專利名稱：人源化抗nogo-a單克隆抗體的制備及生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和制藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的人源化抗 N0G0-A單克隆抗體。另外，本發(fā)明還涉及該單克隆抗體的制備以及大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備該 抗體的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
腦中風(fēng)是一組好發(fā)于中、老年人的急性腦血管病，其特點是發(fā)病率高、死亡率高、 致殘率高、并發(fā)癥多，因此又稱“三高一多”癥，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計， 目前全國共約有515-745萬人患中風(fēng)，即在我國每年每10萬人口中就有185-219例。統(tǒng)計 顯示，中風(fēng)發(fā)病率隨年齡增加而增長，在每10萬人口中70 %左右的是65歲以上的老年人首 次發(fā)生中風(fēng)，患病率在每10萬人口中約有430-615例，中風(fēng)的死亡率為每年每10萬人口中 有116-140例，中風(fēng)存活后的病人約60-80%有不同程度的殘疾，嚴(yán)重者甚至喪失正常生活 能力。另外，有中風(fēng)病史的患者，約25-80%可能在2-5年內(nèi)復(fù)發(fā)。多數(shù)患者由于偏癱致殘 喪失勞動力和生活自理能力，精神和肉體蒙受著極大的痛苦，同時也給社會和家庭帶來了 沉重的負(fù)擔(dān)。所以積極有效的治療中風(fēng)及其后遺癥，減少中風(fēng)患者的致殘率，可以解除患者 病痛，同時也為社會和家庭減輕負(fù)擔(dān)，它是擺在醫(yī)藥工作者面前的一項嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，具有重大 的現(xiàn)實意義。但是，迄今為止，臨床上缺乏有效的治療中風(fēng)的方法，世界上所公認(rèn)的溶栓療法僅 限于中風(fēng)發(fā)生三小時內(nèi)，可多數(shù)病人送到醫(yī)院救治時，已超過溶栓療法的有效作用時間。另 外，大多數(shù)針對急性中風(fēng)治療(即神經(jīng)保護(hù))的治療劑主要涉及靶向谷氨酸受體及其已知 參與急性細(xì)胞死亡的下游信號傳導(dǎo)途徑。然而，在臨床試驗中已經(jīng)證明這些策略是不成功 的，它們經(jīng)常與劑量局限性副作用有關(guān)。腦中風(fēng)后引起腦的基本組成單元，神經(jīng)元的損傷。而成年哺乳類由于中樞環(huán)境對 再生不利，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元受損后，再生能力弱，這一方面是由于起保護(hù)神經(jīng)元的各種 營養(yǎng)因子嚴(yán)重匱乏；另一方面是因為存在著抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的分子。因此，阻斷 損傷后的抑制因子的作用，對于促進(jìn)中風(fēng)后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)具有重要的理論和臨床 應(yīng)用意義，它已成為近期治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病的重大的發(fā)展策略。在中樞環(huán)境眾多不利再生的因素中，近年來發(fā)現(xiàn)主要為與髓鞘相關(guān)的蛋白，其中 尤以N0G0-A最為重要。N0G0-A對神經(jīng)突起的生長具有很強(qiáng)的抑制作用，在體內(nèi)體外均可 明顯抑制神經(jīng)突起的生長，從而抑制損傷后神經(jīng)纖維的再生及功能的恢復(fù).而針對N0G0-A 的抗N0G0-A抗體如IN-1能取消髓鞘的抑制作用，促進(jìn)中風(fēng)后肢體功能恢復(fù)及一定程度的 神經(jīng)再生。此外，在中風(fēng)發(fā)生后一周使用抗N0G0-A抗體，或在老年大鼠中風(fēng)模型上使用抗 N0G0-A抗體，均能促進(jìn)患側(cè)功能恢復(fù)，效果顯著(1，2，3)。大量研究發(fā)現(xiàn)，抗N0G0-A單克隆抗體能取消髓鞘的抑制作用，促進(jìn)神經(jīng)纖維的再 生。但是用鼠源性抗體治療人體疾病，受到鼠源性抗體的免疫原性等限制。以往的臨床經(jīng) 驗已證實，鼠源抗體很難取得理想的療效。近年來，人源化抗體技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為這種針對N0G0-A的單克隆抗體免疫治療過渡到臨床提供了可能。因此，本領(lǐng)域需要一種新的生 物活性更高的人源化抗N0G0-A單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性結(jié)合N0G0-A的單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是制備上述單克隆抗體的方法。本發(fā)明還提供大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備該抗體的生產(chǎn)工藝。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明一方面提供了一種人源化單克隆抗體，該蛋白特異 性結(jié)合并中和人N0G0-A，結(jié)合區(qū)域為人N0G0-A蛋白的氨基酸565-697之間。該蛋白包含重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”指從一類基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包 含的單個抗體是相同的。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點，即針對抗原上的單個 決定簇。另外，單克隆抗體是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。