專利名稱：一種糖尿病食療酵母及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖尿病食療酵母及其構(gòu)建方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種嚴重威脅人類健康和生命的代謝紊亂性疾病。就糖尿病患病人數(shù)而言，已經(jīng)接近于流行的比例。目前，用于治療2型糖尿病的藥物中，除了磺脲類、二甲雙胍、 阿卡波糖以及噻唑烷二酮類等化學藥物外，還包括肽類藥物胰島素。它們通過不同的機制 來降低血糖，但是這些藥物不能阻止β細胞的死亡或者促進β細胞的新生。所以，2型糖 尿病患者使用上述方法治療，依然無法避免β細胞功能持續(xù)下降。胰高血糖素樣肽-1 (glucagons-like ρ印etade-1，GLP-1)是一種來自腸道L 細胞加工分泌的多肽類激素，有望成為繼胰島素之后又一種治療糖尿病的重要多肽類藥 物。研究表明，GLP-I具有增加外周細胞胰島素受體對胰島素敏感性；改善β-細胞功 能，增加細胞數(shù)量；促進胰島素原合成，胰島素分泌，降低血糖和糖化血紅蛋白，抑制 胰高血糖素分泌等功能(Endocr. Rev.，May 1,2008 ；29 (3) :367_379，PNAS, September 5， 2006 ；103(36) 13468-13473.，Diabetes Care, October 1,2004 ；27(10) :2554_2559， Lancet 2002 ；359 824-830, Endocrinol, 1992,130 159-166, Diabetes,1989,38(3) 338-342，Endocrinology,1995,136 :4910_4917，Euro J Endocrinol,2000,143 :717_725， J Clin Invest,2000,105 :955_965，Diabetes，1999，48 2270-2276,Endocrinology, 2003, 144(4) 1444-1455, Endocrinology,2003,144(12) :5149_5158，J Clin Invest,1993,91 301-307，Diabetes, 1989，38 :902_909，Diabetologia, 1993，36 :741_744，Diabetes, 1989， 38 :902-909)，并且上述功能是血糖依賴性的，不會產(chǎn)生糖尿病治療中最嚴重的急性低血糖 等副作用。但是，由于受到血漿中二肽基肽酶(DPP-IV)降解作用，天然GLP-I在血漿中的 半衰期很短，無法實現(xiàn)臨床應(yīng)用。因此，眾多研究者采取改變天然GLP-I中受該酶作用的氨 基酸位點來抵抗二肽酶降解的策略(No. 5118666，W090/11296, PCT/US89101121)，以延長 GLP-I半衰期。肽類藥物的制備除了化學合成技術(shù)以外，還可以用DNA重組技術(shù)。據(jù)報道，已有的 利用生物細胞表達GLP-I或者GLP-I類似物的專利包括CN1363654A (利用大腸桿菌包內(nèi) 表達GLP-I (7-36))，CN1865430A (利用畢赤酵母表達GLP-I類似物)以及US6110703 (利用 釀酒酵母表達GLP-1)。然而，上述表達策略是針對GLP-I (或者GLP-I類似物)單分子表達，以及以獲得 單分子蛋白為主要目的。本發(fā)明則旨在通過在釀酒酵母中表達十拷貝串聯(lián)長效胰高血糖素 樣肽-1，以提高長效胰高血糖素樣肽-1表達效率(rolGLP-Ι)，并最終以口服表達rolGLP-1 的重組釀酒酵母來治療2型糖尿病為目的。此外本發(fā)明利用DNA合成技術(shù)，既將天然GLP-I 中的胰蛋白酶水解位點去除又將其中的DPP-IV水解位點去除，這樣既避免了表達產(chǎn)物在 腸道內(nèi)被降解失活的可能，又延長了其在體內(nèi)的半衰期，確保了降低血糖的長效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是構(gòu)建一種穩(wěn)定表達長效胰高血糖素樣肽-1的重組釀酒酵母。
