專利名稱：：一種含雙硫代核苷寡核苷酸探針在測(cè)定dna序列的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及DNA測(cè)序探針及其在測(cè)定DNA測(cè)定序列中的應(yīng)用，特別涉及一種含雙硫代核苷寡核苷酸測(cè)序探針及其在測(cè)定DNA序列的應(yīng)用。二
背景技術(shù)：
：核酸(如DNA)包含著所有生物機(jī)體的藍(lán)圖，對(duì)核酸序列的研究對(duì)生命科學(xué)至關(guān)重要。隨著人類基因組計(jì)劃和各種模式生物基因組計(jì)劃的開(kāi)展和完成，使人類步入了后基因時(shí)代，對(duì)當(dāng)代的生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了巨大的影響，分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科得到了迅猛的發(fā)展。從基因水平上認(rèn)識(shí)生命的差異，疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。就基因序列分析而言，后基因時(shí)代的重點(diǎn)己由全基因組序列測(cè)定轉(zhuǎn)移到了對(duì)基因組中個(gè)體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。在基礎(chǔ)研究方面，研究疾病基因的遺傳規(guī)律，克隆致病基因；在應(yīng)用方面，直接尋找疾病的易感基因突變位點(diǎn)通過(guò)對(duì)于大量某一特定疾病的基因組樣本中突變基因型進(jìn)行大規(guī)模鑒定和檢測(cè)，可以獲得有關(guān)與該疾病相關(guān)基因型的信息。通過(guò)基因組麗A序列的測(cè)定可以為理解生命的起源、疾病發(fā)生、以及個(gè)體化醫(yī)療等提供有用的相關(guān)核酸序列信息。目前，全基因組DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為國(guó)際上一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)十分激烈的研究領(lǐng)域。除了對(duì)現(xiàn)有的基于電泳的測(cè)序技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)外，當(dāng)前正在發(fā)展的新型測(cè)序技術(shù)主要集中在非電泳的手段上。而新型非電泳高通量測(cè)序技術(shù)不管采用延伸法，還是連接法測(cè)序其原理均是遞進(jìn)式的方式即先用已知標(biāo)記物標(biāo)記的單體或者引物延伸(連接)，以形成的標(biāo)記物確定第一次測(cè)序中的堿基序列，然后將第一次測(cè)序中的標(biāo)記物清除，再進(jìn)行下一次序列的測(cè)定，由此循環(huán)完成對(duì)模板序列的所有測(cè)定。因此標(biāo)記物的有效清除就顯得非常重要，因?yàn)闃?biāo)記物清除不徹底將導(dǎo)致標(biāo)記物量的累結(jié)，給后續(xù)標(biāo)記物量的確定帶來(lái)困難，影響測(cè)序的長(zhǎng)度和正確性；同時(shí)對(duì)標(biāo)記物清除過(guò)程中是否對(duì)模板或者測(cè)序引物造成破壞也將大大影響測(cè)序的長(zhǎng)度和正確性。對(duì)標(biāo)記物的清除方法有化學(xué)切割、酶降解等各種途徑，既可以直接切割標(biāo)記物基團(tuán)，也可以通過(guò)切割某些與標(biāo)記物連接堿基而間接將標(biāo)記物清除。一般而言，酶降解比化學(xué)切割具有更好的特異性，對(duì)核酸分子的影響也較少。外切酶III具有催化從雙鏈DNA3'端羥基逐一去除單核苷酸的反應(yīng)，但不降解核酸內(nèi)的磷酸二酯鍵，也不降解單鏈DNA及帶3'端突出的雙鏈DNA的性能。同時(shí)巳有的研究表明(Yang"a/.NucleicAcidsResearch,2007，35(9)，3118-3127)，夕卜切酶III的降解作用受阻于硫代修飾的核苷，即不能對(duì)硫代修飾的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割。然而，單硫代修飾的核苷具有R、S兩種對(duì)映異構(gòu)體，而外切酶III對(duì)R型的分子(即oc硫代分子)不具有切割功能，而對(duì)S型的分子具有與普通磷酸二酯鍵同樣的切割功能。很明顯如果利用硫代修飾的磷酸二酯鍵具有不被切割的功能來(lái)清除測(cè)序反應(yīng)中的標(biāo)記物，需要將含量一半的S型的分子進(jìn)行拆分得到純凈的R型的分子，或者對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改性以消除對(duì)映異構(gòu)體。