用于 本發(fā)明的單克隆抗體可用雜交瘤方法制得，或可用重組DNA方法，也可從噬菌體抗體文庫 中分離獲得。人源化抗體是人免疫球蛋白中的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被非人源抗體的CDR殘基 代替。通常，人源化抗體包含基本上所有的(至少一個，通常兩個)可變區(qū)，其中所有的或 基本上所有的CDR區(qū)為非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，所有或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋 白序列的FR區(qū)。本發(fā)明的人源化單克隆抗體通常可通過以下方法來進(jìn)行制備。首先，提供含有編 碼本發(fā)明人源化單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列的表 達(dá)載體。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相鏈的啟動子和終止信號。編碼本發(fā)明的人源化單抗的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段獲得。 然后，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達(dá)載體中，本發(fā)明所用的表達(dá)載 體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達(dá)載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達(dá) 載體。接著，用上述獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。一般包括原核細(xì)胞和真核細(xì) 胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌等。真核細(xì)胞包括CH0細(xì)胞等。本發(fā)明推出的抗N0G0-A抗體具有生物學(xué)活性，包括完整抗體或其片段，可以是完 整的單克隆抗體、多克隆抗體，還可以是至少兩個完整抗體形成的多特異抗體(例如雙特 異性抗體)和抗體片段?？贵w可以是嵌合抗體、完全人抗體或人源化抗體。該抗N0G0-A抗體能促進(jìn)腦中風(fēng)或其他神經(jīng)科疾病/障礙發(fā)生后，受損神經(jīng)功能的 恢復(fù)及神經(jīng)軸突的萌生，對于腦中風(fēng)后肢體功能恢復(fù)具有顯著效果。本發(fā)明中的抗體的用途主要用于預(yù)防或治療人的中風(fēng)，還可用于治療其他神經(jīng)科 疾病/障礙，所述其它神經(jīng)科疾病包括創(chuàng)傷性腦損傷，脊髓損傷，阿爾茨海默病，額顳癡呆 (tau蛋白病)，周圍神經(jīng)科疾病，帕金森病，亨廷頓舞蹈病和多發(fā)性硬化。本發(fā)明所述抗體可用于腦中風(fēng)發(fā)生當(dāng)時到發(fā)生12月內(nèi)，較優(yōu)的選擇是發(fā)生當(dāng)時 至發(fā)生1月內(nèi)。本發(fā)明所述的抗體特征在于給藥途徑以口服給藥為主，也可采用胃腸外給藥，包括通過皮下、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射給予藥物組合的成分，還可通過鞘內(nèi)注射等給藥。本發(fā)明所述藥物的特征在于在組成上包括有效劑量的抗N0G0-A抗體和及藥學(xué)上 可以接受的載體、輔料和(或)其它藥物。藥物使用劑量范圍可以隨患者的年齡，病情和病程而變化。本發(fā)明還提供一種先進(jìn)的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備該人源化單克隆抗體的生產(chǎn)工藝， 其特征在于，以改良型DXL無血清培養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì)，采用中空纖維生物反應(yīng)器，高密度 CH0細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)法繼以分離純化制得。其中，改良型無血清培養(yǎng)液添加了神經(jīng)細(xì)胞生長因 子，表皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子或胚胎生長因子中的一種或幾種。各種生長因子的 含量各為0.01-0. 1毫克/升。實施例1 制備和篩選雜交瘤給SJL小鼠皮下注射15 ii g總蛋白(人N0G0-A剪接體(氨基酸565-697))及CFA 和RIBI兩種佐劑。8天和14天后，再給予小鼠8 yg相同蛋白及RIBI佐劑，加強(qiáng)免疫。3 天以后，從局部引流的淋巴結(jié)獲得免疫細(xì)胞，使用PEG1500將免疫細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 融合，產(chǎn)生雜交瘤。通過2-3輪有限稀釋，克隆單一雜交瘤細(xì)胞系。起始雜交瘤抗體選擇是根據(jù)在微量滴定板上與N0G0-A蛋白直接結(jié)合。然后根據(jù) 在ELISA測定中可溶性蛋白競爭該結(jié)合活性的能力，篩選出約50個雜交瘤。實施例2可變區(qū)的克隆從選定的3B4/1和4D3/3雜交瘤細(xì)胞中，提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)提取重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)cDNA序列。RT-PCR的正向引物是簡并引物的混合 物(所述引物對鼠免疫球蛋白基因前導(dǎo)序列具有特異性)，而反向引物是針對恒定區(qū)的同 種型特異性抗體。PCR引物被設(shè)計為攜帶5’限制酶識別位點，使其克隆到PUC19中，用于 DNA測序。實施例3用基因工程和抗體工程方法制備重組抗N0G0-A抗體可以從用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，純化具有鼠2a/k恒定區(qū)的重組抗體，所述質(zhì)粒包含 克隆到小鼠IgG2a/k恒定區(qū)基因區(qū)段中的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。