本發(fā)明所構(gòu)建的重組釀酒酵母，是將十拷貝串聯(lián)的rolGLP-Ι編碼基因?qū)脶劸?酵母BJ2407，得到穩(wěn)定表達十拷貝rolGLP-Ι融合蛋白的菌株；所述rolGLP-Ι編碼基因的 核苷酸序列通過DNA合成技術(shù)將天然GLP-I第8、26和34位氨基酸替換后獲得；所述十拷貝 rolGLP-Ι編碼基因的核苷酸序列是先根據(jù)rolGLP-Ι編碼基因的核苷酸序列合成兩種類型 核苷酸序列以及前后兩種補平用引物片段，進而利用合成的核苷酸序列進行分步退火一步 連接后獲得。十拷貝串聯(lián)的rolGLP-Ι編碼基因表達單元的兩端分別連接有選自釀酒酵母 核糖體 RNA 基因(rDNA)序列(GenBank 編號為 NC001144) 29813-30888 位以及 30889-31728 位的核苷酸序列。為了便于篩選，在導(dǎo)入rolGLP-Ι編碼基因的同時還將釀酒酵母乳清酸核 苷-5'-單磷酸脫羧酶基因URA3—同導(dǎo)入釀酒酵母BJ2407;所述乳清酸核苷-5'-單磷 酸脫羧酶基因URA3核苷酸序列的GenBank編號為NP010893。所述rolGLP-Ι編碼基因，rDNA核苷酸序列以及乳清酸核苷_5 ‘-單磷酸脫羧酶 基因URA3是來自重組質(zhì)粒pNK-GLP，pNK-GLP圖譜如圖3。本發(fā)明的第二個目的是提供一種構(gòu)建上述重組釀酒酵母的方法。本發(fā)明提供的構(gòu)建上述重組釀酒酵母的方法，首先是針對天然GLP-I編碼基因的 核苷酸序列設(shè)計新的序列，獲得既能夠抵抗體內(nèi)DPP-IV酶降解并延長其體內(nèi)半衰期，又能 夠抵抗胰蛋白酶降解，在腸道內(nèi)保持其發(fā)揮生物學功能所需的結(jié)構(gòu)。根據(jù)設(shè)計的序列分別 合成I型、II型和左右連接補平引物片段；進而用分步退火一步連接法獲得十拷貝串聯(lián) rolGLP-Ι編碼基因的核苷酸序列。十拷貝rolGLP-Ι的核苷酸序列編碼的融合蛋白中的每 個rolGLP-Ι的N末端為精氨酸，通過胰蛋白酶降解可以得到有效釋放。利用PCR方法擴增得到兩段釀酒酵母核糖體RNA基因(rDNA)序列(GenBank編號 為NC001144的29813-30888以及30889-31728)，釀酒酵母乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧 酶基因URA3 (GenBank編號為NP010893)以及來自質(zhì)粒pYX212的表達元件(TPI表達盒)， 并將上述擴增得到的DNA序列分別克隆到質(zhì)粒pUC18的SaCI/EC0RI、PstI位點、Sall/Xbal 和Xbal/Kpnl位點，得到整合型載體pNKl。所述十拷貝rolGLP-Ι編碼基因克隆到pNKl的BamHI/Smal位點得到表達載體 pNK-GLP。通過HpaI線性化表達載體，并轉(zhuǎn)化釀酒酵母BJ2407 ；通過Ura+表型篩選重組釀 酒酵母。目前，許多具有生物活性的肽類物質(zhì)(如胰島素、降鈣素、GLP-I等)都可以利用不 同的修飾和加工策略通過非注射給藥途徑(如口腔內(nèi)、胃腸內(nèi)、肺部等)提高生物利用度， 改善相應(yīng)疾病癥狀。釀酒酵母是公認的可食用的安全性微生物，并被廣泛應(yīng)用于食品和藥 品生產(chǎn)。同時其本身富含維生素、消化酶等營養(yǎng)活性物質(zhì)，還是傳統(tǒng)的酵母茶或酵母飲料的 原材料。本發(fā)明利用釀酒酵母體內(nèi)的易發(fā)生同源重組的特性，將帶有釀酒酵母rDNA序列的 具有DPP-IV和胰蛋白酶穩(wěn)定性的十拷貝rolGLP-Ι編碼基因表達盒整合到酵母基因組DNA 中的rDNA串聯(lián)多拷貝區(qū)，得到既具有多拷貝rolGLP-Ι編碼基因，又能夠穩(wěn)定表達rolGLP-1 的重組酵母。通過進行高血糖大鼠灌胃高劑量重組釀酒酵母的活體試驗，確證rolGLP-Ι具有明顯的降低高血糖大鼠血糖水平的生物學活性，同時表明表達rolGLP-Ι的重組釀酒酵 母有望被用于糖尿病的治療。本發(fā)明也為進一步開發(fā)以有益腸道微生物為載體的具有高效 降血糖活性的生物藥物開辟了一條新途徑。


圖1十拷貝rolGLP-Ι編碼基因構(gòu)建過程。
