗生素的大量使用，隨之出現(xiàn)的負(fù)面效應(yīng)也日益突出，表現(xiàn)為病原微生物產(chǎn)生耐藥性和藥物在動物產(chǎn)品中殘留，從而對人類的健康產(chǎn)生潛在的危害。因此，抗生素類替代品益生菌、酶制劑、酸制劑等的研究與開發(fā)成為近年來綠色飼料添加劑的熱點，其中益生菌備受關(guān)注。作為益生菌的一種，酵母菌制劑在動物生產(chǎn)中的作用是畜牧業(yè)的科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點。所謂酵母伺料，是指利用酵母菌的新陳代謝和繁殖菌體，經(jīng)過發(fā)酵和干燥等特殊工藝制成的含有活菌和酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物的安全、無污染、無殘留的優(yōu)質(zhì)飼料，主要的酵母培養(yǎng)物(yeastcultures,簡稱YC)是一種含有酵母菌賴以生長的培養(yǎng)基經(jīng)過酵母培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品，它營養(yǎng)豐富，含有維生素，礦物質(zhì)、消化酶、促生長因子和較齊全的氨基酸，適口性極好，是集營養(yǎng)保健為一體的生物活性添加劑。酵母培養(yǎng)物最早是用于反芻動物的蛋白質(zhì)補充料。Lei和Stahl(2001)研究表明，酵母培養(yǎng)物可提高反芻動物對詞料干物質(zhì)、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等有機物和磷的消化率，在飼料中添加酵母培養(yǎng)物可有效提高家畜對飼料粗蛋白質(zhì)、粗纖維，、一物質(zhì)、維生素等養(yǎng)分及能量的消化吸收;預(yù)防和治療腹脹腹瀉等消化不良癥狀;促進(jìn)幼、病畜胃腸道發(fā)育，增強機體的免疫力和抗病力，提高家畜生產(chǎn)性能對反芻動物主要是提高泌乳性能和產(chǎn)肉性能。酵母類產(chǎn)品的開發(fā)利用已成為飼料工業(yè)一個活躍領(lǐng)域，但也存在一些亟待解決的問題如產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、消化率低和成本高等。因此，培養(yǎng)繁殖力強、抗雜菌能力強、能產(chǎn)生齊全氨基酸和較高消化酶的菌種以生產(chǎn)出產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定、在體溫范圍內(nèi)具有較高活性的酵母類產(chǎn)品，以提高其利用率，同時改進(jìn)工藝、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品的市場競爭力以及對于畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康都非常有意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于提供一種釀酒酵母，該釀酒酵培養(yǎng)繁殖力強、抗雜菌能力強、能產(chǎn)生齊全氨基酸和較高消化酶。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種含有上述釀酒酵母的釀酒酵母制劑，該制劑能夠替代現(xiàn)有的抗生素飼料，并具有抗病、促生長的作用。本發(fā)明的第三個目的在于提供含有上述酵母制劑的動物飼料，該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。本發(fā)明的第四個目的在于提供上述酵母制劑、動物詞料的制備方法，該方法工藝簡單、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明的第五個目的在于提供上述釀酒酵母、酵母制劑在制備動物飼料方面的用途。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種釀酒酵母(Saccharomycescervisiae)，S19,2006年3月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登記入冊編號CGMCCNo,1666。該釀酒酵母細(xì)胞為卵圓形、圓形或圓柱形，無鞭毛，不運動，真菌細(xì)胞，細(xì)胞壁不含纖維素，以葡聚糖、甘露聚糖等多糖為主，還含有蛋白質(zhì)，脂類及幾丁質(zhì)等組分。酵母菌是一種結(jié)構(gòu)簡單的單細(xì)胞真核微生物，屬真菌類。酵母菌呈卵圓形、圓形或圓柱形，個體大，蛋白質(zhì)含量高；種類多，發(fā)酵底物范圍廣，易于培養(yǎng)；繁殖迅速，代謝旺盛且代謝產(chǎn)物很多。數(shù)千年前，酵母菌已被用于腌菜、釀酒和制面包，現(xiàn)代科技發(fā)展，使人們對酵母菌優(yōu)良特征的認(rèn)識更加深入，對其開發(fā)利用的熱潮連綿不斷。在畜牧業(yè)中，酵母菌的開發(fā)利用也不斷深化，結(jié)合酵母菌的特征，開辟出各種應(yīng)用途徑。酵母菌分布廣，在動物消化道中含有大量的酵母菌。研究表明，有些酵母菌可以在動物的消化道內(nèi)存活，對動物有益生作用。因此，本發(fā)明從仔豬的消化道內(nèi)的食糜及糞便中分離酵母菌，并研究其抗逆性能。本發(fā)明的釀酒酵母制劑為采用上述釀酒酵母在培養(yǎng)基中經(jīng)過充分培養(yǎng)、發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物與無機物混合，經(jīng)后處理得到的。所述的培養(yǎng)、發(fā)酵包括將釀酒酵母接種于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到的種子培養(yǎng)物再接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中的斜面培養(yǎng)基為適合酵母培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員都知曉何種培養(yǎng)基適合酵母培養(yǎng)。然而可以優(yōu)選為麥芽汁斜面培養(yǎng)基，這里所述的麥芽汁斜面培養(yǎng)基理解為以麥芽汁為主要成分，并還有其它合適成分的斜面培養(yǎng)基，并非僅僅含有麥芽汁的斜面培養(yǎng)基。所述其它合適成分可以為現(xiàn)有技術(shù)任何適合釀酒酵母培養(yǎng)的其它成分，這為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，但是仍可進(jìn)一步優(yōu)選培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉1030g，葡萄糖粉220g,瓊脂1030g，水5002000ml;優(yōu)選為麥芽汁粉1525g，葡萄糖粉515g,瓊脂1525g，水7001500ml;更優(yōu)選麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g,瓊脂20g，水1000ml。其中的液體培養(yǎng)基為適合酵母培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員也知曉這種液體培養(yǎng)基，其中可優(yōu)選麥芽汁斜面培養(yǎng)基，這里所述的麥芽汁斜面培養(yǎng)基理解為以麥芽汁為主要成分，并還有其它合適成分的斜面培養(yǎng)基，并非僅僅含有麥芽汁的斜面培養(yǎng)基。