專利名稱：一株根霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株根霉i Wz印^ sp.B1219菌株及其發(fā) 酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(3-苯基乳酸，又稱3-苯基乳酸或2-羥基-3-苯基丙酸(Phenyllactic acid，簡稱PLA)， 相對分子質(zhì)量為166，熔點(diǎn)121 125'C,無氣味，對酸、熱穩(wěn)定，在12rC加熱也不被 破壞，天然存在于蜂蜜中，對人或動(dòng)物細(xì)胞無毒。PLA的第二個(gè)碳原子為手性碳原子， 因此有兩種對映異構(gòu)體R-(+)-3-苯基乳酸(D-(+)-3-苯基乳酸)，和S-(-)-3-苯基乳酸 (L-(-)-3-苯基乳酸)。PLA是一種新型的抑菌物質(zhì)，有較廣的抑菌譜，其抑菌特性已受 到研究者的廣泛關(guān)注。特別是它能抑制真菌的污染可延長食品的貨架期，而且它又一種 可生物合成的天然化合物，有望作為新型天然防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)或其他領(lǐng)域中。 R-3-苯基乳酸和S-3-苯基乳酸均有抑菌效果，在較低濃度下就可有效抑制大部分食品腐 敗菌，其抑菌效果要顯著優(yōu)于一些常用食品防腐劑，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等合成防腐 劑。
現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)PLA的方法主要有化學(xué)法和生物合成法?；瘜W(xué)方法存在的問題是 產(chǎn)物的光學(xué)純度不夠高，操作復(fù)雜、污染環(huán)境嚴(yán)重、產(chǎn)品成本高以及產(chǎn)品質(zhì)量難以控制 等。由于PLA主要應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，在消費(fèi)者崇尚天然、營養(yǎng)食品的今天，世 界各國的研究者把研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了生物合成法方面。
生物合成法即通過完整的微生物細(xì)胞的立體選擇性生物催化來實(shí)現(xiàn)PLA的生產(chǎn)， 因此篩選高立體選擇性的優(yōu)良工業(yè)微生物菌株是此方法的關(guān)鍵點(diǎn)。早在1986年，Kamata 等就用乳糖發(fā)酵短桿菌5"v^fl"e〃'wm Za"o/ew2enmw發(fā)酵生產(chǎn)了 R-3-苯基乳酸，產(chǎn)量 為1.94 g/L，并且申請了專利；1998年，Dieuleveux等從白地霉Geofr/dmw Ow必Aw 的培養(yǎng)液中也分離到了 R-3-苯基乳酸，該菌株在TSBYE培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生R-3-苯基乳 酸的量為0.6g/L 1 g/L; 2000年，Lavermicocca等發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵面團(tuán)中分離到的植物乳 桿菌Za"o6fld//^ p/a"toraw 21B能分泌R-3-苯基乳酸，他們將植物乳桿菌接種在小麥 粉水解液中，30'C培養(yǎng)發(fā)酵24 h，產(chǎn)生的R-3-苯基乳酸量為0.009 mol/L; 2002年，Katrin 等從青貯草中也分離到了一株i^/flnmnwi MiLAB 393，它產(chǎn)生的S型和R型3-苯基乳酸的比例為9:1; 1996年，Hashimoto等從土壤中篩選到了一株假單胞菌尸"wctowo"cw sp. BC218,該菌株能將苯乙醛-氰醇轉(zhuǎn)化為S-3-苯基乳酸，這一轉(zhuǎn)化有較高的對映選擇性， 生成的S-3-苯基乳酸的e.e.值為75%，再經(jīng)過優(yōu)先結(jié)晶操作，其e.e.值更可達(dá)到99%， 經(jīng)該菌株經(jīng)誘變后，S-3-苯基乳酸的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的12倍；Diversa公司用腈酶(EC 3.5.5.1) (Nitrilases)可以制備e.e.值為99%的S-3-苯基乳酸；近來，Thierry等發(fā)現(xiàn)費(fèi) 氏桿菌戶rop/ow/6ac/en'w y^t^fewe/cW/在奶酪發(fā)酵過程中產(chǎn)生了 3-苯基乳酸，這些3-苯基乳酸是由苯基丙酮酸在羥基還原酶作用下得到的。目前3-苯基乳酸已在Diversa公 司進(jìn)行了工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一支具有高產(chǎn)苯基乳酸能力的微生物菌株，使得該菌株相 對于現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)苯基乳酸微生物而言具有培養(yǎng)容易、產(chǎn)率高的優(yōu)勢。