圖2整合載體pNK-GLP構(gòu)建流程圖。圖3重組釀酒酵母SG2的Southern blot分析結(jié)果。圖4釀酒酵母BJ2407和重組酵母菌株SG2細胞裂解物的SDS-PAGE (A)和Western blot (B)分析結(jié)果。圖5重組酵母SG2的遺傳穩(wěn)定性(A)和rolGLP-Ι的Western blot (B)分析結(jié)果。圖6連續(xù)灌胃重組酵母20天后高血糖大鼠的血糖變化。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、十拷貝rolGLP-Ι編碼基因的構(gòu)建(圖1)。根據(jù)文獻報道的天然GLP-I基因序列(Genbank號為X03991的7196-7306位核苷 酸序列)設(shè)計并合成rolGLP-Ι基因的I、II型和左右連接補平引物I型引物片段I-I 5' -AGTTCTTACC AGCAGCTCAA GAATTCATCG AGATGGCCGT-3‘1-2:5' -TTGAGCTGCT GGTAAGAACT TACATCAGAT CCTCAGAATG-3‘II型引物片段II-I 5' -CATTCTGAGG AGCAGCTCAA GAATTCATCG AGATGGCCGT-3‘11-2:5' -TTGAGCTGCT CCTCAGAATG ACGGCCATCT CGATGAATTC-3‘前端連接補平引物5'-CATTCTGAGG GAACATTCAC ATCTGATGTA-3'后端連接補平引物5'-CTTAAGTAGC GAACCGAGCA TCTACCGGCA-3'將上述合成的各引物分別在10 μ 1體系的磷酸化混合液中進行磷酸化處理?；旌?液包括合成的引物片段，1μ 1 IOX激酶buffer，0. 5μ 1 10mmol/LATP，IU磷酸激酶，8 μ 1 ddH20?；靹蛞褐糜?7°C保溫75分鐘，然后100°C加熱1分鐘終止反應(yīng)，置冰浴中冷卻。再 將磷酸化的樣品冷凍干燥。將I型兩個片段和前端補平用片段依次加入4μ1 10Χ連接酶緩沖液，4μ1 lmol/L NaCl,32yl重蒸水，2滴石蠟油；置90°C加熱3分鐘，三片段混合，然后將管置 200ml 90°C水中自然冷卻到室溫；獲得退火產(chǎn)物1。將II型兩個片段和后端補平用片段依次加入4μ 1 10Χ連接酶緩沖液，4μ 1 lmol/L NaCl,32yl重蒸水，2滴石蠟油；置90°C加熱3分鐘，將II型兩個片段混合，然后 將管置200ml 90°C水中自然冷卻到室溫；獲得退火產(chǎn)物2和3。按1 5 1比例取退火產(chǎn)物1、2、3混合，72°C保溫3分鐘，32 μ 1重蒸水，2滴石 蠟油，將管置200ml 72°C水中自然冷卻到室溫；獲得最終退火產(chǎn)物。將最終退火產(chǎn)物加200 μ 1乙醚，混勻后離心除去上層有機相，重復(fù)乙醚抽提1次；加2倍體積的無水乙醇，混勻后置_20°C沉淀1小時，15000rpm離心15分鐘，去上清液后將
沉淀冷凍干燥。向干燥后的最終退火產(chǎn)物中依次加入3μ 1 IOX連接酶緩沖液，2μ IlOmmol/L ATP，2單位T4DNA連接酶，23 μ 1重蒸水，12 16°C連接過夜。瓊脂糖凝膠電泳中分 離相應(yīng)大小的連接產(chǎn)物并切膠回收。將回收產(chǎn)物置于20 μ 1混有IU的Taq聚合酶，2 μ 1 10XPCR緩沖液，0. 5 μ IlOmM dATP的混合液中，72°C溫浴30min。再用酚抽提、乙醇沉淀DNA 后，冷凍抽干樣品。最后將樣品克隆到PMD18-T中，得到pMD-GLP。實施例2、整合載體pNK-GLP的構(gòu)建。以釀酒酵母染色體中多拷貝串聯(lián)排列的rDNA序列作為外源基因多拷貝整合的位 點，針對rDNA序列中位于25S和5S rDNA之間的一段2. 2kb的同源重組熱點區(qū)域設(shè)計兩對 引物rDNA 引物 1 (A) 5' -ACCGAGCTCGCATGCCACCTACCGACC-3‘
rDNA 引物 2 (B) 5' -GAGGAATTCGTTAACAGGACATGCCTTTG-3‘rDNA 引物 3 (C) 5' -CAACTGCAGGTTAACTATAGGAAATGAG-3‘rDNA 引物 4(D) 5' -ACACTGCAGGGGTTTAGACCGTCGTGAGAC-3‘劃線部分分別是Sac I.EcoR I、Pst I和Pst I酶切位點，以釀酒酵母基因組DNA 為模板(1μ 1)，在含有 2μ llOXpCR Buffer.O. 4μ 1 EX Taq DNA 聚合酶、10 μ M 引物各 0. 5 μ 1、0. 5 μ IlOmMdNTPs和15 μ 1雙蒸水的混合液中進行PCR反應(yīng)。條件為94°C變性 lOmin，再以94°C變性50s，55°C退火lmin，72°C延伸90s，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0分別 得到AB和CD兩條rDNA片段。再將ABXD分別連接到pUC18的SacI/EcoRI和PstI位點， 得到 pUC18-Sr。