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的就是通過(guò)一種不具有對(duì)映體結(jié)構(gòu)的(即含雙硫代)核苷測(cè)序探針，利用某些酶(如外切酶III等)對(duì)正常堿基間的磷酸二酯鍵具有的降解作用，而對(duì)雙硫代修飾的磷酸二酯鍵具有不被切割的功能，實(shí)現(xiàn)測(cè)序反應(yīng)中標(biāo)記物的清除。本發(fā)明的目的是提供一種含雙硫代核苷寡核苷酸測(cè)序探針在測(cè)定面A序列的應(yīng)用，具有測(cè)定正確可靠，易于實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。建立新的雜交-酶連接-酶切割的高通量測(cè)序技術(shù)，為全基因組DNA序列分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的基因組序列測(cè)定技術(shù)。技術(shù)方案本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針的3'端為一種標(biāo)記物，5'端為磷酸基團(tuán)，測(cè)序探針序列包含3-15個(gè)堿基和一個(gè)與標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的明確堿基和至少一個(gè)雙硫代核苷，雙硫代修飾的核苷位于與3'端標(biāo)記物連接的堿基上游的任意位置，且在探針序列中位置為已知確定，明確堿基位于雙硫代修飾的核苷5'端上游的任意位置，且在探針序列中的位置是已知確定的。含雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸的測(cè)序探針，其特征在于這段寡核苷酸序列中至少含有一個(gè)含雙硫代核苷，該核苷不被外切酶III切割，而外切酶III可切割正常的DNA序列。利用這個(gè)特點(diǎn)可以將標(biāo)記寡核苷酸序列選擇性的切割將標(biāo)記物6清除以實(shí)現(xiàn)循環(huán)序列測(cè)定。含雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸探針序列中至少含有一個(gè)明確堿基或雙硫代的明確堿基，四個(gè)明確堿基分別為A、G、C、T或雙硫取代的A、G、C、T，每個(gè)明確堿基標(biāo)記一種特定的標(biāo)記物。明確堿基位于雙硫代修飾的核苷5'端的上游任意位置，即酶切割不會(huì)切割到明確堿基的位置。所述的含雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列中的若干個(gè)堿基N的數(shù)目應(yīng)盡可能小，一般為3-15個(gè)，最好為3-5個(gè)，這樣可以提高測(cè)序探針的濃度。同時(shí)為了確保探針雜交的特異性，位于雙硫代核苷3'端的下游堿基N可以由除正常四個(gè)堿基(A、G、G、T)夕卜，還為通用堿基即能與正常堿基形成氫鍵的其它堿基或者堿基類似物基團(tuán)構(gòu)成，如脫氧肌苷、脫氧核糖、核糖、次黃嘌呤、甲基腺嘌呤、甲基鳥(niǎo)嘌呤等。將基因組用酶切割(或者超聲破碎)成大小為100bp左右的片斷，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對(duì)通用連接子進(jìn)行連接，通過(guò)使用與連接子序列互補(bǔ)的擴(kuò)增引物擴(kuò)增，固定，變性后獲得未知DNA模板單鏈。與其中一個(gè)連接子序列互補(bǔ)的序列作為測(cè)序定位引物，并與未知DNA模板單鏈完成雜交后，四種標(biāo)記的含雙硫代核苷探針與所有未知DNA模板雜交，在連接酶的作用下，硫代核苷探針與緊鄰的測(cè)序定位引物的連接反應(yīng)，當(dāng)連接反應(yīng)完成后，在45'C下用中性緩沖液洗滌，將未連接的硫代核苷探針清除，即在45'C下，含雙硫代核苷探針不能再與DNA摸板形成雜交而隨洗滌液清除，掃描記錄該次不同位置上未知DNA模板給出的標(biāo)記物信號(hào)，便可確定未知DNA模板上對(duì)應(yīng)的堿基序列。由于該次連接的這段寡核苷酸序列中至少含有一個(gè)含雙硫代核苷，當(dāng)外切酶III能夠?qū)φ：塑者M(jìn)行切割時(shí)，這個(gè)含雙硫代則不會(huì)被切割。由于熒光標(biāo)記物連接在位于雙硫代核苷3'端的簡(jiǎn)并堿基N上，因此利用這個(gè)特點(diǎn)可以將標(biāo)記寡核苷酸序列選擇性的切割標(biāo)記物及雙硫代核苷3'端的簡(jiǎn)并堿基N，以實(shí)現(xiàn)對(duì)下一個(gè)堿基的序列測(cè)定。具體步驟如下a.將待測(cè)DNA模板連接已知的連接子，固定并擴(kuò)增后變性為單鏈DNA模板，與連接子序列互補(bǔ)的測(cè)序定位引物同單鏈DNA模板完成雜交，雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i，i》1且為自然數(shù)數(shù)；b.