為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一、本發(fā)明從生產(chǎn)黃酒的酒藥中分離篩選、純化得到一株根霉菌株，其分類命名為
根霉i /z/zo/nw sp.B1219，保藏登記號為CCTCC NO: M 209007。 (一)根霉朋/zojmssp.B1219的篩選純化方法
1、 出發(fā)菌株的選育
準(zhǔn)確稱取生產(chǎn)黃酒的酒藥制備成酒藥稀釋液后，置于無菌PDA固體平板培養(yǎng)基上 28-C保溫培養(yǎng)3 5天，挑取培養(yǎng)基中長出的肉眼可見的真菌菌落，分別移入PDA固體 平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)、純化直至得到單菌落，轉(zhuǎn)移至斜面試管保藏，用作出發(fā)菌株 備用；
2、 高產(chǎn)苯基乳酸能力菌株的篩選
用接種環(huán)分別取少量各株出發(fā)菌株的真菌孢子接種在PDA液體培養(yǎng)基中，搖床培 養(yǎng)72 120小時(shí)后離心獲得真菌菌絲體，并將菌絲體加入到苯基丙酮酸底物轉(zhuǎn)化液中， 35'C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)12 48h，得到轉(zhuǎn)化后的樣品液；
在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基，將用出發(fā)菌株制得的孢子懸液接種于PDA 平板培養(yǎng)基上，均勻涂布后在平板上4只牛津小杯，使各杯之間間距相等，用無菌潔凈 移液管滴加上述轉(zhuǎn)化后的樣品液后28'C培養(yǎng)3 5天，室溫下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牛津杯 的周圍有一株真菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈，因此將這一株真菌命名為根霉朋^pm sp.B1219。(二)根霉及Wzo/ Msp.B1219的形態(tài)特征 將根霉i /n'zo/7"ssp.B1219菌株接種在馬鈴薯固體瓊脂平板上，28'C培養(yǎng)3天，菌落 直徑達(dá)9cm，菌落初期為白色，菌絲絮狀，無色，向四周蔓延，并逐漸成淡黃色。菌落 背面無色，不分泌色素。普通顯微鏡下孢子囊呈球形或近球形，直徑34.5 57 ]um，初 為黃白色，然后逐漸變成褐色；孢子囊孢子卵圓形或球形，無色，直徑5.0 12.5pni; 孢子囊梗壁光滑，無色，寬8.5 12pm;有假根和匍匍枝。
二、本發(fā)明所述的根霉i Wzo/ ^ Sp.B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用。 具體的應(yīng)用方法為
(一) 根霉i /^o/nw sp.B1219菌絲體的制備 將根霉/ /^o; ^sp.B1219接種至PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)條件為28"，培
養(yǎng)72 120小時(shí)后離心獲得根霉菌絲體；
(二) 根霉i W加p^ sp.B1219菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸
將所獲得的根霉及/^o/7^sp.B1219菌絲體轉(zhuǎn)接到含有苯基丙酮酸的底物轉(zhuǎn)化液中， 35'C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)12 48 h得到苯基乳酸粗品。
本發(fā)明的有益效果在于-
本發(fā)明的根霉及Wzo/7M 3 .81219菌株來源于生產(chǎn)黃酒的酒藥，因此其對溫度、pH 等自然環(huán)境的適應(yīng)范圍較廣；根霉i Wzop^ sp.B1219在PDA培養(yǎng)基和査氏培養(yǎng)基上生 長良好，容易培養(yǎng)和保存，通過發(fā)酵所得的苯基乳酸含量為0.55 g/L;根霉i^/zo/n^ sp.B1219抑制污染食品的能力強(qiáng)；根霉朋feo; ^ sp.B1219達(dá)到食品級的要求，保證了使 用的安全性。


圖1根霉sp.B1219的菌絲照片。
本發(fā)明的微生物根霉sp.B1219的保藏日期為2009年1月6日，保藏單位 全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，其保藏登記號為CCTCCNO: M209007。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
