專利名稱：一種tceal7基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和
應用
技術領域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒 及其檢測方法和應用
背景技術：
卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列 居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位對婦女生命造成嚴重威脅。由于 卵巢的胚胎發(fā)育，組織解剖及內分泌功能較復雜它所患的腫瘤可能是良性或惡性。因卵巢 癌臨床早期無癥狀，鑒別其組織類型及良惡性相當困難，卵巢癌行剖腹探查術中發(fā)現(xiàn)腫瘤 局限于卵巢的僅占30%，大多數(shù)已擴散到子宮雙側附件，大網(wǎng)膜及盆腔各器官，所以卵巢癌 無論在診斷和治療上確是一大難題多年來專家們對卵巢惡性腫瘤的病理形態(tài)，臨床發(fā)生發(fā) 展規(guī)律及治療方案進行了許多的探討，積累了大量的經(jīng)驗到目前為止，就國內外臨床資料 統(tǒng)計，其五年生存率僅25% 30%。TCEAL7，NM-152278 mRNA 1162bp，日本山梨大學醫(yī)學院解剖與細胞生物學系，美 國南卡羅來納醫(yī)科大學兒童研究所，密協(xié)根韋恩州立大學醫(yī)學院放射腫瘤科等處的科技院 發(fā)現(xiàn)一名為Tceal7的基因可能是一種新的腫瘤抑制基因。上皮卵巢瘤的發(fā)生發(fā)展病理生 理學機制至今未明，最近，研究人員在上皮卵巢癌病例中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個表達水平下調 的轉錄蛋白TCEAL7到目前為止，該基因表達量下調的生物學意義還不清楚。在本研究中 研究小組發(fā)現(xiàn)TCEAL7在多種人類癌癥細胞中表達降低，這促進非貼壁依賴性細胞生長。研 究人員發(fā)現(xiàn)TCEAL7與cyclinDl啟動子有關聯(lián)，包括Myc-E-box序列，并且TCEAL7可轉錄 eyeIinDl的表達，然后，下調TCEAL7可促進Myc-Max與DNA結合，并上調c-MAyc靶位基因 啟動子的活性，鳥氨酸脫羥酶可加強TCEAL7的表達抑制Myc誘導鳥氨酸脫羥酶啟動活性， 研究結果表明，TCEAL7可通過抑制Myc活性限制卵巢上皮細胞活性而且，cmyc被激活，就可 能下調TCEAL7的抑癌活性。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到早期預測診斷。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種TCEAL7基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測卵巢癌疾病藥物中的應用， 所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜 交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種TCEAL7基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。所述的a步驟中形成雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作1).將待測標本放入反應槽中；2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；3).儀器自動棄去液體，自動后固定；4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C )；5).儀器自動棄去液體，自動清洗；6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；7).儀器自動棄去液體，自動清洗；8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
3、本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測卵巢癌發(fā)生動態(tài)過程，以及用于卵巢癌預 防醫(yī)學的檢測和篩選工具。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及 影像醫(yī)學檢查有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測TCEAL7異常表達，在影像醫(yī)學檢 查及其它檢查未發(fā)現(xiàn)占位性卵巢癌病灶之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫 塊之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床卵巢癌病患一個真正的預后早 期診斷。這樣才有可能實施卵巢癌的早期診斷、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底 根治卵巢癌惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中卵巢癌病人TCEAL7基因表達圖片。圖2是本發(fā)明實施例中正常人TCEAL7基因表達圖片。
具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中， 所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體 和標本組成如下消化液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
保護液100 μ 1/管1管/盒無色透明液體
預雜交液1300 μ 1/ 管2管/盒無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管/盒無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ 管1管/盒無色透明液體
堿性磷酸酶抗體1μ l/管1管/盒無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/ 管1管/盒黃色液體
顯色劑B3201/ 管1管/盒無色透明液體
緩沖液I 10x90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液II 10x80ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液III 10x20m/瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體
緩沖液IV 10x90ml/ 瓶1瓶/盒淺黃色或無色透明液體
固定液90ml/ 瓶1瓶/盒無色透明液體
陽性對照標本6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，100mg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護液0.2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ul
llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2gKH2PO4 2g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(PH7. 9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調 PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50_60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種TCEAL7基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用一、標本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1 X緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10 X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內在42°C恒溫水浴箱中用2 X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、1X緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到 30ml IX緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。
四、結果判斷在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內對照應無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 TCEAL7基因表達量，用來確定癌癥的預后。臨床研究表明，TCEAL7基因在癌癥中低表達，因 為TCEAL7基因在正常人高表達，TCEAL7基因的低表達說明癌癥，TCEAL7基因的表達程度與 癌癥的預后有關，屬負相關，表達愈低預后愈差。從而獲得癌癥的診斷信息。如上所述，當 檢測TCEAL7基因表達時，可預測受試者為癌癥情況。本發(fā)明實施例采樣為卵巢癌病人10 名，正常對照組10名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果 表示，所有卵巢癌患者TCEAL7基因不表達，細胞無染色。正常對照組TCEAL7基因有過度表 達，細胞染色。具體結果請見圖1，圖2。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(上海)有限公司<120> 一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1162<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1gggtaccagc tccttactgc cctgcagaca agcgtgccgt gcgtgcttgt ggccaaggga 60aggaagagct ggttgatcca cagatagctc cttcctcccc gccccttcct ttttgtttgg 120aggtcccagg atctgtgttc acagacatct gggggaagaa aaggagcagg aaactacccc 180gcacagagtt aagcaggaaa caacaacaac atcatgcaaa aaccctgcaa agaaaacgaa 240ggaaagccaa agtgcagcgt gccaaagagg gaggaaaaac gcccgtatgg agaatttgaa300cgccagcaaa cagaagggaa ttttagacag aggctgcttc agtctctcga agaatttaaa 360gaggacatag actataggca ttttaaagat gaagaaatga caagggaggg agatgagatg 420gaaaggtgtt tggaagagat aaggggtctg agaaagaaat ttagggctct gcattctaac 480cataggcatt ctcgggaccg tccttatccc atttaattaa tttctctgac aattcaatta 540ttttctgtta ttaatgttgc cactgctttc tgtttgtctg cactttcttg ataaatattt 600gctatcgttt tactccagtc attcgatgtt gctgagattt acatatgact cttgtcaaca 660tctcatcttt tgacccaatc ttattcattt aataagaggt ctcattcatt tgcatggaaa 720aatgctcatt gtatattgca aagtgaaaat aacgagttgc aaaacagtgt atacatatat 780gtgtgtatat atgtacactt tatttgtaca tttctatgtg acataatgca aaggaaagtg 840tctgatttta ttatacacca aaggttaaca gtgaatctct gtgtgatctc tttttttttc 900tttttgccta tctgcatctt ctcacttgcc aaaaaatgaa tatatgttta tgtgtgtata 960ttacttgtgtcctaaagtag acagtaaaag aacttgtcaa tcgcctttgg 1020aaggcaatga aacacttaat aaactctcaa taacagaagc gtaaaaatga aatgtaaacc 1080tccaattacc tctggatctc ttagccagag taataaactg gtaattatta caggtaaaaa 1140aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a a 116權利要求
一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測卵巢癌疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的標記物選自放射性核素或非 放射性標記物。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
9.一種TCEAL7基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。
10.根據(jù)權利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或 組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種TCEAL7基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種TCEAL7基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測卵巢癌疾病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101988094SQ200910056078
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權日2009年8月7日 公開號200910056078.發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司