根據(jù)URA3基因序列和TPI表達盒核苷酸序列設(shè)計兩對引物URA3 引物 I(Ul) :5, -ACCGTCGACAGCTTTTCAATTC-3‘URA3 引物 2 (U2) 5 ‘ -GAGGTCTAGAGGGTAATAACTG-3 ‘TPI 引物 1 (T1) 5' -CAATCTAGAACCTGACGTC-3‘TPI 引物 2(T1) :5' -ACAGGTACCATTCGCCATTC-3‘劃線部分分別是Sail、XbaI, XbaI和KpnI酶切位點。以質(zhì)粒pYX212作為模板， PCR反應(yīng)條件為94°C變性lOmin，再以94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，30 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。分別擴增得到營養(yǎng)標記基因URA3和包括組成型磷酸丙糖異構(gòu)酶 (triose-phosphate isomerase, TPI)啟動子在內(nèi)的表達盒(TPI cassette)片段，將 URA3 基因和表達盒依次連接到pUC18-Sr的Sall/Xbal和Xbal/Kpnl位點，得到載體pNKl。用BamHI和SalI雙酶切pMD_GLP，得到rolGLP_l十拷貝核苷酸序列，將該序列克 隆至載體pNKl的BamHI/XhoI位點，得到載體pNK_GLP。實施例3、穩(wěn)定表達rolGLP-Ι的重組釀酒酵母的構(gòu)建。載體pNK-GLP經(jīng)HpaI酶切線性化，轉(zhuǎn)化釀酒酵母BJ2407。在不含有脲嘧啶的營養(yǎng) 缺陷型培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，得到rolGLP-Ι和URA3被整合到酵母染色體上的轉(zhuǎn)化子SG2。提取SG2基因組DNA用BglII酶切消化，以rolGLP_l單體核苷酸序列擴增產(chǎn)物為 探針，進行Southern雜交，結(jié)果受體菌BJ2407基因組泳道沒有雜交條帶，而在挑選的重組 酵母SG2中出現(xiàn)雜交條帶。圖3中，1泳道為受體菌BJ2407基因組消化產(chǎn)物；2泳道為陽性對照pMD-GLP酶切產(chǎn)物；3泳道為pNKl酶切產(chǎn)物；4泳道為重組酵母SG2。小量培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子SG2經(jīng)過玻璃珠破碎，SDS-PAGE后(圖4A)，利用Western blot 檢測到一條約36kDa的蛋白條帶(圖4B)，表明十拷貝rolGLP-Ι蛋白得到表達。圖4中，M 為蛋白分子量標準，1泳道為釀酒酵母BJ2407細胞裂解物，2泳道為重組酵母SG2細胞裂解 物。在非選擇培養(yǎng)基中的連續(xù)培養(yǎng)和Western blot鑒定表明，SG2中的十拷貝rolGLP-Ι基 因保持著良好的穩(wěn)定性(圖5A)，并持續(xù)表達(圖5B)。實施例4、降血糖生物活性試驗。Wistar大鼠(中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心)禁食10小時后，腹腔注射 60mg/kg鏈脲佐菌素構(gòu)建高血糖模型大鼠。將高血糖大鼠(25. 1 士3. 5mM) 30只分為5組， 分別進行5g重組酵母SG2/kg劑量灌胃；0. 5g重組酵母SG2/kg劑量灌胃和0. Ig重組酵 母SG2/kg劑量灌胃；陽性對照組進行0. Ig 二甲雙胍/kg劑量灌胃；模型組進行5g酵母 BJ2407/kg劑量灌胃，所有處理持續(xù)20天。測定血糖前，大鼠禁食10h，不禁水。尾靜脈采 血，使用微量血糖測試儀(Advantage血糖儀)測定空腹血糖值，測定結(jié)果如圖6所示，表明 灌胃高劑量重組酵母SG2能夠明顯降低高血糖大鼠血糖水平。
權(quán)利要求