所述其它合適成分可以為現(xiàn)有技術(shù)任何適合釀酒酵母培養(yǎng)的其它成分，這為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，然而進(jìn)一步優(yōu)選的培養(yǎng)基配方為麥芽汁粉1030g，葡萄糖粉220g,水5002000ml;優(yōu)選麥芽汁粉1525g，葡萄糖粉515g,水7001500ml;更優(yōu)選麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000ml。應(yīng)用上述培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員一般都知曉具體培養(yǎng)過程，這里優(yōu)選為上述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)在154(TC下，培養(yǎng)1096小時。其中的斜面接種優(yōu)選在恒溫箱中2530。C下培養(yǎng)3555小時。前面所述的無機物為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的能夠作為飼料添加劑的無機物，本發(fā)明優(yōu)選所述無機物為輕質(zhì)碳酸鈣、稻殼粉、麩皮粉、硅藻土、石粉中的一種或幾種任意組合，更優(yōu)選輕質(zhì)碳酸鈣。其中培養(yǎng)物與無機物的比例優(yōu)選為1:0.51:10，進(jìn)一步優(yōu)選為1:11:5。所述的后處理為將培養(yǎng)液與無機物的混合物干燥、粉碎并制粒。這里所述的后處理方法為本領(lǐng)域常用處理方法，無需本領(lǐng)域技術(shù)人員再付出創(chuàng)造性勞動。本發(fā)明的動物飼料包括常用動物飼料和本發(fā)明的酵母制劑。其中酵母制劑的含量至少為0.001%，優(yōu)選為0.0013%，更優(yōu)選0.01%2%，最優(yōu)選0.05%0.2%。本發(fā)明的酵母制劑可以同目前市面上任何常用動物詞料進(jìn)行配合，即本發(fā)明所述動物飼料保護(hù)范圍不為配合的常用動物飼料種類所限制。然而其中的常用動物詞料可優(yōu)選為日糧，進(jìn)一步優(yōu)選為豬用日糧、雞用日糧、反芻動物用日糧和水產(chǎn)動物用日糧。對于不同的動物，其日糧的配方各不相同，但是，現(xiàn)有技術(shù)中公開的任何日糧都可以作為本發(fā)明的動物詞料，其配方都是該領(lǐng)域的公知常識。本發(fā)明的釀酒酵母、酵母制劑可以作為添加劑用于制備動物飼料，其中的動物包括但不限于豬、牛、羊、雞等各種動物，優(yōu)選作為豬。本發(fā)明的釀酒酵母及其釀酒酵母制劑主要作為動物的飼料添加劑，其可以替代現(xiàn)有動物日糧中的抗生素，改善消化道微生物區(qū)系、能刺激腸道內(nèi)有效微生物的增生，提供營養(yǎng)因子、促進(jìn)營養(yǎng)物的消化吸收、降低腹瀉、促進(jìn)動物的生長、提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。本發(fā)明的釀酒酵母及其釀酒酵母制劑對防治動物消化系統(tǒng)疾病起到保健作用，同時對幼年動物可刺激其胃腸道發(fā)育，所以將之作為飼料添加劑應(yīng)用在飼料中能起到抗病促生長的作用。同時，本發(fā)明的釀酒酵母及其釀酒酵母制劑無耐藥性和藥物在動物產(chǎn)品中殘留從而對人類的健康產(chǎn)生潛在的危害的可能，是一種有前途的綠色飼料添加劑。下面結(jié)合具體實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實施利用與理解而不是限制本發(fā)明。保藏說明菌種名稱釀酒酵母拉丁名Saccharomycescervisiae保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京朝陽區(qū)大屯路甲3號保藏日期2006年3月29日保藏中心登記入冊編號CGMCCNo.166圖1為S19菌種的發(fā)酵生長曲線；圖2為pH對S19菌株生長的影響；圖3為發(fā)酵溫度對S19菌株生長影響；圖4為用平皿挖溝法測定乳酸桿菌培養(yǎng)物對大腸桿菌的抑制示意圖。具體實施例方式實施例l本發(fā)明的釀酒酵母是從豬糞便中提取、分離、篩選、純化得到的。1.1試驗材料從北京、內(nèi)蒙古、福建、江西、廣東、湖南、山東、河南、河北等豬場取健康仔豬糞便，液氮冷凍后，運回北京，于低溫冰箱(85°C)保存。1.2培養(yǎng)基1.2.1麥芽汁培養(yǎng)基麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。1.2.2麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基麥芽汁粉20g,葡萄糖粉IOg，瓊脂20g，水IOOOmL。1.2.3酵母菌富集培養(yǎng)基蛋白胨0.5g、酵母膏0.5g、蔗糖2.Og、可溶性淀粉1.0g、MgS040.001g、ZnS040.04g、CuS040.005g、KH2P040,2g、蒸餾水100mL(滅菌冷凍到50。C)加氨青霉素濃度為lu/mL，或1%鏈霉素0.6mL。1.3耐酸性能選育制備pH2.1的麥芽汁培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的酵母菌，接種量1%，于28'C培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐酸。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的酵母菌的最初分離樣品保存在-85'C冰箱備用。1.4耐膽鹽性能選育制備含豬膽鹽0.3%的麥芽汁培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的酵母菌，接種量1%，于28。C培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐膽鹽。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的酵母菌的最初分離樣品保存在-85'C冰箱備用。1.5耐高銅性能選育制備含有0.1%五水硫酸銅的麥芽汁培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的酵母菌，接種量1%，于28'C培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐高銅。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的酵母菌的最初分離樣品保存在-85'C冰箱備用。1.6耐高鋅性能選育制備含有1%氧化鋅的麥芽汁培養(yǎng)基，接種已培養(yǎng)24h的酵母菌，接種量1%，于28'C培養(yǎng)24h后觀察。如果培養(yǎng)基變的渾濁，說明該菌株耐高鋅。然后鏡檢看是否染菌。能夠生長的酵母菌的最初分離樣品保存在-85'C冰箱備用2.結(jié)果與討論2.1酵母菌的分離本試驗從59個糞樣當(dāng)中篩選出786個酵母菌種。有的糞樣直接用麥芽汁培養(yǎng)基篩選不到酵母菌，在這種情況下，本試驗先用富營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后再進(jìn)行篩選。菌種的篩選是及其煩瑣的過程。