加入四種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，測(cè)序探針與緊鄰的測(cè)序定位引物連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定堿基，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；c.在外切酶III切除后的DNA模板中，加入四種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，緊鄰未被外切酶III切除的測(cè)序探針堿基與測(cè)序探針連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定堿基，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；d.重復(fù)步驟c，根據(jù)序列測(cè)定的長(zhǎng)度和雙硫代堿基在探針中的位置確定終止上述步驟；例如雙硫代堿基位于探針中5'端的第四個(gè)位置，且為明確堿基。如果序列測(cè)定長(zhǎng)度為25個(gè)堿基，則進(jìn)行5次連接，4次切割；如果序列測(cè)定長(zhǎng)度為35個(gè)堿基，則進(jìn)行7次連接，6次切割。e.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，使得雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i-n，其中i》l且為自然數(shù)，1《n《i且n為從l開(kāi)始的遞增自然數(shù)；f.重復(fù)步驟b，c,d，e;g.測(cè)定當(dāng)『i時(shí)，重復(fù)歩驟b，c，d，終止測(cè)定。上面所述的四種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針為含有四種明確堿基或雙硫代明確堿基。由于用于雜交的測(cè)序定位引物是通過(guò)非常成熟的固相DNA方法(文獻(xiàn)依據(jù)UhlmannE，PeymanA.ChemicalReviews1990,90(4)，544—584;EngelsJW,UhlmannE.Angew.Chem.Int.Ed.Engl,1989，28,716-734)合成并純化得到，因此該方法更換的測(cè)序定位引物沒(méi)有錯(cuò)誤連接的累積效應(yīng)，能夠維DNA模板和測(cè)序定位引物的量，序列的測(cè)定正確可靠。其中檢測(cè)熒光的方法為通過(guò)常規(guī)的檢測(cè)熒光的方法，后進(jìn)行計(jì)算分析，獲得未知模板DNA序列本文所述的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目是指定位引物3'端堿基距離單鏈DNA模板的3，端堿基位置的堿基數(shù)；DNA模板的第O號(hào)位置上的堿基為測(cè)序DNA模板連接己知的連接子，固定并擴(kuò)增后變性為單鏈DNA模板5，端堿基為0號(hào)，并沿測(cè)序DNA模板序列的5'端至3'端，從l開(kāi)始編號(hào)核苷為生物化學(xué)方面的核苷酸、寡核苷酸測(cè)序定位引物指能夠確定模板測(cè)序起點(diǎn)位置，并與測(cè)序模板雜交的寡核苷酸測(cè)序引物，由于所有測(cè)序模板均在兩端連接了已知序列的連接子，測(cè)序定位引物是其中一個(gè)連接子部分序列的完全互補(bǔ)序列；擴(kuò)增引物指能夠擴(kuò)增測(cè)序模板的擴(kuò)增引物，由于所有測(cè)序模板均在兩端連接了已知序列的連接子，擴(kuò)增引物是這兩個(gè)連接子部分或者完全互補(bǔ)序列；雙硫代的A、G、C、T:堿基A、G、C、T中磷酸二酯鍵中的兩個(gè)非橋氧原子被兩個(gè)硫原子所取代；通用連接子由于測(cè)序模板序列完全不同，為了在同一條件下擴(kuò)增和測(cè)序這些未知DNA序列，將所有未知DNA序列(測(cè)序模板)的兩端分別連接一段已知、但不測(cè)序模板完全相同或者互補(bǔ)的寡核苷酸序列，這樣所有測(cè)序模板兩端均含有一端完全相同的序列一即通用連接子；簡(jiǎn)并堿基N:探針序列中某個(gè)堿基位置為簡(jiǎn)并堿N表示該位置是由25%的A、25%的0、25y。的C或25y。的T組成的四條寡核苷酸序列，這四條序列的該位置分別與四個(gè)互補(bǔ)的堿基(A、G、C、T)雜交；通用堿基寡核苷酸序列中某個(gè)堿基位置為通用堿基，表示該位置能與四個(gè)堿基(A、G、C、T)雜交，即能與正常堿基形成氫鍵的其它堿基或者堿基類似物基團(tuán)；明確堿基寡核苷酸序列中某個(gè)堿基位置為明確堿基，表示該位置的堿基是確定的堿基如A、G、C、T之一，該明確堿基與雙硫代核苷探針的標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)，即測(cè)序過(guò)程中檢測(cè)的明確堿基是通過(guò)其對(duì)應(yīng)標(biāo)記的熒光物質(zhì)來(lái)反映的。