專利名稱：一種pde7b基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用的制作方法
一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應
用
技術領域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應用
背景技術：
慢性淋巴細胞白血病(CLL)是歐美白種人較為常見的白血病，亞洲人也多發(fā)，一 旦發(fā)現(xiàn)療效不是很好。2008年全美約有15100例慢性淋巴細胞新發(fā)病例，其中有4400人 因此死亡。美國加州大學圣地安哥分校醫(yī)學院藥理學教授保羅.A賽爾等研究發(fā)現(xiàn)，在白血 病患者體內(nèi)一組被稱為環(huán)核苷酸磷酸二脂酶的酶中，一種PDE7B磷酸二脂酶的含量比正常 人高10倍。PDE7B可控制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平，該化學物質(zhì)可促進編程性細胞死亡， 在CLL患者體內(nèi)該過程往往存在缺陷。雖然大多數(shù)的癌癥都會失去對細胞生長的控制，CLL 的特點在于本來應該死亡的白細胞卻大量存在。而高水平的PDE7B意味著cAMP含量的減 少和細胞正常死亡率的降低。研究人員對85例尚未得到治療的CLL患者和30位健康的成 人體內(nèi)的PDE7B水平進行監(jiān)測對比，他們按照體內(nèi)PDE7B含量的高低將受試者分為兩類，進 一步確定PDE7B對白血病診斷的意義。賽爾研究小組發(fā)現(xiàn)，具有高含量PDE7B的個體確實 也存在更嚴重的疾病，相對來說，PDE7B是目前較為準確的白血病監(jiān)測指標，在某些情況下， PDE7B水平也可以作為一種新的白血病標志物。研究人員稱，如果含量比較高，PDE7B可以 單獨作為診斷CLL的標志物。在PDE7B含量不高時，我們采用檢測PDE7B mRNA的方法可以 更早期檢測到CLL已發(fā)生、發(fā)展，對白血病的早期基因診斷有重要的臨床意義。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆 時)就能做到早期預測診斷。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起 來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種PDE7B基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種PDE7B基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測慢性淋巴細胞白血疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。 PDE7B 基因序列號ΝΜ-018945，mRNA 5387bp，位于染色體 6q23_q24〃，CDS 304. . . 1656bp。
所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。
所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種PDE7B基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。所述的a步驟中形成雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或組織細胞標本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作1).將待測標本放入反應槽中；2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；3).儀器自動棄去液體，自動后固定；4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C )；5).儀器自動棄去液體，自動清洗；6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；7).儀器自動棄去液體，自動清洗；8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明能及早做到PDE7B基因表達異常的信息采集，給臨床慢性淋巴細胞白血 病患一個真正的預后早期診斷。這樣才有可能實施慢性淋巴細胞白血病的早期診斷、早期 預防、早期治療。

圖1是本發(fā)明實施例中慢性淋巴細胞白血病PDE7B基因表達圖片。圖2是本發(fā)明實施例中正常人PDE7B基因表達圖片。
具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細說明。實施例1一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標記。試劑盒中的其它液體和 標本組成如下消化液100 μ 1/管1管/盒 無色透明液體保護液100 μ 1/管1管/盒 無色透明液體預雜交液1300 μ 1/管2管/盒 無色透明液體正義雜交液10μ1/管 1管/盒 無色透明液體反義雜交液10μ1/管 1管/盒 無色透明液體封閉液100(^1/管1管/盒 無色透明液體堿性磷酸酶抗體Ιμ /管 1管/盒 無色透明液體顯色劑A175 μ 1/管 1管/盒 黃色液體顯色劑B320 μ 1/管1管/盒 無色透明液體緩沖液I IOx90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體緩沖液II IOx 80ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體緩沖液III IOx 20m/瓶3瓶/盒 淺黃色或無色透明液體緩沖液IV IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無色透明液體固定液90ml/瓶 1瓶/盒 無色透明液體陽性對照標本 6片/盒上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)1、消化液20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360gKCl 2g
KH2PO4 2g 加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(ΡΗ7·9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種PDE7B基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應用一、標本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細胞分離液(血淋巴細胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標本可保存在-20°c，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；
3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標本兩張，(另外兩張留作復查用)及陽性對照標本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預熱10分鐘。放進16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護液(保護液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結果判斷在光鏡下計數(shù)100-300個細胞，計算染上紫色細胞的百分比。陽性對照標本加反義雜交液的應該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應無色。地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針， 不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克 服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表達量。