大多數(shù)乳酸菌的選育過程是從消化道上皮分離益生菌，這樣便可已獲得具有良好定植效果的菌種。由于目前的研究結(jié)果認(rèn)為，酵母菌是動物消化道的路過菌，不會在消化道上皮定植，因此，本試驗直接從動物的糞便中分離酵母菌，以期獲得具有益生作用的菌種。2.2耐酸性能選育通過耐酸性能選育，有573株酵母可以在pH2.1的麥芽汁培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為27%。這說明糞便中的大多數(shù)酵母菌耐酸性能較好，有73%的可以在仔豬的胃中進(jìn)行繁殖。路過菌如果要發(fā)生益生作用往往是通過產(chǎn)生具有抗菌作用的物質(zhì)或產(chǎn)生大量的菌體以排斥其他有害菌的生長。因此，如果菌種對胃酸沒有耐受性很難對動物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生良好的作用。2.3耐膽鹽性能選育將通過耐酸性能選育的573株酵母進(jìn)行耐酸性能選育，有287株酵母可以在含膽鹽0.3%的麥芽汁培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為50%。研究表明，酵母菌的耐膽鹽性能比耐酸性能好一些。有研究表明，乳酸菌的耐膽鹽性能是可以馴化的，乳酸桿菌容易對膽鹽產(chǎn)生耐受性，且具有一定的遺傳性(Chou和Weimer，1999)。然而，酵母菌在這方面的報道較少。2.4耐高銅性能選育將通過耐膽鹽性能選育的287株酵母進(jìn)行耐高銅性能選育，有238株酵母可以在含膽鹽0.3%的麥芽汁培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為17%。由于酵母菌本身具有耐受和吸附重金屬離子的特性，其對高銅的抗逆性是較強的。由于高銅日糧具有促生長的作用，目前我國比較普遍使用的日糧，因此選擇具有耐高銅的酵母菌是極其必要的。2.5耐高鋅性能選育將通過耐高銅性能選育的238株酵母進(jìn)行耐高鋅性能選育，有63株酵母可以在200910076559.1說明書第7/22頁含膽鹽0.3%的麥芽汁培養(yǎng)基中生長繁殖，淘汰率為74%。高鋅具有防止腹瀉、促進(jìn)生長的作用，因此在我國利用氧化鋅來配制仔豬飼料，尤其是斷奶仔豬飼料的廠家很多。從本試驗的結(jié)果來看高鋅對酵母菌的殺傷力要高于高銅。3.小結(jié)通過本試驗獲得63株來源于仔豬糞便，對消化道內(nèi)環(huán)境有一定抵抗能力的酵母菌，這為以后的選種工作打下了基礎(chǔ)。一種釀酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19，2006年3月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號CGMCCNo.1666。該釀酒酵母細(xì)胞為卵圓形、圓形或圓柱形，無鞭毛，不運動，真菌細(xì)胞，細(xì)胞壁不含纖維素，以葡聚糖、甘露聚糖等多糖為主，還含有蛋白質(zhì)，脂類及幾丁質(zhì)等組分。實施例2酵母菌S19生物學(xué)特性的研究1.材料與方法1.1菌種由本實驗室篩選出的S19酵母菌。1.2培養(yǎng)基1.2.1麥芽汁培養(yǎng)基麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。1.2.2麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，瓊脂20g，水1000mL。1.2.3酵母菌培養(yǎng)基葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏1%、微量元素1%、瓊脂2%。1.2.4其他培養(yǎng)基豆芽汁培養(yǎng)液、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、無維生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)類淀粉化合物培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等，按現(xiàn)有技術(shù)方法制備。1.2.5菌種的特性1.2.5.1生物學(xué)特性S19菌接種于新鮮豆芽汁平板上，置28'C培養(yǎng)48h，取新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀察，記錄菌體的形態(tài)、大小和出芽方式。取S19菌接種于豆芽汁液體培養(yǎng)基，28'C培養(yǎng)48h后觀察生長表現(xiàn)。取S19菌劃線于新鮮豆芽汁平板，普通瓊脂平板，血瓊脂平板于28'C培養(yǎng)48h，記錄結(jié)果。假菌絲的形成(Dalmau平板法)。取融化并保溫在50。C左右的馬鈴薯浸汁瓊脂斜面培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)基平皿中，使凝成平板。將平皿倒置數(shù)小時使表面稍干，取28。C培養(yǎng)48h的S19菌少許分別在平板上劃線接種23條(拉開距離)。在其上蓋上滅菌蓋玻片(75%酒精浸泡滅菌，火焰烤干，待蓋玻片冷卻后蓋上)，輕壓擠出空氣，使造成厭氧環(huán)境。28'C培養(yǎng)35d后，用低倍鏡觀察假菌絲的生長狀況。1.2.5.2生理生化試驗(1)糖發(fā)酵試驗采用半固體法，按參考文獻(xiàn)[3]的方法制備。配制后裝入小試管做成半固體瓊脂培養(yǎng)基，于1.7X105Pa滅菌30min。滅菌后，取出小試管，待溫度冷卻至56'C時，每管加入0.1mL菌懸液，搖勻，迅速冷卻，使瓊脂凝固。28'C培養(yǎng)l2周，記錄結(jié)果。結(jié)果依下述原則描述"+"表示發(fā)酵，培養(yǎng)基由紫色變黃；"_"表示不發(fā)酵，培養(yǎng)基不變色。(2)其他生理生化試驗①碳源同化試驗。試驗采用生長譜法(auxanographicmethod)[1-2]。取每管裝有20mL碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管，滅菌并冷卻至56'C，每管加lmL菌懸液，充分搖勻，制成平板，凝固后于28'C倒置幾個小時，使表面稍干，在平板底部分區(qū)并標(biāo)上碳源標(biāo)記。用無菌不銹鋼匙按標(biāo)記于平板表面加碳源少許，28'C下培養(yǎng)l2d，觀察結(jié)果。以葡萄糖區(qū)和空白區(qū)作對照，能同化的則在碳源周圍形成生長圈，為陽性，記為"+"。有時為了避免臨近不同碳源的干擾，在不同碳源的分區(qū)交界之間用小鋼鏟鏟開一狹溝(平板中心不開溝)。②氮源同化試驗。采用氮源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其方法同碳源同化。在加氮源時，把少量所測氮源化合物點在平板上，如是亞硝酸鹽，則用接種針尖蘸取它的潮解液點在平板上，以避免濃度過量而抑制菌的生長。以硫酸銨和空白區(qū)作對照，記錄結(jié)果。陽性反應(yīng)者在所加試劑處或周圍有菌落生長，記為"+"。③類淀粉化合物的測定。某些菌在一定的基質(zhì)上能形成胞外類淀粉多糖化合物，該化合物遇碘呈藍(lán)色反應(yīng)。將28'C培養(yǎng)48h的S19菌接種于產(chǎn)類淀粉化合物的培養(yǎng)液中，28'C培養(yǎng)3周，加路哥氏碘液(Lugol，s)l2滴，如顏色變?yōu)樗{(lán)色，表示陽性,記為"+"。石蕊牛乳試驗。