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明中所述的雙硫代核酸或雙硫代序列用作抗腫瘤方面，而在測(cè)序方面在本發(fā)明申請(qǐng)之前未見(jiàn)報(bào)道，由于雙硫代核酸比單硫代核酸增加了一個(gè)硫取代，避免了單硫代核酸R、S兩種對(duì)映異構(gòu)體問(wèn)題，從而外切酶III更好進(jìn)行切割，即不需要將含量一半的S型的分子進(jìn)行拆分得到純凈的R型的分子，或者對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改性以消除對(duì)映異構(gòu)體，從而節(jié)約了成本。本發(fā)明所述的探針序列可以為一個(gè)以上雙硫代核酸且雙硫代核酸可以為雙硫代的A、G、T、C，在測(cè)序過(guò)程中更加準(zhǔn)確，錯(cuò)誤率低。實(shí)現(xiàn)了DNA序列測(cè)定的標(biāo)記物的定點(diǎn)有效切除，由于采用酶切方法，因此切割位置準(zhǔn)確、切割效率高，對(duì)模板和測(cè)序引物無(wú)影響，序列的測(cè)定正確可靠。2.本發(fā)明的測(cè)序探針由于確定的堿基可以置于任何己知的位置，因此可以通過(guò)改變測(cè)序定位引物的方法先將某些特定位置堿基序列確定的方法來(lái)增加序列測(cè)定的閱讀長(zhǎng)度。此外，該發(fā)明雙硫代寡核苷酸可以按照目前DNA固相合成的方法合成得到，其它步驟均按照流行的分子生物學(xué)方法進(jìn)行，容易在現(xiàn)有的技術(shù)上實(shí)施。以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。四圖1是本發(fā)明含雙硫代核苷DNA鏈及其酶切割位置示意圖。圖2是本發(fā)明一組標(biāo)記的含雙硫代核苷的寡核苷酸(測(cè)序探針)示意圖。圖3是本發(fā)明一種含雙硫代核苷探針及其連接序列測(cè)定方法示意圖。圖4是本發(fā)明發(fā)明一種含雙硫代核苷探針在不同測(cè)序引物下堿基序列測(cè)定位置的確定示意圖。五具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的雙硫代寡核苷酸序列可以從GlenResearch公司(美國(guó))購(gòu)買，經(jīng)過(guò)高效液相色譜法純化，也可以是凝膠電泳純化的產(chǎn)品。5，-p-NNNNAsNXXX-Cy3、5，-p-NNNNGsNXXX-Cy5、5，-p-NNNNCsNXXX-TexasRed、5'-p-NNNNTsNXXX-Fam四種熒光標(biāo)記物為GlenResearch公司(美國(guó))合成T4連接酶為英駿(上海)生物工程有限公司生產(chǎn)外切酶III為上海生工生產(chǎn)生產(chǎn)圖1中1為含雙硫代修飾核苷的DNA鏈，2為能與含雙硫代修飾核苷的DNA鏈互補(bǔ)的一條DNA鏈。由于外切酶III可以通過(guò)催化DNA的磷酸酯鍵水解，從雙鏈DNA的3'-OH末端降解生成5'-單核苷酸的3'—5'外切酶活性，但是不能降解3'-突出末端。因此在外切酶III的作用下(A)，從含雙硫代修飾核苷的DNA鏈的3'端開(kāi)對(duì)正常的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割。由于雙硫代修飾的磷酸二酯鍵具有保護(hù)作用，外切酶III對(duì)雙硫代修飾的磷酸二酯鍵，及其所保護(hù)的5'端的其它正常磷酸二酯鍵均不再被切割。同時(shí)由于與含雙硫代修飾核苷的DNA鏈互補(bǔ)的一條DNA鏈的3'端為突出末端，不會(huì)被降解。圖2中寡核苷酸序列中的上標(biāo)S表示雙硫代修飾的磷酸二酯鍵，下標(biāo)P表示磷酸根基團(tuán)，F(xiàn)l、F2、F3、F4分別表示4種不同標(biāo)記物(如TexasRed，Cy5,Cy3，F(xiàn)am等)。堿基N表示四個(gè)堿基混合，數(shù)目為1-9，最佳為3-6，X表示堿基N、堿基類似物或者基團(tuán)，如脫氧肌苷、脫氧核糖、核糖、次黃嘌呤、甲基腺嘌呤、甲基鳥(niǎo)嘌呤、甲基胞嘧啶、二氫尿嘧啶等，X數(shù)目為1-10，最佳為3-6，且3《N+X《15，最佳為3《N+X《8，在這組(四個(gè))硫代核苷測(cè)序探針中，除明確的堿基A(或者G、或者C、或者T)位置需要與模板序列中相應(yīng)的堿基配對(duì)外，其余堿基，不管是堿基N，或者X，均能與模板序列的堿基配對(duì)。圖(3)中有測(cè)序定位引物1,未知DNA模板序列2，含雙硫代核苷測(cè)序探針3。測(cè)序定位引物(1)與固定的單鏈DNA模板(2)完成雜交，加入標(biāo)記的一組雙硫代核苷測(cè)序探針(3)完成雜交(a)，在連接酶的作用下，緊鄰測(cè)序定位引物(2)的完全配對(duì)的硫代核苷測(cè)序探針(3-1)與測(cè)序定位引物(2)完成連接反應(yīng)(b)，過(guò)變性、清除未連接的硫代核苷測(cè)序探針(3-2，3-3)，并掃描記錄DNA模板本次雜交-連接列后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的一個(gè)堿基T(第1個(gè)堿基)的測(cè)定(c)。