通過PCR擴(kuò)增克隆鼠 V區(qū)，引入克隆到哺乳動物表達(dá)載體Rid和Rln中所需的限制位點。在VH區(qū)符合讀框地設(shè) 計Hind III和Spe I位點，以便克隆到含有小鼠Y 2a恒定區(qū)的修飾Rid載體中。在&區(qū) 符合讀框地設(shè)計Hind III和BsiW I位點，以便克隆到含有小鼠k恒定區(qū)的修飾Rln載體 中。實施例43B4的人源化修飾通過構(gòu)建重疊寡核苷酸，從頭開始制備人源化VH和\構(gòu)建體。所述重疊寡核苷酸 包含用于克隆到Rid和Rln哺乳動物表達(dá)載體的限制位點以及人信號序列。將Hind III和 Spe I限制位點符合讀框地引入到含有CAMPATH-1H信號序列的VH區(qū)中，用于克隆到含有人 體突變恒定區(qū)的Rid中。將Hind III和BsiW I限制位點符合讀框地引入到含有CAMPATH-1H 信號序列的八區(qū)中，用于克隆到含有人k恒定區(qū)的修飾Rln。并對影響親和力的框架區(qū)重要?dú)埢M(jìn)行回復(fù)突變。實施例5大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備該抗體從生產(chǎn)細(xì)胞庫中取出高效表達(dá)目的蛋白的CH0細(xì)胞株，經(jīng)小量擴(kuò)增，取對數(shù)期前 細(xì)胞移入中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)，監(jiān)控工藝條件，包括合適的溫度、PH、PC02、P02、氧流速 率等。并對葡萄糖、乳酸以及PH值等指標(biāo)進(jìn)行分析，以實現(xiàn)細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成 平衡調(diào)控，進(jìn)行高密度、高產(chǎn)量細(xì)胞培養(yǎng)。待抗體濃度達(dá)到要求后，收集培養(yǎng)液，低溫升華法 離心濃縮，得到初級產(chǎn)品，再以HPLC分離純化初級產(chǎn)品，以低壓低溫升華法濃縮產(chǎn)品，同時 對產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，最后經(jīng)無菌過濾后獲得整分子的單抗。參考文獻(xiàn)1. Catherine M e t a 1 . (2002) Functional recovery and neuroanatomicalplasticity following middle cerebral artery occlusion and IN—1 antibodytreatment in the adult Rat. Ann Neurol. 51 :433_4412. Seymour AB et al. (2005) Delayed treatment with monoclonal antibodyIN-1 1 week after stroke results in recovery of function and corticorubralplasticity in adult rats. J Cereb Blood Flow Metab 25:1366—13753. Markus TM et al. (2005) Recovery and brain reorganization after strokein adult and aged rats. Ann Neurol 58 :950_95權(quán)利要求
一種人源化單克隆抗體或其功能片段，所述抗體或其功能片段結(jié)合并中和人NOGO-A蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，所述抗體與人NOGO-A蛋白的氨基酸565-697之間的區(qū)域結(jié)合
3.—種表達(dá)載體，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體的DNA 序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a) 提供一表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有編碼權(quán)利要求1所述的人源化單克隆抗體的DNA序列以 及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；c) 在適合所述人源化單克隆抗體表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細(xì)胞；d)分離純化獲 得所述人源化的單克隆抗體。
6.一種先進(jìn)的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備該人源化單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，其特征在于，以 改良型DXL無血清培養(yǎng)液為培養(yǎng)基質(zhì)，采用中空纖維生物反應(yīng)器，高密度CHO細(xì)胞連續(xù)培 養(yǎng)法繼以分離純化制得。其中，改良型無血清培養(yǎng)液添加了神經(jīng)細(xì)胞生長因子，表皮生長 因子，成纖維細(xì)胞生長因子或胚胎生長因子中的一種或幾種。各種生長因子的含量各為 0.01-0. 1 毫克 / 升。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人源化抗NOGO-A單克隆抗體，該單克隆抗體的生物活性和在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量有顯著提高。本發(fā)明還提供了該抗體的制備方法及大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)制備該抗體的工藝方法。
文檔編號C12P21/08GK101851290SQ200910048760
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者毛力真 申請人:毛力真