將28'C培養(yǎng)48h的S19菌分別接種于石蕊牛奶培養(yǎng)基，28'C下培養(yǎng)24周，觀察牛奶顏色的變化,以及是否凝固或胨化，并記錄結(jié)果。⑤耐高滲透壓的測試。取28'C培養(yǎng)48h的S19菌分別接種于含50%和60%D-葡萄糖酵母膏瓊脂斜面，用蠟紙封口以防干燥，置28'C培養(yǎng)12周后，觀察生長與否。◎尿素分解試驗。有些菌能產(chǎn)生脲酶，可分解尿素形成大量的氨，使培養(yǎng)基pH值升高，從而使酚紅指示劑呈紅色。取28'C培養(yǎng)48h的S19菌分別接種于水解尿素試驗的瓊脂斜面上，28。C培養(yǎng)57d，每天觀察結(jié)果。如瓊脂斜面變?yōu)榧t色，表示陽性,記為"+"。⑦無維生素培養(yǎng)基生長試驗。無維生素培養(yǎng)基生長試驗?zāi)康氖菧y定菌體本身是否能合成它生長所需的全部維生素。取28'C培養(yǎng)48h的S19菌接種于無維生素的培養(yǎng)液中，28i:下培養(yǎng)l2周，以不接菌的無維生素培養(yǎng)基作對照，觀察生長情況。為了防止造成假象，可將上述試驗中的菌液再接種1次，培養(yǎng)2周后觀察結(jié)果。在無維生素培養(yǎng)基中能生長者，表示它自身能合成生長所需的全部維生素,液體變混濁表示陽性，記為"+"。⑧37'C生長試驗。取28。C培養(yǎng)48h的S19菌分別接種于豆芽汁瓊脂斜面，置37°C下培養(yǎng)34d，觀察結(jié)果。如生長表示陽性，記為"+"。1.3發(fā)酵試驗1.3.1生長曲線測定將活化的S19菌種液體種子以0.5M(v/v)的接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度3rC，搖床轉(zhuǎn)速為120rmin-l，定期采用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。1.3.2最優(yōu)發(fā)酵pH測定將活化的S19菌種液體種子以0.5%(v/v)的接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基中(pH28)，培養(yǎng)溫度31。C，搖床轉(zhuǎn)速為120r，min-1，于發(fā)酵28h采用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。1.3.3最優(yōu)發(fā)酵溫度測定將活化的S19菌種液體種子以0.5%(v/v)的接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基中(pH6)，培養(yǎng)溫度2(TC50。C,搖床轉(zhuǎn)速為120rmin-1，于發(fā)酵28h采用稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。2.結(jié)果與討論2.1S19酵母菌的生物學(xué)特性28。C培養(yǎng)48h后，在豆芽汁瓊脂平板上，S19為直徑23mm，白色，圓形，中央隆起，邊緣整齊，不透明，表面干燥，有皺褶，中等大小的菌落。在豆芽汁液11體培養(yǎng)基中，S19菌液體稍渾濁，無沉淀，表面形成松散菌膜，細(xì)菌沿管壁匐行。在普通瓊脂平板和血瓊脂平板上均生長不良，且在血瓊脂平板上均不溶血。S19菌的染色、形態(tài)、大小、繁殖方式與假菌絲的形成見表1。表1S19的生物學(xué)特性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2S19酵母菌的生理生化試驗結(jié)果S19酵母菌生理試驗結(jié)果見表2。表2酵母菌生理試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>綜合上述試驗結(jié)果，依據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》、《微生物學(xué)實驗手冊》和《菌種保藏手冊》中的有關(guān)描述，S19菌為釀酒酵母(Saccharomycoscerevisiae)。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的酵母種已超過500種(分屬于60多屬)。在酵母屬的區(qū)分中，主要根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征(細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)特征、能否產(chǎn)生子囊孢子及假菌絲)，并結(jié)合少量生理生化特性。由于酵母形態(tài)比較簡單，缺乏明顯的細(xì)胞分化，對于種的劃分主要依靠生理生化特性，其中以糖的發(fā)酵和同化為最重要。在酵母菌糖發(fā)酵試驗中，常采用杜氏管法和艾氏管法，根據(jù)管中的產(chǎn)氣量進(jìn)行判斷結(jié)果。而在本試驗中,采用了半固體瓊脂法。以酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(產(chǎn)朊假絲酵母，由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實驗室提供)作對照，根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的變色和有無氣體的產(chǎn)生來判斷結(jié)果，克服了杜氏管法和艾氏管法中的一些缺點。在酵母菌的同化試驗中，最常用的試驗方法是液體培養(yǎng)試管法和生長譜法。在碳源同化試驗中，一些糖類在液體培養(yǎng)試管法中易造成假陽性結(jié)果，故采用生長譜法；在氮源同化試驗中，由于有些氮源化合物被酵母菌同化分解后的中間產(chǎn)物對酵母菌本身的生長有抑制作用，在液體培養(yǎng)試管法中常出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，因此，在本試驗氮源同化過程中也采用了生長譜法。2.3發(fā)酵試驗2.3.1S19菌株的生長曲線S19菌種的發(fā)酵生長曲線見圖1。生長曲線反映該菌的生長規(guī)律，作為一個生長菌種必須具有較短的遲滯期和較長的生長穩(wěn)定期。最初l12h為遲滯期，1228h為對數(shù)生長期，芽率較高，30h后進(jìn)入穩(wěn)定期，45h后進(jìn)入衰亡期，此時菌體死亡較多，活菌數(shù)較少，并出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象。2.3.2S19菌株的發(fā)酵最優(yōu)pHpH對S19菌株生長的影響見圖2。S19在pH值28的范圍內(nèi)都能生長，pH值為56時生長狀態(tài)最好，菌數(shù)最多，鏡檢時菌體形態(tài)規(guī)則，出芽率高。因此，在發(fā)酵過程中，起始pH應(yīng)調(diào)至5.5左右。2.3.3S19菌株的發(fā)酵最優(yōu)溫度發(fā)酵溫度對S19菌株生長影響見圖3?？梢钥闯霭l(fā)酵溫度在2535'C之間菌種生長較好，在253(TC培養(yǎng)時活菌數(shù)最高?？紤]到其他發(fā)酵因素的影響，發(fā)酵溫度應(yīng)在28°C。3小結(jié)通過S19菌種的生物學(xué)特性和生理生化試驗初步判定為釀酒酵母。其最適發(fā)酵溫度、時間和pH分別為28。C、24h和5.5。