重復(fù)上述過(guò)程，進(jìn)行下一個(gè)堿基(第5個(gè)堿基、...)的測(cè)定(e)。圖4中P0為含雙硫代核苷寡核苷酸，Pl，P2，P3，P4，P5，為堿基數(shù)目相差一個(gè)的不同測(cè)序引物?？驁D中表示測(cè)序引物P1為測(cè)序起點(diǎn)，更換測(cè)序引物清除標(biāo)記物的DNA測(cè)序堿基的位置，Pl-l，Pl-2，Pl-3，P1-5，P1-5對(duì)應(yīng)DNA模板5、10、15、...等堿基位置。同樣地測(cè)序引物P2，P3，P4，...等為測(cè)序起點(diǎn)對(duì)應(yīng)于對(duì)應(yīng)DNA模板相應(yīng)的數(shù)字表示出的堿基位置。從一個(gè)測(cè)序引物P更換為另一11個(gè)測(cè)序引物只需要將前一個(gè)測(cè)序引物從DNA模板中清除變性，然后雜交另一個(gè)測(cè)序引物即可以。當(dāng)高通量雙硫代核苷探針實(shí)際上是一組(四個(gè)或者十六個(gè))寡核苷酸序列，這組序列是所有測(cè)序模板的測(cè)序探針。當(dāng)測(cè)序定位引物與未知DNA模板完成雜交后，加入標(biāo)記的這組硫代核苷測(cè)序探針與未知DNA模板雜交，并在連接酶的作用下，將緊鄰測(cè)序定位引物的，完全配對(duì)的硫代核苷測(cè)序探針與測(cè)序定位引物完成連接，然后通過(guò)變性、清除未連接的硫代核苷測(cè)序探針，并掃描記錄DNA模板本次雜交-連接列后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的一個(gè)堿基的測(cè)定。重復(fù)上述過(guò)程，每加入一組硫代核苷探針就實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的下一個(gè)堿基的測(cè)定。實(shí)施例1:雜交-連接熒光標(biāo)記序列法測(cè)定包含人全基因組。將人基因組用酶切割(或者超聲破碎)成大小為50-1000堿基的片斷，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對(duì)通用連接子(假定均為20個(gè)堿基)使用T4連接酶(英駿(上海)生物工程有限公司)在37'C連接2小時(shí)。連接子的互補(bǔ)寡核酸序列作為擴(kuò)增引物(其中一個(gè)預(yù)先將修飾固定在微珠上固定方法可以采用英駿(上海)生物工程有限公司合成的生物素修飾寡核酸與NewEnglandBiolabs(美國(guó))公司生產(chǎn)的鏈霉親和素修飾的微珠之間在室溫下反應(yīng)1小時(shí)完成)，而其中的一個(gè)連接子寡核酸序列與后續(xù)測(cè)序反應(yīng)中的測(cè)序定位引物的序列完全相同將片段化核酸序列與一對(duì)擴(kuò)增引物(其中一個(gè)引物固定在微珠上進(jìn)行并行乳液PCR反應(yīng)；PCR的條件反應(yīng)條件如下95'C變性5分鐘，94'C變性30秒，62°C30秒復(fù)性，72'C延伸1分鐘，循環(huán)60次)，擴(kuò)增片段化的人全基因組。然后用末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，37。C反應(yīng)30分鐘，將帶有氨基的核苷轉(zhuǎn)移到PCR產(chǎn)物的末端，由于經(jīng)過(guò)末端專移的PCR產(chǎn)物中有一條單鏈與微珠相連接，將這些含有氨基的PCR產(chǎn)物與醛基修飾的玻璃片之間在37°C，pH=10的條件下反應(yīng)2小時(shí)，便可以將含DNA模板的微珠固定到玻璃片上，通過(guò)0.1M的NaOH溶液在常溫下變性1小時(shí)將未固定在微珠上的PCR產(chǎn)物清除，變得到固定在玻璃片上的人全基因組測(cè)序模板。12參照附圖1、圖2、圖3和圖4，將測(cè)序定位引物與人全基因組測(cè)序模板雜交，然后將GlenResearch公司(美國(guó))合成、并標(biāo)記不同顏料的5，-p-NNNNAsNXXX-Cy3、5'-p-NNNNGsNXXX-Cy5、5'-p-NNNNCsNXXX-TexasRed、5，-p-NNNNTsNXXX-Fam(GlenResearch公司(美國(guó))合成)與人全基因組測(cè)序模板完成雜交一連接，并在清除未連接的標(biāo)記硫代核苷測(cè)序探針后，進(jìn)行掃描分析，確定哪些位置的模板進(jìn)行了哪些堿基的連接反應(yīng)，從而確定基因組序列上第5個(gè)位置上堿基的序列。用酶切方法將連接探針中未被硫代修飾的堿基連同熒光分子一同切除。重復(fù)上述過(guò)程，每重復(fù)一次便增加一個(gè)堿基的序列測(cè)定，直到因每個(gè)堿基的延伸效率導(dǎo)致不能準(zhǔn)確堿基序列為止，這樣便可以知道位置5、10、15、20、...、等位置的堿基序列；停止該次測(cè)序，將延伸上述測(cè)定若干個(gè)堿基序列的測(cè)序定位引物變性掉，并重新雜交3端比原來(lái)少一個(gè)堿基的測(cè)序定位引物，基于同樣的道理可以測(cè)定4、9、14、19.....