本實(shí)施例說明根霉及Wzo/ w sp.B1219的篩選純化方法
PDA固體平板培養(yǎng)基配方馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g,蒸餾 水1 L， pH自然。
PDA液體培養(yǎng)基配方馬鈴薯提取液1.0L,葡萄糖20.0g，蒸餾水1L， pH自然。
1、 出發(fā)菌株的選育
準(zhǔn)確稱取生產(chǎn)黃酒的酒藥(取自常熟王四酒家黃酒廠)25 g，在無菌條件下，將酒 藥加入盛有225 mL無菌水的三角瓶中，震蕩30 min，吸取1 mL酒藥稀釋液迸一步梯 度稀釋，吸取不同梯度的酒藥稀釋液lmL置于已凝固的無菌PDA平板培養(yǎng)基上，用無 菌涂布棒把各梯度濃度的稀釋液分別均勻地涂布在整個(gè)平板表面，28'C保溫培養(yǎng)3 5 天，挑取培養(yǎng)基中長出的肉眼可見的真菌菌落，分別移入PDA固體平板培養(yǎng)基上，恒 溫培養(yǎng)、純化直至得到單菌落后，轉(zhuǎn)移至斜面試管作為出發(fā)菌株保藏。
2、 高產(chǎn)苯基乳酸能力菌株的篩選
用接種環(huán)分別取出發(fā)菌株的少量真菌孢子接在PDA液體培養(yǎng)基中，28°C， 200 r/min 搖床培養(yǎng)3 5天，離心獲得真菌菌絲體。將所獲得的菌絲體加入到含有苯基丙酮酸(純 度37%) 1.5 g，葡萄糖3.42 g，蒸餾水300 mL， pH7.9的轉(zhuǎn)化液中，35'C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)12 48h，得到轉(zhuǎn)化后的樣品液。
在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體平板培養(yǎng)基，將從豆奶和面包上分離到的霉菌制成 孢子懸液，取0.1mL接種于PDA固體平板培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻地涂布。然后在固 體平板上輕輕的放置4至牛津小杯，其間距相等，用無菌潔凈移液管滴加上述樣品液， 加液量與杯口水平為準(zhǔn)，28'C培養(yǎng)3 5天，室溫下觀察結(jié)果，在牛津杯的周圍有一株 真菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈，因此將這一株真菌命名為根霉i /2feopwsp.B1219。
3、 根霉7 Wzo;ws sp.B1219的形態(tài)特征
將根霉/ W加;7Wsp.B1219菌株接種在PDA固體平板培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)3天，菌 落直徑達(dá)9cm，菌落初期為白色，菌絲絮狀，無色，向四周蔓延，并逐漸成淡黃色。菌 落背面無色，不分泌色素。普通顯微鏡下孢子囊呈球形或近球形，直徑34.5 57nm， 初為黃白色，然后逐漸變成褐色；孢子囊孢子卵圓形或球形，無色，直徑5.0 12.5nm; 孢子囊梗壁光滑，無色，寬8.5 12pm;有假根和匍匐枝。實(shí)施例2
本實(shí)施例說明根霉/ /^o/>m sp.B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用。
1、 根霉及Wzo; ^ sp.B1219菌絲體的制備
將上述的根霉孢子接種在300mLPDA液體培養(yǎng)基中，28°C， 200 r/min搖瓶培養(yǎng)72 小時(shí)，3000r/min離心，進(jìn)行菌液分離得到菌絲體。
其中PDA液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯汁1.0L，葡萄糖20g， pH自然。
2、 根霉/ /^o/n^ sp.B1219菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸
將菌絲體按接種量20 g接入到100mL (含有39%苯基丙酮酸)底物轉(zhuǎn)化液中，35°C 下反應(yīng)12h，然后用2倍體積的乙酸乙酯萃取，減壓蒸發(fā)濃縮，得到苯基乳酸的粗品， 測定轉(zhuǎn)化液中苯基乳酸的含量為0.40 g/L。
其中，
苯基丙酮酸的底物轉(zhuǎn)化液配方為苯基丙酮酸(純度37%，) 1.5g，葡萄糖3.42g， 蒸餾水300mL， pH7.9。
苯基乳酸含量的測定方法采用高效液相色譜法-
島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀；色譜柱VP-0DSC18;流動(dòng)相0.05% 三氟乙酸-甲醇(v/v);流速lmL/min;柱溫3(TC;進(jìn)樣量10 ]liL (產(chǎn)物進(jìn)樣前用0.22 jam的微孔濾膜過濾)；檢測器UV-245紫外檢測器。