實施例3將實施例l得到的釀酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19,CGMCCNo.1666接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g,瓊脂20g，水1000ml，在恒溫箱中25'C下培養(yǎng)55小時，得到種子培養(yǎng)物，將該種子培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，麥芽汁液體培養(yǎng)基配方為麥芽汁粉20g,葡萄糖粉10g,水1000ml，在30'C下培養(yǎng)30小時，得到的培養(yǎng)物與輕質(zhì)碳酸鈣按照l:5的比例混合，經(jīng)干燥、粉碎得到釀酒酵母制劑。將上述酵母制劑同常見豬飼料混合，譬如糠麩類飼料、餅粕類飼料、糟渣類飼料、糧食類飼料、動物性詞料、青綠飼料等。其中酵母制劑含量為O.1%，用于豬用日糧。實施例4將實施例l得到的釀酒酵母(Saccharomycescervisiae)，S19，CGMCCNo.1666接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉30g，葡萄糖粉20g,瓊脂10g，水2000ml，在恒溫箱中30'C下培養(yǎng)35小時，得到種子培養(yǎng)物，將該種子培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，麥芽汁液體培養(yǎng)基配方為麥芽汁粉25g，葡萄糖粉15g，水1500ml，在15'C下培養(yǎng)96小時，得到的培養(yǎng)物與稻殼粉按照l:0.5的比例混合，經(jīng)干燥得到釀酒酵母制劑。將上述酵母制劑同常用家禽飼料混合，譬如碳水化合物類飼料、蛋白質(zhì)類飼料、青綠飼料等。其中酵母制劑含量為0.2%，用于雞用日糧。實施例5將實施例l得到的釀酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19，CGMCCNo.1666接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉10g,葡萄糖粉3g,瓊脂15g，水800ml，在恒溫箱中27'C下培養(yǎng)35小時，得到種子培養(yǎng)物，將該種子培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，麥芽汁液體培養(yǎng)基配方為麥芽汁粉10g,葡萄糖粉2g，水500ml，在4(TC下培養(yǎng)IO小時，得到的培養(yǎng)物與麩皮粉按照l:IO的比例混合，經(jīng)干燥得到釀酒酵母制劑。將上述酵母制劑同各種羊飼料混合，譬如青貯飼料、干草飼料、秸稈類飼料、精細(xì)飼料類等。其中酵母制劑含量為2%，用于羊用日糧。實施例6將實施例1得到的釀酒酵母(Saccharomycescervisiae),S19，CGMCCNo.1666接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉25g，葡萄糖粉15g，瓊脂25g，水1300ml，在恒溫箱中28'C下培養(yǎng)45小時，得到種子培養(yǎng)物，將該種子培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，麥芽汁液體培養(yǎng)基配方為麥芽汁粉25g，葡萄糖粉15g，水1600ml，在22'C下培養(yǎng)48小時，得到的培養(yǎng)物與硅藻土按照1:8的比例混合，經(jīng)干燥、制粒得到釀酒酵母制劑。將上述酵母制劑同常用魚類飼料混合，其中酵母制劑含量為0.01%，用于魚用日糧。實施例7將實施例l得到的釀酒酵母(Saccha，ycescervisiae)，S19，CGMCCNo.1666接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉15g，葡萄糖粉2g，瓊脂15g，水800ml，在恒溫箱中26。C下培養(yǎng)40小時，得到種子培養(yǎng)物，將該種子培養(yǎng)物接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，麥芽汁液體培養(yǎng)基配方為麥芽汁粉15g，葡萄糖粉5g，水700ml，在22'C下培養(yǎng)50小時，得到的培養(yǎng)物與石粉按照l:7的比例混合，經(jīng)干燥、制粒得到釀酒酵母制劑。將上述酵母制劑同常用牛飼料混合，其中酵母制劑含量為3%，用于牛用日糧。實驗例l釀酒酵母對仔豬生產(chǎn)性能和消化道微生物區(qū)系的影響。1.l材料與方法實驗動物選取20日齡斷奶的壯長大三元雜種仔豬180頭，平均體重7.56±0.52(斷奶后在哺乳舍飼養(yǎng)料7天，飼養(yǎng)教槽料)，按體重隨機區(qū)組分為5個處理組，每組六個重復(fù)，每個重復(fù)六頭仔豬。1.2釀酒酵母制劑，采用實施例25的釀酒酵母制劑，每克樣品中含有109個酵母。1.3飼養(yǎng)管理試驗于國家飼料工程技術(shù)研究中心實驗豬場進(jìn)行。實驗動物飼養(yǎng)于封閉、半漏縫地板式豬舍，每個重復(fù)飼養(yǎng)予一欄，自由采食，飲水。按常規(guī)免疫程序飼養(yǎng)管理。于每天7:00;12:00;4:30測定溫度、相對濕度，晚間250w紅外線燈泡保溫(懸掛，高出創(chuàng)面70厘米)。試驗期21天。根據(jù)黃霉素和釀酒酵母制劑的添加水平設(shè)計五種日糧，分別是基礎(chǔ)日糧、基礎(chǔ)日糧+10mg/kg，基礎(chǔ)日糧+0.05%釀酒酵母制劑，基礎(chǔ)日糧+0.1%釀酒酵母制劑，基礎(chǔ)日糧+0.15%釀酒酵母制劑。釀酒酵母制劑可以直接加到基礎(chǔ)日糧中混合喂食，也可以單獨喂食；釀酒酵母制劑采用實施例3的產(chǎn)品?；A(chǔ)日糧的組成及營養(yǎng)水平見表4:表4基礎(chǔ)日糧的組成及營養(yǎng)水平原料配方(%)營養(yǎng)成分營養(yǎng)水平玉米54DE34401cal/kg膨化全脂大豆14Cp(%)20.50帶皮豆粕14Lys賴氨酸(％)1.40秘魯魚粉4Met蛋氨酸(%)0.38SDPP-13M+C(%)0.77低蛋白乳清粉6.7Ca%0.82大豆油1P(%)0.66石粉0.88TP%0.50磷酸二氫鈣1.1Salt%0.51^"鹽0.1賴氨酸0.19蛋氨酸0.03復(fù)合預(yù)混料1總計100.001.4測定指標(biāo)試于0d，10d，21d早晨空腹稱重一次，及酸品均日增重，品均料肉比，全期腹瀉率。實驗結(jié)束時，對照組、抗生素組和釀酒酵母制劑2的每個重復(fù)隨機取1投仔豬，宰殺后取十二指腸、空腸和回腸食糜，與-8(TC冷凍保存，待測。大腸桿菌用麥康凱培養(yǎng)基計數(shù)，酵母軍用麥芽汁培養(yǎng)基計數(shù)，乳酸菌用MRS滾管法計數(shù)。1.5統(tǒng)計分析測定結(jié)果利用SAS軟件采用GLM程序進(jìn)行統(tǒng)計分析，并進(jìn)行Duncun(Duncun需要解釋一下，前面兩個比較通用，Duncun不熟悉，可能會公開不充分)多重比較。2.結(jié)果與討論飼料中添加不同水平的釀酒酵母制劑對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響見表5。實驗結(jié)果表明，日糧中添加黃霉素可以顯著提高斷奶仔豬前期的日增重(ADG，P<0.05)，抗生素組的仔豬平均日增重較對照組提高了8%，而黃霉素組對斷奶仔豬的料肉比(F/g)沒有顯著影響(P>0.05)。