等位置的堿基序列；依上述原理進(jìn)行便可以將未知DNA模板的序列確定。具體歩驟如下a.將測(cè)序DNA模板連接已知的連接子，固定并擴(kuò)增后變性為單鏈DNA模板，與連接子序列互補(bǔ)的測(cè)序定位引物同單鏈DNA模板完成雜交，雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i且i》l。b.加入四種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，測(cè)序探針與緊鄰的測(cè)序定位引物連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定第0號(hào)堿基，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；加入DNA測(cè)序引物并完成與未知單鏈DNA模板的雜交、連接反應(yīng)，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知DNA模板的第^號(hào)位置上的堿基的測(cè)定(未知DNA模板測(cè)序位置規(guī)定為0、1、2、...，與DNA模板連接的已知序列則從第0號(hào)位置開(kāi)始規(guī)定為-l、-2、-3、...)，然后，用外切酶III將DNA測(cè)序引物中未被硫代修飾的堿基連同熒光分子一同切除，所述的DNA測(cè)序引物包括一組雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，所述一組雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列分別為5，-p-ANNNsNXXX-Fl5，-p-GNNNsNXXX-F2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中，A、G、C、T為堿基，并與4種不同標(biāo)記物(Fl、F2、F3、F4)相對(duì)應(yīng)，上標(biāo)S表示雙硫代修飾的磷酸二酯鍵，下標(biāo)P表示磷酸根基團(tuán)，N為簡(jiǎn)并堿基，數(shù)目為3-15，X為簡(jiǎn)并堿基、堿基類似物或者基團(tuán)，X數(shù)目為l-lO，A/G/C/T在寡核苷酸序列中為巳知明確的位置，可以位于第l、2、3.....等位置，但最大位置不超過(guò)簡(jiǎn)并堿基所占據(jù)的位置，也可以被雙硫代修飾，雙硫代修飾的核苷位置已知，可以位于寡核苷酸序列中第1、2、3.....等位置，但最大位置不超過(guò)簡(jiǎn)并堿基所占據(jù)的位置；將A/G/C/T位置規(guī)定為寡核苷酸序列中第1位置，雙硫代修飾的核苷位置位于寡核苷酸序列中第4位置的一組標(biāo)記的寡核苷酸作為測(cè)序探針進(jìn)行測(cè)序。c.在外切酶III切除后的DNA模板中，加入四種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，緊鄰未被外切酶III切除的測(cè)序探針堿基與測(cè)序探針連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，依次測(cè)得第5、75、……、5^號(hào)位置上的堿基，其中，歷為自然數(shù)，5m《i;用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；d.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)步驟c，依次測(cè)得第4、9、14、……、5m-l號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;e.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)步驟c，依次測(cè)得第3、8、13、……、5m-2號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;f.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)歩驟c，依次測(cè)得第2、7、12、……、5m-3號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;g.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)歩驟c，依次測(cè)得第1、6、11、……、5m-4號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;實(shí)例2:三條已知DNA模板序列的測(cè)序?qū)⑷斯ず铣傻?