本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 PDE7B基因表達量，用來確定慢性淋巴細胞白血病是否發(fā)生，因為PDE7B基因在正常人中低 表達，如果PDE7B基因表達高，說明慢性淋巴細胞白血病已經(jīng)發(fā)生，從而獲得慢性淋巴細胞 白血病的診斷信息，具體結果請見圖1，圖2。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(上海)有限公司<120> 一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>5387<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1cagtcagttg gtctgggcac tgcagcaggc tcggctctgt cccagcactt gtctgggaga 60aaagtggtgt tactcaccca gggagagtct ctctttctac cttccttctt tctcgatctc 120cttgtgtgct tttgtgtttc tttatttctt ttcctttttt ttcttttttt ttttttgtta 180cttaattata ttcctaatcc tggatgaagt tgctggattc tgcagcacaa gtcttcatga 240 acaagcagca ccgctcagag atttcacggc attcaaaggt cacagaactg ccactatggt 300taaatgtctt gtttaatggt tgagaggtgt ggcgaaatct tgtttgagaa ccccgatcag 360aatgccaaat gtgtttgcat gctgggagat atacgactaa ggggtcagac gggggttcgt 420gctgaacgcc gtggctccta cccattcatt gacttccgcc tacttaacag tacaacatac 480tcaggggaga ttggcaccaa gaaaaaggtg aaaagactat taagctttca aagatacttc 540catgcatcaa ggctgcttcg tggaattata ccacaagccc ctctgcacct gctggatgaa 600gactaccttg gacaagcaag gcatatgctc tccaaagtgg gaatgtggga ttttgacatt660 ttcttgtttg atcgcttgac aaatggaaac agcctggtaa cactgttgtg ccacctcttc 720aatacccatg gactcattca ccatttcaag ttagatatgg tgaccttaca ccgattttta 780gtcatggttc aagaagatta ccacagccaa aacccgtatc acaatgctgt tcacgcagcc 840gacgtcaccc aggccatgca ctgctacctg aaagagccaa agcttgccag cttcctcacg 900cctctggaca tcatgcttgg actgctggct gcagcagcac acgatgtgga ccacccaggg 960gtgaaccagc catttttgat aaaaactaac caccatcttg caaacctata tcagaatatg 1020tctgtgctgg agaatcatca ctggcgatct acaattggca tgcttcgaga atcaaggctt 1080cttgctcatt tgccaaagga aatgacacag gatattgaac agcagctggg ctccttgatc 1140ttggcaacag acatcaacag gcagaatgaa tttttgacca gattgaaagc tcacctccac 1200aataaagact taagactgga ggatgcacag gacaggcact ttatgcttca gatcgccttg 1260aagtgtgctg acatttgcaa tccttgtaga atctgggaga tgagcaagca gtggagtgaa 1320agggtctgtg aagaattcta caggcaaggt gaacttgaac agaaatttga actggaaatc 1380agtcctcttt gtaatcaaca gaaagattcc atccctagta tacaaattgg tttcatgagc 1440tacatcgtgg agccgctctt ccgggaatgg gcccatttca cgggtaacag caccctgtcg 1500gagaacatgc tgggccacct cgcacacaac aaggcccagt ggaagagcct gttgcccagg 1560cagcacagaa gcaggggcag cagtggcagc gggcctgacc acgaccacgc aggccaaggg 1620actgagagcg aggagcagga aggcgacagc ccctaggggc cggcccaact tagacgcggc 1680tctcctccgg cagggccccc agagggcaga agcagcgtgg aggggccctc acgcagcagc 1740ccagccactt tctgagtgtt gtcctggggc tctttggaac gccatcttcc tcccacttac 1800
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agttgatagt ttacattaca attaggtctt gaagaagagc tcacagagaa aaaactacca 4200aatatccaat gggtaagccc atgatgtagc cactagtaca ataaaaatct gaagtaaaat 4260gaggcataaa cttgatgcag ctgcctccct cattcaactg gggagttctt gagttcctca 4320tttgttggtagaatgtgaaa atgtctcttt ttttcttggc tattagtggc 4380tgtcttgcaa tatttcaata ggagtccaat tactagttaa aacactggcg gggtgcggtg 4440gctcacgcct gtaatcctag cactttggga ggccaagttg ggcagatcac aagttcaaga 4500 gatcgagacc attctggcca acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat acaaaaatta 4560gctgggcatg gcagtgcgtg cctgcaatcc cagctactca ggaagctgag gcaggagaat 4620cgcttgaacc tgggaggtgg aagttgtagt gaactgagat cgcaccactg cactccagcc 4680tggcaacaga gctagaatcc gtctcaaaca
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一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測慢性淋巴細胞白血疾病藥物中的應用，所述的試劑盒包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的標記物選自放射性核素或非 放射性標記物。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所述的非放射性標記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，其特征在于，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標記物選自放射性核素或非放射性標記物。
9.一種PDE7B基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復合體；b、檢測a步驟得到的雜交復合體。
10.根據(jù)權利要求9所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細胞標本或 組織細胞標本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PDE7B基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種PDE7B基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測慢性淋巴細胞白血疾病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101988085SQ200910056058
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權日2009年8月7日 公開號200910056058.發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司