專利名稱：一種braf基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
大腸癌為結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，大腸癌是指大腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種 致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變預(yù)后不良，死亡率較高。大腸癌是大腸粘膜上皮起源的惡 性腫瘤，是最常見的消化道惡性腫瘤之一，僅次于胃癌、食管癌。腸癌是常見的消化道惡性 腫瘤占胃腸道腫瘤的第3位。好發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，占65%發(fā)病多在 40歲以后，男女之比為2 3 1。結(jié)腸癌患者大多已中年以上，其中位數(shù)年齡為45歲，約 有5%患者的年齡在30歲以下。結(jié)腸癌的臨床表現(xiàn)隨其病灶大小所在部位及病理類型而 有所不同。不少早期結(jié)腸癌患者在臨床上可毫無癥狀，但隨著病程的發(fā)展和病灶的不斷增 大，可以產(chǎn)生一系列結(jié)腸癌的常見癥狀，諸如大便次數(shù)增多、大便帶血和粘液、腹痛、腹瀉或 便秘、腸梗阻以及全身乏力、體重減輕和貧血等癥狀。直腸癌(rectal cancer)是胃腸道中 常見的惡性腫瘤發(fā)病率僅次于胃和食道癌是大腸癌的最常見部分(占65%左右)絕大多數(shù) 基因病人在40歲以上30歲以下者約占15%男性較多見男女之比為2-3 1，直腸癌是一 種生活方式病。目前，它已在癌癥排行榜中躍居第二位了，所以飲食和生活方式，是癌癥的 禍根。大腸癌從癌前變到形成癌癥，需要幾年時間，如何做到早期檢測、診斷、預(yù)后的檢 測及診治后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移早期檢出是降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因是大腸癌新致癌基因，它在腸癌的發(fā)生中起到重要的作用， 在腸癌組織及血清中有較高的表達(dá)。BRAF-基因序列號NM-004333，2949bp，位于染色體 7q34"，cds 62—2362bp,隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時)就能做到早期預(yù)測診斷。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種BRAF基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種BRAF基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測大腸癌疾病藥物中的應(yīng)用，所 述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種BRAF基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。所述的a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時間為16-24小時，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或組織細(xì)胞標(biāo)本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作
1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C )；
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。
本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。
2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測大腸癌發(fā)生動態(tài)過程，以及用于大腸癌預(yù)防醫(yī)學(xué)的檢測和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標(biāo)志物，以及 影像醫(yī)學(xué)檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測BRAF異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查 及其它檢查未發(fā)現(xiàn)占位性大腸癌病灶之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫塊 之前，能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床大腸癌病患一個真正的預(yù)后早期 診斷。這樣才有可能實施大腸癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根 治大腸癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中結(jié)腸癌癥病人BRAF過量表達(dá)圖。圖2是本發(fā)明實施例中正常人BRAF圖。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細(xì)說明。實施例1一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和 標(biāo)本組成如下消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預(yù)雜交液1300 μ 1/ 管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體 μ /管1管/盒無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管1管/盒黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
緩沖液I IOx90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II IOx80ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV IOx90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒無色透明液體
陽性對照標(biāo)本6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護液0· 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預(yù)雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul
0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2PO4 2g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT 1g 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP 1g 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種BRAF基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清·沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；
5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10 X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽性對照標(biāo)本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷
在光鏡下計數(shù)100-300個細(xì)胞，計算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽性對照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應(yīng)無色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的BRAF 基因表達(dá)量，用來確定大腸癌是否發(fā)生。臨床研究表明，BRAF基因是大腸癌的特異基因，因 為BRAF基因在正常人中不表達(dá)，唯獨在癌表達(dá)，說明大腸癌已經(jīng)發(fā)生，用來確定大腸癌是 否發(fā)生，或是正常。從而獲得大腸癌的診斷信息。本發(fā)明實施例采樣為結(jié)腸癌病人5名，正常對照組5名。抽所有待檢人的外周血 3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有結(jié)腸癌患者BRAF基因有過度表達(dá)，細(xì) 胞染色；正常對照組BRAF基因不表達(dá)，細(xì)胞無染色。具體結(jié)果請見圖1和圖2。實施例3用BRAF基因試劑盒檢測結(jié)腸癌疾病與用VEGF基因試劑盒檢測結(jié)腸癌疾病之間平 行實驗。為了科學(xué)評價上述基因各自在結(jié)腸癌疾病的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性。我們用 平行試驗的方法，同時檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用同一例 結(jié)腸癌疾病患者的外周血，同時檢測BRAF基因和VEGF(VEGF基因序列號NM-001025366， 6pl2”3665bp cds :492…1730bp)基因的mRNA(進(jìn)行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記 數(shù)、結(jié)果報告等均采用實施例1和實施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。發(fā) 現(xiàn)BRAF基因在結(jié)腸癌疾病病人中表達(dá)量比VEGF基因在同一疾病病人的表達(dá)量要高。結(jié)果 表明，BRAF基因?qū)Y(jié)腸癌疾病診斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性比VEGF基因更好，原位雜交基 因表達(dá)圖顯示，BRAF基因的表達(dá)量是70 %，VEGF基因的表達(dá)量是50 %。本發(fā)明的試劑盒作 于結(jié)腸癌疾病診斷的指標(biāo)有非常重要的臨床意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補充，這些改進(jìn)和補充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2949<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)
<400>1cgcctccctt ccccctcccc gcccgacagc ggccgctcgg gccccggctc tcggttataa 60gatggcggcg ctgagcggtg gcggtggtgg cggcgcggag ccgggccagg ctctgttcaa 120cggggacatg gagcccgagg ccggcgccgg cgccggcgcc gcggcctctt cggctgcgga 180ccctgccatt ccggaggagg tgtggaatat caaacaaatg attaagttga cacaggaaca 240tatagaggcc ctattggaca aatttggtgg ggagcataat ccaccatcaa tatatctgga 300ggcctatgaa gaatacacca gcaagctaga tgcactccaa caaagagaac aacagttatt 360ggaatctctg gggaacggaa ctgatttttc tgtttctagc tctgcatcaa tggataccgt 420tacatcttct tcctcttcta gcctttcagt gctaccttca tctctttcag tttttcaaaa 480tcccacagat gtggcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg ttagagtctt 540cctgcccaac aaacagagga cagtggtacc tgcaaggtgt ggagttacag tccgagacag 600tctaaagaaa gcactgatga tgagaggtct aatcccagag tgctgtgctg tttacagaat 660tcaggatgga gagaagaaac caattggttg ggacactgat atttcctggc ttactggaga 720agaattgcat gtggaagtgt tggagaatgt tccacttaca acacacaact ttgtacgaaa 780aacgtttttc accttagcat tttgtgactt ttgtcgaaag ctgcttttcc agggtttccg 840ctgtcaaaca tgtggttata aatttcacca gcgttgtagt acagaagttc cactgatgtg 900tgttaattat gaccaacttg atttgctgtt tgtctccaag ttctttgaac accacccaat 960accacaggaa gaggcgtcct tagcagagac tgccctaaca tctggatcat ccccttccgc 1020acccgcctcg gactctattg ggccccaaat tctcaccagt ccgtctcctt caaaatccat 1080tccaattcca cagcccttcc gaccagcaga tgaagatcat cgaaatcaat ttgggcaacg 1140
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權(quán)利要求
一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測大腸癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非 放射性標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
9.一種BRAF基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或 組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種BRAF基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種BRAF基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測大腸癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101988100SQ20091005608
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日 公開號200910056084.X
發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司