條DNA序列作為模板，采用雙硫代核苷探針對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定，其模板序列、測(cè)序引物和探針見(jiàn)下表l:表1含雙硫代核苷探針測(cè)定三條己知模板序列的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>試驗(yàn)步驟如下1)將這三條DNA序列點(diǎn)樣于醛基修飾的玻璃片之間，在37'C，pH10的條件下反應(yīng)2小時(shí)，制備多樣本DNA模板；2)用3'端羥基化的第一測(cè)序定位引物與DNA模板雜交，a.將四種熒光標(biāo)記物分別標(biāo)記且5'端磷酸化的含雙硫代寡核苷酸探針加入到玻璃片上，并在T4連接酶的作用下20'C連接40分鐘，45。C下用洗滌液洗滌，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，然后掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定第l位置堿基的序列，然后用外切酶III37'C，1U/yl，反應(yīng)40min-lh，將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同熒光分子一同切除；b.在外切酶III切除后的DNA模板中，加入四種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與未知單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，緊鄰未被外切酶III切除的測(cè)序探針堿基與測(cè)序探針連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定第6個(gè)位置堿基的序列，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同熒光分子一同切除；c.重復(fù)步驟b;進(jìn)行5次連接，4次切割，則分別得到為第1、6、11、16、21位置堿基序列3)用0.1MNaOH變性將第1測(cè)序引物及其連接片段清除，更換新的測(cè)序定位引物(第2、3、4、5等)與固定未知單鏈的DNA模板完成雜交，雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i-n，其中i》1且為自然數(shù)，1《n《i且n為從l開(kāi)始的遞增整數(shù)；重復(fù)步驟a，b，c4)測(cè)定當(dāng)11=5時(shí)，重復(fù)步驟a，b，c，終止測(cè)定。這樣，第l測(cè)序引物測(cè)定第l、6、11、16、21位置堿基序列；第2測(cè)序引物測(cè)定第2、7、12、17、22位置堿基序列；第3測(cè)序引物測(cè)定第3、8、13、18、23位置堿基序列；第4測(cè)序引物測(cè)定第4、9、14、19、24位置堿基序列；第5測(cè)序引物測(cè)定第5、10、15、20、25位置堿基序列；因此三條序列的25個(gè)堿基信息全部確定。其切割特異性、切割效率，測(cè)序準(zhǔn)確性如下表2所示表2對(duì)已知序列測(cè)序的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1.一種含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針在測(cè)定DNA序列的應(yīng)用，所述的應(yīng)用方法包括以下步驟a.將待測(cè)DNA模板連接已知的連接子，固定并擴(kuò)增后變性為單鏈DNA模板，與連接子序列互補(bǔ)的測(cè)序定位引物同單鏈DNA模板完成雜交，雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i，i≥1且為自然數(shù)數(shù)；b.加入四種明確堿基為A、G、C、T或四種雙硫代的明確堿基含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，測(cè)序探針與緊鄰的測(cè)序定位引物連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定堿基，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；c.在外切酶III切除后的DNA模板中，加入四種明確堿基為A、G、C、T或四種雙硫代的明確堿基含雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，緊鄰未被外切酶III切除的測(cè)序探針堿基與測(cè)序探針連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定堿基，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；d.重復(fù)步驟c，根據(jù)序列測(cè)定的長(zhǎng)度和雙硫代堿基在探針中的位置確定終止上述步驟；e.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，使得雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i-n，其中i≥1且為自然數(shù)，1≤n≤i且n為從1開(kāi)始的遞增自然數(shù)；f.