專利名稱：一種p16基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用的制作方法
一種p16基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說(shuō)關(guān)于一種P16基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其 檢測(cè)方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
鱗癌，又稱表皮樣癌，是發(fā)生在皮膚、附屬器或粘膜的惡性腫瘤。鱗癌多發(fā)于50歲 以上的男性，常見(jiàn)于面部、頭皮、下唇、手背、前臂、陰部等處。尤其是皮膚與粘膜交界處更易 發(fā)生。初起為暗紅色堅(jiān)硬的疣樣小結(jié)節(jié)，表面毛細(xì)血管擴(kuò)張，中央有角質(zhì)物附著，不易剝離， 用力剝后可出血。皮損逐漸擴(kuò)大，形成堅(jiān)硬的紅色斑塊，表面有少許鱗屑，邊境清楚，向周圍 浸潤(rùn)，觸之較硬，迅速擴(kuò)大形成潰瘍，潰瘍向周圍及深部侵犯，可深達(dá)肌肉與骨骼，損害互相 粘連形成堅(jiān)硬的腫塊，不易移動(dòng)，潰瘍基底部為肉紅色，有壞死組織，有膿液、臭味，易出血。 潰瘍邊緣隆起外翻，有明顯炎癥，自覺(jué)疼痛。如發(fā)生在皮膚與粘膜交界處，固潮濕與摩擦更 易出血，發(fā)展更快，可形成菜花狀，破壞性大，有明顯疼痛，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。pl6 基因序列號(hào) NM-000077 1163bp mRNA CDS 213......· 683bp，在染色體 9p21，，。
P16基因是抑制癌癥基因，它在正常人中有非常高的表達(dá)，在臨床各種類型癌癥中都有表達(dá) 降低或缺失。臨床研究人員采用PCR方法對(duì)P16基因在外陰鱗癌、外陰基底細(xì)胞癌、外陰疣 狀癌、外陰上皮肉瘤變III (VINIII)、正常外陰皮膚中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果是P16在 正常外陰皮膚中的陽(yáng)性表達(dá)率為100 %，外陰上皮肉瘤變III (VINIII)中為61. 9 %，外陰 鱗癌中為27. 91%，外陰基底細(xì)胞癌和外陰疣狀癌中零表達(dá)，它們之間的差異有顯著性(P < 0. 05)，P16基因的表達(dá)量與臨床分期分型及轉(zhuǎn)移程度有關(guān)。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開(kāi)，至 今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時(shí))就能做到早期預(yù)測(cè)診斷。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來(lái)，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過(guò)標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑 盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)外陰鱗癌等腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述的疾病是外陰基底細(xì)胞癌或外陰疣狀癌及其它類型的腫瘤。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中所述的雜交探 針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。所述的a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的 時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或組織細(xì)胞標(biāo)本。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C )；5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42°C )；7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。2、本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明能及早做到pl6基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床外陰鱗癌病患一個(gè)真 正的預(yù)后早期診斷。這樣才有可能實(shí)施外陰鱗癌的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能 從源頭上徹底根治外陰鱗癌惡疾。

圖1是正常人pl6基因表達(dá)圖；圖2是外陰上皮肉瘤變病人pl6基因表達(dá)圖；圖3是外陰疣狀癌病人的pl6基因表達(dá)圖
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1—種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和標(biāo) 本組成如下消化液100 μ 1/管1管/盒 無(wú)色透明液體保護(hù)液100 μ 1/管1管/盒 無(wú)色透明液體預(yù)雜交液1300 μ 1/管2管/盒 無(wú)色透明液體正義雜交液 10μ1/管 1管/盒 無(wú)色透明液體反義雜交液 10μ1/管 1管/盒 無(wú)色透明液體封閉液1000 μ 1/管1管/盒 無(wú)色透明液體堿性磷酸酶抗體1 μ 1/管 1管/盒 無(wú)色透明液體顯色劑A175 μ 1/管 1管/盒 黃色液體顯色劑B320 μ 1/管1管/盒 無(wú)色透明液體緩沖液I IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體緩沖液II IOx 80ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體緩沖液III IOx 20m/瓶 3瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體緩沖液IV IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 淺黃色或無(wú)色透明液體固定液90ml/瓶 1瓶/盒 無(wú)色透明液體陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本 6片/盒上述試劑成分說(shuō)明(所有試劑購(gòu)自SIGMA)1、消化液20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；2、保護(hù)液0. 2g的glycine加入Iml的1 X緩沖液I ；3、預(yù)雜交液:1 X緩沖液II 7. 5ml50 X D 3ml10mg/ml yest t-RNA 750ulllmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul0. 04M EDTA 3ml50% formamide 15ml4、封閉液0.03g的bloking(購(gòu)買(mǎi)自羅氏公司)加入Iml IX緩沖液III;5、IOx 緩沖液 I (PH7. 1-7. 4)NaCl 80gNa2HPO4. 12H20 360g