斷奶仔豬日糧中添加釀酒酵母可以顯著提高斷奶仔豬前期的日增重(P<0.05)，釀酒酵母組l的仔豬平均日增重(ADG)較對照組提高了8%，釀酒酵母組2較對照組提高了12%,釀酒酵母組3與對照組沒有顯著性影響(P〉0.05)?？股睾歪劸平湍笇ψ胸i生產(chǎn)性能的影響沒有顯著性差異(P〉0.05)。在試驗后期，雖然抗生素和釀酒酵母對仔豬生產(chǎn)性能有影響，但是沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(P〉0.05)。16日糧中添加抗生素可以降低斷奶仔豬腹瀉率(P<0.05)，日糧中添加釀酒酵母也可以降低端奶仔豬腹瀉率(P<0.05)。釀酒酵母組l對仔豬腹瀉的防治效果要好于抗生素(P<0.05=，其他組無顯著性差異(P>0.05)。表5詞料中添加不同水平的釀酒酵母制劑對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其中F/G為料肉比。飼料中添加不同水平的釀酒酵母制劑對斷奶仔豬糞便微生態(tài)區(qū)系的影響見表6。可以看出，飼料中添加釀酒酵母后，可以明顯改變消化道區(qū)微生態(tài)區(qū)系(P<0.05)。添加釀酒酵母制劑后，在仔豬十二指腸、空腸和回腸食糜中酵母菌的檢出數(shù)量較抗生素組和對照組顯著提高(P<0.01)。添加抗生素和釀酒酵母制劑顯著提高十二指腸、空腸和回腸食糜中乳酸菌的檢出數(shù)量(P<0.05)。同時，大腸桿菌的檢出數(shù)量顯著降低(P<0.05)這表明，釀酒酵母制劑和抗生素一樣通過改變消化道區(qū)微生態(tài)區(qū)系，使之有利于仔豬的消化道健康，從而達(dá)到提高動物生產(chǎn)性能的目的。表6飼料中添加的釀酒酵母制劑對斷奶仔消化道微生態(tài)區(qū)系的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>對于動物詞料中常用的其他抗生素，維吉尼霉素、恩3立霉素、泰樂菌素、土霉素或金霉素也分別進(jìn)行了上述實驗，同樣發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加本發(fā)明的釀酒酵母制劑后，抗生素和釀酒酵母對仔豬生產(chǎn)性能的影響沒有顯著性差異(P>0.05)，釀酒酵母對仔豬腹瀉的防治效果要好于抗生素(P<0.05);添加本發(fā)明的釀酒酵母制劑后，在仔豬十二指腸、空腸和回腸食糜中酵母菌、乳酸菌的檢出數(shù)量較抗生素組和對照組顯著提高(P<0.01);大腸桿菌的檢出數(shù)量顯著降低(P<0.05)。實驗例2本試驗使用實施例25的釀酒酵母分別以0.1%和0.05%添加到肉雞日糧中，與正對照(使用抗生素)和負(fù)對照(不使用抗生素)進(jìn)行對比試驗，進(jìn)一步驗證釀酒酵母對肉雞生產(chǎn)性能及其在肉雞生產(chǎn)中的適宜添加量。1、材料與方法1.1試驗動物與設(shè)計試驗選用1日齡健康肉雞雛480羽，公母各半按體重隨機分成4個處理。處理A為正對照組(使用抗生素)；處理B為負(fù)對照(不使用抗生素)；處理D為0.10X釀酒酵母組；處理E為0.05X釀酒酵母組。具體試驗設(shè)計見表7。1.2飼養(yǎng)管理試驗山東進(jìn)行。試驗雞采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，家用煤爐供暖。自由采食和飲水。03曰齡光照時間為24h/d，4日齡到出欄光照時間為23h/d。按照公司現(xiàn)行肉雞免疫程序接種疫苗，除進(jìn)雞雛前后三天外，每天兩次帶雞消毒。1.3試驗日糧配制各組試驗日糧均按照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》2004配制，日糧組成及營養(yǎng)成分見表7。表7:試驗設(shè)計處理基礎(chǔ)日糧添加劑及添加量處理重復(fù)數(shù)重復(fù)雞數(shù)備注A白羽雞日糧抗生素620正對照B白羽雞日糧空白620負(fù)對照D白羽雞日糧0.1%添加釀酒酵母620試驗組E白羽雞日糧0.05%添加釀酒酵母620試驗組1.4測量指標(biāo)雞群在l、21、42、49日齡以欄為單位對試驗雞進(jìn)行稱重，在21、42、49日齡以欄為單位記錄耗料量和雞只的死淘數(shù)，并計算平均日增重、平均日采食量和料肉比。181.5統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)采用ExceL和SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。2、試驗結(jié)果2.1釀酒酵母對肉雞生產(chǎn)性能的影響分別對肉雞生長過程中的各個階段和全程的生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計，觀察雞在各個階段的生長情況，進(jìn)而分析日糧中添加釀酒酵母對肉雞生長性能的影響，釀酒酵母不同添加量對肉雞的影響及釀酒酵母作為抗生素替代品在肉雞生產(chǎn)中應(yīng)用的可能性。肉雞各個不同生長階段生產(chǎn)性能的結(jié)果見表8。表8試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*預(yù)混料為每公斤全價料提供維生素A，14400IU;維生素D，1800IU;維生素E，20mg;維生素K,1.5mg;維生素B〃2.25mg;維生素B2，9mg;泛酸鈣，15mg;煙酸，30mg;維生素B6，3mg;維生素Bu，0.025mg;葉酸，0.75;膽堿，雨Omg;Mn，60mg;Zn，40mg;Fe，80mg;Cu，8mg;1,0.35;Se,0.15mg。從表9可以看出，在前21天，釀酒酵母組肉雞的平均日增重與對照組沒有顯著差異(p>0.05)，釀酒酵母組間亦沒有顯著差異(p>0.05);在平均日采食量方面，E組(含0.05%釀酒酵母)肉雞顯著低于對照組和D組(含0.10%釀酒酵母)(p<0.05);E組(含0.05%釀酒酵母)的料肉比顯著低于對照組和D組(含0.10%釀酒酵母)(p<0.05)。在成活率方面，E組(含0.05%釀酒酵母)略高于其他幾組但差異不顯著(p>0.05)。在前42天，釀酒酵母組肉雞的平均日增重顯著高于對照組(p<0.05)，料肉比顯著低于對照組(p<0.05)，而兩個釀酒酵母組間差異不顯著(p>0.05);平均日采食量各組間沒有顯著差異(p>0.05)。成活率方面，A纟卩.(抗生素組)略低于其他二組，但差異不顯著(p>0.05)。從整個試驗來看，釀酒酵母組肉雞的平均日增重顯著高于對照組(p<0.05)，料肉比顯著低于對照組(p<0.05);D組(含0.10%釀酒酵母)肉雞的平均日增重高于E組(含0.05%釀酒酵母)，但差異不顯著(p>0.05);在料肉比上E組(含0.10%釀酒酵母)略好于D組(含0.05%釀酒酵母)，但差異不顯著(p>0.05)。A組(抗生素組)的平均日增重和料肉比兩項指標(biāo)略好于B組(空白組)，但差異不顯著(p〉0.05)。成活率各組間沒有顯著差異(p>0.05)。