一種重組釀酒酵母，是將一種治療糖尿病的多肽——長效胰高血糖樣肽-1(rolGLP-1)的編碼基因以同向串聯(lián)方式導(dǎo)入到釀酒酵母BJ2407中，得到穩(wěn)定表達rolGLP-1的菌株；所述串聯(lián)rolGLP-1基因的編碼DNA堿基序列為編碼的氨基酸序列通式為[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg]n，n＝1-10。F2009100680377C0000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組釀酒酵母，其特征在于串聯(lián)的基因中，每個rolGLP-1 基因其C端的Arg恰好是胰蛋白酶識別位點，保證融合蛋白口服后被胰蛋白酶分解為 rolGLP-1單體發(fā)揮功能。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組釀酒酵母，其特征在于利用DNA合成技術(shù)將天然胰高 血糖樣肽-1的第8、26、34位的Ala、LyS、LyS分別替換為Ser、Gln、ASp。從而消除了天然 胰高血糖樣肽-1內(nèi)的二肽基肽酶(DPP IV)和胰蛋白酶識別位點。rolGLP-1具有如下的編 碼DNA堿基序列102030405060708090CATTCTGAGG GAACATTCAC ATCTGATGTA AGTTCTTACC TCGAGGGCCA AGCAGCTCAA GAATTCATCG CTTGGCTCGT AGATGGCCGTGTAAGACTCC CTTGTAAGTG TAGACTACAT TCAAGAATGG AGCTCCCGGT TCGTCGAGTT CTTAAGTAGC GAACCGAGCA TCTACCGGCA以及氨基酸序列[His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-G lu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Gln-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Asp-Gly-Arg]。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組釀酒酵母所需要的整合型載體的構(gòu)建方法，是通過 PCR的方法分別擴增兩段釀酒酵母核糖體RNA基因(rDNA)序列(GeneBank編號為NC001144 的29813-30888以及30889-31728)，釀酒酵母乳清酸核苷_5 ‘-單磷酸脫羧酶基因 URA3 (GeneBank編號為NP010893)以及來自質(zhì)粒pYX212的表達元件(TPI表達盒)，并將各 DNA序列分別克隆到質(zhì)粒pUC18的SacI/EcoRI、PstI位點、Sall/Xbal和Xbal/Kpnl位點， 得到整合型載體PNK1。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于將權(quán)利要求1 中的串聯(lián)rolGLP-1基因克隆到權(quán)利要求4中所構(gòu)建的整合載體pNKl中，得到表達載體 pNK-GLP，再通過限制性內(nèi)切酶線性化pNK-GLP，并用線性化載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述，構(gòu)建表達rolGLP-1的重組酵母作為一種口服制劑用于預(yù)防 和治療糖尿病。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述用途，用于糖尿病病人的治療方法，或者作為藥物組合物的一 個組分。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種糖尿病食療酵母及其構(gòu)建方法。該重組酵母是以釀酒酵母基因組DNA為模板擴增兩段rDNA序列；以pYX212為模板擴增營養(yǎng)標記基因URA3和磷酸丙糖異構(gòu)酶啟動子驅(qū)動的表達盒片段；將四個擴增產(chǎn)物分別克隆到pUC18的相應(yīng)位點，得到整合型載體pNK1。再利用DNA合成點突變技術(shù)除去天然GLP-1分子中的二肽酶VI和胰蛋白酶的酶切位點，合成I、II型和左右連接補平引物片段，用分步退火一步連接法獲得十拷貝串聯(lián)rolGLP-1序列并將之克隆到pNK1中得到pNK-GLP。然后線性化pNK-GLP并轉(zhuǎn)化釀酒酵母BJ2407，篩選得到重組酵母SG2。因rolGLP-1基因整合于酵母染色體中，該重組菌株具有穩(wěn)定高效表達rolGLP-1的特性和降低高血糖大鼠血糖水平的功能，可用于開發(fā)治療糖尿病的酵母生物藥物。
文檔編號C12N1/19GK101824388SQ20091006803
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者衛(wèi)一鳴, 廖芳, 李娜, 李明剛, 武志強, 王瑞菊, 王維婧, 胡曉宇, 趙磊, 陳苗, 馬百成 申請人:南開大學