KCl 2gKH2P042g加三蒸水至11，并高壓滅菌；6、IOx 緩沖液 II (PH7. 0)NaCl 175. 3g檸檬酸鈉88. 2gHCl 幾滴加三蒸水至11，并高壓滅菌；7、緩沖液 III :(ΡΗ7·9)Tris 121. IgNaCl 87. 66gHCl 60ml 左右加三蒸水至11，并高壓滅菌；8、緩沖液 IV:IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 水至11，并高壓滅菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高壓滅菌；0.5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪拌至溶 解；10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實(shí)施例2一種pl6基因原位雜交檢測(cè)方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清·沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。 每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；
按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成1 X緩沖液III ；4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本兩張(每次 實(shí)驗(yàn)做一對(duì)陽(yáng)性對(duì)照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護(hù)液(保護(hù)液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過(guò)程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5mllX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計(jì)數(shù)100-300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對(duì)照應(yīng)無(wú)色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過(guò)程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探 針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過(guò)檢測(cè)外陰皮膚細(xì)胞中的 P16基因表達(dá)量，用來(lái)確定外陰鱗癌。臨床研究表明，P16在正常外陰皮膚中的陽(yáng)性表達(dá)率 為100%，外陰上皮肉瘤變III (VINIII)中為61.9%，外陰鱗癌中為27. 91%，外陰基底細(xì)胞 癌和外陰疣狀癌中零表達(dá)。本發(fā)明實(shí)施例采樣為正常對(duì)照組5名，外陰上皮肉瘤變病人5 名，外陰疣狀癌病人5名。結(jié)果表示，所有正常人的pl6基因有過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞染色；外陰上 皮肉瘤變病人P16基因有表達(dá)，細(xì)胞染色；所有外陰疣狀癌病人的pl6基因不表達(dá)，細(xì)胞無(wú) 染色。具體結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)圖1是正常人P16基因表達(dá)圖；圖2是外陰上皮肉瘤變病人pl6基因 表達(dá)圖；圖3是外陰疣狀癌病人的pl6基因表達(dá)圖。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法和應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1163<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1ctcctccgag cactcgctca cggcgtcccc ttgcctggaa agataccgcg gtccctccag 60aggatttgag ggacagggtc ggagggggct cttccgccag caccggagga agaaagagga 120ggggctggct ggtcaccaga gggtggggcg gaccgcgtgc gctcggcggc tgcggagagg 180gggagagcag gcagcgggcg gcggggagca gcatggagcc ggcggcgggg agcagcatgg 240agccttcggc tgactggctg gccacggccg cggcccgggg tcgggtagag gaggtgcggg 300cgctgctgga ggcgggggcg ctgcccaacg caccgaatag ttacggtcgg aggccgatcc 360aggtcatgat gatgggcagc gcccgagtgg cggagctgct gctgctccac ggcgcggagc 420ccaactgcgc cgaccccgcc actctcaccc gacccgtgca cgacgctgcc cgggagggct 480tcctggacac gctggtggtg ctgcaccggg ccggggcgcg gctggacgtg cgcgatgcct 540ggggccgtct gcccgtggac ctggctgagg agctgggcca tcgcgatgtc gcacggtacc600 660 720 780 840 900
960
1020 1080 1140 1163
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權(quán)利要求
一種p16基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)外陰鱗癌疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非 放射性標(biāo)記物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化酶或熒光素中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述的 增效劑是堿性磷酸酶抗體。
8.—種pl6基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述的 雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
9.一種pl6基因的原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求8所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測(cè)RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測(cè)a步驟得到的雜交復(fù)合體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本或 組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種p16基因的原位雜交檢測(cè)試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種p16基因原位雜交檢測(cè)方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測(cè)外陰鱗癌疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101988087SQ200910056060
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日 公開(kāi)號(hào)200910056060.發(fā)明者張?jiān)聘? 裘建英 申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司