表9:肉雞生產(chǎn)性能結(jié)果曰齡組別Ac正對照)B(負(fù)對照)D(0.1%釀酒酵母)E(0.05%釀酒酵母)平均日增重(g)30.33士0,56a30.45士0.29a30.17士0.44a30.43士0.23a1-21平均日采食量(g)41.71土0.81a41.59士0.61a41.21士0.63a40.76士0.64b料肉比1.376±0.010a1.366士0.013a1.366土0.015a1.340士0.017b成活率(％)98.34±5.1298.33±4.3698.34±3.6899.17±0.78平均日增重(g)48.69士0.36a48.036士0,25a50.68士0.98b50.61士0.42b1-42平均日采食量(g)90.26±3.2189.83±0.3989.54±0.5389.08±0.43料肉比1.854士0.018a1.870±0.013a1.768士0.023b1.761士0細(xì)b成活率(％)95.85±2.3196.65±1.0296.65±2.0196.65±1.32平均日增重(g)53.95土0.58a54.82土0.34a56.28士0.48b55.76土0.19b1-49平均日采食量(g)104.58±0.67104.81±0.30106.13±0.29104.76±0.27料肉比1.944士0.068a1.915士0.045a1.889士0.019b1.881士0.052b成活率(％)95±1.4395±2.1395±1.5495士1.363.討論本次試驗的結(jié)果表明，前21天在提高肉仔雞的生產(chǎn)性能方面，釀酒酵母與抗生素具有同樣的作用效果。到了42天，釀酒酵母的作用效果逐漸明顯，釀酒酵母組肉仔雞的平均日增重顯著高于對照組(正、負(fù))(p<0.05),料肉比顯著低于對照組(正、20負(fù))(p<0.05)。從49天的試驗來看，釀酒酵母組肉仔雞的平均日增重顯著高于對照組(正、負(fù))(p<0.05)，料肉比顯著低于對照組(正、負(fù))(p〈0.05);而兩組釀酒酵母組在平均日增重和料肉比方面差異不顯著(p>0.05)。以上的試驗結(jié)果表明，釀酒酵母應(yīng)用在肉仔雞日糧中可以提高肉仔雞的生產(chǎn)性能，比抗生素的作用效果更加明顯。兩組釀酒酵母組(0.10%、0.05%)之間沒有顯著差異(P>0.05)，因此釀酒酵母在肉仔雞日糧中添加量可以考慮在0.05%為宜。4.結(jié)論本次試驗可以得出以下結(jié)論1)在肉雞日糧中釀酒酵母可以促進(jìn)肉雞的生長，提高飼料的轉(zhuǎn)化效率；2)釀酒酵母可以替代抗生素在肉雞日糧中應(yīng)用，其適宜的添加量為0.05%。采用牛、羊、鴨、魚等各種動物分別進(jìn)行上述實驗，結(jié)果相似。對本發(fā)明實施例46得到的釀酒酵母制劑也分別進(jìn)行了實驗，結(jié)果基本相同。對于其他常用動物詞料也進(jìn)行了實驗，結(jié)果與本實驗例基本相同。上述實驗表明，飼料中添加釀酒酵母制劑可以替代抗生素，促進(jìn)動物生長、改善消化道微生態(tài)區(qū)系、提高動物的細(xì)胞免疫水平。實驗例3不同酵母菌對于大腸桿菌的作用比較1.材料與方法1.1酵母菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌能力的選育大腸桿菌(K88、K99和987P)購自中國獸藥監(jiān)察所。K88在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44742，K99在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44820，987P在中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心的保藏號為CMCC44317。酵母菌63株耐酸、膽鹽、高銅和高鋅的酵母菌。培養(yǎng)基麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基(購自北京天壇生物制品股份有限公司)。麥芽汁培養(yǎng)基麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。抑制大腸桿菌試驗制作麥康凱培養(yǎng)基，加熱溶解后在121'C高壓滅菌15min后，無菌傾倒平皿。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區(qū)域，每個區(qū)域用接種棒劃線接種大腸桿菌培養(yǎng)液(4.0X108CFU/mL)于培養(yǎng)基表面，然后在距平皿中線約3cm的地方挖一寬為0.5cm的溝，溝與接種劃線垂直，用熱接種棒補底，如圖4所示。分別用不同的酵母菌培養(yǎng)物將溝填滿(不能溢出)，其中圖4中1即為填充酵母菌培養(yǎng)物的溝，置普通培養(yǎng)箱28'C培養(yǎng)24h后，觀察出現(xiàn)大腸桿菌菌落的位置，大腸桿菌的菌落為紅色，測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離。每個酵母菌作兩個平行樣，以平均值表示結(jié)果。1.2酵母菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)抑制作用選育大腸桿菌(K88、K99和987P)來源同上。酵母菌11株腸代謝產(chǎn)物對大腸桿菌具有較強抑制作用的酵母菌。大腸桿菌的檢測培養(yǎng)基麥康凱(MacConkay)培養(yǎng)基同上。隨機選擇一株酵母菌，取5mL培養(yǎng)物(8.2xl09CFU/mL)分別與15mL營養(yǎng)肉湯混合，制成含酵母菌培養(yǎng)物濃度的營養(yǎng)肉湯，接種大腸桿菌，接種量為培養(yǎng)液的5%，置37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4、8和18h后，分別用無菌注射器取出培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋成10-210-5后，每個稀釋度作4個平行樣，取0.3mL稀釋液，用"L"棒均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，置于37°C，普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，取菌落數(shù)在50150個的平皿計數(shù)，以平均值表示結(jié)果，計算每毫升培養(yǎng)液中大腸桿菌的數(shù)量。1.3酵母P-1,3/1,6-葡聚糖含量檢測1.3.1主要試劑氫氧化鈉(分析純)；醋酸(分析純)；葡萄糖(分析純)。1.3.2主要實驗設(shè)備干燥箱；三角瓶；高壓鍋；恒溫水浴鍋；分光光度計；分析天平(感量為0.001克)。1.3.3主要試劑的配制氫氧化鈉溶液分別配制3%的氫氧化鈉溶液。3%醋酸取3mL冰醋酸溶液定容至100mL。1.3.4酵母e-1,3/1,6-葡聚糖的制備過程取不同酵母發(fā)酵液離心，固形物干燥，取50g，加入250mL氫氧化鈉溶液，在120。C加熱3h。等冷卻至室溫后，離心(1000xg，IO分鐘)，進(jìn)行固液分離。棄去上清液后，加250mL水于剩余不溶物中，攪拌均勻，再離心(方法同上)。如此重復(fù)2次。再向不溶物中加入2.5L醋酸溶液(3%，v/v)攪拌均勻。然后在85'C水浴中保溫1h。如上述方法再進(jìn)行固液分離，并同樣洗滌2次。剩余不溶物在40'C干燥。2.結(jié)果與討論2.1酵母菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌的抑制作用酵母菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的效果以離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離為指標(biāo)，距離越大，說明抑菌效果越好。本試驗所采用的平皿挖溝法是對經(jīng)典的平皿挖孔法的改進(jìn)，基本原理是放置在溝中的抗菌物質(zhì)能滲透過瓊脂來抑制大腸桿菌，隨著離溝距離的增大，能滲透過去的抗菌物質(zhì)的濃度就越小。