實(shí)施例3
本實(shí)施例說明根霉i /^op^ sp,B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用，且操作方法同 實(shí)施例2的小試操作，本實(shí)施例即實(shí)施例2的中試放大。
按實(shí)施例2的方法，利用5L發(fā)酵罐(用無菌生理鹽水將斜面孢子洗下，調(diào)節(jié)孢子 濃度至l(^個(gè)/mL，接種到3L培養(yǎng)液中，接種量10%， 28t:下振蕩培養(yǎng)120h)培養(yǎng)菌 絲體，5L的反應(yīng)罐(將菌絲體600g接入到3L底物轉(zhuǎn)化液中)進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，pH值 用無機(jī)酸、堿類自動(dòng)調(diào)節(jié)，按實(shí)施例2的方法進(jìn)行產(chǎn)物的分離和提取。結(jié)果為35°C， 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間14小時(shí)，苯基乳酸產(chǎn)量為0.55 g/L。
實(shí)施例4
本實(shí)施例說明根霉及/n'zopi^sp.B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用，且操作方法同 實(shí)施例2的小試操作，本實(shí)施例即實(shí)施例2的中試放大。按實(shí)施例2的方法，利用10 L發(fā)酵罐(用無菌生理鹽水將斜面孢子洗下，調(diào)節(jié)孢 子濃度至10^個(gè)/mL，接種到8L培養(yǎng)液中，接種量10%， 28'C下振蕩培養(yǎng)96h)培養(yǎng) 菌絲體，10L的反應(yīng)罐(將菌絲體1100g接入到8L底物轉(zhuǎn)化液中)進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，pH 值用無機(jī)酸、堿類自動(dòng)調(diào)節(jié)，按實(shí)施例2的方法進(jìn)行產(chǎn)物的分離和提取。結(jié)果為35°C， 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)，苯基乳酸產(chǎn)量為0.67g/L。
權(quán)利要求
1、一株根霉，其分類命名為根霉Rhizopus sp.B1219，保藏登記號為CCTCC NOM209007。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的根霉朋/zo;mysp.B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的根霉i /n'加/nw sp.B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用， 其特征在于所述的具體應(yīng)用方法包括(1) 根霉i /^o/J^sp.B1219菌絲體的制備 將根霉i Wzo;7^sp.B1219接種至PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)條件為28。C，培養(yǎng)72 120小時(shí)后離心獲得根霉菌絲體；(2) 根霉i^/zc^M sp.B1219菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸將所獲得的根霉i /^o/n^ Sp.B1219菌絲體轉(zhuǎn)接到含有苯基丙酮酸的底物轉(zhuǎn)化液中， 35'C下轉(zhuǎn)化反應(yīng)12 48h得到苯基乳酸粗品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株根霉菌株Rhizopus sp.B1219，其保藏日期為2009年1月6日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，其保藏登記號為CCTCC NOM 209007；本發(fā)明還涉及根霉Rhizopus sp.B1219在發(fā)酵生產(chǎn)苯基乳酸中的應(yīng)用。本發(fā)明的根霉Rhizopus sp.B1219來源于生產(chǎn)黃酒的酒藥，對溫度、pH等自然環(huán)境的適應(yīng)范圍較廣，容易培養(yǎng)和保存，抑制食品腐敗菌的能力強(qiáng)，保證了使用的安全性。
文檔編號C12N1/14GK101508960SQ20091002562
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者梅艷珍, 王立梅, 鄭麗雪, 旭 韓, 斌 齊 申請人:常熟理工學(xué)院