重復(fù)步驟b，c，d，e；g.測(cè)定當(dāng)n＝i時(shí)，重復(fù)步驟b，c，d，終止測(cè)定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的測(cè)定方法包括如下歩驟a.將測(cè)序DNA模板連接己知的連接子，固定并擴(kuò)增后變性為單鏈DNA模板，與連接子序列互補(bǔ)的測(cè)序定位引物同單鏈DNA模板完成雜交，雜交的測(cè)序定位引物距離單鏈DNA模板未知堿基序列位置的堿基數(shù)目為i且i》l。b.加入四種明確堿基為A、G、C、T或四種雙硫代的明確堿基的雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，測(cè)序探針與緊鄰的測(cè)序定位引物連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，測(cè)定第0號(hào)堿基，用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；c.在外切酶III切除后的DNA模板中，加入四種明確堿基為A、G、C、T或四種雙硫代的明確堿基的雙硫代核苷寡核苷酸的測(cè)序探針，完成與單鏈DNA模板的雜交，在連接酶的作用下，緊鄰未被外切酶III切除的測(cè)序探針堿基與測(cè)序探針連接，清除未連接的雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列，掃描記錄DNA模板本次雜交-連接后出現(xiàn)的標(biāo)記信號(hào)，依次測(cè)得第^、7隊(duì)75、……、，5/7號(hào)位置上的堿基，其中，ffi為自然數(shù)，5m《i;用外切酶III將測(cè)序探針中未被硫代修飾的堿基連同標(biāo)記物一同切除；d.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)歩驟c，依次測(cè)得第4、9、14、……、5m-1號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;e.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)步驟c，依次測(cè)得第3、8、13、……、5m-2號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;f.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)步驟c，依次測(cè)得第2、7、12、……、5m-3號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i;g.將測(cè)序定位引物變性清除，更換新的測(cè)序定位引物與單鏈的DNA模板完成雜交，重復(fù)步驟c，依次測(cè)得第1、6、11、……、5m-4號(hào)位置上的堿基，其中，m為自然數(shù)，5m《i。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的四種雙硫代核苷的標(biāo)記寡核苷酸序列分別為5,-p-ANNNsNXXX-Fl5，-p-GNNNsNXXX-F25，-p-CNNNsNXXX-F3(5，扁p-TNNN^XXX-F4其中，A、G、C、T為堿基，F(xiàn)l、F2、F3、F4為TexasRed、Cy5,Cy3、Fam，上標(biāo)S表示雙硫代修飾的磷酸二酯鍵，下標(biāo)P表示磷酸根基團(tuán)，N為簡(jiǎn)并堿基，X為通用堿基。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一種含雙硫代核苷寡核苷酸測(cè)序探針在測(cè)定DNA序列的應(yīng)用，即一種不具有對(duì)映體結(jié)構(gòu)的(即含雙硫代)核苷測(cè)序探針，利用外切酶III對(duì)正常堿基間的磷酸二酯鍵具有的降解作用，而對(duì)雙硫代修飾的磷酸二酯鍵具有不被切割的功能，實(shí)現(xiàn)測(cè)序反應(yīng)中標(biāo)記物的清除建立新的雜交-酶連接-酶切割的高通量測(cè)序技術(shù)，為全基因組DNA序列分析提供一種新方法，建立快速，準(zhǔn)確，便宜的基因組序列測(cè)定技術(shù)，具有測(cè)定正確可靠，易于實(shí)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101550448SQ200910026039公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年3月13日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日公開(kāi)號(hào)200910026039.X發(fā)明者靜唐,李燕強(qiáng),肖鵬峰,陸祖宏申請(qǐng)人:東南大學(xué)被以下專利引用(1),