大腸桿菌菌落與小溝的距離越大，說明酵母菌代謝產(chǎn)物所含抗菌物質(zhì)的抑菌能力越強。用平皿挖溝法在同一平皿可以同時測定酵母菌代謝產(chǎn)物對3株大腸桿菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能測定對一株大腸桿菌的抑制作用。63株酵母菌對大腸桿菌K88、K99和987p的抑菌距離在1.02.6ctn之間，其中11株抑菌較好的見表10。表10酵母菌對大腸桿菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>2.2酵母p-l,3/l,6-葡聚糖含量檢測由表11可以看出S19、H02和H14的|3-1,3/1,6-葡聚糖含量分別為9.2%、8.9%禾口9.1%。P-l,3/l,6-葡聚糖具有提高動物免疫機能的作用，因此，含量越高該菌種產(chǎn)生的益生作用越好。表11酵母e-1,3/1,6-葡聚糖含量<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>2.3酵母菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)抑制作用選育由表12可以看出，酵母菌對大腸桿菌的抑制作用是不同的，但是基本上與上一個試驗結(jié)果吻合。這說明酵母菌主要是通過代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌的增值，其中與S19混合培養(yǎng)的大腸桿菌未檢出。表12酵母菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)的抑制作用(單位CFU/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>63.小結(jié)通過本研究表明，酵母菌的益生作用主要是通過代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的。從綜合益生效果來看S19是最佳菌株。權(quán)利要求1.一種釀酒酵母，為SaccharomycescervisiaeS19，2006年3月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號CGMCCNo.1666。2.—種釀酒酵母制劑，其特征在于，為采用權(quán)利要求1的釀酒酵母在培養(yǎng)基中經(jīng)過充分培養(yǎng)、發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物與無機物混合，經(jīng)后處理得到的。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母制劑，其特征在于，所述的培養(yǎng)、發(fā)酵包括將釀酒酵母接種于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到的種子培養(yǎng)物再接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的釀酒酵母制劑，其特征在于，所述的斜面培養(yǎng)基為適合酵母培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，優(yōu)選麥芽汁斜面培養(yǎng)基，其中優(yōu)選的培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉1030g,葡萄糖粉220g，瓊脂1030g，水5002000ml;優(yōu)選為麥芽汁粉1525g,葡萄糖粉515g，瓊脂1525g，水7001500ml;更優(yōu)選麥芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，瓊脂20g，水1000ml;所述的液體培養(yǎng)基為適合酵母培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，優(yōu)選麥芽汁斜面培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的配方為麥芽汁粉1030g，葡萄糖粉220g，水5002000ml;優(yōu)選麥芽汁粉1525g,葡萄糖粉515g,水700■ml;更優(yōu)選麥芽汁粉20g,葡萄糖粉10g，水1000ml。5.根據(jù)權(quán)利要求34任何一項所述的釀酒酵母制劑，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)為在154(TC下，培養(yǎng)1096小時；其中的斜面接種優(yōu)選在恒溫箱中，253(TC下培養(yǎng)3555小時。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母制劑，其特征在于，所述的無機物為適合作為飼料添加劑的無機物，其中優(yōu)選輕質(zhì)碳酸鈣、稻殼粉、麩皮粉、硅藻土、石粉，更優(yōu)選輕質(zhì)碳酸鈣，培養(yǎng)物與無機物的比例為1:0.51:10，優(yōu)選l:11:5。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的釀酒酵母制劑，其特征在于，所述的后處理為將培養(yǎng)液與無機物的混合物干燥、粉碎并制粒。8.含有權(quán)利要求27任何一項的酵母制劑的動物飼料，包括常用動物飼料和權(quán)利要求27任何一項的酵母制劑，其中酵母制劑的含量為0.001%3%，優(yōu)選9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的動物飼料，其中的常用動物飼料為日糧，優(yōu)選豬用日糧、雞用日糧、反芻動物用日糧或水產(chǎn)動物用日糧。10.權(quán)利要求l的釀酒酵母或權(quán)利要求27任何一項的釀酒酵母制劑在制備動物飼料上的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種釀酒酵母、含有該釀酒酵母的釀酒酵母制劑、動物飼料、其制備方法及其用途，其中的釀酒酵母為SaccharomycescervisiaeS19，2006年3月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號CGMCCNo.1666。所述的釀酒酵母制劑，為采用該釀酒酵母在培養(yǎng)基中經(jīng)過充分培養(yǎng)、發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物與無機物混合，經(jīng)后處理得到的。本發(fā)明的釀酒酵母及其釀酒酵母制劑主要作為動物的飼料添加劑，其可以替代現(xiàn)有動物日糧中的抗生素，改善消化道微生物區(qū)系、能刺激腸道內(nèi)有效微生物的增生，提供營養(yǎng)因子、促進(jìn)營養(yǎng)物的消化吸收、降低腹瀉、促進(jìn)動物的生長、提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。文檔編號C12N1/18GK101463329SQ200910076559公開日2009年6月24日申請日期2009年1月7日優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日發(fā)明者宋青龍,張建東,汪梅芳,譙仕彥申請人:北京龍科方舟生物工程技術(shù)中心